Bilgi

Jelim neden bu kadar düşük çözünürlüğe sahip?

Jelim neden bu kadar düşük çözünürlüğe sahip?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Bio'ya yepyeni bir kullanıcı Bu Site burada. Bu jeli (%0.9 agaroz, 60V'da başlayıp, ardından ~30-45 dakika boyunca 105V'de çalıştırın) her kuyuda 20uL DNA ve 1X izleme boyası içeren DNA örnekleriyle çalıştırdım. Bu jelin çözünürlüğünün neden bu kadar zayıf olduğunu bilmiyorum. Bunun DNAse aktivitesinden kaynaklandığını varsayıyorum, çünkü laboratuvar teknisyenim muhtemelen öyle olduğunu söyledi. Prosedürle ilgili her şeyi doğru yaptığımdan eminim. Numunelerin jelin çalıştırılmasından bir hafta önce -20C'de hazırlanmış ve saklanmış olması dışında başka hangi bilgileri sağlayabileceğimden emin değilim. Aşağıda jelin bir resmi var.


Teknolojiniz DNA örneklerinize atıfta bulunsa da, merdiveniniz aynı zamanda koşu tekniğinizi geliştirmek için bir miktar yer olduğunu da gösteriyor. Bir hafta boyunca -20C, dondurucuya girmenin kaliteli olduğunu varsayarsak, DNA'nın kalitesini etkilememeliydi. Metal iyonlarını çözeltiden çekecek olan depolama tamponunuza EDTA ekleyerek DNAaz aktivitesini azaltabilirsiniz. Daha sonra metal iyonları gerektiren (PCR gibi) bir reaksiyon yapıyorsanız bunu hesaba kattığınızdan emin olun.

DNA

Önce DNA örneklerine odaklanıyorum. Kontrol edilecek birkaç şey var.

Ne kadar yükledin? 20uL dediğini görüyorum, ama konsantrasyon neydi? Numune olarak kullanılan ng miktarını bilmek daha önemlidir. Çeşitli lekelerin algılayabildikleri farklı konsantrasyonları vardır (EtBr, SYBR, vb.) Uygun miktarda DNA yüklediğinizden emin olmak için kullandığınız lekenin özelliklerini kontrol ederim.

Bunlar PCR ürünleri mi? Eğer öyleyse, PCR'niz kaç döngü çalıştırıldı? Örnekler çok fazla döngü için çalıştırılırsa PCR'den benzer sonuçlar gördüm. Spesifik olmayan ürünler daha sonraki döngülerde üretilmeye başlar ve spesifik ürünlerinizin bozulmasına neden olur. Ayrıca primerlerinizi, uzatma süresini ve kullandığınız polimerazı tekrar kontrol ederim. Bahsettiğiniz 5.8kb ve 6.8kb boyutlarının uzantılarını yapmak daha zor ama imkansız değil.

Bunlar kısıtlama özetleri mi? Sindirilmemiş plazmidi veya başka bir kaynağı gösteren bir kontrol kuyucuğunuz var mı? Sonuçlarda temiz bir bant beklemek için önce kaynağınızın temiz bir bandı olmalıdır. Kaynağınız temiz ve parlaksa ve özet yukarıdaki örneklere benziyorsa, özet tamponunuzu ve enzimlerinizi kontrol edin.

Elektroforez

Bir agaroz jelin kalitesini artırabilecek birkaç şey vardır. Thermofisher, ipuçları ve püf noktaları için bir kılavuz sağlar. Aşağıda kendi deneyimlerimde faydalı bulduğum şeyler var.

  1. Jelin dökülmesi ile çalıştırılması arasındaki süre. Yaygın bir uygulama, jel yapmak ve bunları kullanıma hazır olana kadar TBE/TAE tamponunda saklamaktır. Tecrübelerime göre jelin kalitesi zamanla azalacak ve dağınık bantlar oluşacaktır. En iyi sonuçlar taze dökülmüş ve dökülmüş bir jel ile elde edilir.

  2. Yükleme tekniği. Numunelerin kuyulara dikkatlice yüklenmesi, böylece çevreleyen tamponla karışmadan dibe yakın bir şekilde yerleşmeleri çok önemlidir. En iyi sonuçlar, pipet ucunun kuyunun dibine değmesiyle ve numuneyi serbest bırakırken yavaşça dışarı çekerek elde edilir, böylece numune kendi başına kuyuya yerleşmek zorunda kalmaz.

  3. Yüklemeden hemen sonra çalıştırın ve çalıştırdıktan hemen sonra görüntü. Difüzyon, numuneler kuyuda ne kadar uzun süre oturursa, güzel sıkı bantların zayıflamasına neden olur.

  4. Voltaj, zamanlama ve agaroz konsantrasyonu. Bunları doğru yapmak pratik gerektirir. Jelinizi mümkün olduğunca çabuk çalıştırmayı denemek isteyeceksiniz. Jel içinde ne kadar uzun süre oturursa, o kadar fazla difüzyon meydana gelir. Ancak voltajı çok yüksek tutarsanız jelinizi eritme riskiyle karşı karşıya kalırsınız. Peşinde olduğunuz DNA boyutunu hedeflemek için agaroz konsantrasyonunu değiştirin. Daha önce %0.5 ile %1.5 arasında herhangi bir yerde kullandım.

  5. Jeli presleme mi yoksa post boyama mı? İyi çalışan lekeler için ön boyamayı tercih ederim, çünkü bu, difüzyonun oluşmasına izin vererek numunelerin jel içinde oturma süresini kısaltır.

  6. Merdiveninize ve sağlanan standardın bağlantısına bakıyorum ve hangi grupların hangileri olduğunu söylemek zor. 3.0 kb'lik parça en parlak olarak göze çarpmalıdır, ancak jelinizdeki alt bant en parlak olanıdır. Bu 3.0kb bant mı? Belki. Onaylamak için üstündeki bantların sayısını saymak zor. Değilse, bu, numunelerinizin hiçbirinin jelin sonuna kadar gitmemiş gibi görünmesiyle gösterilebilir, o zaman bu 0,5 kb bant olacaktır. 0,5 kb bant ise, merdiven yoğunluğu beklediğiniz yoğunlukla uyuşmuyor. Hangi boyutlara baktığınızı bilmek için merdiveninizi iki kez kontrol edin.


Bulanık bantlar. - (Tem/07/2012 )

Merhaba,
Bir süredir SDS Sayfaları çalıştırıyorum. Son zamanlarda bazı DNA afinite kromatografi deneyleri yapıyordum ve elüsyonları %16'lık bir jel üzerinde yürütüyordum. Benim özel ilgim daha küçük proteinlerin (yaklaşık 10 - 20 kDa) tanımlanmasıdır. Nedenini bilmiyorum ama görünüşe göre jelimdeki daha küçük proteinler bulanık bantlar olarak görünüyor (ekteki dosyaya bakın) ve bu nedenle daha fazla MALDI analizi için gerçekten sorun yaratıyor.

Alt bantları nasıl sıkıştırabileceğimi bilen var mı? %10'luk bir jel çalıştırıp daha önce çalıştırmayı durdurmak mantıklı olur mu? Bu aslında neden oluyor?

Şimdiden teşekkürler,
Şerefe, Daniel
' href="http://www.protocol-online.org/forums/index.php?app=core&module=attach§ion=attach&attach_rel_module=post&attach_id=4036" target="_blank">

Elüsyon tamponunun tuz içeriğini kontrol ederdim. Tuzu biraz azaltmak için daha düşük bir tuz tamponuna karşı diyaliz yapmayı deneyebilirsiniz.

Selam,
evet .. Bu konuyu daha önce düşünmüştüm . mesele şu ki, bir DNA afinite kromatografisiyle, elüsyon tamponundaki tuz konsantrasyonunu arttırmanız gerekiyor. diyaliz bir seçenek olurdu.. ama daha kolay bir yolu tercih ederdim.

ekli görüntüye gelince (soldan sağa), 100 mM NaCl'den 1 M NaCl'ye.
Gördüğünüz gibi, ilgilendiğim bantlar 100 mM ile 500 mM NaCl arasındadır (en güçlü bant yaklaşık 350, 500 mM ile) .. aslında bu tuz konsantrasyonlarının çalışmayı etkilemeyeceğini varsayıyordum.

. elüsyonun nasıl konsantre edileceğine dair herhangi bir öneriniz var mı? Bir anlamda, sadece 40-50 ul elüsyonunuz varken diyalizi nasıl yapacaksınız?

Özellikle bir log çalışmasından sonra tamponunuzun voltajına ve sıcaklığına bakmanız gerekebileceğini öneririm. Ayrıca, belki de yeni APS ve B-merkaptoetanol kullanarak değiştirmeniz gerekebilir. Böyle şeyler doğru olmadığında bulanık bantlarım vardı.

Adrian K, Paz Tem 8 05:24:08 2012 dedi ki:

Özellikle bir log çalışmasından sonra tamponunuzun voltajına ve sıcaklığına bakmanız gerekebileceğini öneririm. Ayrıca, belki de yeni APS ve B-merkaptoetanol kullanarak değiştirmeniz gerekebilir. Böyle şeyler doğru olmadığında bulanık bantlarım vardı.

Serum numunelerini çalıştırdığımda 3kDa amicon filtreleri kullanmayı seviyorum, bunlar muhtemelen uygulamanızla iyi çalışır. Bu filtreleri 50 uL ila 400 uL arasındaki numunelerde kullandım.

Ayrıca, paylaştığın resimden tam olarak anlayamadım ama istifleme jeli mi kullanıyorsun? Bu kesinlikle çözünürlüğü artırmaya yardımcı olabilir.

proteaMatt 9 Tem 12:41:36 2012 tarihinde dedi ki:

Serum numunelerini çalıştırdığımda 3kDa amicon filtreleri kullanmayı seviyorum, bunlar muhtemelen uygulamanızla iyi sonuç verir. Bu filtreleri 50 uL ila 400 uL arasındaki numunelerde kullandım.

Ayrıca, paylaştığın resimden tam olarak anlayamadım ama istifleme jeli mi kullanıyorsun? Bu kesinlikle çözünürlüğü artırmaya yardımcı olabilir.

Merhaba, Cevabınız için teşekkürler! Filtre fikri kulağa çok hoş geliyor.. umarım çok pahalı değildirler. . Ve evet, istifleme jelim var ama boyamaya başlamadan önce onu kesip atın.

damla diyaliz ile tuzu giderebilirsiniz

düşük mw proteinlerin ve peptitlerin çözünürlüğü, tris-glisin-sds jelleri ile yüksek akrilamid yüzdesiyle bile genellikle zayıftır. %10 tris-trisin-sds jel (shagger ve von jagow) ile ilgilendiğiniz proteinlerin olağanüstü çözünürlüğünü elde edebilirsiniz.

mdfenko 9 Tem 16:30:18 2012 tarihinde dedi ki:

damla diyaliz ile tuzdan arındırabilirsiniz

düşük mw proteinlerin ve peptitlerin çözünürlüğü, tris-glisin-sds jelleri ile yüksek akrilamid yüzdesiyle bile genellikle zayıftır. %10 tris-trisin-sds jel (shagger ve von jagow) ile ilgilendiğiniz proteinlerin olağanüstü çözünürlüğünü elde edebilirsiniz.

Merhaba, Cevabınız için teşekkürler .. Bunu yarın deneyebilirim .. jeli ve tamponu hazırlamak için bir protokolünüz olma ihtimali var mı? Bu jelleri herhangi bir sistemle çalıştırabilir miyim? Bu ifadeyi bulduğumdan beri:

Tris-Tricine-SDS (TTS) çalışan tampon, katot (üst rezervuar) tamponudur

Biraz kafam karıştı .. üst rezervuar ne anlama geliyor? Bunun için özel bir sisteme mi ihtiyacım var .. anot tamponuna da ihtiyacım var mı?

EDIT: Sanırım üst rezervuar cam plakalar arasındaki düzeneğin bir parçası ve alt rezervuar bütün depo mu?


Mikroskoplar büyütür ve daha fazla ayrıntı gösterir

Mikroskopların nasıl çalıştığı hakkında konuştuğumuzda, genellikle onların şeyleri daha büyük gösterdiklerini, yani onları büyüttüklerini söyleriz. Mikroskopta gördüklerimizi aynı şekilde tanımlarız, örneğin baktığımız ölü sineğin 200 kat büyütülmüş olduğunu söyleyebiliriz. Bu, gördüklerimizi anlamlandırmamıza yardımcı olur. Ayrıca fotoğraflarımıza veya çizimlerimize bakan diğer kişilerin de neye baktıklarını anlamalarına yardımcı olur. Bu nedenle bilimsel dergilerde yayınlanan tüm mikrograflar büyütmenin derecesini belirtmelidir.

Ancak, işleri büyütmek hikayenin sadece bir parçası. Mikroskoplar zaten görebildiğimiz şeyi büyütmekten başka bir şey yapmasaydı, pek bir faydası olmazdı! Bunun yerine, mikroskoplar görebildiğimiz ayrıntı miktarını arttırır. Görebildiğimiz ayrıntı düzeyi için başka bir kelime de 'çözünürlük'tür.

Bir şeyi büyütmekle görünen ayrıntıyı artırmak arasındaki farkı anlamak için harakke'nin bu dijital fotoğrafına bakın.


PCR ürünü: klon mu, yoksa doğrudan dizileme mi?

Doğrudan dizileme ile klonlanmış ürünle bu bilgilerin yakalanmasını sağlamak için 7-8 klon, bu tür heterozigotluk genellikle çevreleyen tepe noktalarının kabaca ½ kadar yüksek olan iki örtüşen tepe noktası olarak görünür olacaktır. Bununla birlikte, bazen veriler klonlama olmadan elde edilemez. Daha fazla bilgi için bu web sitesindeki "Diğer bilgiler 'altın madenleri' mi?

a) Tek ürün: Numune bir agaroz jel içinde temiz, tek bir bant olarak çalıştığında (parça boyutuna bağlı olarak tipik olarak %0,8 - 3,0) saflaştırılmış PCR ürününün (ticari kolonlar, standart etanol çökeltme veya ExoSap ile) doğrudan sıralamasını deneyin.

B) Çoklu bantlar: Numune bir agaroz jeldeki diğer bantlar arasında temiz bir bant olarak çalıştığında, jelle saflaştırılmış PCR ürününün doğrudan sıralanmasını deneyin.

C) 'Tek taban' bölgeleri: Dizinizin saf bir poli-'tek tabanlı' bölge (>8-10 baz) içerdiğini biliyorsanız, ya ürünü klonlayın ya da her iki yönde doğrudan dizilemeyi deneyin. (Orijinal PCR sırasında iplik kayması nedeniyle, dizi verileri saf baz bölgesinden sonra okunamaz hale gelir.)

NS) Plazmitlerle git: Saflaştırılmış plazmid DNA ile, saf poli-“tek-bazlı” bölgelerin uzantıları (örn. Tam PCR ürününü yeniden oluşturmak için her iki okumadan bir contig oluşturabileceğiniz için hem ileri hem de geri yönde temiz bir okuma elde edebilirsiniz.

    Primer-Dimerler: Tipik olarak, primer-dimerler

70-bp olarak adlandırılan tabana okunabilir ve gerçek pikleri karartabilir. Daha uzun okumaların söz konusu olduğu durumlarda, son derece yüksek UDT seviyelerine (temizleme sonrası) sahip numuneler, dizide daha sonra ek UDT tepe noktalarına sahip olacaktır (

İlk olarak, aynı büyüklükteki parçaların çoğunluğu temelde bir jel içinde bir bant olarak birlikte göç etse de, numunedeki tüm boyutlardaki parçalar aslında jel şeridi boyunca mevcuttur. Bu nedenle, en iyi koşullar altında bile jelle saflaştırılmış ürünler tamamen saf olmayacaktır (bu "en iyi" durumlarda safsızlıklar aslında önemli olmasa da). Ancak burada, iyi bant ayrımının olmaması durumu daha da kötüleştirir ve jel ile saflaştırılmış bir numunede bile yüksek düzeyde hedef olmayan şablonların olması muhtemeldir. düşük kaliteli okumalara neden olur.

PCR Primer Titrasyonları: Çok basit bir yaklaşım, seri olarak seyreltilmiş primerler kullanılarak bir dizi test reaksiyonu çalıştırılır. Bu primer titrasyonu yaklaşımı, primerler dimerizasyonu destekleyen çok zayıf bir tasarım olmadıkça, primer dimerleri (primerlerin birbiriyle temas etme olasılığını en aza indirerek) ortadan kaldırması muhtemeldir. Ayrıca, primerler, hedeflerle olduğu kadar hedef olmayanlarla da eşleşmedikçe, hedef dışı hazırlamayı en aza indirecek veya ortadan kaldıracaktır. Böylece, primer konsantrasyonları düştükçe, hedef bant daha da zayıflayacak olsa da, bunu primer-dimerler veya spesifik olmayan ürünler için meydana gelecek olandan daha yavaş yapacaktır.

İdeal olarak, bir noktada hedef bant (kullanarak

Jel kuyusunda 3-5 ul) belirgin bir şekilde görünür olacaktır (ancak çok parlak değildir) ve görünür herhangi bir primer-dimer veya diğer spesifik olmayan ürünler olmayacaktır. Bu durumda, bu PCR ürünlerini saflaştırın ve ardından DNA dizilimi gerçekleştirmek için orijinal PCR ürünlerinin 3-5 ul eşdeğerini kullanın.

  • Artık primerler: Temizlenmiş PCR ürünleri bile, kalan primerlerin dengelenmesine yardımcı olmak için orijinal reaksiyondan kalan primerler içerebilir, 10-20 uM'de (vs. 2-5 uM) 1 ul sıralama primeri kullanın.
  • Büyük Boya: Normal BigDye seviyeleri (örneğin, 10 ul'lik bir reaksiyonda 0,5 ul), çok kısa şablonlarda iki soruna neden olabilir.
    >> İlk olarak, çok kısa şablonlar, uzun ürünler kadar boya sonlandırıcıları tüketmez. Bu nedenle, tamamlanan reaksiyonları temizlerken, çok fazla UDT kaldığı için yeterince UDT'yi çıkarmak zor olabilir.
    >> İkincisi, hedef çok kısaysa, standart BigDye miktarı aşırı sinyal yoğunluğu oluşturabilir çünkü polimeraz hızla ek şablonlara geçebilir. Aşırı sinyal, temel arama ile ilgili sorunlara neden olabilir.
    >> Açıkçası, 0,1 ul kadar küçük bir BigDye bile daha kısa ürünler için kabul edilebilir sinyal yoğunlukları üretebilir.

Doğrudan genomik DNA'yı sıralayabilir miyim?

4 kb vektör şablonu, düşük de olsa kabul edilebilir bir sinyal üretecek minimum giriş,

20-25 ng. ve daha güçlü sinyal, en az 50-100 ng DNA gerektirir. Bu nedenle, organizmanın genomu yalnızca 25X daha büyük olsaydı (yani 100 kb), dizileme için yeterli kopyaya sahip olmak için en az 500 ng DNA'ya ihtiyacınız olurdu. Bununla birlikte, Mycoplasma'nın genomları bile 1000 kb'yi aşmaktadır, bu da 5 ug DNA girişi mertebesinde gerektirecektir. Sıralama reaksiyonunun 5 ug DNA mevcut olduğunda işlev görmesi pek olası değildir. diğer birçok organizma için gerekli olacak miligram DNA girdisini bırakın.

Daha iyi klonlama sonuçları nasıl elde edilir?

Aşağıdaki durumlarda hem "örneklemeden örneğe" hem de "deneyden deneye" tutarlılığı iyileştirilir:

a) Varyasyonu en aza indirin: bakteri üreme periyodlarını ve işlenmiş hacimleri tutarlı tutun.
B) Büyüme süresini en aza indirin: daha kaliteli DNA ve daha iyi sıralama sonuçları verir.

37 o C'de gecelik büyüme (yani,

14 saat) ticari saflaştırma kolonlarının kapasitesini 'bastıracak' kadar çok hücreli kültürler üretebilir. Ayrıca, genomik DNA'nın tamamının sağlam olmadığı ve hücre duvarına konjuge olmadığı geç log fazı/erken durağan fazda olan hücrelerle sonuçlanır.

Buna karşılık, 30°C'de gece boyunca büyüme veya 37°C'de sınırlı büyüme (yani, 5-8 saat), 37°C'de standart bir gecelik büyümeye göre minipreplerden daha kaliteli DNA üretme eğilimindedir. miniprep boyutundaki sütunlar yerine 'midi' hazırlıklar tarafından saflaştırılır.

Çoklu sinyallerden nasıl kaçınılır?

En yaygın olarak, dizi verilerinizdeki birden çok sinyal, dizileme reaksiyonunda birden çok şablonun varlığından ortaya çıkacaktır (ancak bazen dizileme primeri şablon üzerinde birden fazla uygun konum bulacaktır). Ayrıca bkz. PCR durdurulduktan sonra düşük seviyeli sinyale neden olan nedir? başka bir olasılık için.

a) klonlanmış DNA: Aynı hücre içinde bir vektörün (farklı ekler içeren) birden çok kopyası var ya da temiz, tek bir koloni seçemediniz. İnsertler farklı boyutlarda olduğunda, klonlanmış DNA'yı standart PCR ile test ederek her iki problemden de kaçınılabilir.

Temiz bir koloni toplama şansınız, kolonileri sadece görünür olacak kadar büyük olduklarında ve böylece hala iyi ayrılmış olduklarında toplayarak artar. Ayrıca, kolonileri düşük güç kapsamı altında incelemek, görünen bir koloninin aslında iki bitişik hücre tarafından oluşturulduğu durumları ortaya çıkaracaktır (koloni şekli dairesel değil 'aptal çan' gibi olacaktır). Kolonileri erken toplamak, uydu kolonilerin (yani, ekteki antibiyotiğe dirençli genden yoksun olanlar) 'gerçek' kolonilerin yanında büyümesi için yeterli zamanın olmamasını da sağlar. Tipik olarak, antibiyotik bakterilerin büyümesini engeller, bu nedenle, antibiyotiğe dirençli koloniler, antibiyotiği nötralize eden bileşikleri (plakalarda veya et suyunda) sızdırmaya başladığında, uydu kolonilerdeki bakteriler büyümeye başlayacak ve bu şekilde ekleri olacaktır. DNA ekstrakte edildiğinde de hasat edilebilir. Dizileme vektör primerleri ile yapılırsa, ekleme primerleri ile yapılırsa çift sinyal olacaktır, sinyal beklenenden daha zayıf olabilir.

B) PCR ürünleri: Tipik olarak, bir reaksiyonda birden fazla PCR ürününün varlığı basit bir agaroz jel deneyinden anlaşılır, bu durumda en azından DNA'yı jelle saflaştırmanız gerekir. Bununla birlikte, bazen tek bir temiz bant bile aslında birden fazla PCR ürününden oluşur (ki bunu dizileme yoluyla keşfedeceksiniz), önce DNA'yı klonlamanız gerekir.

C) Primer sorunu: Primeriniz 5' ucunda bozulduysa veya "n-1" (veya daha fazla) nts ile üretildiyse (primerlerin sentezlenme şekli nedeniyle primerin 5' ucundaki nt'leri atlar), DNA sıralayıcı üzerinde 'çerçeve kaydırılacak' şablonlar üretecektir.

Dizileme için PCR ürünlerini temizlemek gerekli midir?

Bir dizileme reaksiyonunu durdurabilecek olası kontaminantları ortadan kaldırmanın yanı sıra, PCR ürününü temizlemenin amacı, orijinal primerleri ve diğer PCR reaktiflerini çıkarmaktır. İdeal olarak, temizlenmiş şablonlar düşük TE tamponunda (örn., TVLE, 10 mM Tris, 0,05 mM EDTA pH 8) yeniden süspanse edilmelidir, alternatif olarak, nükleaz içermeyen suda yeniden süspanse edilebilirler ve bununla birlikte, Primer yeniden süspansiyon tamponu seçimi bölümünde belirtilen sorunlar ? şablonlar için de geçerlidir.

Bununla birlikte, PCR ürünlerinin saflaştırılması şiddetle tavsiye edilirken, gerekli olmayabilir. Örneğin, PCR ürünü yeterince seyreltilmişse, dizileme, önce PCR ürününü temizlemeden başarılı olabilir. Orijinal PCR primerlerinin, fark edilir düzeyde sekanslanmış ürün üretmeyecekleri noktaya kadar seyreltilmeleri özellikle önemlidir, aksi takdirde orijinal primerler sinyale parazit verecektir. Gerekli seyreltme seviyesinin belirlenmesi ampirik bir süreçtir. PCR ürününü seyreltmeye ek olarak, orijinal PCR reaktiflerini ortadan kaldırmak için kitler (örn. ExoSAP-IT&trade) kullanabilirsiniz. Her iki yaklaşım da Genomik Tesisine gönderilen örneklerde başarıyla kullanılmıştır, ancak uygun dikkatle kullanılmalıdır.

Dizileme için DNA şablonları nasıl temizlenir?

a) PCR ürünleri: Sağlam bir reaksiyon varsayarsak, standart bir etanol çökeltme (ucuz yöntem) genellikle artık primerleri ve primer dimerleri ortadan kaldırmak için mükemmel bir iş çıkarır, ancak sodyum asetat kullanmayın. dizileme reaksiyonlarınızda (hem ileri hem de geri primerlerin varlığından dolayı) birden fazla sinyal oluşturmak için yeterince yüksek konsantrasyonlarda tüketilmeyen primerleri birlikte çökeltmesi muhtemeldir. Daha iyi bir seçenek, Templates_EtOH-EDTA_Preciptation.docx (96 kuyulu plakalar için) veya Sequencing-Templates EtOH-EDTA Preciptation.docx (1.5 ml tüpler için) bölümünde açıklandığı gibi 70-150 mM EDTA (Genomik Tesisinden temin edilebilir) kullanmaktır. .

Bununla birlikte, bazı primerlerin, bu tür primerler için standart EtOH-EDTA protokolü tarafından çıkarılmaya özellikle dirençli olduğunu lütfen unutmayın; Genomik Tesisi, primerleri ve primer-dimerleri etkin bir şekilde aşağıdaki seviyelere çıkaran 'tescilli' modifiye EtOH-EDTA protokolü geliştirmiştir. sıralama reaksiyonunun kayda değer bir sonucu yoktur. Bu 'tescilli' yöntemden yararlanmak için lütfen Genomik Tesisi ile uygun çevrimiçi başvuruyu yapın.

B) plazmitler: Ticari sütunlar, sıralama için en iyi şablonu verir. Ev yapımı bir teknik kullanıyorsanız, lütfen web sitesindeki “Plasmid Prep” belgesine bakın.

C) DNA Temizleme ve Yoğunlaştırıcı-5 Kiti (Genesee Scientific [Zymo Research ürünü] tarafından dağıtılmaktadır): Kolon teknolojilerini tercih edenler için bu, hem DNA örneklerini iyi temizleme işini yapan hem de çok küçük hacimlerde (>6µl) elüsyona izin veren mükemmel bir üründür. Her zamanki gibi, aşağı akış uygulamalarına müdahale etmeden pH sorunları veya küçük DNAz kontaminasyonu ile ilgili herhangi bir sorundan kaçınmak için TVLE'de elüsyon yapılmasını öneririz (bkz. Primer yeniden süspansiyon tamponu seçimi?). Zymo, 50 bp ila 10 kb arasında değişen DNA için geri kazanımın %70-95 olduğunu belirtir, kolonun primerlerin çoğunu (tipik olarak

18-25 bp oligo) &mdash, ancak bazı durumlarda, yeterli primer kaldırma elde etmek için Boyut Seçin Sütunlarını (D4080) kullanmanız gerekebilir. özellikle primer-dimerler bir sorunsa. Laboratuvarınız için kolonlar satın alabilir veya örneklerin Genomics Facility tarafından işlenmesini sağlayabilirsiniz.

NS) Ticari sütunlarla ilgili notlar: Öncelikle, primerleri ve primer-dimerleri çıkarmak için bir kolon kullanıyorsanız, lütfen ürün özelliklerini çok dikkatli bir şekilde okuyun. bazı kitler, sıralama için problemler yaratmak için yeterli miktarda primer tutar. İkincisi, birçok protokol, yıkama etanolünün eklenmesinden sonra 5 dakikalık bir dönüşle sona erer, ancak kolonun altındaki etanol buhar basıncı, bir miktar etanolün filtreden dışarı dönmesini önler. Böylece, yıkama etanolünü (1 dakika) döndürün, etanol ve blot toplama tüplerini bir Kimwipe üzerine boşaltın ve son bir döndürme (5 dakika) ile bitirin.

Bir dizileme reaksiyonunda ne kadar DNA kullanılır?

En yaygın sıralama hatası, çok fazla DNA (hacim veya miktar) kullanmaktır.

(1) Ses: daha yüksek hacimler, karışıma 'reaksiyon öldürücü' kirleticilerin dahil olma potansiyelini artırır.

(2) Miktar: aşırı başlangıç ​​şablonunun iki sinerjik etkisi vardır, bu da dizi okuma uzunluğunun önemli ölçüde azalmasına neden olabilir: (a) BigDye reaktifleri çok küçük parçalar oluşturarak tükenir ve (b) aşırı miktarda küçük parçalar dizileyici üzerindeki kılcal damarı tıkayarak daha uzun parçaların enjeksiyonu.

En yaygın olarak, araştırmacılar DNA örneklerinin konsantrasyonunu belirlemek için standart bir spektrofotometre kullanacaklardır. Gerçekten vicdanlıysalar, Nanodrop gibi özel bir spektrofotometre kullanacaklardır. Ancak, bu araçların bu tür çalışmalar için önemli sınırlamaları olduğunu (bkz.

Her durumda, protokolleriniz dizileme için tutarlı bir şekilde uygun DNA konsantrasyonları oluşturmadıkça, DNA şablonlarınızı dizilemeden önce uygun şekilde nicelleştirmek için adımlar atarak zamandan ve paradan tasarruf edeceksiniz. Sonuç olarak, optimum DNA kütlesini kullanmak için dizileme reaksiyonuna kaç ve mikrol şablonun ekleneceğini belirlemek için DNA konsantrasyonu tahminlerini kullanacaksınız.

  • Spektrofotometreler Neden "Kötü" ve bunun yerine ne yapılmalı? bölümünde tartışıldığı gibi, plazmit numunelerinin en azından bir kısmının bir agaroz jel üzerinde çalıştırılması tavsiye edilir.
  • Aksi takdirde, rastgele bir saflaştırılmış şablon numunesi üzerinde A260/A280 okumaları almak ve DNA'yı buna göre seyreltmek genellikle yeterlidir. Yine de, okumalar nispeten tutarlı değilse, tüm şablonları işleyin, daha sonra gelecekteki örnekler için bkz. Daha iyi klonlama sonuçları nasıl elde edilir? değişken verimlerin oluşumunu en aza indirmek için.
  • Son olarak, numuneleriniz çok konsantre olmadıkça, düşük hacimli bir spektrofotometreden daha güvenilir sonuçlar elde edeceksiniz. Nanodroplar bu konuda özellikle yararlı olabilir ve ayrıca kirletici tuzların varlığına ilişkin bazı ipuçları da sağlar (Nanodrop ipuçları.pdf'de tartışıldığı gibi absorbans grafiğinde) ayrıca Nanodrop Nucleic Acid Guide.pdf'ye bakın.

ben) Seçenek A . ucuz: Geçerli bir A260 okuması (yanlış okumanızı çıkararak) için yeterli PCR ürününü saflaştırın ve temiz %2 jel içinde 1 ng'ye kadar seri seyreltme referans fotoğrafı yapın. Etidyum bromür ile 1 ng şeridi görünür bir bant göstermemelidir, ancak 3-5 ng DNA ile son derece soluk bir bant görünmelidir. Gerekli seyreltmeleri tahmin etmek için ürünleri referans fotoğrafla karşılaştırın.

ii) Seçenek B. pahalı: Temizlenmiş PCR ürününüzü, dsDNA'da araya giren bir boyaya dayanan bir aletle ölçün. Örneğin, Agilent Bioanalyzer'ı (konsantrasyon, boyut dağılımı ve numune bütünlüğü) veya Qubit'i (yalnızca konsantrasyon) kullanabilirsiniz. Her iki platformun da farklı uygulamalar için birkaç farklı kiti vardır, her ikisinin de artıları ve eksileri vardır. Ne yazık ki, çok sayıda numuneyi doğru bir şekilde nicelleştirmeniz gerekiyorsa her iki seçenek de pahalıdır.

iii) C seçeneği. ucuz: 1 & mikrol & 3 & mikrol numunenin eşdeğerini (saflaştırılmış veya ham) temiz bir %2 jelde (etidyum bromür ile boyanmış) çalıştırın, örneğin, her bir şablondan 5 & mikrol 20 µl yükleme boyası ile karıştırın (TVLE ile %20'ye seyreltilmiş) ) ve ardından her numune için bitişik kuyucuklarda 5'e karşı 15 & mikrol elektroforez. Ham (yani saflaştırılmamış) PCR ürünleri çalıştırıyorsanız, DNA'nızı bir kolondan ayrıştırmak için (veya etanol çökeltmesi yapıyorsanız yeniden süspansiyon için) hacimleri belirlemek için sonuçları kullanın.

Kriterler: 1-µl bandı zar zor görünüyorsa ve 3-µl bandı soluksa (ancak belirginse), sıralama reaksiyonunda 1-3 µl DNA kullanın. Buna karşılık, yalnızca 3 µl bandı görünüyorsa >3 µl şablonunu kullanın veya 1 µl bandı parlaksa şablonunuzun bir seyreltmesini kullanın.

Bu Zayıf-Güçlü PCR ürünleri.jpg örneğinde, şablonların tümü bir sıralama reaksiyonunda 1-3 & mikrol ile kullanım için uygun olabilir. Bununla birlikte, 'A' çok parlak hale geliyor 'B' mükemmel 'C' biraz zayıflıyor 'D' aşırı derecede zayıf (özellikle 1 kb'lik bir ürün için,

Eşdeğer kopya sayısı için 500 bp'lik bir üründen 2 kat daha parlak) ve en az 6 ul kullanılmalı ve hatta

'E' için 450 baz puanlık ürün,

6 µl şablon kullanıldı. Fotoğrafta, bant boyutları Biorad EZ Load 100 bp Molecular Ruler'a (#1708352) atıfta bulunulmaktadır.

Buna karşılık, bu Strong PCR ürünleri.jpg örneğinde, 1-3 & mikrol DNA kullanan dizileme reaksiyonları tüm numuneler için uygun olacaktır. Yine de, 'A' gibi örnekler 1-3 ve mikrol kullanmak için mükemmel olsa da, 'B' gibi örnekler çok parlak olmaya başlıyor ve kullanmayı düşünebilirsiniz.

Bu tür numuneler için 3 & mikrol yerine 1 & mikrol. Fotoğrafta, bant boyutları Biorad EZ Load 100 bp Molecular Ruler'a (#1708352) atıfta bulunulmaktadır.

Spektrofotometreler neden "Kötü" ve bunun yerine ne yapılmalı?

Peki. yani "Kötü" dramatik bir abartı. Bununla birlikte, DNA ile ilgili olarak, standart spektrofotometrelerin bazı önemli sınırlamaları vardır:

  1. PCR ürünleri ve Plazmitler: Numunenin jel üzerine aşırı yüklenmemesi çok önemlidir, aksi takdirde birden fazla ürünün (neredeyse aynı boyutta) varlığı aşırı geniş ve parlak bantlarla maskelenebilir.
  2. PCR ürünleri: uygun konsantrasyondaki jellerde doğrudan çalıştırılabilir (parça boyutuna göre).
  3. plazmitler: ideal olarak, bunlar sarmal ve süper sarmal formları ortadan kaldırmak için önce doğrusallaştırılmalıdır.
    • Kısıtlama enzim(ler)i, vektörü bir kez (tek, uzun bir parça oluşturarak) veya iki kez (vektörden eki serbest bırakmak için) kesmek için kullanılabilir, her iki yöntemin de avantajları olabilir.
    • Bir plazmidin lineerleştirilmesi bazen daha iyi sıralama sonuçları elde etmek için de yardımcı olabilir, elbette, kısıtlama bölgesi istenen okuma içinde veya istenen okuma ile primer site arasında olamaz!

260/230 ve 260/280 OD oranları nasıl yorumlanır?

DNA'yı ölçmek için bir Nanodrop kullanmalı mıyım?

220-300 nM, Nanodrop aslında ücretsiz olarak faydalı bilgiler sağlayabilir. Ancak, ek ayrıntılar için bir Nanodrop'tan okumaları kötü bir şekilde çarpıtabilecek çeşitli faktörlerin farkında olunmalıdır, lütfen Nanodrop ipuçları.pdf ve Nanodrop Nucleic Acid Guide.pdf'ye bakın.

Nükleik Asitler için Nanodrop Kılavuzu?

Nanodrop Nucleic Acid Guide.pdf, Thermo Scientific NanoDrop 2000/2000c, 8000 ve 1000 spektrofotometrelerle ilgili nükleik asit ölçümü destek bilgileri sağlar. Cihaz ve yazılım özellikleriyle ilgili daha ayrıntılı bilgi için lütfen modele özel kullanıcı kılavuzuna bakın.

Patentli NanoDrop™ numune tutma sistemi, 0,5 μL ila 2 μL numuneleri iki optik fiber arasında yerinde tutmak için yüzey gerilimi kullanır. Bu teknolojiyi kullanan NanoDrop spektrofotometreler, standart 1 cm küvet kullanılarak ölçülen numunelerden 50 ila 200 kat daha konsantre numuneleri ölçme kabiliyetine sahiptir.

Protein için Nanodrop Kılavuzu?

Nanodrop Protein Guide.pdf, Thermo Scientific NanoDrop 2000/2000c, 8000 ve 1000 spektrofotometrelerle ilgili doğrudan A280 yöntemleri için bazı temel protein ölçüm destek bilgilerini sağlamayı amaçlamaktadır. Cihaz ve yazılım özellikleriyle ilgili daha ayrıntılı bilgi için lütfen modele özel kullanıcı kılavuzuna bakın.

Patentli NanoDrop™ numune tutma sistemi, 0,5 μL ila 2 μL numuneleri iki optik fiber arasında yerinde tutmak için yüzey gerilimi kullanır. Bu teknolojiyi kullanan NanoDrop spektrofotometreler, standart 1 cm küvet kullanılarak ölçülen numunelerden 50 ila 200 kat daha konsantre numuneleri ölçme kabiliyetine sahiptir. Protein A280 yöntemi, Trp, Tyr kalıntıları veya Cys-Cys disülfid bağları içeren ve 280 nm'de absorbans sergileyen saflaştırılmış proteinlere uygulanabilir. Bu yöntem, standart bir eğri oluşturulmasını gerektirmez ve yazılım başlangıcında protein numunesi miktar tayini için hazırdır. BCA, Pierce 660 nm, Bradford ve Lowry gibi kolorimetrik testler, standart eğriler gerektirir ve daha yaygın olarak karakterize edilmemiş protein çözeltileri ve hücre lizatları için kullanılır.


Resim 3

50, 51, 52, 53, 54 ve 55 kuyularındaki DNA bozulur. Kuyu 59'daki DNA konsantrasyonu çok yüksektir, bu nedenle kuyudan çıkamaz. 56, 59,60, 61 ve 62 numaralı kuyulardan tarak düzgün bir şekilde çıkarılmamıştır. DNA örnekleri, proteinlerin yanı sıra RNA'larla (59 ila 62) yüksek oranda kontamine olmuştur.


İçindekiler

2-D elektroforez, birinci boyutta elektroforez ile başlar ve daha sonra ikinci boyutta bir elektroferogram oluşturmak için molekülleri birinciden dik olarak ayırır. Birinci boyutta elektroforezde moleküller izoelektrik noktalarına göre lineer olarak ayrılır. İkinci boyutta, moleküller daha sonra moleküler kütleye göre birinci elektroferogramdan 90 derecede ayrılır. İki molekülün iki farklı özellikte benzer olması pek olası olmadığından, moleküller 2-D elektroforezde 1-D elektroforezden daha etkili bir şekilde ayrılır.

The two dimensions that proteins are separated into using this technique can be isoelectric point, protein complex mass in the native state, or protein mass.

Separation of the proteins by isoelectric point is called isoelectric focusing (IEF). Thereby, a pH gradient is applied to a gel and an electric potential is applied across the gel, making one end more positive than the other. At all pH values other than their isoelectric point, proteins will be charged. If they are positively charged, they will be pulled towards the more negative end of the gel and if they are negatively charged they will be pulled to the more positive end of the gel. The proteins applied in the first dimension will move along the gel and will accumulate at their isoelectric point that is, the point at which the overall charge on the protein is 0 (a neutral charge).

For the analysis of the functioning of proteins in a cell, the knowledge of their cooperation is essential. Most often proteins act together in complexes to be fully functional. The analysis of this sub organelle organisation of the cell requires techniques conserving the native state of the protein complexes. In native polyacrylamide gel electrophoresis (native PAGE), proteins remain in their native state and are separated in the electric field following their mass and the mass of their complexes respectively. To obtain a separation by size and not by net charge, as in IEF, an additional charge is transferred to the proteins by the use of Coomassie Brilliant Blue or lithium dodecyl sulfate. After completion of the first dimension the complexes are destroyed by applying the denaturing SDS-PAGE in the second dimension, where the proteins of which the complexes are composed of are separated by their mass.

Before separating the proteins by mass, they are treated with sodium dodecyl sulfate (SDS) along with other reagents (SDS-PAGE in 1-D). This denatures the proteins (that is, it unfolds them into long, straight molecules) and binds a number of SDS molecules roughly proportional to the protein's length. Because a protein's length (when unfolded) is roughly proportional to its mass, this is equivalent to saying that it attaches a number of SDS molecules roughly proportional to the protein's mass. Since the SDS molecules are negatively charged, the result of this is that all of the proteins will have approximately the same mass-to-charge ratio as each other. In addition, proteins will not migrate when they have no charge (a result of the isoelectric focusing step) therefore the coating of the protein in SDS (negatively charged) allows migration of the proteins in the second dimension (SDS-PAGE, it is not compatible for use in the first dimension as it is charged and a nonionic or zwitterionic detergent needs to be used). In the second dimension, an electric potential is again applied, but at a 90 degree angle from the first field. The proteins will be attracted to the more positive side of the gel (because SDS is negatively charged) proportionally to their mass-to-charge ratio. As previously explained, this ratio will be nearly the same for all proteins. The proteins' progress will be slowed by frictional forces. The gel therefore acts like a molecular sieve when the current is applied, separating the proteins on the basis of their molecular weight with larger proteins being retained higher in the gel and smaller proteins being able to pass through the sieve and reach lower regions of the gel.

The result of this is a gel with proteins spread out on its surface. These proteins can then be detected by a variety of means, but the most commonly used stains are silver and Coomassie Brilliant Blue staining. In the former case, a silver colloid is applied to the gel. The silver binds to cysteine groups within the protein. The silver is darkened by exposure to ultra-violet light. The amount of silver can be related to the darkness, and therefore the amount of protein at a given location on the gel. This measurement can only give approximate amounts, but is adequate for most purposes. Silver staining is 100x more sensitive than Coomassie Brilliant Blue with a 40-fold range of linearity. [3]

Molecules other than proteins can be separated by 2D electrophoresis. In supercoiling assays, coiled DNA is separated in the first dimension and denatured by a DNA intercalator (such as ethidium bromide or the less carcinogenic chloroquine) in the second. This is comparable to the combination of native PAGE /SDS-PAGE in protein separation.

IPG-DALT Edit

A common technique is to use an Immobilized pH gradient (IPG) in the first dimension. This technique is referred to as IPG-DALT. The sample is first separated onto IPG gel (which is commercially available) then the gel is cut into slices for each sample which is then equilibrated in SDS-mercaptoethanol and applied to an SDS-PAGE gel for resolution in the second dimension. Typically IPG-DALT is not used for quantification of proteins due to the loss of low molecular weight components during the transfer to the SDS-PAGE gel. [4]


  • Magnification is the ability to make small objects seem larger, such as making a microscopic organism visible.
  • Resolution is the ability to distinguish two objects from each other.
  • Light microscopy has limits to both its resolution and its magnification.
  • airy disks: In optics, the Airy disk (or Airy disc) and Airy pattern are descriptions of the best-focused spot of light that a perfect lens with a circular aperture can make, limited by the diffraction of light.
  • diffraction: the breaking up of an electromagnetic wave as it passes a geometric structure (e.g., a slit), followed by reconstruction of the wave by interference

Magnification is the process of enlarging something only in appearance, not in physical size. This enlargement is quantified by a calculated number also called &ldquomagnification. &rdquo The term magnification is often confused with the term &ldquoresolution,&rdquo which describes the ability of an imaging system to show detail in the object that is being imaged. While high magnification without high resolution may make very small microbes visible, it will not allow the observer to distinguisharasında microbes or sub-cellular parts of a microbe. In reality, therefore, microbiologists depend more on resolution, as they want to be able to determine differences between microbes or parts of microbes. However, to be able to distinguish between two objects under a microscope, a viewer must first magnify to a point at which resolution becomes relevant.

Resolution depends on the distance between two distinguishable radiating points. A microscopic imaging system may have many individual components, including a lens and recording and display components. Each of these contributes to the optical resolution of the system, as will the environment in which the imaging is performed. Real optical systems are complex, and practical difficulties often increase the distance between distinguishable point sources.

At very high magnifications with transmitted light, point objects are seen as fuzzy discs surrounded by diffraction rings. These are called Airy disks. The resolving power of a microscope is taken as the ability to distinguish between two closely spaced Airy disks (or, in other words, the ability of the microscope to distinctly reveal adjacent structural detail). It is this effect of diffraction that limits a microscope&rsquos ability to resolve fine details. The extent and magnitude of the diffraction patterns are affected by the wavelength of light (&lambda), the refractive materials used to manufacture the objective lens, and the numerical aperture (NA) of the objective lens. There is therefore a finite limit beyond which it is impossible to resolve separate points in the objective field. This is known as the diffraction limit.


Estimate apparent molecular mass for unknowns

Relative mobility should be calculated for each band of interest and the standard curve used to estimate apparent molecular mass. Because the relationship between mass and Rf is logarithmic, one should interpolate the standard curve data rather than use a trendline that may miss some of the data points. It is especially important to avoid extrapolating the standard curve, since even the logarithmic relationship begins to break down in the top 20% or so of a gel. One can report the mass of an unknown to exceed that of the highest mass standard, but cannot estimate a molecular mass for an unknown with Rf smaller than that of any of the standards. For example, if the Rf for the myosin standard (205 kDa) was 0.18 and the Rf for unknown 1 was 0.15, one reports that unknown 1 had apparent molecular mass > 205 kDa.

Consider resolution in the appropriate region of a gel and thickness of the band of interest when determining significant figures with which to report a mass estimate. For example, suppose the distance between 97,000 and 116,000 kDa standards is 0.5 cm and a band between them is 1 mm thick. You have resolution to the nearest 4,000 Daltons. An estimate of, say, 110 kDa should probably be written as 110 ± 4 kDa.


STING condensates on ER limit IFN response

STING is a key player in the IFN response to cytosolic DNA, and its multimerization is commonly associated with activation of the pathway. A new study now shows that STING forms ‘puzzle’-like condensates to limit the IFN response and constrain antiviral immune activation.

Formation of higher-order assemblies including liquid and gel condensates has recently emerged as a major mechanism of signal transduction in innate immunity 1 . Indeed, activation of pathways through multimerization of sensor and adaptor proteins is known for Toll-like receptor signalling 2 , inflammasome activation 3 , retinoic acid-inducible gene I (RIG-I) 4 and cyclic GMP–AMP synthase (cGAS) 5 nucleic acid detection, as well as many others. However, the question as to whether and how a multimerization principle may also be involved to inhibit immune pathways has not been fully addressed. In this issue of Doğa Hücre Biyolojisi, Yu et al. report that excess 2′,3′-cyclic GMP–AMP (2′,3′-cGAMP) induces STING to phase separate on the endoplasmic reticulum (ER) in a puzzle-like structure, thereby preventing STING overactivation 6 .


Restriction Digestion/Gel Electrophoresis Assignment 1

What we're going to do now is give you some experimental results and let you interpret them, so let's jump right in. You have performed Restriction Digestion and Agarose Gel Electrophoresis on a plasmid you purified, using 3 different Restriction Enzymes, and the gel is shown below. Unfortunately, you forgot to label your tubes or keep good records, and the only things you can remember about the experiment are that your standards are in Lane 5 and your uncut control is in Lane 1, and that you loaded roughly the same amount of total DNA in your sample lanes (1-4). Hey, at least you remembered that much!

2. How many times did the enzyme used in Lane 2 digest the plasmid? Does the data seem reasonable? What is the likely number of base pairs this enzyme recognizes?

3. When DNA appears as a messy, continuous band as it does at the bottom of Lane 3, rather than independent, discreet bands, the effect is known as smearing. What are some likely explanations for the smearing detected in Lane 3? You should be able to come up with at least two.

4. How many times did the enzyme used in Lane 4 digest the plasmid? Does the data seem reasonable?

Answers to Questions

2. How many times did the enzyme used in Lane 2 digest the plasmid? Does the data seem reasonable? What is the likely number of base pairs this enzyme recognizes?    The enzyme digests the plasmid in two places. It is important to think about the state of the DNA before digestion. The DNA used in this experiment was a plasmid, and plasmids are circular. If you cut a circle once, you get one linear fragment. You must cut it a second time to get 2 linear fragments like in Lane 2. The data does seem reasonable because if you add up the approximate sizes of the resulting fragments (roughly 4 kb and 2.5 kb), you get the original size of 6.5 kb. Lastly, it is likely that the enzyme used recognizes a sequence of 6 bases. 6-cutters, if you'll recall, cut an average of once every 4,096 bases. This is just an average, however, so in this case where we have a piece of DNA 6,500 bp long, cutting twice is very reasonable.

3. What are some likely explanations for the smearing detected in Lane 3?    In general terms, smearing is when you have many bands together close enough in size that you cannot distinguish between adjacent bands (i.e., no resolution). With beginning molecular biologists, the most likely reason for the smearing is contamination by some stray nuclease that degraded the DNA into dozens, hundreds, or even thousands of little pieces. Another beginning mistake is to use the wrong buffer, wrong temperature, or wrong conditions. Any or all of these could make the enzyme behave badly, including cutting away at your DNA at multiple, random sites. However, as you do more and more experiments like this, personal error becomes less of a concern and you need to start thinking in terms of the science. If this experiment was performed without significant error, the likely explanation is that a 4-base cutter was used. Cutting an average of once every 256 bases in a 6.5 kb plasmid yields roughly 25 fragments, all smaller than the original. It is unlikely that one could see 25 individual fragments of such a small size, and the smearing pattern is probably what would be detected.

4. How many times did the enzyme used in Lane 4 digest the plasmid? Does the data seem reasonable?    If you said twice, you are correct, but let's see if you were correct for the right reasons. In question 2, it was pointed out that to get two fragments from a circular piece of DNA, you need two cuts. So far so good. It was also mentioned that the total size of the resulting DNA fragments must add up to the original size. Uh oh--they don't, do they? Looking at the gel you see one band approximately 6.5 kb and one large band at roughly 3 kb. Does 6.5 + 3 = 6.5? Not in this class.

Science doesn't lie, it's just sometimes hard to interpret. So break it down. Is there anything significant about 6.5 kb? Yes, it's the size of the original plasmid. This, plus the fact that there is a band in the uncut control (Lane 1) which migrates to the same position, should suggest to you that not all of your DNA was digested (a common occurrence). This leaves the band around 3 kb. Could that band be 3.2 or 3.3 kb instead of 3.0? Kolayca. Unless we plot a standard curve, we're just approximating anyway. Is there anything significant about 3.3 kb? Yes, it's about half of our original sample. If the enzyme cut the plasmid into two roughly equal sized pieces, those pieces would run about the same, and would likely be indistinguishable on a gel. This is further supported by the information about this experiment which states that roughly equal amounts of DNA were loaded into Lanes 1-4. Notice how much darker the 3 kb band in Lane 4 is than the bands in Lane 2. There is twice as much DNA in that band than there is in either of the bands in Lane 2, and the data supports this conclusion.


Videoyu izle: Rusyanın Azerbaycan Stratejisi Ne Olur? (Ağustos 2022).