Bilgi

Trisure kullanarak RNA ekstraksiyonu işlemi sırasında DNA nerede?

Trisure kullanarak RNA ekstraksiyonu işlemi sırasında DNA nerede?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Burada açıklanan Trisure kullanılarak RNA ekstraksiyonu işlemi sırasında DNA nerede? DNA'nın da bir nükleik asit olduğu göz önüne alındığında, izole edilmiş RNA'nın da DNA içermesini beklemeli miyim? Bununla birlikte, Bioline 'neredeyse hiç genomik DNA kontaminasyonu olmayan' RNA olduğunu iddia ediyor.


Beklendiği gibi, size TRIsure'ın ne olduğunu gerçekten söylemek istemiyorlar. Söyledikleri, DNA'nın ekstraksiyondan sonra organik veya interfazda bulunduğu, RNA ise sulu faza ayrıldığıdır. Bu neredeyse kesinlikle asit fenol ekstraksiyonunun bir çeşididir. Onay olarak, MSDS bileşenleri olarak fenol, amonyum tiyosiyanat, guanidinyum tiyosiyanat, gliserol ve sitrik asit listeler.


DNA & RNA Arıtma

DNA ve RNA ekstraksiyonu moleküler biyolojide kullanılan temel bir yöntemdir. Yüksek kaliteli, oldukça saf nükleik asit ihtiyacı, çok çeşitli araştırma ve klinik uygulamalar için önemlidir. Nükleik asit saflaştırması, birçok moleküler biyoloji ve genomik iş akışında ilk adımdır.

DNA ve RNA örnekleri genellikle ham preparasyonlardan elde edilir. Genomik DNA, plazmit DNA ve toplam RNA, bakteri ve memeli hücreleri, bitki dokusu, mantar dokusu, memeli dokusu, kan, plazma, serum, virüsler, bukkal ve nazal swablar, jel matrisleri dahil olmak üzere çeşitli kaynaklardan ekstrakte edilebilir ve saflaştırılabilir. PCR'ler ve diğer enzimatik reaksiyonlar. Bu numunelerden nükleik asit izolasyonu genellikle hücre zarlarının parçalanmasını veya numune homojenizasyonunu, ardından proteinlerin, enzimlerin, deterjanların, tuzların ve lipidlerin çıkarılmasını içerir.

Ortak yaklaşımlar şunları içerir:

  • alkali çıkarma
  • Fenol-kloroform ekstraksiyonu
  • Sezyum klorür (CsCl) yoğunluk gradyanlı santrifüjleme
  • Oligo(dT)-selüloz kromatografisi
  • silika matris
  • Cam boncuklar
  • Silisli toprak
  • anyon değişim kromatografisi
  • Boyut dışlama kromatografisi


Son uygulama, saflaştırma için en iyi yöntemi belirleyecektir. Aşağı akış uygulamaları arasında PCR, qPCR, kısıtlama sindirimleri, ligasyon, klonlama, genotipleme, gen ekspresyon analizi, yeni nesil dizileme (NGS) ve Northern ve Southern blot yer alır.


İçindekiler

Bu yöntem, sulu numune ve suya doymuş fenol ve kloroform içeren bir çözeltiden oluşan bir karışımın santrifüjlenmesiyle faz ayrılmasına dayanır ve bir üst sulu faz ve bir alt organik faz (esas olarak fenol) ile sonuçlanır. Bir kaotropik ajan olan guanidinyum tiyosiyanat, proteinlerin (nükleik asitleri güçlü bir şekilde bağlayanlar veya RNA'yı bozanlar gibi) denatürasyonuna yardımcı olmak için organik faza eklenir. Nükleik asitler (RNA ve/veya DNA) sulu faza bölünürken, protein organik faza bölünür. Karışımın pH'ı, hangi nükleik asitlerin saflaştırılacağını belirler. [4] Asidik koşullar altında (pH 4-6), RNA sulu fazda kalırken DNA organik faza bölünür. Nötr koşullar altında (pH 7-8) hem DNA hem de RNA sulu faza bölünür. Son bir adımda, nükleik asitler, 2-propanol ile çökeltme yoluyla sulu fazdan geri kazanılır. 2-propanol daha sonra etanol ile yıkanır ve pelet kısaca havada kurutulur ve TE tamponu veya RNAse içermeyen su içinde çözülür.

Guanidinyum tiyosiyanat, RNazlar dahil olmak üzere proteinleri denatüre eder ve rRNA'yı ribozomal proteinlerden ayırır; fenol, izopropanol ve su ise çözünürlüğü zayıf olan çözücülerdir. Kloroform veya BCP (bromokloropropan) varlığında, bu çözücüler tamamen renkleriyle tanınan iki faza ayrılır: berrak, üst sulu faz (nükleik asitleri içerir) ve alt faz (fenolde çözünmüş proteinleri ve kloroform içinde çözülmüş lipidler). 2-merkaptoetanol ve sarkosin gibi diğer denatüre edici kimyasallar da kullanılabilir. En büyük dezavantajı, fenol ve kloroformun hem tehlikeli hem de uygunsuz malzemeler olması ve ekstraksiyonun genellikle zahmetli olmasıdır, bu nedenle son yıllarda birçok şirket artık RNA'yı izole etmek için alternatif yollar sunmaktadır.


DNA Ekstraksiyonunda Yer Alan 3 Ana Adım

Başlangıçta, DNA'yı izole etmek, büyük miktarda DNA'nın toplandığı uzun ve zor bir süreçti. Bitkilerden, hayvanlardan ve bakterilerden DNA çıkarmak, hücresel bileşenlerin bir çözelti halinde serbest bırakılmasını gerektirir. Bakteriler tek hücreli olduğundan ve kemik, yağ, kıkırdak vb. içermediğinden DNA'nın çıkarılması nispeten kolaydır.

Buna karşılık, hayvan ve bitkilerden ve bitkilerden alınan numuneler, ilerlemeden önce genellikle küçük parçalar halinde öğütülmelidir. Bitki hücreleri çok sert hücre duvarlarına sahip olduğundan, araştırmacının hücreleri bir karıştırıcıda mekanik olarak açması veya hücre duvarı bileşenlerini sindirmek için özel parçalayıcı enzimler eklemesi gerekir.

Benzer şekilde, bir farenin kuyruğundan DNA çıkarmak için, bağ dokuyu parçalamak ve hücreleri dağıtmak için enzimler eklenir. DNA elde etmenin en kolay yolu, onu bakterilerden çıkarmaktır. Birkaç damla bakteri kültürü, amaçların çoğu için bol miktarda DNA verecektir. İlk olarak, bakteri hücre duvarı, hücre duvarının peptidoglikan tabakasını bozan bir enzim olan lizozim tarafından kolayca sindirilir.

Deterjanla ardarda yapılan bir işlem, hücre zarındaki lipidleri çözer. EDTA (Etilen Diamin Tetra asetat) gibi şelatlama maddeleri de özellikle gram-negatif bakterilerle birlikte dış membran ve membran bileşenlerini birbirine bağlayan metal iyonlarını uzaklaştırmak için kullanılır. Tüm bu numunelerde, DNA da dahil olmak üzere hücre içeriği daha sonra çözeltiye salınır ve kürk­ther serileri ile saflaştırılır.

DNA ekstraksiyonu: Adım 2.

DNA'nın saflaştırılması:

DNA'nın saflaştırılması için iki genel prosedür türü kullanılır:

Santrifüj prensibi aşağıdaki gibidir:

Numune yüksek hızda döndürülür ve merkezkaç kuvveti, daha büyük veya daha ağır bileşenlerin tüpün altında çökelmesine neden olur. Örneğin bakte­ria'nın hücre duvarını lizozim ve deterjanlarla yok etmek, hücre duvarının küçük olan parçalarını ve DNA'yı içeren bir solüsyon bırakır. Numune santrifüj edildiğinde DNA ve diğer bazı büyük bileşenler tüpün alt kısmında çökeltilir.

Hücre duvarının parçaları, diğer birçok çözünür bileşenle birlikte çözelti içinde kalır ve atılır. Tortulanmış DNA daha sonra uygun bir tampon solüsyonunda yeniden çözülür. Yine de içinde çok fazla protein ve RNA karışmış durumda.

Bunlar genellikle kimyasal yollarla uzaklaştırılır. Birçok DNA saflaştırmasında kullanılan bir adım phe&synol ekstraksiyonudur. Car&shibolik asit olarak da bilinen fenol, tüm canlı maddelerin yüzde 60 ila 70'ini oluşturan proteinleri çözdüğü ve denatüre ettiği için çok aşındırıcı ve son derece tehlikeli ve titrektir. Sonuç olarak, bir DNA örneğinden tüm proteinleri çözmek ve çıkarmak için fenol kullanılabilir.

Suya fenol eklendiğinde, iki sıvı tek bir çözelti oluşturmak için karışmaz, bunun yerine daha yoğun fenol suyun altında ayrı bir katman oluşturur. Çalkalandığında, iki katman geçici olarak karışır ve proteinler fenolde çözülür.

Çalkalama durduğunda, DNA çözeltisi ve fenol içeren proteinler iki katmana ayrılır (Şekil 3.1). DNA ile hiçbir fenolün tutulmadığından emin olmak için numune kısa süre santrifüj edilir. Daha sonra DNA ve RNA içeren su emilir ve tutulur. Genel olarak, proteinleri DNA'dan saflaştırmak için birkaç ardışık fenol ekstraksiyonu yapılır.

Fenol ekstraksiyonundan kaçınan çeşitli yeni teknikler geliştirilmiştir. Bunların çoğu, DNA'yı bağlayan ancak diğer hücre bileşenlerini bağlamayan bir reçine içeren bir kolondan geçirilerek DNA'nın saflaştırılmasını içerir.

Bu konudaki teknik ve teknikler aşağıdaki iki türdendir:

1. Afinite Kromatografisi:

Bu silika reçineleri kullanır. Silika reçineleri, düşük pH ve yüksek tuz konsantrasyonlarında nükleik asit ve asitleri hızlı ve spesifik olarak bağlar. Nükleik asitler daha yüksek pH ve düşük tuz konsantrasyonunda salınır.

2. İyon Değişim Kromatografisi:

Dietil amino-etil-selüloz gibi an­ion exchange reçineler pozitif yüklüdür ve negatif yüklü fosfat&sifat grupları aracılığıyla DNA'ya bağlanır. Bu durumda bağlanma, düşük tuz konsantrasyonlarında meydana gelir ve nükleik asitler, iyonik bağı bozan yüksek konsantrasyonlarda tuz ile ayrıştırılır.

DNA ekstraksiyonu: Aşama 3.

İstenmeyen RNA'nın Kaldırılması:

Özel enzimler, bir DNA örneğinden kirletici RNA'yı çıkarır. Şerit clease enzimi, RNA'yı kısa oligonükleo&shitidlere indirger, ancak dev DNA makromolekülünü değiştirmeden bırakır. Bir DNA ve RNA karışımı önce enzim aktivitesi için optimum sıcaklıkta ribonükleaz ile inkübe edilir.

Daha sonra eşit hacimde alkol eklenir. Alkol, uzun DNA zincirleri de dahil olmak üzere büyük makromolekülleri çözeltiden çökeltir. Bununla birlikte, küçük RNA fragmanları çözülmüş halde kalır.

Alkol tedavisinin çok spesifik olmadığı ve büyük karbonhidratların ve birçok proteinin yanı sıra hem DNA hem de RNA'nın sağlam makromoleküllerini çökelteceği belirtilmelidir. Bu nedenle, alkol çöktürmesi ancak bu bileşenler santrifüjleme ve fenol ekstraksiyonu ile DNA'dan çıkarıldıktan sonra kullanılabilir.

Daha sonra DNA, santrifüjleme yoluyla tüpün dibinde çökeltilir ve RNA parçalarını ve shymentlerini içeren süpernatant solüsyonu atılır (Şekil 3.2). Tüpün dibinde kalan küçük DNA peleti genellikle zar zor görünür. Bununla birlikte, çoğu araştırma ve inceleme için yeterli milyarlarca DNA molekülü içerir.


RNA'nın TRIzol (TRI reaktifi) kullanılarak saflaştırılması

TRIzol çözündürme ve özütleme, RNA'yı proteinden arındırmak için nispeten yakın zamanda geliştirilmiş genel bir yöntemdir. Bu yöntem, hücrelerin veya dokuların endojen RNazlar için zenginleştirildiği veya sitoplazmik RNA'nın nükleer RNA'dan ayrılmasının pratik olmadığı durumlarda özellikle avantajlıdır. TRIzol (veya TRI Reaktifi), aynı anda biyolojik materyali çözündüren ve proteini denatüre eden fenol ve guanidinyum izotiyosiyanatın monofazik bir çözeltisidir. Çözündürmeden sonra, kloroform ilavesi faz ayrılmasına neden olur (fenol:kloroform:izoamil alkol ile ekstraksiyon gibi), burada protein organik faza ekstrakte edilir, DNA arayüzde çözülür ve RNA sulu fazda kalır. Bu nedenle, RNA, DNA ve protein tek bir numuneden (dolayısıyla TRIzol adı) saflaştırılabilir. TRIzol ekstraksiyonu ayrıca mikroRNA'lar, piwi ile ilişkili RNA'lar veya endojen, küçük enterferans yapan RNA'lar gibi küçük RNA'ları izole etmek için etkili bir yöntemdir. Bununla birlikte, TRIzol pahalıdır ve RNA peletlerinin yeniden süspanse edilmesi zor olabilir. Bu nedenle, düzenli fenol ekstraksiyonu pratik olduğunda TRIzol kullanımı önerilmez.


NGS İş Akışı Adımları

Yeni nesil sıralama iş akışı üç temel adım içerir: kitaplık hazırlama, sıralama ve veri analizi. Her adımın temellerini öğrenin ve NGS iş akışınızı nasıl planlayacağınızı keşfedin.

NGS İş Akışına Hazırlık

Yeni nesil dizileme iş akışına başlamadan önce nükleik asidinizi izole edin ve saflaştırın. Bazı DNA ekstraksiyon yöntemleri, NGS iş akışında meydana gelen enzimatik reaksiyonları olumsuz yönde etkileyebilecek inhibitörler sunabilir. En iyi sonuçlar için numune türünüze göre optimize edilmiş bir ekstraksiyon protokolü kullanın. RNA dizileme deneyleri için, ters transkripsiyon yoluyla RNA'yı cDNA'ya dönüştürün.

Çıkarma işleminden sonra çoğu NGS iş akışı bir KK adımı gerektirir. Saflık değerlendirmesi için UV spektrofotometrisi ve nükleik asit miktar tayini için florometrik yöntemler kullanmanızı öneririz.

NGS İş Akışında 1. Adım: Kütüphane Hazırlığı

Kütüphane hazırlığı, NGS iş akışınızın başarısı için çok önemlidir. Bu adım, DNA veya RNA örneklerini bir sıralayıcı ile uyumlu olacak şekilde hazırlar. Sıralama kitaplıkları tipik olarak DNA parçalanarak ve her iki uca özel adaptörler eklenerek oluşturulur. Illumina dizileme iş akışında bu adaptörler, DNA fragmanlarının akış hücresine bağlanmasına izin veren tamamlayıcı diziler içerir. Fragmanlar daha sonra amplifiye edilebilir ve saflaştırılabilir.

Kaynaklardan tasarruf etmek için, birden çok kitaplık bir havuzda toplanabilir ve aynı çalıştırmada sıralanabilir; bu, çoğullama olarak bilinen bir işlemdir. Adaptör ligasyonu sırasında, her kitaplığa benzersiz dizin dizileri veya "barkodlar" eklenir. Bu barkodlar, veri analizi sırasında kütüphaneleri ayırt etmek için kullanılır.

Kütüphane Hazırlık Kaynakları

Kitaplık ölçümü ve kalite kontrolü için kılavuz bulun.

DNA/RNA'yı saflaştırırken kontaminasyonu nasıl önleyeceğinizi öğrenin.

NGS İş Akışında 2. Adım: Sıralama

NGS iş akışının sıralama adımı sırasında, kitaplıklar bir akış hücresine yüklenir ve sıralayıcıya yerleştirilir. DNA fragmanlarının kümeleri, küme oluşturma adı verilen bir süreçte amplifiye edilir ve bu, milyonlarca tek iplikli DNA kopyası ile sonuçlanır. Çoğu Illumina sıralama cihazında kümeleme otomatik olarak gerçekleşir.

Sentez yoluyla dizileme (SBS) adı verilen bir süreçte, kimyasal olarak modifiye edilmiş nükleotitler, doğal tamamlayıcılık yoluyla DNA şablon zincirine bağlanır. Her nükleotid, bir floresan etiket ve bir sonraki bazın dahil edilmesini engelleyen tersinir bir sonlandırıcı içerir. Floresan sinyal, hangi nükleotidin eklendiğini gösterir ve sonlandırıcı, sonraki bazın bağlanabilmesi için bölünür.

İleri DNA zincirini okuduktan sonra, okumalar yıkanır ve işlem ters iplik için tekrarlanır. Bu yönteme eşleştirilmiş uç dizileme denir.

Sentez Teknolojisi ile Sıralama

NGS İş Akışında 3. Adım: Veri Analizi

Sıralamadan sonra, cihaz yazılımı nükleotidleri (baz çağrı adı verilen bir süreç) ve bu baz çağrılarının tahmin edilen doğruluğunu tanımlar. Veri analizi sırasında, sıralama verilerinizi standart bir analiz aracına aktarabilir veya kendi işlem hattınızı oluşturabilirsiniz.

Bugün, biyoinformatik eğitimi veya ek laboratuvar personeli olmadan NGS verilerini analiz etmek için sezgisel veri analizi uygulamalarını kullanabilirsiniz. Bu araçlar, sıra hizalama, değişken çağırma, veri görselleştirme veya yorumlama sağlar.

Veri Analizi Hakkında Daha Fazla Bilgi Edinin

NGS İş Akışınıza Hızlı Başlayın

Daha hızlı başlamak ister misiniz? İş Akışı Tasarım ve Değerlendirme Hizmetimiz aracılığıyla deneysel tasarım uzmanlarına danışın.* Size uygun bir NGS iş akışı tasarlamanıza, örneklerinizi işlemenize ve ilk NGS veri setinizi oluşturmanıza yardımcı olacağız.

*Asya ve Güney Pasifik ülkelerinde mevcut değildir.

Bizimle iletişime geçin

Mikrobiyal Tüm Genom Dizileme

Mikrobiyal tam genom dizilimi, patojenleri tanımlamak, genomları karşılaştırmak ve antimikrobiyal direnci analiz etmek için kullanılabilir. Bu uygulama için öne çıkan NGS iş akışımız, önerilen adımları açıklamaktadır. Tüm iş akışı, DNA'dan verilere 24 saatten daha kısa bir sürede ilerler.

DNA İzolasyonu

İnhibitörleri tanıtmadan mikrobiyal kolonilerden DNA'yı izole etmek için bir ekstraksiyon kiti kullanın. Cam boncuk kullanmanızı öneririz. UV spektrofotometrisi kullanarak saflığı değerlendirin ve florometrik yöntemler kullanarak DNA'yı ölçün.

Kütüphane Hazırlığı

Illumina DNA Hazırlık Kılavuzu'nda listelenen protokolü izleyerek kitaplıkları hazırlayın ve miktarını belirleyin. Agilent 2100 Bioanalyzer veya Advanced Analytical Fragment Analyzer'ı kullanarak isteğe bağlı bir kitaplık kalite kontrolü de yapabilirsiniz. İhtiyacın olacak:

2.5 saat
Tahmini DNA girişi: 1-500 ng

Sıralama

2 × 150 bp'lik dizi kitaplıkları, iSeq 100 Sistem Kılavuzu'nda listelenen protokolü izleyerek çalışır. İhtiyacın olacak:

19.5 saat
Tahmini çıktı: 2 × 150 bp çalıştırma başına 1,2 Gb
Çalışma başına numune sayısı: 50× kapsama alanında 5 Mb varsayılarak 4-5 numune

Veri analizi

BWA Aligner uygulamasını kullanarak verileri analiz edin ve BaseSpace Sequence Hub'daki Integrative Genomics Viewer uygulamasını kullanarak verileri görselleştirin. İhtiyacın olacak:


Soyut

Başarılı yüksek verimli dizileme (HTS) analizi için yeterli kalitede nükleik asit malzemesi çok önemlidir. Arşiv FFPE materyalinden izole edilen DNA ve RNA, fiksasyon sırasında ortaya çıkan kimyasal hasar nedeniyle sıklıkla bozulur ve kolayca çoğaltılamaz. Optimal nükleik asit ekstraksiyon kitlerini belirlemek için HTS uygulamalarında DNA ve RNA miktarı, kalitesi ve performansı değerlendirildi. DNA ve RNA, üç farklı ticari satıcıdan yedi kitten sekiz ekstraksiyon protokolü kullanılarak beş sarkom arşiv FFPE bloğundan izole edildi. DNA ekstraksiyonu için, Covaris'in truXTRAC FFPE DNA kiti daha yüksek verim ve daha iyi amplifiye edilebilir DNA verdi, ancak tüm protokoller Agilent SureSelect XT kullanılarak karşılaştırılabilir HTS kitaplığı verimleri verdi ve aşağı akış varyant çağrısında iyi performans gösterdi. RNA ekstraksiyonu için, tüm protokoller karşılaştırılabilir verimler ve büyütülebilir RNA verdi. Bununla birlikte, Archer FusionPlex Sarkom Testi kullanılarak füzyon geni tespiti için, Covaris'ten truXTRAC FFPE RNA kiti ve Beckman Coulter'dan Agencourt FormaPure kiti, en yüksek benzersiz okuma çiftleri yüzdesini göstererek HTS verilerinin daha yüksek karmaşıklığını ve tekrarlayan füzyonun daha sık saptanmasını sağladı genler. truXTRAC eşzamanlı DNA ve RNA ekstraksiyonu, bireysel protokoller olarak benzer çıktılar verdi. Bu bulgular, çoğu durumda başarılı HTS kitaplıkları oluşturulabilmesine rağmen, farklı protokollerin FFPE nükleik asit ekstraksiyonu için değişken miktar ve kalite verdiğini göstermektedir. Optimal prosedürün seçilmesi oldukça değerlidir ve sınırda kaliteli numunelerde sonuçlar üretebilir.

Alıntı: Kresse SH, Namløs HM, Lorenz S, Berner J-M, Myklebost O, Bjerkehagen B, et al. (2018) FFPE örneklerinin yüksek verimli dizilimi için ticari DNA ve RNA ekstraksiyon yöntemlerinin değerlendirilmesi. PLoS BİR 13(5): e0197456. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0197456

Editör: Ruslan Kalendar, Helsinki Üniversitesi, FİNLANDİYA

Alınan: 2 Ağustos 2017 Kabul edilmiş: 2 Mayıs 2018 Yayınlanan: 17 Mayıs 2018

Telif hakkı: © 2018 Kresse ve ark. Bu, orijinal yazar ve kaynağın belirtilmesi koşuluyla herhangi bir ortamda sınırsız kullanım, dağıtım ve çoğaltmaya izin veren Creative Commons Atıf Lisansı koşulları altında dağıtılan açık erişimli bir makaledir.

Veri kullanılabilirliği: Kişisel verilerin işlenmesi ve serbest dolaşım ile ilgili olarak bireylerin korunmasına ilişkin 24 Ekim 1995 tarihli Avrupa Parlamentosu ve Konseyinin 95/46/EC sayılı Direktifi tarafından getirilen etik ve yasal kısıtlamalar nedeniyle veriler mevcut değildir. bu tür verilerden. Kişisel Veriler Yönetmeliği § 7-12 Veri Koruma Görevlisi, yukarıda belirtilen yasalar uyarınca, gizlilik ve etik kaygılar nedeniyle verileri kamuya açıklamamıştır. Oslo Üniversite Hastanesi Veri Sorumlusu'nun sorumluluğunda olduğundan, gerektiğinde veriler hastanenin kontrolünde olduğu sürece verilerin denetimine yönelik hükümler konulabilir. Veri mevcudiyeti ile ilgili sorular hem [email protected] adresinden Veri Koruma Görevlisine hem de [email protected] adresinden ilgili yazara yönlendirilebilir.

Finansman: Bu proje, Norveç Kanser Derneği'nden (PR-2007-0163) Leonardo A. Meza-Zepeda'ya, Norges Forskningsråd'dan (221580) Ola Myklebost'a ve Oslo Üniversite Hastanesi'ndeki Gen Terapi programından Leonardo A. Meza-Zepeda'ya bağışlarla desteklenmiştir. . Finansörlerin çalışma tasarımı, veri toplama ve analizi, yayınlama kararı veya makalenin hazırlanmasında hiçbir rolü yoktu.

Rekabet eden ilgi alanları: Yazarlar, rekabet eden çıkarların olmadığını beyan etmişlerdir.


Fenol/Kloroform ekstraksiyonunun pratik uygulaması

RNA'nızı veya DNA'nızı temizlemek için eskisinden çok daha fazla yöntem arasından seçim yapmak mümkün olsa da, bazen Fenol/Kloroform ekstraksiyonu hala gidilecek en iyi yoldur. Burada bu tekniği kullanmanın bazı pratik yönlerini tartışacağım.

Nick, organik özütlemenin proteinleri sulu bir çözeltiden nasıl çıkaracağına ilişkin bazı fikirlere değinerek önceki bir makalede Fenol/Kloroform özütleme konusunu tanıttı. Özetle, proteinler hem hidrofobik hem de hidrofilik kalıntılardan oluşur ve protein katlanması yoluyla suda çözünür kalmak için bir uzlaşma sağlar. Ancak, onlara hem polar hem de polar olmayan kalıntıları (yani fenol veya fenol/kloroform) hiçbir uzlaşma gerekmeden (yani – katlanma) barındırabilen bir ortama geçme fırsatı verildiğinde, mutlu bir şekilde buna geçerler. faz. Karbonhidratlar ve nükleik asitler gibi daha yüksek polar moleküller, sulu fazda (aşağıda belirtilen bazı istisnalar dışında) "daha mutludur" ve orada kalırlar. Şimdi nitty-cesur için.

Fenol'e karşı Fenol/Kloroform'a karşı Kloroform'a karşı
Birini eğitirken bana en sık sorulan sorulardan biri, ekstraksiyonda kullanılan farklı organik fazlar arasındaki farkların ne olduğudur. İşte onları anladığım kadarıyla, arıza.

Fenol – Burada aslında bahsettiğimiz şey, aslında yaklaşık %72 fenol, %28 sudan oluşan bir çözeltiden oluşan tamponla doyurulmuş fenoldür. Fenol zayıf bir asit olduğundan, kullandığımız çözeltiler pH'ı belirli bir hedefe getirmek için tamponla dengelenmiştir - ya RNA saflaştırması için asidik ya da DNA saflaştırması için hafif alkali. Fenol içinde çözülen belirli bir miktar suya ek olarak, suda çözünen belirli bir miktarda fenol vardır - dengede sulu faz yaklaşık %7 fenol içerecektir. Bu çözünmüş fenol, proteinler hala sulu çözelti içindeyken denatüre olmasına yardımcı olduğundan, bunun ekstraksiyona yardımcı olduğu düşünülmektedir. Tampon doymuş fenol, sudan sadece biraz daha yüksek bir yoğunluğa sahiptir.

Fenol/Kloroform – Bu, tamponla doyurulmuş fenol ve kloroform karışımıdır, genellikle DNA saflaştırması için 1:1'e yakındır ve diğer oranlar bazen RNA saflaştırması için kullanılır. İzoamil alkol bazen bir köpürme önleyici madde olarak dahil edilir, ancak genellikle etkisiz ve isteğe bağlı bir ilave olduğu düşünülür. Bu çözelti, birkaç nedenden dolayı yaygın olarak tamponla doyurulmuş fenol yerine kullanılır. Yukarıda bahsettiğim gibi, doymuş fenol tamponunun yoğunluğu sudan sadece biraz daha yüksektir. Bu nedenle, sulu fazınız yoğunluğunu artıracak yeterli miktarda tuz veya başka herhangi bir çözünen içeriyorsa, ekstraksiyon sırasında, sulu fazınızın fenolün üstünde değil, altında olduğu faz inversiyonu ile sonuçlanabilir. Kloroform sudan önemli ölçüde daha yoğundur, bu nedenle onu organik faza eklemek, o fazın toplam yoğunluğunu artırarak faz inversiyonunu önlemeye yardımcı olur.

Ek olarak, kloroform (ve bazıları izoamil alkol der) interfazı - nereye gitmek istediklerine karar veremeyen moleküller tarafından doldurulan iki faz arasındaki bulanık sınırı - azaltmaya yardımcı olur. Bunlar kısmen denatüre proteinler, DNA (pH'a bağlı olarak) ve/veya hala DNA'ya yapışan kısmen denatüre DNA bağlayıcı proteinler olabilir ve bu gerçek bir baş belasıdır. Sulu fazı çıkarırken bu malzemenin bir kısmını pipetlerseniz, numunenizin saflığını azaltırsınız. Pipetleme yaparken çok çekingenseniz, veriminize zarar verirsiniz. Eğer şansım varsa, o zaman en çok saklamak istediğin şey onun içinde oturuyor. Karışıma kloroform eklemek bunu azaltmaya yardımcı olur. (Ama bu soruna aşağıda anlatacağım daha iyi bir çözümüm var.)

Kloroform – Bu normalde fenol veya fenol/kloroform ekstraksiyonlarından sonra kullanılır. Saf kloroform, protein ekstraksiyonu için yukarıda bahsedilen organik solüsyonlar kadar iyi çalışmasa da, sulu solüsyonlardan fenol çıkarmak için iyi çalışır. Sulu fazın içerdiğini söylediğimi hatırla

Dengelemeden sonra %7 fenol? Fenolün proteinleri denatüre etmeyi sevdiğini söylediğimi de hatırlıyor musun? Şu anda protein içermeyen nükleik asit solüsyonunuzdaki fenolden kurtulmazsanız (veya en azından ciddi şekilde azaltmazsanız), DNA veya RNA'yı tedavi ettiğiniz enzimleri kısmen veya tamamen inhibe ederek sizi rahatsız edebilir. hat. Güzel bir kloroform yuvası ile sunulan fenol, nükleik asitlerinizden ayrılacaktır. Kloroformun kendisi suda fenolden yaklaşık 10 kat daha az çözünür (

%0.8) ve proteinlere daha az denatüre edicidir. Ayrıca uzun zaman önce bana, bir zamanlar etanol çökeltmesi sırasında fenolün DNA ile peletlenmesinin daha az olası olduğu söylendi, ancak bu noktayı destekleyecek bir referans bulamıyorum.

Eter – Bu aynı zamanda fenolün sulu fazdan çıkarılması için de kullanılabilir. Bununla birlikte, eterin patlayıcı potansiyeli ve biyoloji tiplerinin laboratuvarlarında Bunsen brülörlerine ve vurucularına sahip olma eğilimi nedeniyle, yerini büyük ölçüde kloroform almıştır.

Pembe çok güzel değil
Dikkat notu: Çözelti pembeye dönüyorsa fenol veya fenol/kloroform kullanmayın. Fenolün oksidasyonu pembe/kahverengi bir bileşik üretir ve bu bileşik DNA'nızın çentiklenmesine ve RNA'nızın bozulmasına neden olur. Çoğu ticari fenol solüsyonu, bu oksidasyonu önlemek için bir antioksidan içerir ve asidik bir pH'ta tamponlanmış fenol oksidasyona dirençli gibi görünmektedir, ancak doymuş fenol tamponunun bir kısmını (kahverengi şişeden) taşımak kötü bir fikir değildir. çıkarma işlemine başlamadan önce incelemek için şeffaf bir şişeye veya tüpe koyun.

pH önemlidir – çok fazla
Bazen biri fenol ekstraksiyonu yapar ve numunedeki DNA'nın hiçbirini geri almaz. Bu sizin veya laboratuvarınızdaki birinin başına gelirse, ilk sorunuz “Hangi fenol kullandınız?” olmalıdır. Hem DNA hem de RNA çalışması yapan laboratuvarlar muhtemelen hem asidik hem de bazik tamponlu fenol solüsyonlarına sahip olacak veya birileri pH'a dikkat etmeden yeni bir şişe fenol alacak. Asidik fenol içeren numuneler içeren DNA'nın ekstraksiyonu, DNA'nın denatürasyonu ile sonuçlanır ve bir kez denatüre edildiğinde, DNA organik faza bölünür. Bu, asidik tamponla doymuş fenolün kullanılmasının nedenlerinden biri olan birçok RNA saflaştırma protokolünün önemli bir özelliğidir.

Şimdi, bazen bir laboratuvarın DNA fenol ekstraksiyonları başarısız olmaya başlar (daha sonra DNA geri kazanılmaz) ve fenolün pH'ı sorgulanır. Kendinizi bu noktada bulursanız, pH metrenizi içine daldıramazsınız ve pH kağıdı kullanamazsınız, çünkü kağıttaki pH göstergesi sulu çözeltilerle karakterize edilmiştir. Kullandığım yöntem, 1 ml doymuş fenol tamponunu 9 ml %45 metanol ile seyreltmek, karıştırmak ve ardından standart bir pH metre ile pH'ı ölçmektir. pH'ı ayarlamanın en güvenli yolu, fenol çözeltisinin üstündeki sulu fazı taze bir alikot ile değiştirmektir.

100 mM tamponlu su (DNA çalışması için genellikle Tris pH 7.9), fazlar iyice karıştırın ve sonra fazlar yeniden iyice ayrılana kadar şişenin oturmasını bekleyin. Sonra tekrar pH.

Aşamalarınızı karıştırmak
Fenol/kloroform ekstraksiyonları şaşırtıcı derecede etkilidir – ilk ekstraksiyon dengeye geldikten sonra ortalama proteinin %1'inden daha azı sulu fazda kalır. İşin püf noktası, elbette, ekstraksiyonu dengeye getirmektir. İki faz arasında ne kadar fazla yüzey alanı varsa, bu o kadar hızlı gerçekleşir ve bu yüzey alanı, yarattığınız daha ince emülsiyon kadar büyüktür. Bu, birçok protokolün gerektirdiği gibi fazları birkaç dakika vorteksleyerek başarılabilir, ancak tüm numuneler girdaplanamaz. Genomik DNA gibi çok büyük DNA'yı saflaştırıyorsanız, numunenizi çok daha nazikçe karıştırmanız ve bu nedenle her bir ekstraksiyonu çok daha uzun süre yapmanız gerekebilir. Bu noktada, protokolünüzü takip edin ve bu adımdan zaman ayırmaya çalışırken çok dikkatli olun.

Denatürasyon ve sindirimin etkileri
Bazı protokoller, ekstraksiyondan önce protein denatürasyonu ve muhtemelen Protinaz K ile sindirim gerektirir. Bu adımların her ikisi de interfazda yakalanan materyal miktarını azaltma ve dolayısıyla geri kazanılan DNA veya RNA verimini artırma girişimleridir. Ekstraksiyondan önce proteinleri SDS ile denatüre etmenin herhangi bir olumsuz etkisini görmedim. Öte yandan, proteinin sindirimi, kurtardığınız nükleik asidin saflığını azaltabilir. Bütün proteinlerin organik faza bölünmeleri neredeyse garanti olsa da, protein küçük peptitlere sindirildiğinde, bu peptitlerin hepsi bütün proteinin aynı kimyasal “karakterine” sahip olmayacak ve her birinin kendi bölünme numarası olacaktır. Alt uygulamanıza bağlı olarak, nükleik asidinizde bazı peptitlerin olması çok önemli olmayabilir, ancak bu kirleticilerin numunenin gelecekteki miktarını etkilemesi resmi olarak mümkündür. Ancak, korkunç interfazı ortadan kaldırmanın daha iyi bir yolunu keşfettim…

Faz Kilidi jeli®
Bu, laboratuvarların %50'sinde görünen şeylerden biri, ancak konuştuğum insanların %10'undan daha azı bunun ne olduğunu veya nasıl çalıştığını biliyor. Bunu araştırmamın kritik bir noktasında keşfettim ve tezimi kurtardı. Kısacası, Phase-lock jel, yoğunluğu sudan biraz daha fazla olan, yapışkan, Vazoline benzer bir jeldir. Ekstraksiyonunuzu bir santrifüj tüpünde üstüne ekler ve sonra santrifüjlerseniz, Faz Kilidi jeli sulu ve organik fazlar arasında toplanır, ikisini ayırır ve DNA/RNA aç interfazının oluşumunu engeller.

İnternette yapılan bir araştırma, bu sürecin yeterince iyi olduğunu düşündüğüm herhangi bir fotoğrafını ortaya çıkarmadı, bu yüzden kendi fotoğraflarımdan bazılarını çektim. Bu küçük gösteride, değerli nükleik asidimizin yerini kırmızı boya alıyor ve proteinin yerini mavi boya alıyor.

A) Phase Lock jel®, 1.5 ml'lik bir Eppendorf tüpünün dibine peletlendi.
B) Fenol/kloroform ve sulu fazı ekledikten sonra, sulu fazda sahte DNA (kırmızı) ve sahte protein (mavi) ile tamamlayın.
C) 5 dakika hafifçe çalkalandıktan sonra.
D) Santrifüjden sonra. Jelin organik fazı sulu fazdan ayırdığına dikkat edin.
E) İkinci bir fenol/kloroform ilavesinden ve 5 dakika hafifçe çalkalandıktan sonra.
F) İkinci santrifüjden sonra. Sahte DNA, artık fenolün çıkarılması için artık kloroform ile (boşluk izin veriyorsa aynı tüpte) ekstrakte edilebilir.

Gördüğünüz gibi, jel iki faz arasında sabit bir bölüm oluşturur ve numuneyi ikinci kez çıkarmak istiyorsanız ve tüpte hala yer varsa, aynı tüpü iki veya daha fazla kullanarak yapabilirsiniz. numune saflığından ödün vermeden kez. Bu reaktifi içeren bir tüpte iki fazı vorteksle karıştıramazsınız, ancak ayrı bir tüpte karıştırmayı oylayabilir, ardından numuneyi jel ve santrifüj ile tüpe ekleyebilirsiniz. Bu jelin iki farklı aroması vardır - biri normal numuneler için (hafif) ve diğeri yüksek tuz veya protein konsantrasyonlu çözeltiler (ağır) gibi yüksek yoğunluklu numuneler için.

Ekstraksiyondan önce numunemdeki proteinleri denatüre etmek için SDS kullanmak ve ardından fazları ayırmak için Phase Lock jel® kullanmak bana tutarlı bir şekilde 260/280 oranlı 1.8 ve %98'den fazla geri kazanımlı DNA örnekleri verdi. Cidden harika şeyler.

Bu makaleyi hazırlarken birçok yararlı bilgi içeren bu web sitesine rastladım. Fenol hakkında daha fazla bilgi edinmek istiyorsanız ziyaret edin.

Şimdi sizden haber almak için: Mükemmel protein ekstraksiyonları için püf noktalarınız ve ipuçlarınız nelerdir?


Çip Üzerinde Laboratuvar Teknolojisi ve Uygulamaları

Burak Yılmaz , Fazilet Yılmaz , Omics Teknolojileri ve Biyomühendislik , 2018

8.1.1.2 LOC Cihazlarında PCR, qPCR ve Moleküler Tayin

DNA ekstraksiyonundan sonra en yaygın analiz PCR'dir (Polimeraz Zincir Reaksiyonu). PCR, dizileme tekniklerine doğrudan ve dolaylı olarak benzeyen birçok uygulamaya sahiptir. Doğrudan PCR uygulamalarından biri, açıkça, tespit edilebilir düşük miktarda DNA yapmaya yardımcı olan DNA dizilerinin amplifikasyonudur (örneğin, bakteri veya virüs gibi patojen tespiti için).

PCR'nin genomik analizdeki önemi, PCR için çok sayıda LOC cihazının geliştirilmesini etkiler. Hacmin minyatürleştirilmesi ve yüksek yüzey/hacim oranı, hızlı ve entegre PCR için hızlı termal transfer sağlar. PCR also requires a post-analysis so that amplicons’ size detection carried out by electrophoresis have been made to integrate PCR and electrophoresis on-chip ( Timothée, 2015a ).

Originally electrophoresis is done by using gels, mainly made using agarose (for longer DNA) and polyacrylamide (for shorter DNA). With the advent of LOCs, DNA electrophoresis was one the first molecular processes that could be integrated on a chip ( Curtis Saunders et al., 2013 ). This miniaturization enabled to increase even more the process time to realize electrophoresis, reduce reagent consumption, and assemble on a chip other DNA process steps as mentioned before ( Fig. 8.1 ).

Figure 8.1 . PCR microfluidic system.

qPCR is another technique that was adapted to LOC devices that present the advantage to be faster (automated detection during PCR), more sensitive, and sustainable.

As an example, using ultra-fast pressure controller and fluorescence reader and based on the ultra-fast temperature control, ultra-fast qPCR microfluidic system had been developed by Elvesys system for the molecular detection of diseases like Anthrax and Ebola in less than 8 minutes with a detection efficiency identical to commercial systems that are 7–15 times slower ( Ramalingam et al., 2010 ).

Another emerged field is digital microfluidics that deals with emulsion and droplets within LOC devices.

Ultra-low amount of DNA can be captured within damlacıklar, and limits can be increased with one copy number detection within LOC droplet qPCR ( Beer et al., 2007 ) ( Fig. 8.2 ).

Figure 8.2 . LOC droplet qPCR.


Yöntem¶

  • Bleach ile kuru bir reaktif spatulası ve küçük bir manyetik karıştırma çubuğu sterilize edin.
  • Ağırlıkça %5-10 oranında Chelex100 Reçine (Biorad kısım 143-3832,100-200 ağ Chelex, sodyum formu) ve UV ile sterilize edilmiş HPLC su bulamacı hazırlayın. Bunu yapmanın en etkili yolu, 50 ml'lik steril bir şahin tüpünü küçük bir beher içine bir teraziye yerleştirmek ve teraziyi sıfırlamaktır. Ardından 5 gram Chelex ekleyin ve 50 ml işaretine kadar suyla doldurun.

Hassasiyet kritik değildir. Steril tekniktir.

  • Steril karıştırıcıyı tüpe yerleştirin ve manyetik karıştırıcıya yerleştirin. Chelex hızla çöker, bu nedenle bulamaç iyi karıştırılmazsa konsantrasyonlarınız ve sonuçlarınız değişken olacaktır. Bulamacı iyice karıştırarak, 300-500 mikro litreyi 0,6 veya 1,6 ml eppendorf tüplerine (yine, steril) bölün ve hemen kapatın. Bir laminer akış başlığına erişiminiz varsa, tüm bunları yapmak için iyi bir yerdir. Kullanmadan önce ölçeği ve karıştırıcıyı %10 çamaşır suyu solüsyonu ve/veya UV sterilizasyonu ile silmek isteyebilirsiniz.
  • Isıtma bloğunu açın. 95 °C'ye ayarlayın. Delikleri suyla doldurun.

  • Steril forseps kullanarak (sterilize etmek için alkol yakıcı üzerinde birkaç kez alev), numunenizden küçük bir doku parçası çıkarın. Bu doku parçası görülebilecek kadar büyük olmalı, ancak kolayca görülebilecek kadar büyük olmamalıdır. Standart bir zımbanın 0,2 mm'lik bir bölümünü kestiğinizi hayal edin. Bu çok büyük. Çok fazla doku reaksiyonlarınızı engelleyebilir.

Numuneler arasında forseps sterilize edin.

  • Bitirdiğinizde, sterilize edilmiş forsepslerinizi bir Chelex bulamacı tüpüne daldırarak negatif bir Chelex kontrolü yapın.
  • 10-15 saniye vorteks numunesi ve chelex bulamacı.

Başlamadan önce kapakların sıkıca kapatıldığından emin olun.

* Bu adımı yaparken blok sıcaklığı biraz düşebilir. Bu düşüş normaldir. Kapakların fırlamadığından emin olmak için inkübasyon sırasında tüpleri kontrol edin. *

Buhar santrifüj tüpünün kapağını açabileceğinden dikkatli olun. Kapakları aşağıda tutun.

Yalnızca PCR reaksiyonları için süpernat kullanın. Chlex boncuk Taq'ı etkisiz hale getirecek!

Bu yöntem, izin alınarak burada bulunan orijinal bir protokole dayanmaktadır.


Videoyu izle: استخلاص ال DNA - DNA extraction (Ağustos 2022).