Bilgi

Agaroz jel elektroforezinde fazladan tanınmayan bant elde etmenin olası nedenleri nelerdir?

Agaroz jel elektroforezinde fazladan tanınmayan bant elde etmenin olası nedenleri nelerdir?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

GFP vektöründen oluşan plazmit DNA örneğimin %0.7 agaroz jel elektroforezini Nhel ve HindIII restriksiyon enzimi kullanarak çalıştırdım.
İki tip plazmit kullandım, yani miniprep-alkali yöntemiyle izole edilmiş ve aynı kaynaktan midi hazırlık sistemi (saf) ile izole edilmiş bir başka plazmit E. koli.
4 ve 5 satırları, sırasıyla, midi hazırlık sistemi tarafından izole edilmiş, kesilmiş ve kesilmemiş plazmidi göstermektedir.
1, 2 ve 3 satır, sırasıyla miniprep izole edilmiş plazmid sinyalinin 500 bp işaretçisini, kesildiğini ve kesilmediğini gösterir. Ekli görüntüde alkali yöntemiyle izole edilen plazmitlerde (hat 2 ve 3) fazladan bir bant bulduk, ancak saf örneklerde (hat 4 ve 5) böyle bir ekstra bant bulunamadı.
Sonucun arkasındaki olası nedenler nelerdir? Bu sonucu nasıl yorumlayabilirim? Benzer sonuçlar yaşayan varsa lütfen paylaşsın.


Bana genomik DNA kontaminasyonu gibi görünüyor.

Daha da önemlisi, gerçekten önemli mi? Merakınızı kesinlikle takdir ediyorum, ancak amacınız klonlama ise, devam edip dönüşümden sonra plazmidinizin bazı tanısal kesimlerini yapardım. Vektörünüzü açıkça görebilir veya jele yerleştirebilirsiniz.


Birkaç şey olabilir… kafamın hemen üstünde. Vektör haritanız ve beklenen boyutlarınız olmadan kesin olarak söylemek neredeyse imkansız olacaktır.

Muhtemelen kuluçka koşullarınız vb. hakkında bize daha fazla bilgi vermeniz gerekecektir.

  1. Hazırladığınız orijinal kültürünüz düşündüğünüz kadar homojen olmayabilir:
    • Sonunda bir mutant buldunuz (belki de o klondaki kısıtlama sitenizde)
    • Orijinal kültürünüz, belki de farklı bir plazmit taşıyan ikinci bir E coli ile kirlenmiştir.

Moleküler/mikrobiyoloji tekniğinizin uygun olduğunu varsayarsak, bu muhtemelen olası değildir, ancak zaman zaman olur.

  1. Eksik sindirim. İlk ekstraksiyon yönteminizin eluatındaki bir şey muhtemelen enzimlerinizi inhibe etti, bu diğer ekstraksiyon mekanizmasında gerçekleşmedi veya sindirimi yeterince uzun süre bırakmadınız.

  2. Örneklerden biri için reaksiyon karışımından bir şeyi kaçırdınız (genellikle işler ters gittiğinde önce kendimi suçlarım, bu yüzden emin olmak için genellikle tekrarlarım!)


Agaroz jel elektroforezinde fazladan tanınmayan bant elde etmenin olası nedenleri nelerdir? - Biyoloji

Polikistik böbrek hastalığı (PKD), insanlarda en sık görülen genetik hastalıklardan biridir. Savunmasız bir insan alt popülasyonunda ortaya çıkan bir bulaşıcı hastalık ve/veya mikrobiyal toksikoz olabileceğini iddia ediyoruz. Limulus amebosit lizat (LAL) tahlili için bir diferansiyel aktivasyon protokolünün kullanılması, PKD'li insan böbreklerinden alınan kist sıvılarında bakteriyel endotoksin ve mantar (1 3)-ß-D-glukanlar gösterdi. Kist sıvısının yağ asidi analizi, endotoksinin özelliği olan 3-hidroksi yağ asitlerinin varlığını doğruladı. Üç PKD hastasından alınan doku ve kist sıvısı mantar bileşenleri açısından incelendi. Serolojik testler gösterdi Fusarium, Aspergillus, ve kandida antijenler. IgE, ancak IgG değil, reaktif Fusarium ve kandida kist sıvısında da tespit edildi. Bu üç PKD hastasının böbrek dokusunda ve kist sıvısında mantar DNA'sı saptandı, ancak sağlıklı insan böbrek dokusunda saptanmadı. Endotoksin ve mantar bileşenlerinin etkilerinin iç içe geçmiş doğasını, PKD'deki sfingolipid biyolojisini, PKD gen ürünlerinin yapısını, enfeksiyonları ve bağırsak fonksiyonunun bütünlüğünü, insan kistik hastalığının mikrobiyal provokasyonu için mekanik bir hipotez oluşturmak için inceliyoruz. Bu hipotezin kanıtı, dahil olan mikropların ve mikrobiyal bileşenlerin tanımlanmasını ve PKD hücre biyolojisinin çok yönlü çalışmalarını gerektirecektir.

Polikistik böbrek hastalığının (PKD) ortaya çıkan bir bulaşıcı hastalık ve/veya hassas bir insan popülasyonunda mikrobiyal toksikoz olduğu hipotezini incelemek, hastalık etiyolojisi ve ilerlemesini mikropların, hücresel bileşenlerinin tanımlanmasıyla ilişkilendiren kavramsal araçların gözden geçirilmesiyle başlamalıdır. ve etkilenen kişilerde toksinleri döker (1). Ortaya çıkan bir bulaşıcı hastalık, kısmen, mikropların yeni bir nedensel faktör olarak ve/veya hastalığın ilerlemesine katkıda bulunan bir faktör olarak kabul edildiği mevcut bir hastalık olarak tanımlanabilir. Mikrop 1) lezyon bölgesinde mevcut olabilir, 2) tüm vücuda yayılmış olabilir veya 3) birincil lezyonlardan ayrı bir anatomik bölgede lokalize olabilir. Bu üçüncü durumda, mikrop tarafından dağıtım sıvılarına, genellikle kana salınan bir veya daha fazla toksin, patolojik etki(ler) üretir; bu süreç, hastanın sadece diyette bulunan toksin(ler)e maruz kaldığı mikrobiyal toksikoza benzer, çevre ve bağırsak mikroflorası. Toksinin kaynağı uzaklaştırılacak veya azaltılacaksa, bulaşıcı bir hastalık ile mikrobiyal toksikoz arasında ayrım yapılması esastır. Eşzamanlı enfeksiyon ve mikrobiyal toksikoz (örn., endotoksikoz, mikotoksikoz) da ortaya çıkabilir. Mikotoksikozun genel olarak aflatoksin, fumonisin veya trikotesen gibi küçük organik mantar toksinlerinin absorpsiyonuna atıfta bulunduğu anlaşılsa da, vücut sıvılarında ve dokularında toksinin tespiti genellikle zordur. Toksine maruz kalma epizodik olabilir. Bilinen ve yeni keşfedilen birçok mikrobiyal toksin için, özellikle hassas alt popülasyonlarda akut ve kronik hastalıklarda yer alan toksinlerin seviyelerine ilişkin analitik yöntemlerin insan dokularında ve sıvılarında geliştirilmesi ve doğrulanması gerekmektedir. Toksin üreten mikrobiyal cins/türlerin imza bileşenlerinin varlığının, dökülen toksinler de dahil olmak üzere mikrobun tüm bileşenlerinin de mevcut olduğunu gösterebileceği görüşünü aldık. Sonuç olarak, moleküler boyutta genellikle klasik mikotoksinler ve endotoksinlerden daha büyük olan saptanabilir mikrobiyal bileşenlerin absorpsiyonu, diğer bileşenlerin ve toksinlerin bu organizmadan emildiğini varsaymalıdır.

İlk bakışta, PKD ortaya çıkan bulaşıcı bir hastalık gibi görünmüyordu. Klasik olarak Mendel genetiğini takip eden kalıtsal bir hastalık olarak görülen, otozomal dominant formundaki PKD, Amerika Birleşik Devletleri'nde 600.000 kişiyi 400-1.000 kişide 1 oranında etkiler, otozomal çekinik form 44.000 doğumda 1 oranında görülür. Böbrek diyalizindeki hastalarda edinilmiş bir PKD formu oluşur. Kalıtsal ve kimyasal olarak indüklenen PKD'nin hayvan modelleri tarif edilmiştir (2-4). Mevcut fikir birliği, hücre farklılaşması veya olgunlaşmasındaki temel anomalilerin, kistik böbrek epitelindeki anomali dizisini açıkladığıdır. Kistler bazen uteroda saptanabilse de, otozomal dominant PKD hastalarının %50'sinde altıncı dekatta böbrek fonksiyonunun son dönem böbrek hastalığı noktasına kadar kaybı meydana gelir. PKD'nin moleküler genetik araştırmalarındaki önemli ilerlemeye rağmen, kusurlu gen ürünlerinin, son dönem böbrek hastalığına neden olması ve ilerlemesindeki rolü belirsiz kalmıştır (3,5,6). Gerçekten de, PKD'nin son dönem böbrek hastalığına ilerlemesi için gerekli olduğu ek faktörlerin önerilmiştir. PKD hastalarında genel olarak sağlıklı kişilere göre böbrek ve idrar yolu enfeksiyonları ve hastalık ve enfeksiyondan ölüm oranları daha yüksektir (7,8). Aksi takdirde sağlıklı kişilerde bu enfeksiyonlar PKD'ye yol açmadığından, PKD hastaları enfeksiyona karşı yüksek hassasiyet ve mikrobiyal hücre bileşenleri ve toksinlere karşı hassasiyet sergiliyor olabilir. Böyle bir hassasiyet ve güvenlik açığının nasıl meydana geldiği bilinmemektedir. Hastalık, bağışıklığı baskılanmış bir durumu içeriyor gibi görünmüyor. Bu nedenle, üroepitelyumun değişmiş kolonizasyonu ve değişmiş bağırsak yapısı ve kolonizasyonu gibi alternatif olasılıklar düşünülmelidir.

Mikroplar ve Mikrobiyal Bileşenler

Werder et al. (9) PKD'de mikroplar için patojenik bir rol belirlemede belki de kritik deneyi gerçekleştirdi. Genetik olarak kistik fareler kullanarak, mikropsuz koşullar altında büyütülen farelerin, ortam koşulları altında yetiştirilen kistik yavrulardan önemli ölçüde daha uzun süre hayatta kaldığını bulmuşlardır. Gardner et al. (10,11), kimyasal bir sistojenle beslenen sıçanların, mikropsuz koşullar altında büyütüldüklerinde daha düşük renal sistogenez oranlarına sahip olduklarını ve ayrıca gram-negatif bakterilerin her yerde bulunan hücre duvarı bileşeni olan lipopolisakkaritleri (LPS) birlikte uyguladıklarını bildirdiklerinde bu gözlemleri genişletti. ve kimyasal sistojen, tek başına sistojen kullanmaktan daha yüksek oranda kist oluşumu üretti. Bu nedenle, LPS, renal sistogenez için altta yatan genetik (veya kimyasal olarak indüklenen) duyarlılığın bir provokatörü olarak kabul edildi. Bu araştırma hattından, LPS'nin tek başına veya diğer mikrobiyal veya çevresel faktörlerle kombinasyon halinde hastalığın ilerlemesini teşvik etme ve bu tür provokatörlerin ortadan kaldırılmasının PKD'nin son durum böbrek hastalığına ilerlemesini yavaşlatma olasılığı ortaya çıkmıştır.

Endotoksin, LPS ve diğer bakteri hücre duvarı proteinlerinin ve bakteriyel enfeksiyonlarda bulunan bileşenlerinin karışımıdır (12). LPS, bakteri hücre duvarlarının solvent ekstraksiyonu ile izole edilir, kimyasal saflığı preparasyonlar arasında değişebilir. LPS'nin bilinen biyolojik aktivitelerinin çoğundan sorumlu olan kısmı Lipid A'dır, karbonhidrat yan zincirleri de insanlarda tepkiler ortaya çıkarır (13). LPS'nin kimyasal bileşimi, izole edildiği bakterinin cinsine ve türüne bağlıdır (13,14). LPS'nin yapısı ve biyolojik aktiviteleri hakkındaki bilgiler arttıkça ve endotoksine dayalı bulaşıcı hastalık sözlüğü ile birleştiğinden, bu terimler bazen birbirinin yerine kullanılmaktadır. Örneğin, Limulus amebosit lizat (LAL) testinde pozitif referans materyali olarak kullanılan yüksek oranda saflaştırılmış LPS, Kontrol Standardı Endotoksin olarak adlandırılır. LPS ve endotoksin terimlerinin birbirinin yerine kullanılması, hastalıkta mikrobiyal katılımın takdir edilmesini desteklese de, hastalıktan bahsederken endotoksin terimini tercih ediyoruz çünkü bu, LPS'nin yapısal ve farmakolojik heterojenliğine ve in vivo olarak mevcut olan diğer mikrobiyal bileşenlerin karışımlarına saygı duyuyor.

Miller ve ark. (15) klinik olarak belirgin enfeksiyonu olmayan erkek PKD hastalarının kültür negatif idrar örneklerinde klasik LAL testi ile varsayılan endotoksin seviyelerini ölçtüler, %80'i saptanabilir LAL-pozitif materyal içeriyordu, sağlıklı erkek gönüllülerin idrar örneklerinde ise yoktu. PKD hastalarından alınan kist sıvısında Gardner ve ark. (16) tipik olarak LPS tarafından indüklenen LAL-pozitif materyal ve sitokinler bildirdi. Böbrek ve idrar endotoksininin kökenleri bilinmeyen olası kaynaklar arasında bağırsak mikroflorası, gizli ürogenital enfeksiyonlar, kriptik kolonizasyonlar ve normal günlük emilen endotoksin yükünün karaciğer tarafından anormal kullanımı yer alır. Endotoksin insan sağlığı ve hastalığında temel bir rol oynadığından, PKD hastasında endotoksine daha fazla maruz kalma önemlidir. Düşük dozlarda endotoksin bağışıklık sistemini güçlendirir, ancak daha büyük miktarlarda öldürücüdür. İlaçlar ve diğer maddelerle kombinasyon halinde, doku hasarına ve ciddi hastalık örneklerine neden olabilir, endotoksin diğer maddelerle sinerjisinin diğer maddelerle sinerjisine neden olabilir; bunlar arasında sirozda alkol, Reyes sendromunda aspirin ve trikotesen T-2 toksini (bir mikotoksin) bulunur. Fusarium) gastrointestinal sistem hasarında (17). Endotoksin ayrıca bakterilerin bağırsaktan kana geçişini de teşvik edebilir (18). Duyarlı kişilerde, endotoksine kronik maruziyet romatoid artrit ile ilişkilendirilmiştir (19) ateroskleroz ile geçici bağlantılar da bildirilmiştir (20). PKD'de endotoksin düşündürmekle birlikte, yukarıda kullanılan LAL yöntemleri, yanlış pozitif ve/veya negatif sonuçlara duyarlı olduklarından endotoksin için spesifik değildi.

İnsan PKD Böbrek Kistlerinde Bakteriyel Endotoksin

Şekil 1. Limulus amebosit lizat testinde jel pıhtısı oluşumuna yol açan biyokimyasal etkileşimler ve reaksiyonlar dizisi. Lipid A kısmı yoluyla Faktör C'ye bağlanan endotoksin, aktivasyonu ile sonuçlanır.

Bu raporda, 1) LAL yöntemlerindeki son gelişmelerden sonra kaydedilen endotoksin seviyeleri, 2) bakteriyel endotoksine özgü yağ asitlerinin analizi ve 3) insan kist sıvısında diğer mikrobiyal bileşenlerin varlığı ile ilgili son bulgularımızı açıklıyoruz. LAL tahlili (Şekil 1) biyolojik sıvılarda ve farmasötiklerde düşük endotoksin seviyelerini tespit etmek için kullanılan klasik yöntemdir.

Altı otozomal dominanttan kist sıvılarına iki Limulus yolunun farklı aktivasyonuna dayalı yöntemler uygulandığında hem endotoksin (sekiz hastadan sekizinde) hem de (1 3)-ß-D-glukanlar (sekiz hastadan ikisinde) tespit edildi. PKD hastaları, bir otozomal resesif PKD hastası ve tek bir basit kistten 200 ml elde edilen basit kistleri olan bir hasta (Tablo 1). Bu hastaların hiçbiri klinik enfeksiyon kanıtı sergilemedi, hemodiyalizde bulunmadı veya nefrektomiden önce ß-D-glukan reaktivitesinden sorumlu olabilecek insan immünolojik ürünleri almamıştı (26). Altı hasta için (dört otozomal dominant, bir otozomal resesif ve biri basit kistleri olan), hem LAL hem de LAL+laminarin testleri için kist sıvılarında jel pıhtısı uç noktalarında sadece endotoksin saptandı, bu da test edilen her sıvı için eşit olduğunu gösteriyor. -D-glukan ile uyarılan yol aktive edilmedi. Polimiksin B'ye maruz kaldığında, LAL-pozitif kist sıvıları negatif hale geldi. Bu, bu antibiyotik, tahlilde aktif olmayan bir stokiyometrik kompleks oluşturmak üzere Lipid A'ya bağlandığında meydana gelen konformasyonel değişikliklerle tutarlıdır (25). Buna karşılık, bir erkek hastadan (donör 4) ve bir kadın hastadan (donör 5) alınan böbrek dokusu, ayrı ayrı endotoksin veya ß-D-glukan içeren kist sıvıları verdi, ancak tek bir sıvı her iki maddeyi de içermedi (Tablo 1). Polimiksin B varlığında veya yokluğunda LAL pozitif, ancak laminarin varlığında negatif olan sıvılar, ß-D-glukanın saptanmasıyla tutarlıdır. Donör 6, nefrektomiden önce 1 yıldan biraz daha uzun süredir periton diyalizindeydi. Kist sıvılarının tümü başlangıçta LAL negatif olmasına rağmen, LAL testinin inkübasyon süresi 1 saatten 2 saate çıkarıldığında, 13 kist sıvısından 4'ü endotoksin pozitifti, ancak diyalize girmeyen hastalardan alınan sıvılardan çok daha düşük konsantrasyonlardaydı. Donör 6'dan alınan kist sıvılarının hiçbiri, daha uzun inkübasyonlardan sonra ß-D-glukan için pozitif değildi. Daha uzun inkübasyon süreleri, diğer donörlerden LAL-negatif kist sıvılarında LAL-pozitif materyal üretmiş olabilir, bu nedenle, her hasta için LAL-pozitif kist sıvılarının yüzdesini minimum bir değer olarak görüyoruz.

Lipid A, Faktör C'ye bağlanır ve onu aktive ederek jel pıhtı oluşumuna yol açan bir dizi enzimatik reaksiyonla sonuçlanır, pozitif son nokta (22). Klasik LAL reaktiflerinde ayrıca bir yan basamaktan (yani alternatif yoldan) sorumlu olan Faktör G de bulunur. Faktör G, esas olarak mantar hücre duvarlarıyla ilişkili (1 3)-ß-D-glukanlar tarafından uyarılır (23). Faktör G'ye (24) glukan bağlanmasının bir inhibitörü olan laminarinin eklenmesi, endotoksin ile indüklenen jel pıhtı oluşumunun daha spesifik bir ölçümüne izin verir ve biyolojik numunelerde (1 3)-ß-D-glukanlar için bir tarama aracı sağlar. diğer inhibitörler ve aktivatörler ile farklı bir aktivasyon protokolünde kullanılır. İki dahili kontrol olarak polimiksin B, endotoksinin (25) LAL reaktivitesini bloke edebilir ve testin inhibisyonunu saptamak için çift numunelere bilinen miktarlarda Kontrol Standardı Endotoksin eklenebilir.

Lipid A, Faktör C'ye bağlanır ve onu aktive ederek jel pıhtı oluşumuna yol açan bir dizi enzimatik reaksiyonla sonuçlanır, pozitif son nokta (22). Klasik LAL reaktiflerinde ayrıca bir yan basamaktan (yani alternatif yoldan) sorumlu olan Faktör G de bulunur. Faktör G, esas olarak mantar hücre duvarlarıyla ilişkili (1 3)-ß-D-glukanlar tarafından uyarılır (23). Faktör G'ye (24) glukan bağlanmasının bir inhibitörü olan laminarinin eklenmesi, endotoksin ile indüklenen jel pıhtı oluşumunun daha spesifik bir ölçümüne izin verir ve biyolojik numunelerde (1 3)-ß-D-glukanlar için bir tarama aracı sağlar. diğer inhibitörler ve aktivatörler ile farklı bir aktivasyon protokolünde kullanılır. İki dahili kontrol olarak, polimiksin B, endotoksinin (25) LAL reaktivitesini bloke edebilir ve testin inhibisyonunu saptamak için çift numunelere bilinen miktarlarda Kontrol Standardı Endotoksin eklenebilir.

Böbrekler, renal allogreft almış veya bekleyen yedi hastaya aitti. Kist sıvısı, PKD hastalarının yedi eksize edilmiş böbreğinden (nefrektomi sonrası) aseptik aspirasyon yoluyla hem yüzey (korteks) hem de yüzey altı (medüller) kistlerinden ex vivo elde edildi. Basit kist sıvısı, radyolojik kılavuzlu iğne aspirasyonu ile geri kazanıldı. Tüm böbrekler ve kist sıvıları, onaylanmış bir Kurumsal İnceleme Kurulu protokolü altında toplandı. Böbrek başına aspire edilen ortalama kist sayısı 10 (aralık 1-21) idi ve her ikisi de çalışma için kullanılan hastalardan birinden iki böbrek alındı. Kist hacimlerinin çok küçük olduğu otozomalresesif PKD hastası dışında, her böbrekteki ayrı kistlerden gelen sıvı ayrı ayrı toplandı (

0.1 ml) bireysel testler için. Bu nedenle, birbirine yakın sekiz kistten sıvı toplandı. Tüm prosedürler, böbreklerin ve kist sıvılarının toplanmasında, işlenmesinde ve işlenmesinde ve Limulus testi için ürünlerin ve reaktiflerin hazırlanmasında pirojen içermeyen materyaller kullandı. Hem endotoksin hem de (1 3)-ß-D glukanları ortadan kaldıran 250°C'de 4 saat boyunca depirojenasyon gerçekleştirilmiştir (27). Kist sıvıları -70°C'de saklandı. Kistlerin değerlendirme parametreleri, sıvılar için renk ve boyut, renk, bulanıklık, pH, mg protein/ml, özgül ağırlık ve kandır. Kist sıvısı pH'ını, özgül ağırlığını ve kanı saptamak ve yarı niceliğini belirlemek için ticari bir ölçüm çubuğu kullanıldı (Ames 10 SG Multistix, Miles, Inc., Elkhart, IN, ABD). Kan duyarlılığı, mikrolitre başına 5-20 bozulmamış kırmızı kan hücresine eşdeğer 0,015-0,062 mg/dL hemoglobin olmuştur. Sonuçlar 1-4+ olarak kaydedildi. Özgül ağırlık için, izin verilen belirlemeler pH için 1.000-1.030, 5.0-9.0 aralığındadır. Protein Lowry ve ark. (28)

LAL jel pıhtı son noktası tahlili (22) üreticinin talimatlarına göre yapıldı (Charles River ENDOSAFE, Charleston, SC). LAL testinin mekanizması Şekil 1'de gösterilmektedir. Endotoksin miktarını belirlemek için seyreltilmemiş numuneler ve 1:64'e kadar seri iki kat seyreltmeler test edildi. Alternatif (1 3)-ß-DG yolunun aktivasyonundan kaynaklanan yanlış pozitifleri saptamak için, glukan inhibitörü laminarin ile güçlendirilmiş LAL tahlil reaktifi kullanıldı (23). Laminarin, Dr. J. Cooper, Charles River ENDOSAFE, Charleston, SC'nin izniyle sağlanmıştır. Laminarin, 0.2 N NaOH ile 50°-60°C'de 6 saat süreyle işleme tabi tutularak endotoksinsiz hale getirilmişti, LAL tahlilinde laminarinin aktivitesini etkilemedi (23). LAL tahlil reaktifine (23) laminarin eklenmesi dışında standart jel pıhtı son noktası yöntemi kullanıldı.Her iki testin de minimum duyarlılığı 0.03-0.06 Endotoksin Ünitesi (EU)/ml (3-6 pg kontrol standart endotoksin, CSE 10 EU/ng EC-5) olmuştur. E.coli O133) ABD Standardı endotoksin ß-DG için, ³10 pg/ml (29).

Bilinen endotoksin-pozitif (musluk suyu) ve -negatif (pirojensiz su) numuneleri, bir CSE eğrisi ile birlikte kontrol olarak çalıştırıldı. Endotoksin konsantrasyonu, günlük olarak doğrulanan lizatın duyarlılığına karşı pozitif bir test üreten maksimum seyreltme çarpılarak tahmin edildi. Kist sıvısındaki ß-DG içeriği, endotoksin spesifik tahlil (LAL+laminarin) ve geleneksel LAL tahlili (30) arasındaki titrelerdeki farkla tahmin edildi. Tüm numunelerin bazı kısımlarına ek olarak 0.25 EU CSE eklenmiş ve inhibitör maddeler için test edilmiştir. LAL testlerinde inhibisyon gözlemlendiyse, numuneler 5 dakika kaynatıldı, oda sıcaklığına soğutuldu ve yeniden test edildi. Örnekler, bazı durumlarda kaynatıldıktan sonra, LAL testinden önce polimiksin B (5 mg/tahlil) ile oda sıcaklığında 30 dakika süreyle inkübe edildi. Polimiksin B, reaktif olmayan bir kompleks veren LPS'ye doğrudan bağlanmasıyla Faktör C yoluyla LPS ile aktive olan yolu inhibe eder (25). Alternatif bir yaklaşım, Faktör C'yi doğrudan inhibe etmek için %20 dimetil sülfoksit (DMSO) kullanmaktı (23) DMSO, endotoksin olmayan, ancak polimiksin B'ye bağlanarak inaktive edilmemiş LAL-reaktif malzemelerin saptanmasına izin vermek için kullanıldı. sistem DMSO, CSE varlığında LAL reaksiyonunu tamamen bloke etti.

Kist sıvısının santrifüjlenmesinden sonra, LAL-pozitif materyal, otozomal resesif ve basit kist türevli sıvılar için sadece süpernata yerleştirildi. Otozomal baskın türevli sıvılar için, reaktif materyal pelet içinde yer aldı. Bu nedenle, LAL testinden önce partikülat materyali uzaklaştırmak için sıvıların santrifüjlenmesi sonuçları etkileyebilir.

Otozomal resesif ve basit kist sıvıları dahil olmak üzere test edilen 73 kist sıvısının yaklaşık üçte ikisinde LAL testi inhibisyonu tespit edildi. Kaynatılmamış numunelerdeki engelleyici etkinin üstesinden gelmek için genellikle kist sıvısının 1:16 oranında seyreltilmesi gerekiyordu. Tüm sıvıların veya süpernatların ve peletlerin 5 dakika kaynatılması, hemen hemen tüm numunelerde tüm dilüsyonlarda LAL testi inhibisyonunu ortadan kaldırdı. İstisnalar, bazı seyreltilmemiş ve 1:2 oranında seyreltilmiş çikolata renkli kist sıvılarıydı; burada inhibisyon, otozomal dominant sıvıların hem test hem de çivili numunelerinde ortadan kaldırılmadı.

Otozomal dominant kist sıvılarındaki endotoksine özgü materyalin konsantrasyonları 0.12 ila 3.84 EU/ml idi ve önemli seviyelerde endotoksin (3.84 EU/ml), bir otozomal resesif böbrekten sekiz kist ve birinden basit kistten oluşan bir havuzda bulundu. bağışçı. Test edilen tüm otozomal dominant sıvılarda (LAL negatif olanlar dahil) ortalama endotoksin konsantrasyonu 0.65 EU/ml'dir. Dönüşüm faktörü olarak 10 EU/ng kullanılması 65 pg endotoksin/ml kist sıvısı verir normal endotoksin plazma seviyeleri <4-5 pg/ml'dir (31). 5 EU/kg vücut ağırlığının (350 EU/70 kg) intravenöz enjeksiyonu ortalama yetişkin erkekte şoka neden olabilir (21). Yetişkin bir erkekteki tek bir kistik böbreğin (3-5 kg ​​böbrek ağırlığının %33'ü kist sıvısıdır) 648 ila 1.080 EU/böbrek veya böbrek başına yaklaşık iki ölümcül doz endotoksin içerdiğini tahmin ediyoruz. PKD hastalarında açıklanamayan ateş ve yan ağrısı, kistlerin rüptürü veya kanamasından IL-1'in salınmasına bağlanmıştır (27). Bu çalışmada gözlemlenen yüksek endotoksin seviyelerine ve insanların endotoksine karşı yüksek duyarlılığına dayanarak, endotoksinin kistten peritona veya kana salınmasının, sızıntıdan sonra bir dizi biyolojik olayın önemli bir başlatıcısı olabileceğini öneriyoruz. veya böbrek kistlerinin yırtılması.

Bir donör (verici 3) için her iki böbrek de kist sıvısı analizi için mevcuttu (sırasıyla dokuz sol ve 11 sağ böbrek kisti). LAL pozitif sıvıların (endotoksin) sıklığı karşılaştırıldığında ise anlamlı bir fark bulunmadı (Tablo 1). Bununla birlikte, sağ böbrek ile karşılaştırıldığında sol böbrek kist sıvılarında inhibitör saptama sıklığında üç kat fark gözlendi (sırasıyla %90'a karşı %31). Bu nedenle, endotoksin için sıvıların LAL testi, hem yanlış negatif hem de pozitif materyaller için dikkatli olmayı gerektirir.

Özel Bakteriyel Yağ Asitleri

Böbrek kistlerinde endotoksin varsa, varlığını doğrulamak için endotoksine özgü yağ asitleri kullanılabilir. LPS'nin Lipid A bölgesi, çeşitli zincir uzunluklarında (13,14) ortalama olarak dört 3-hidroksi (3-OH) asil grubu içerir. LPS'nin asit hidrolizi, 3-OH yağ asitlerini ve diğer yağ asitlerini serbest bırakır. Farklı bakteri cinsleri, çeşitli zincir uzunluklarındaki yağ asitlerinin karakteristik oranlarını ve bu tür imza yağ asidi profillerinin hidroksilasyon derlemelerinin modellerini sergiler, birçok cins için mevcuttur (14). İlk olarak, beş kist sıvısının alikuotları, Mayberry ve Lane (32) tarafından tarif edildiği gibi gaz kromatografisi-kütle spektrometrisi ile tek bir kör şekilde analiz edildi. 3-Hidroksi (3-OH) yağ asitleri nC:12:0 ve nC:14:0 karbon uzunluğu saptandı, ancak endotoksine özgü LAL tahlilinde pozitif olan üç kist sıvısında nicelendirilmedi, LAL negatif olan iki kist sıvısında saptanmadı. Böylece, LAL reaktivitesinin ve imza yağ asidi analizinin tam uyumu gözlemlendi. 3-OH yağ asitleri (C:14, C:16) ayrıca ayrı bir referans laboratuvarı (Microbiological Insights, Inc., Knoxville, TN) tarafından LAL-pozitif kist sıvılarında rapor edilmiştir. Klasik bir imza yağ asidi profili ve bir veya daha fazla bakteri cinsine bağlantı mümkün olmadan önce kist sıvısının ek kimyasal analizleri gereklidir. Ayrıca, endotoksinin bozunması sırasında salınan 3-OH yağ asitlerinin, LAL tahlilinde pozitif olan memeli sfingolipidlerine dahil edilmesi, böylece hem bu tür yağ asitlerinin mevcudiyetini hem de kist sıvılarında LAL reaktivitesini hesaba katma olasılığını göz ardı edemeyiz.

(1→3)-ß-D-Glukanlar (ß-DG)

Endotoksine ek olarak, LAL testinin farklı aktivasyonu ile iki hastadan alınan kist sıvılarında (1→3)-ß-D-glukanlar tanımlandı (Tablo 1). Kist sıvılarındaki ß-DG reaktif materyal aralığının 40 ila 160 pg/ml olduğu tahmin edilmiştir. Sağlıklı kişilerin plazmasında ß-DG seviyeleri 6.9 pg/ml'nin altındadır (26). Filamentli mantar ve maya hücre duvarlarının (33) her yerde bulunan bir bileşeni olan ß-DG, yalnızca LAL tahlilindeki reaktivitesinde endotoksin tarafından aşılır 13 bağlantısı olmayan glukanlar LAL reaktif değildir (34) ve mannans, dekstranlar, ve selüloz (24,26). Glukanların çeşitli formları mantar hücre duvarlarının bileşenleri olmasına rağmen, (1→3)-ß bağlantılarına sahip olanlar, hipersensitivite pnömonisine ve diğer ciddi akciğer hastalıklarına neden olmada en güçlü olanlardır (35). ß-DG'ler mantar hücre duvarlarının göstergesi olsa da, tek başına oluşumları onu üreten mantarın cinsini ve türünü tanımlamaz. Mantar bileşenlerinin varlığını doğrulamak ve ß-DG kaynağını belirlemek için, otozomal dominant PKD hastasından alınan üç ß-DG pozitif ve iki ß-DG negatif kist sıvısı üzerinde serolojik testler yapıldı (Tablo 2). LAL-reaktif materyal için negatif olan donör 6'dan alınan kist sıvısı da saptanabilir mantar antijenleri içermez ve ß-DG-pozitif materyal içeren her iki böbrekten gelen anti- (donör 4 ve 5 Tablo 1) mantar antijenleri için de pozitiftir. Verici 5'ten gelen sıvı ayrıca mantar antikorları sergiledi Donör 4'ten gelen sıvı, mantarlara karşı antikorlar için test edilmedi.

LAL testinde uzun süreli inkübasyonun ardından ß-DG pozitifliği olan donör 4 ve 5'ten alınan üç kist sıvısı (Tablo 1) ve donör 6'dan alınan iki kist sıvısı üzerinde hem endotoksin hem de ß-DG için negatif olan mantar serolojisi uygulandı. Sıvılar antikor için test edildi Penicillium notatum (Penicillium krizojen) ve penisilyum müdavimler, Aspergillus fumigatus, Candida albicans (maya) ve Fusarium moniliforme. Pharmacia CAP sistemleri RAST FEIA (IgE) ve IgG FEIA kullanıldı (Pharmacia & Upjohn Diagnostics, Kalamazoo, MI, ABD). Testler, sıvının testle plazma interferansı yerine kist sıvısı kullanılarak modifiye edildi. Mantar antijenlerini saptamaya yönelik testler, Atlanta, GA'daki Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri tarafından gerçekleştirilmiştir. Tespit etmek için Fusarium sp. antijen, modifiye bir aspergilloz mikroimmünodifüzyon testi (36) deneysel tavşan anti-Fusarium solani antikor böbrek kisti sıvısı plazma ile ikame edildi. tespit etmek için bir çift antikorlu sandviç enzim immünoassay kullanıldı. c. albicans kist sıvılarında serotip A mannan konsantrasyonları bu testin serumdaki özgüllüğü %100 olarak bildirilmektedir (37). Tespit etmek için deneysel bir ELISA inhibisyon tahlili kullanıldı. Aspergillus galaktomannan (Steven Hurst, yayınlanmamış protokol) Miktarları tahmin etmek için standart serum referans eğrileri kullanıldı. c. albicans manan ve Aspergillus kist sıvılarında galaktomannan. Bununla birlikte, bu testler kist sıvıları için değil, serum antijen tespiti için tasarlanmıştır ve bu nedenle, tahmini miktarlar olarak görülmelidir.

Fungal serolojik testler, potansiyel ß-DG kaynakları hakkında fikir verdi. İlk ölçümler gösterdi Fusarium solani antijen. Bu bulgular antijenin F. solani veya diğerinde bulunan ortak bir antijen Fusarium türler (L. Kaufman, pers. comm.). IgE (ancak IgG değil) antikoru Fusarium moniliforme da tespit edildi. Aspergillus galaktomannan antijeni ve Candida albicans serotip A. mannan seçilmiş kist sıvılarında mevcuttu. çapraz reaktivitesi Fusarium ile birlikte Aspergillus ve penisilyum 1) gibi olası değildir Fusarium antikor (miselyuma karşı hazırlanmış) ile çapraz absorbe edildi. Aspergillusve 2) immünodominant grubu Aspergillus ve penisilyum türler, bir galaktofuranosil parçasına (38) sahip olan galaktomannan, Fusarium türler (39). Serolojik testler olarak Fusarium ve Aspergillus kist sıvılarında deneyseldir ve klinik olarak değerlendirilmemiştir, bu veriler bu mantar antijenlerinin varlığının dolaylı olası göstergeleridir. İnsan dokularında ve vücut sıvılarında ve insan diyetindeki mantar bileşenlerinde ortaya çıkan mantar patojenlerinin saptanması ve tanımlanması için fungal serolojik ve kimyasal yöntemlerin yetersizliği, başkaları tarafından not edilmiştir.

IgE antikorları da tespit edildi kandida. Her ikisine de IgE antikorları Fusarium ve kandida kist sıvısında mantarlara karşı immünolojik savunmaların işe alınmasını önerir. Bu IgE'lerin üretim yeri ve kiste giriş yolu bilinmemektedir, bir aşırı duyarlılık reaksiyonu göz ardı edilemez. İnsan ve deneysel PKD'de, kistik hastalığın şiddeti, dolaşımdaki nötrofillerin sayısı ile ilişkilidir, nötrofili, her ikisi de kist sıvılarında rapor edilmiş olan endotoksin ve sitokinlere maruz kalma ile ilişkilidir (16). Fungal antijenler ve antikorlar bulmamız, ß-DG ve mannanın sitokin üretimini uyardığı rapor edildiğinden, ß-DG ve mantarlardan salınan mannan tarafından PKD'de lökosit aktivasyonunun ek olasılığını yükseltir (40).

Mantar enfeksiyonunu tespit etmek için sıklıkla serolojik testler kullanılır. PKD hastalarından, hastalığın ilerleyici evreleri sırasında ardışık zamanlarda toplanan kist sıvıları uygun değildi. Bu nedenle, bu hastalarda aktif mantar enfeksiyonlarını belirlemek için antijen veya antikor titrelerindeki kantitatif ve/veya kalitatif değişiklikler kullanılamadı. antijenleri olmasına rağmen Aspergillus veya Fusarium türler genellikle belirgin veya gizli enfeksiyon olarak yorumlanır, başka bir olasılık da mantar bileşenlerinin enfeksiyondan bağımsız olarak emilmesi ve dağılımıdır (yani, enfeksiyona karşı mikotoksikoz). Süre Aspergillus öncelikle inhalasyon yoluyla girer, bu yol baskın kaynak gibi görünmemektedir. Fusarium içerdiği hava örneklerinin %1'inden azı Fusarium türler (41). fumonisin Fusarium insanlar tarafından tüketilen tahıllar, pirinç ve mısırda bulunur (42), diyet ürününün seviyelerinde ve tipinde ve işlenmesinde bölgesel farklılıklar vardır. Gıda tedarikinde bulunmaları ve deney hayvanları üzerindeki etkileri nedeniyle fumonisinlerin insanlarda böbrek hastalığına katkıda bulunabileceği öne sürülmüştür (43).

ß-D-Glukanlar ve mananlar büyüme sırasında mantarlar tarafından atılır (26,39) ve bu nedenle bakteriyel endotoksin gibi potansiyel olarak kan ve lenf yoluyla dağıtılabilir. Divertiküler hastalık ve bağırsağın yapısal ve fonksiyonel bütünlüğündeki diğer anomaliler, PKD hastalarının %80'e varan kısmında ortaya çıkabilir (2,44). Bağırsaktan türetilen endotoksinin absorpsiyonunun önündeki engellerin azalmasına ek olarak, çıkıntılar (divertikül), bağırsak mikroflorasının (45) küçük alt popülasyonları tarafından aşırı büyüyerek, potansiyel olarak emilebilir mikrobiyal bileşenlerin olağandışı karışımlarının artan miktarlarını üretir. Divertiküler hastalık (44) ve edinsel böbrek kistik hastalığı (46) hemo- ve periton diyalizindeki hastalarda ortaya çıkar. Bu akıl yürütme çizgisinin simetrisini tamamlamak için, PKD'deki renal tübül çıkıntıları hem kist hem de divertikül olarak tanımlanır (2). Bazal laminanın intrakist basıncının ve elastikiyetinin doğrudan ölçümü, sistogenezin obstrüksiyon hipotezinin (yani, fiziksel bir balon şişirme) reddedilmesine yol açmıştır ve bazal laminanın hücre aracılı yeniden yapılandırılması ve kiste elektrolit taşınması ile birleştirilmiştir. intrakist hacmini genişletin (47). Divertiküler hastalığın basınca bağlı bir lezyon olduğu düşünülse de, PKD ve diyaliz hastalarında bağırsak divertikülü ayrıca basınçla daha da desteklenen hücresel bir lezyonu içerebilir. Böylece böbrek ve bağırsaktaki divertikül mikrobiyal bileşenlerle ilişkilidir. Renal sistogenez, bağırsak divertikülünün oluşumu ve enfekte edici materyalin duvarlanması süreçlerinin hepsinin insanlarda aynı savunma tepkisinin yönleri olup olmadığı bilinmemektedir. Basit bir kistik böbrek sıvısında nispeten yüksek konsantrasyonlarda endotoksin bulundu (Tablo 1), bağırsak veya safra yolu tıkanıklığı ve idrar yolu enfeksiyonları basit böbrek kistleri ile ilişkilendirilmiştir (2). Endotoksinin "yüksek sodyumlu kist sıvıları" ile ilişkili olduğu öne sürülmesine rağmen (47), düşük ve yüksek sodyum içerikli kist sıvılarında endotoksin gözlemledik (veriler gösterilmemiştir).

Çalışmamızla ilgili olarak, ß-DG'nin bakteriyel endotoksin ve enfeksiyona karşı duyarlılıkla sonuçlanan hücre sistemlerini hazırlama kapasitesinin raporudur (48), ß-DG-endotoksin artışının bir örneği ß-DG ve endotoksin de güçlü bir makrofajlar üzerinde sinerjik etki (49). Ayrıca, mikotoksin ve endotoksin arasında sinerji olduğuna dair raporlar mevcuttur (50).

Mantar DNA'sının Tespiti

Şekil 2. Evrensel mantar primerleri ITS 1 ve NL 4 ile normal ve PKD böbrek dokusu ve kist sıvılarının amplifikasyon sonuçları. 2A: 1:10, 1:100 ve seyreltilmiş sağlıklı insan böbrek dokusundan DNA.

Mantar DNA'sını geçmiş veya mevcut mantar enfeksiyonunun kanıtı olarak ve/veya mantar bileşenlerinin böbrek kistlerine absorpsiyonunu ve dağılımını belirlemek için, PKD kist sıvılarında ve böbrek dokusunda mantar DNA'sını amplifiye etmek ve böylece saptamak için polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) yöntemleri kullanıldı. Üç hastadan alınan altı kist sıvısı ve iki otozomal dominant PKD hastasından alınan iki böbrek dokusu örneğinin tümü mantar DNA'sı için pozitifti. Normal insan böbreğinin bir numunesi mantar DNA'sı için negatifti (Şekil 2 A-C). Kist sıvılarından kültür doğrulaması yapılmadığından, türe özgü problarla genişletilmiş çalışmalar garanti edilir.

Polimeraz zincirleme reaksiyonu

PCR örnekleri şunları içerir: 1) kafa travması nedeniyle ölen 7 yaşındaki bir kız çocuğundan alınan normal insan böbrek dokusu (0.46 g) böbrek, hematom varlığı nedeniyle nakledilemezdi, ancak başka türlü normaldi, PCR için kullanılan bölüm hariç tutuldu hematom alanı. 2) İki otozomal dominant PKD hastasının her birinden kist sıvısından yoksun 0,5 g kistik doku (donör 4 ve 5, Tablo 1). 3) çoklu kist sıvıları (her donör 4, 5 ve 6 için 0,5-1,0 ml). Pozitif kontrol, ekstrakte edilen DNA'dan oluşuyordu. A. tamarii (NRRL 26010) artı astar. Mantar genomik DNA'sı için CTAB ekstraksiyon yöntemi kullanıldı. Mantarlar için evrensel oligonükleotid primer çifti ITS 1 ve NL4, daha önce tarif edildiği gibi (51) kullanıldı, NL 4 ters primerdir. 1.5 mM MgCl ile PCR ana karışımı (37)2 ve 100 ml'lik bir nihai reaksiyon hacmindeki primerler, aşağıdaki termal döngü parametrelerine (Perkin Elmer Thermo Cycler 1) tabi tutuldu: 40 döngü için 96°C-30 saniye 53°C-30 saniye ve 72°C-30 saniye, ardından 72°C'de son 7 dakikalık bir uzatma ile ve 4°C'de ıslatın. Beklenen moleküler ağırlıklı PCR ürünlerinin (600 bp) mevcudiyeti, %1.0 agaroz jeli üzerinde ayrıldıktan sonra etidyum bromür boyaması ile doğrulandı. Amplifiye edilen ürünler, bant yoğunluğundaki bantların varlığı veya yokluğu temelinde benzerlik açısından görsel olarak karşılaştırıldı.

AC, evrensel mantar primer çifti, ITS 1 ve NL 4 ile PCR amplifikasyonunu takiben sağlıklı böbrek dokusu, kistik böbrek dokuları ve kist sıvılarının agaroz jel elektroforezi ile elde edilen bant modellerini temsil eder. Negatif PCR kontrollerinde amplifiye mantar ürünleri tespit edilmedi ( 2A, şerit 5 2B ve C, şerit 9) veya normal insan böbrek dokusu (2A, şerit 1-3). Belirgin bir tezat olarak, kullanılan her bir mantar primerinin tahmin edilen boyutunun farklı bantları (

600 bp 45) tüm kistik böbrek dokularında tespit edildi ve üç hastadan (2B-C) incelenen sıvılarda minör fragman tespit edilmedi. Göç paternleri, pozitif mantar DNA kontrolü (2A, şerit 4) ile tutarlıydı.

PKD böbreklerinden ß-DG veya pozitif serolojik bulgular gösteren doku ve sıvılarda mantar DNA'sı beklenmiş olsa da, bu bileşenlerden yoksun olan donör 6'dan (2B ve C: Şerit 1 ve 5) alınan PKD kist sıvısında da mantar DNA'sı bulunmuştur.. Donör 4 ve 5'ten test edilen ß-DG pozitif kist sıvıları sırasıyla Şerit 2 ve 3 ve 4 ve 6'dadır. Şerit 3'te gösterilen sıvı da pozitif serolojik sonuçlara sahipti. F. solani PCR ile test edilen diğer sıvılar üzerinde antijen serolojik testi yapılmadı. Her bir kist sıvısı bağımsız bir örnek olarak kabul edilmelidir, aynı böbrek içindeki diğer sıvılar bazında kist içeriğinin doğrudan ölçümünü gerektiren varsayım geçerli değildir (16). Donör 4 ve 5'ten alınan böbrek dokusunda da mantar DNA'sı tespit edildi (Şekil 2B ve C Şeritleri 8 ve 7). Kullanılan iki primer arasında farklar kaydedilmiştir, ITS 1 tüm PKD numunelerinde amplifiye ürünler verirken, NL 4 daha az amplifiye olmuş, ß-DG'nin tespiti ile daha uyumlu olmuştur. Amplikonlar, mantar DNA'sının olası kanıtıdır.

Önemli çabalara rağmen, aksenik yöntemlerle PKD kist sıvılarından ne bakteri ne de mantar kültürü elde edemedik, ancak kültür L-formları veya diğer hücre-şekillerine uygun PKD böbrek dokusu (aşağıya bakınız) yöntemlerle kültürlenmiş epitel hücrelerinde mantarlar tespit edildi. duvar kusurlu mikroplar gerçekleştirilmedi.Kist sıvısı süpernatlarının ve peletlerinin gram boyaları, sağlam bakteri göstermedi. Elektron mikroskobu da bozulmamış bakteriler göstermedi, ancak bazen mantar hücre duvarları ile tutarlı bir alan gözlendi (gösterilmemiştir) bozulmamış mantarlar gözlenmedi. Bununla birlikte, mantar organizmalarının sıklıkla PKD epitel hücre kültürlerinden izole edilmesi, kist sıvısında ß-DG'nin tanımlandığı yalnızca PKD böbreklerinden olmuştur. Laboratuarda aynı reaktifler ve çalışma alanları tarafından izole edilen ve çoğaltılan diğer insan ve hayvan hücrelerinde mantar üremesi yoktu. Mantarların cinse ait olduğu tespit edildi. Paecilomyces ve yeni bir tür penisilyum (el yazması hazırlanıyor). PKD'de böbrek enfeksiyonlarında etiyolojik ajanlar olarak mantarlar nadiren de olsa bildirilmiştir (8). Yukarıdakilerin tümü göz önüne alındığında, PKD böbrek dokusunda canlı mantarların mevcut olması mümkündür, ancak sadece kalıntıları kist sıvısındaydı. İnsanların bulaşıcı hastalık konusundaki farkındalığının artması, bu PKD çalışmasındaki deneyimimizi iyi tanımlayabilir.

Bulaşıcı Hastalık, Mikrobiyal Toksikoz ve Sfingolipid Biyolojisi

Sfingolipid biyolojisi ve PKD'nin mikrobiyal toksinlere karşı savunmasızlığı hakkında gelişen bilgiler, PKD'ye yeni bir bakış için bir fırsat sunuyor. Spiegel ve Merrill'in (52) belirttiği gibi, sfingolipidler, her ikisi de PKD'de (53,54) değiştirilen iki geniş kategoriye ayrılır. Karmaşık sfingolipidler (yani, karbon-1 üzerinde bir karbonhidrat veya fosfokolin baş grubuna sahip seramid), büyüme faktörü reseptörleri ve hücre dışı matris ve bitişik hücreler ile etkileşime girer ve gram-pozitif ve -negatif bakteriler ve mikrobiyal toksinler için bağlanma yerleri olarak işlev görür. Sfingolipidlerin ikinci kategorisinde, seramid sfingoid bazları (yani, sfingosin, sfinganin, fitosfingozin) ve bunların 1-fosfatları, protein kinazların ve fosfatazların, iyon taşıyıcıların ve artan sayıda sinyal iletim işleminin aktivitesini değiştirir. Bununla birlikte, insan sfingolipid biyolojisinin dinamikleri, mikropların baskın olduğu bir çevre bağlamında meydana gelir.

Şekil 3. Endotoksin ve mikotoksinlerin sfingolipid metabolizması üzerindeki etki alanları. PKD'de renal sfingolipid oluşumu değişmiştir. Bu tür tehlikeye atılmış sfingolipid yollarının, bu son derece güçlülere karşı savunmasız olması beklenir.

Bu nedenle, insan sfingolipidlerinin hareketlerini veya metabolizmasını taklit eden veya antagonize eden mikrobiyal kökenli sfingolipid benzeri moleküller olan "mikrosfingoidler" adı verilen üçüncü bir kategori öneriyoruz. Örnekler arasında, bunlarla sınırlı olmamak üzere, çeşitli mikotoksinler (42,55-57), bakteriyel sfingolipidler (58) ve endotoksin (59,60) yer alır. Bu raporda, endotoksin ve mantar antijenlerinin veya en azından antikorların varlığını gösterdik. Fusarium, Aspergillus, ve kandida insan PKD dokularında ve insan PKD hücrelerinden gelen sıvılarda in vitro olarak karşılaştık Paecilomyces ve penisilyum. Bu mantarlar, sfingolipid biyosentezi için gerekli olan çoklu enzimleri inhibe eden (55 Şekil 3) ve protein fosfatazlar, kalmodulin ve GTP bağlayıcı proteinler (56,61) gibi sinyal iletim basamaklarının çeşitli elemanlarının aktivitesini değiştiren mikotoksinler üretirler. Bu tür mikotoksinler, gıda güvenliği konusunda ortaya çıkan bir endişe olan insan diyetinde de bulunur (42,43,55). Rietschel et al. (13) LPS'nin glikosfingolipidlere benzerliğine dikkat çekmiştir. Wright ve Kolesnick (59), bakteriyel LPS'nin Lipid A bölgesinin seramid ile yapısal benzerliğini ve LPS'nin protein kinaz ve fosfataz aktivitelerinde seramidin neden olduğu değişiklikleri taklit etme yeteneğini gözden geçirmiştir. Endotoksinin ayrıca memeli sfingolipidlerinin yapısını değiştirdiği (62) ve hepsi biyolojik aktivite sergileyen seramid, sfingosin-1-fosfat ve lizosfingolipidler üreten sitokin aracılı kaskadları başlattığı bildirilmektedir (13,63). Gibi cinsler tarafından oluşturulan bakteriyel sfingolipidler göz ardı edilmemelidir. bakteriyotlarbağırsak mikroflorasının yaklaşık %30'unu temsil eder (58). Bakteriyel sfingolipidlerin ve bunların metabolitlerinin insan biyolojisindeki rolü ve hastalıkta biyoyararlanımı tam olarak anlaşılamamıştır. "Mikrosfingoid" terimi, mikropların insan sağlığı ve hastalığında sfingolipid biyolojisine katkısını vurgulamayı amaçlamaktadır.

Genetik anomalilerin ve/veya "mikrosfingoidlerin" neden olduğu sfingolipid biyolojisindeki pertübasyonlar, böbrek kistik hastalığının hem infantil otozomal resesif hem de erişkin başlangıçlı formlarından sorumlu olabilir mi? Hannun (64), çeşitli uyaranlara yanıt olarak yürütülen çeşitli hücresel programları düzenleyen "biyostatlar" olarak sfingolipidlerin rolünü gözden geçirmiştir. Bu tür biyostatik düzenleme, böbrekteki hücresel davranış ve farklılaşmadaki hem akut hem de kronik değişiklikleri açıklayabilir (65). Calvet et al. (2,66), kalıtsal ve edinsel kistik böbreklerde bulunan epitel hücrelerinin olgunlaşmamışlığını veya farklılaşmamış durumunu açıklamak için iki model önermiştir: İnfantil kistik hastalıkta, epitel hücreleri asla terminal farklılaşmaya ulaşmaz ve olgunlaşmamış bir durumda hapsolur, erişkinde ise kistik hastalık formları, başlangıçta olgunlaşmış böbrek epitelinde toksin kaynaklı hasarı, epitelin tamamen farklı bir duruma geri kazanamaması izler. genetik olarak kistik cpk/cpk fareler (otozomal resesif PKD için bir model), Deshmukh ve ark. (53) kistik farelerin böbrek dokusunda seramid ve kompleks glikosfingolipid düzeylerinin değiştiğini bildirdiler, ancak fenotipik olarak normal yavrularında değil. Daha düşük seviyelerde seramid ve sülfatid, ancak daha yüksek seviyelerde glukozil- ve lakto-silseramid ve gangliosid GM3 ölçülmüştür. İnfantil ve yetişkin insan PKD böbrek dokusu ve kist sıvıları üzerindeki araştırmamız, memeli sfingolipidlerinin de novo biyosentezi sırasında oluşan birincil sfingoid baz olan saptanabilir serbest sfinganin göstermedi (54). Bu nedenle, sfingolipid biyolojisindeki anomaliler kistik böbrek dokusunda mevcuttur.

PKD'de sfingolipid biyolojisi kavramlarını bulaşıcı hastalık, mikrobiyal bileşenler ve "mikrosfingoidler" ile ilgili düşüncelerden ayırmak zordur. PKD hücrelerinin yüzeyindeki glikosfingolipidlerdeki değişikliklerin potansiyel sonuçları, bağlanma bölgeleri olarak kompleks sfingolipidlerin mevcudiyeti nedeniyle artan mikrobiyal kolonizasyonu içerir. Mikropların veya bileşenlerinin bu tür sfingolipidlere bağlanması, kompleks sfingolipide bağlanmanın hücre farklılaşması ve morfolojisinde in vitro değişikliklere neden olduğu rapor edildiğinden, sistojenezi teşvik edebilir (67). Sfingoid bazların değiştirilmiş biyosentezi, sfinganin/sfingosine oranlarını, sinyal iletiminin sonuçlarıyla etkiler (61) ve hatta sfingoid bazların doğrudan antifungal ve antibakteriyel aktiviteye sahip olduğu bildirildiğinden (68) antimikrobiyal ortamı değiştirebilir. İnsan kist sıvısındaki (Hjelle, unpub.) sfingosin seviyeleri, in vitro olarak böbrek hücrelerinde bir sito-direnç durumunu (hücresel farklılaşma) indükleyen seviyelerle karşılaştırılabilir (69). Memeli sfingolipid metabolizması ürünlerine ek olarak, PKD'nin infantil ve erişkin formlarından alınan kist sıvılarında ve basit kistlerde nispeten yüksek miktarlarda endotoksin bulunmuştur (Tablo 1). "Mikrosfingoidler" veya mikrobiyal toksinler, böbrek epitel hücrelerine zarar verebilir ve ardından onarımını önleyebilir mi? Farklı bilimsel disiplinlerden elde edilen veriler bu olasılığı desteklemektedir.

LPS, nefron oluşumunu (70) ve renal sistogenezi (11) etkiler. Fumonisinler güçlü nefrotoksinlerdir (43,55), böbrek hücrelerinde in vitro onarım mekanizmalarını değiştirir (71) ve apoptozu indükler (72,73). Kemirgenlerin fumonisinlere kronik maruziyetinden sonra bazen böbrek kistleri rapor edilmektedir (74). PKD böbrek dokusunda programlanmış hücre ölümü oranları anormaldir (75,76) seramid apoptozda çok önemli bir habercidir (64). PKD'de, hücre zarı proteinlerinin ve salgı materyallerinin işlenmesi ve sınıflandırılması değişir (2-4) sfingolipidler, zarların ve iyon taşıyıcıların işlenmesini, sınıflandırılmasını ve hareketini etkiler (64,65), tıpkı böbrek hücrelerinde in vitro fumonisin (77) . PKD'de çeşitli elektrolit taşıma sistemleri değiştirilir (2). cAMP aracılı elektrolit akışlarının kist oluşumunda önemli olduğu öne sürülmüştür (3). Fumonisinlerin cAMP yanıt elemanlarını aktive ettiği bildirilmektedir (78). Kist sıvısı, in vitro olarak sistogenezi destekleyen karaktersiz maddeler içerir (3). LPS izole edilmesine rağmen Escherichia koli in vitro olarak böbrek hücrelerinde beklenen sistojenik tepkilerin tam dizisini indüklememiştir, endotoksinin yapısı, gücü ve ortaya çıkan biyolojik tepkilerin dizisi, izole edildiği bakteri türlerine ve türlerine bağlıdır (13). Mantar bileşenlerinin varlığı ile birleştiğinde, kist sıvısı muhtemelen "mikrosfingoidler" ve zamanla değişebilen toksinlerin karmaşık bir karışımını temsil eder ve kist oluşumuna dinamik sonuçlar verir. Erişkin PKD'de kist hacminin ve büyüme faktörlerinin ve sitokinlerin içeriğinin heterojenliği kaydedilmiştir (3,16).

Enfeksiyon ve "mikrosfingoidler" kavramları, PKD gen ürünlerinin genişleyen bilgisi ile birleşiyor gibi görünmektedir. PKD1 (polisistin) ve PKD2 gen ürünlerinin yapıları, voltajla aktive olan a1E alt tipi, kalsiyum kanalları (3,6) ve muhtemelen döllenme sırasında kalsiyum akışlarına dahil olan bir deniz kestanesi proteini (79) ile benzerlik paylaşır. LPS, memeli hücrelerinde voltajla aktive olan kalsiyum kanallarını (80) ve ozmoregülasyonu (81) değiştirir. PKD1 gen ürünü ayrıca, bitişik hücrelere ve hücre dışı matrise bağlanmada varsayılan olarak dahil olan ligand ve reseptör alanları ile homoloji bölgeleri içerir (3) böyle bir alan, mikropları bağlayabilen C tipi lektinlere benzer (82). Yetişkin PKD'de polisistini eksprese eden böbrek ve bağırsak dahil dokular, böbrek kistlerinde (3) görüldüğü gibi normal moleküler ve partikül trafiğine nispeten daha fazla sızıntı ve divertiküloza yatkınlık (3,44) sergileyebilir. Polisistin ayrıca düşük yoğunluklu lipoproteinden apoprotein ile homoloji gösterir. LPS ve sfingolipidler serum lipoproteinlerine bağlandığından ve bunlar tarafından taşındıklarından, polisistindeki düşük yoğunluklu lipoprotein bağlama bölgesi aynı zamanda "mikrosfingoidlerin" birikmesini ve/veya taşınmasını da sağlayabilir.

PKD genlerindeki ikincil mutasyonlar, klonal kist oluşumu için gerekli görünmektedir (3,5), apoptoz düzensizliği yoluyla böbrek dokusu kaybı (76). ifadesindeki değişiklikler bclFarelerde -2 gen ürünü polikistik böbreklere ve apoptoz düzensizliğine neden olur (83). Enfeksiyon translokasyonu artırsa da bcl-2 geni insan lenfoid dokusunda (84), PKD hastalarında enfeksiyonun böyle bir düzensizliğe neden olup olmadığı bilinmemektedir. bcl-2 böbrek dokusunda.

Enfeksiyon ve sfingolipidlerle ilgili olarak, seramid bağışıklık sisteminde önemli bir molekül olarak ortaya çıkmaktadır (63) ve fumonisinlerin bağışıklık fonksiyonunu değiştirdiği bildirilmektedir (85). Bulgularımızın potansiyel olarak bağlantı kurması ironiktir. Fusarium Fumonisin, PKD'de sfingolipid metabolizmasını ve sinyal iletimini incelemek için moleküler bir araç olarak kullanıldığından, PKD'ye. Enfeksiyon sırasında karşılaşılan ve bağırsak mikroflorasından salınan klasik bakteriyel sfingomiyelinazlar (örn. stafilokok aureus ve Clostridium perfringens) sfingomyelin hidrolizi ile seramid oluşumunu uyarabilir. Bu nedenle, PKD hastalarının enfeksiyona karşı savunmasızlığı, kısmen, 1) hücre düzenlemesinin "biyostatik" mekanizmalarını, 2) plazma zarının yapısını ve PKD gen ürünlerinin işlevini, 3 etkileyen sfingolipid biyolojisindeki anormalliklerle ilişkili olabilir. ) mikroplar ve bileşenleri için bağlanma yerleri olarak glikosfingolipidlerin mevcudiyeti, 4) bağırsakta bulunan mikrobiyal bileşenlerin biyoyararlanımı ve 5) genel olarak antimikrobiyal savunmalar. Bu tür bir güvenlik açığı, muhtemelen değiştirilmiş bir mikroflora ile kolonizasyon için seçim baskısı sağlayan tekrarlanan antimikrobiyal tedavi kurslarından etkilenir. PKD'deki sfingolipid biyolojisinin mikrobiyal faktörlerden ziyade genetik kusurlardan ne ölçüde etkilendiği henüz tanımlanmamıştır.

PKD gen kusur(lar)ının neden olduğu anomaliler tek başına sistogenezi açıklayamaz. Werder ve diğerleri tarafından gösterildiği gibi. (9) genetik olarak kistik fareleri mikropsuz bir ortamda yetiştirmek, sistojenezi esasen ortadan kaldırdı ve 18 ay boyunca çevre ortamında yetiştirilen yavrulara göre hayatta kalma oranını yaklaşık %100'e çıkardı. İnfantil PKD'den alınan kist sıvısında bile, nispeten yüksek seviyelerde endotoksin bulundu (Tablo 1). Bu, mikrobiyal toksinlerin bu hastalığın erken dönemlerinde mevcut olduğunu göstermektedir. Toksinlere ve "mikrosfingoidlere" doğum öncesi maruziyet bilinmemektedir. İncelenen sekiz otozomal dominant PKD dokusu ve kist sıvısı örneğinden sekizinde mantar DNA'sı bulmamız, böbrek kistlerine mantar maruziyeti arasında yakın bir ilişki olduğunu öne sürse de, diyet ve bağırsak mikroflorasını içeren katkıda bulunan çok yönlü bir mikrobiyal toksikoz göz ardı edilemez. Kendi başına, lezyon bölgesinde mikrobiyal bileşenlerin bulunması, hastalığın ilerlemesinde mikrop(lar) için nedensel bir rol olduğunu kanıtlamaz (1). Bununla birlikte, mikropların birincil hastalığın ilerlemesini desteklediğine ve mikropların bileşenlerinin, hastalığın bilinen patofizyolojisi ile makul bir şekilde ilişkili etkilere neden olmak için memeli biyolojisi üzerinde hareket ettiğine dair kanıtlar temelinde çalışan bir hipotez oluşturulabilir.

PKD'nin genetik bir bozukluk olduğuna dair yerleşik bir bilgi birikimi olmasına rağmen, verilerimiz bakteriyel endotoksin, ß-DG ve muhtemelen diğer mikrobiyal bileşenlerin böbrek içinde sistogenezi tetiklemek için mevcut olduğunu göstermektedir. İnsan PKD kist sıvılarında bakteriyel endotoksin ve ß-DG'nin kimyasal ve gelişmiş LAL tahliline dayalı kanıtlarını sağladık. Kist sıvılarından ve PKD böbrek dokusundan, evrensel mantar primerleri ile serolojik testler ve PCR ile mantar DNA'sı ve hücre bileşenlerinin kanıtlarını sağladık. Bu bulguları, PKD gen ürünleri, PKD'de değişen sfingolipid metabolizması, LPS'nin renal sistogenez üzerindeki etkileri, LPS tarafından seramidin taklit edilmesi ve mikotoksinlerin memeli sfingolipid biyolojisi ve sinyal iletimi üzerindeki etkileri hakkında ortaya çıkan bilgilere dayanan çalışan bir hipoteze entegre ettik. , PKD'de enfeksiyon oluşumu ve değişmiş bağırsak geçirgenliği ve mikrobiyal kolonizasyonun PKD'nin ilerlemesi üzerindeki etkisi. PKD, mikrobiyal etkiler tarafından teşvik edilen genetik bir hastalık mıdır? Bu çok yönlü hipotezin testleri, çok sayıda bilimsel disiplinden alınan çok çeşitli konuların farkındalığını gerektirir. İlgili mikropların ve mikrobiyal bileşenlerin tanımlanması, son derece hassas ve spesifik yöntemler kullanılarak uyumlu bir analiz gerektirecektir. Sağlık ve hastalıkta sfingolipid biyolojisinin önemine dair farkındalık arttıkça, hastalıkta seramid ve kompleks sfingolipid biyokimyasını manipüle etmeyi amaçlayan farmakolojik çalışmalarda mikrobiyal etkilerin dikkate alınması gerekeceği konusundaki takdir de artacaktır. Her yerde bulunan ve oldukça güçlü bakteriyel endotoksin, yine bu durumda hastalık provokatörü olarak incelenen olağan şüphelilerden biridir, endotoksinin, seramidin sinyal iletim mekanizmasını kronik hastalığa neden olmak için kullanma modus operandi'si nihayetinde ortaya çıkabilir.

Miller-Hjelle, Mikrobiyoloji profesörü ve Amerikan Tıbbi Mikrobiyoloji Kurulu Diplomatıdır.


Agaroz jel elektroforezinde fazladan tanınmayan bant elde etmenin olası nedenleri nelerdir? - Biyoloji

Birkaç nöromüsküler ve nörodejeneratif hastalığa, sorumlu genlerin içindeki veya yakınındaki genetik olarak kararsız üçlü tekrar dizileri (CTG·CAG, CGG·CCG veya AAG·CTT) neden olur. Yedi üçlü tekrar dizisini (GTA·TAC, GAT·ATC, GTT·AAC, CAC·GTG, AGG·CCT, TCG·CGA ve AAG·CTT) klonlamak için kimyasal olarak sentezlenmiş oligonükleotidlerle yeni klonlama stratejileri uyguladık ve bitişik kağıt (Ohshima, K., Kang, S., Larson, JE ve Wells, RD (1996) J. biyo. kimyasal. 271, 16784-16791), TTA·TAA ile ilgili çalışmaları anlatmaktadır. Bu yaklaşımla birlikte canlıda genişleme çalışmaları Escherichia koli değişen derecelerde polimorfizmlerle her iki yönde ∼16 ila 158 üçlüye kadar uzunluklara sahip tekrar dizilerini içeren en az 81 plazmitin hazırlanmasını sağladı. Ekler, DNA dizilemesinin yanı sıra DNA polimeraz duraklamaları, iki boyutlu agaroz jel elektroforezi ve negatif süper bobin kaynaklı B olmayan DNA konformasyonlarını benimseme kapasitesini değerlendirmek için kimyasal prob analizleri ile karakterize edildi. AAG·CTT ve AGG·CCT, molekül içi tripleksler oluşturur ve diğer beş tekrar dizisi, önceden karakterize edilmiş B-olmayan yapılar oluşturmaz. Ancak, TCG·CGA'nın uzun yolları, CTG·CAG ve CGG·CCG (Kang, S., Ohshima, K., Shimizu, M., Amirhaeri) durumlarında görüldüğü gibi tekrarlardaki belirli lokuslarda güçlü DNA sentezi inhibisyonu gösterdi. , S. ve Wells, RD (1995) J. Biol. Kimya 270, 27014-27021). Bu çalışma, diğer çalışmalarla birlikte (Wells, R.D. (1996) J. biyo. kimyasal. 271, 2875-2878), CTG·CAG, CGG·CCG ve TTA·TAA'da çeşitli fiziksel, moleküler biyolojik, genetik ve tıbbi araştırmalar için tüm 10 üçlü tekrar dizisinin uzun eklerini sağlar. Moleküller arası tripleks oluşumuna dayalı Friedreich ataksisinde mRNA bolluğundaki azalmayı açıklayan bir model önerilmiştir.

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitülerinden Grant GM52982, Ulusal Bilim Vakfı'ndan Grant DMB-9103942 ve Robert A. Welch Vakfı tarafından desteklenmiştir. Bu makalenin yayımlanma masrafları kısmen sayfa ücretlerinin ödenmesiyle karşılanmıştır. Bu nedenle, makale işbu belgede “işaretlenmelidir”Reklamcılık” 18 U.S.C. Bölüm 1734, yalnızca bu gerçeği belirtmek için.

Mevcut adres: Genetik Hastalık Araştırma Laboratuvarı, Ulusal İnsan Genomu Araştırma Merkezi, Ulusal Sağlık Enstitüleri, Bina 49, Bethesda, MD 20892.


Daha fazla ne zaman ve nasıl araştırılacağı

Cleveland Clinic, kar amacı gütmeyen bir akademik tıp merkezidir. Sitemizde reklam vermek, misyonumuzu desteklemeye yardımcı olur. Cleveland Clinic dışı ürün veya hizmetleri onaylamıyoruz.

Monoklonal gammopatiler, anormal bir plazma hücreleri klonu veya diğer lenfoid hücreler tarafından bir monoklonal proteinin (M proteini) üretimi ile karakterize edilen bir dizi bozukluğu kapsar. Önemi belirsiz monoklonal gamopati (MGUS) bu bozuklukların en yaygın olanıdır. MGUS için tanı kriterleri aşağıda listelenmiştir.

Klinik önemi, multipl miyelom veya diğer lenfoproliferatif bozukluklar gibi hematolojik malignitelere veya M proteininin toksik etkilerine bağlı organ disfonksiyonuna ilerleme riskinde yatmaktadır. Bir M proteini, sağlam bir immünoglobubin (Ig) molekülünden (yani, iki hafif zincir ve iki ağır zincirden (en yaygın olarak IgG tipi, ardından IgA ve IgM) veya yalnızca bir hafif zincirden (kappa veya lambda) oluşabilir.

MGUS, 50 yaş üstü nüfusun yüzde 3 ila 4'ünde bulunur ve yaşlı erkeklerde, Afrikalı-Amerikalılarda ve Afrikalılarda daha yaygındır.

Miyelom ve ilgili bozukluklara ilerlemenin genel riski, M proteininin alt tipine bağlı olarak yılda yüzde 1'e eşit veya daha azdır (IgM ile IgM olmayan ve hafif zincirli MGUS'a göre daha yüksek risk). Malign transformasyon riski düşük olmakla birlikte, multipl miyelom hemen hemen her zaman asemptomatik ve sıklıkla tanınmayan bir monoklonal proteinin varlığından önce gelir.

Ne zaman bir M proteini aramalıyız?

Bir M proteini, bir hasta bir dizi mevcut semptom veya durumdan herhangi biri için değerlendirilirken tipik olarak tesadüfi bir bulgudur. Geniş bir retrospektif çalışma, MGUS taramasının çoğunlukla dahiliye hekimleri tarafından yapıldığını bulmuştur. Test endikasyonları anemi, kemikle ilgili sorunlar, yüksek kreatinin, yüksek eritrosit sedimantasyon hızı ve nöropati idi.

Kötü huylu ilerleme riskinin düşük olması, hasta sonuçları üzerinde etkisinin olmaması, eşlik eden duygusal yük ve tedavi seçeneklerinin olmaması göz önüne alındığında, klinik şüphenin yokluğunda bir M proteini için rutin tarama önerilmez. Monoklonal gammopati için değerlendirme, ilişkili klinik semptom ve bulgular ile laboratuvar ve görüntüleme bulgularının incelenmesinin bir parçası olarak düşünülebilir.

Düşük bir anyon açığı, yüksek bir konsantrasyon olmadıkça, bir M proteininin majör bir göstergesi değildir; bu durumda, tanıya rehberlik edecek böbrek yetmezliği gibi başka belirtiler mevcut olacaktır. Düşük anyon açığının bir nedeni olarak poliklonal hipergamaglobulinemi MGUS'tan çok daha yaygındır.

Serum protein elektroforezi bir M proteinini tanımlamak için kullanılan bir başlangıç ​​testidir ve onu ölçmekte kilit bir role sahiptir. Bir M proteini, agaroz jel üzerinde dar bir sivri uç olarak görünür ve diğerlerinin yanı sıra siroz ve kronik enfeksiyöz ve inflamatuar durumlarla ilişkili poliklonal gammopatilerde görülen geniş banttan ayırt edilmelidir. Serum protein elektroforezinin önemli bir dezavantajı, çok düşük konsantrasyonlarda bir M proteinini tespit edememesi veya kimliğini belirleyememesidir.

serum immünfiksasyonu serum protein elektroforezinden daha hassastır ve çoğunlukla küçük miktarlarda M proteininin saptanmasını sağlamak ve ağır zincir ve hafif zincir bileşenlerinin türünü belirlemek için her zaman onunla birlikte sipariş edilmelidir.

Serumsuz hafif zincir testi ayrıca hafif zincirli MGUS ve hafif zincirli miyelomu saptamak için tarama sürecinin önemli bir parçası olarak kabul edilir. Miyelom hastalarının yüzde 16'sı sadece serum immünfiksasyonunda tanımlanamayan hafif zincirler salgılar. Genel olarak, düşük bir kappa-lambda oranı (< 0.26) lambda hafif zincirlerinin aşırı üretimini gösterir ve yüksek bir oran (> 1.65) kappa hafif zincirlerinin aşırı üretimini gösterir.

Serum içermeyen hafif zincir testi, monoklonal hafif zincirlerin anormal salgılanmasını, böbrek tübülleri doygun hale geldiğinde ve onları yeniden ememez hale geldiğinde idrarda görünmeden önce tespit etmeye yardımcı olur.

Unutulmamalıdır ki, serbest hafif zincir oranı kronik böbrek hastalığında anormal olabilir (< 0.26 veya > 1.65). Bu nedenle, anormal bir hafif zincir oranının böbrekler tarafından bozulmuş hafif zincir klirensi ile mi yoksa MGUS ile mi ilişkili olduğunu ayırt etmek zor olabilir. Genel olarak, kappa hafif zincirleri, kronik böbrek hastalığında lambda hafif zincirlerinden daha yüksektir, ancak oran önemli ölçüde çarpık olmamalıdır. 0.37'nin altında veya 3'ün üzerinde bir kappa-lambda oranı, kronik böbrek hastalığında nadiren görülür ve MGUS için çalışma yapılmasını gerektirir.

Kombine testler. M proteinleri için taramanın duyarlılığı, yalnızca serum protein elektroforezi ile yüzde 82'den, serum immünofiksasyonu eklenmesiyle yüzde 93'e ve serumsuz hafif zincir tahlili ile yüzde 98'e kadar değişir. Sonuncusu, daha yüksek duyarlılığı göz önüne alındığında, M proteini için tarama yapılırken idrar protein elektroforezi ve immünfiksasyonun yerini alabilir. Önemli bir uyarı, idrar ölçüm çubuğu testinin idrar hafif zincirlerini tespit etmemesidir.

Bir M proteini bulunduğunda, semptomatik miyelom ile ilişkili olabilen anemi, böbrek yetmezliği ve hiperkalsemi aramak için immünoglobulin ölçümü, tam kan hücresi sayımı ve serum kreatinin ve kalsiyum ölçümleri de önerilir.

Gelecekteki gönderiler, MGUS'un ayırıcı tanısını ve risk sınıflandırmasını tartışacaktır.

Dr. Khouri, Hematoloji ve Tıbbi Onkoloji Bölümü'nde öğretim üyesidir. Dr. Samaras, Valent ve Mejia Garcia, Hematoloji ve Tıbbi Onkoloji Departmanında görevlidir. Faiman, Bayan Mathur ve Bayan Hamilton, Hematolojik Onkoloji ve Kan Bozuklukları Bölümünde klinik hemşire uygulayıcılarıdır. Dr. Nakashima, Klinik Patoloji Bölümünde görevlidir. Dr. Kalaycio, Hematoloji ve Tıbbi Onkoloji Anabilim Dalı Başkanıdır.

Bu kısaltılmış makale orijinal olarak şurada yayınlanmıştır: Cleveland Clinic Tıp Dergisi.


Agaroz jel elektroforezinde fazladan tanınmayan bant elde etmenin olası nedenleri nelerdir? - Biyoloji

Jel Filtrasyon Kromatografisi ve Elektroforez ile DNA ve RNA'nın Ayrılması

Deney tarihi: 26 Ekim 2001

Gönderildi: 16 Kasım 2001

Bu deneyin amacı, kromatografinin sonuçlarını analiz etmek için önce jel filtrasyon kromatografisini ve ardından jel elektroforezi kullanarak DNA'yı RNA'dan ayırmaktı. Elde edilen sonuçlar kromatografinin DNA'yı RNA'dan ayırmada sadece kısmen etkili olduğunu gösterdi. Elektroforezin, DNA'yı RNA'dan ayırmak için kromatografiden çok daha etkili bir yöntem olduğu gösterildi. Kromatografiyi daha etkili hale getirmek için öneriler arasında kolonun uzatılması ve ilk kromatografiden sonra kalan kontamine numuneler üzerinde kromatografi tekniğinin birkaç kez kullanılması yer alır.

Farklı boyut ve şekillerdeki molekülleri ayırmak için jel filtrasyon kromatografisi tekniği kullanılır (JAC Biology NYA Laboratory Outlines, 2001). Bu deneyin amacı, plazmit DNA ve bozulmuş RNA fragmanları içeren bir karışım almak ve iki tür nükleik asidi ayırmaktır. Jel süzme işlemi, RNA ve DNA karışımının bir elüsyon tamponu tarafından bir cam kolonda bulunan bir süzme matrisi içinden taşınmasına izin vermeyi içerir. Matris, gözenekli mikroskobik boncuklardan oluşur (JAC Biology NYA Laboratory Outlines, 2001). Daha büyük, düzensiz şekilli moleküller boncukların gözeneklerine nüfuz edemez ve bunun yerine boncukların etrafında akma eğilimi gösterirken, daha küçük, kompakt (genellikle küresel) moleküller matristen geçmeden önce bir süre gözeneklerde hapsolma eğilimindedir (JAC Biyolojisi) NYA Laboratuvar Anahatları, 2001). Bu nedenle, daha ağır bir molekül, matristen daha hafif olandan daha hızlı geçecektir. Ayırma başarılı olursa, matristen geçen ilk numuneler DNA içermeli, daha sonraki numuneler ise RNA içermelidir, çünkü plazmit DNA'nın moleküler kütlesi, bozulmuş RNA'dan daha yüksektir.

Jel filtrasyon kromatografisinin etkinliğini test etmek için jel elektroforezi adı verilen başka bir işlem kullanılır. Jel elektroforezi yine molekülleri büyüklüklerine ve şekillerine göre ve aynı zamanda yüklerine göre ayırır (JAC Biology NYA Laboratory Outlines, 2001). Kromatografi sırasında toplanan numuneler bir jel yatağına yerleştirilir ve jel yatağına voltaj uygulandığında moleküller çekildikleri direğe doğru göç ederler. DNA ve RNA durumunda, iki tip nükleik asit üzerindeki yük-kütle oranı bir faktör değildir, çünkü her bir baz çifti yükü için her zaman iki negatif yüklü fosfat grubu vardır (JAC Biology NYA Laboratory Outlines, 2001). Her iki nükleik asit türü de pozitif kutba doğru göç edecek, ancak RNA daha küçük olduğu için jel yatağında daha hızlı hareket edecektir. Bunun nedeni, jeldeki polimer liflerinin kalınlaşmasının, daha uzun fragmanları daha kısa olanlardan daha fazla engellemesidir (Campbell, 1999). Esasen, daha uzun moleküller, daha kısa olanlardan daha fazla lifle temas halindedir ve ekstra liflerin ilave sürtünmesi ile yavaşlar.

Jel elektroforezini bir süre çalıştırdıktan sonra, jel filtrasyon kromatografisinin DNA ve RNA'yı ne kadar iyi ayırdığını görmek mümkün olmalıdır. İlk birkaç numune, yalnızca jel yatağında çok fazla hareket etmeyen bir bantla temsil edilmesi gereken DNA'yı içermelidir. Sonraki numuneler, jel yatağında daha fazla hareket eden bantlarla temsil edilmesi gereken RNA'yı içermelidir.

Aşağıdaki değişiklikleri göz önünde bulundurarak JAC Biology NYA laboratuvar anahatlarına bakın.

- 7. adımda "Kısım Toplama" bölümünde 27 damla toplandı

-Adım 8 sırasında "Kısım Toplama" bölümünde, 1, 2 ve 3 numaralı numune tüplerine 4 damla yerleştirildi. Ayrıca, 5-9 numaralı numune tüplerine 12 damla yerleştirildi.

- Adım 3 sırasında "Agaroz Jel Yatak Hazırlama" bölümünde, 500 ml'lik bir Erlenmeyer şişesi kullanıldı.

Sonuçların bir taramasını görüntülemek için burayı tıklayın

Tartışma ve sonuç:

Jelimizin taraması, hem jel filtrasyon kromatografisinin hem de jel elektroforezinin etkinliğini açıkça göstermektedir. Kromatografi ile ayırmanın sonuçları, hangi örneklerin saf DNA içerdiği, hangilerinin saf RNA içerdiği ve hangilerinin karışım içerdiğine bakılarak tartışılabilir. İlk iki şerit boştu ve ne DNA ne de RNA içeriyordu. Bu sadece, bu numuneler alındığında DNA karışımının matristen akmadığını gösterir. İlk iki numune, yalnızca matrisi paketlemek için kullanılan elüsyon tamponunu içermelidir. Üçüncü örnek sadece DNA içeriyordu ve bu türdeki tek saf örnek, dördüncü ve beşinci örnekler ise DNA ve RNA karışımı içeriyordu. Üçüncü örnek, yalnızca DNA içeren tek örnek olduğundan, DNA'nın RNA parçalarından tamamen ayrıldığı tek örnekti. Bu nedenle, yalnızca üçüncü numune durumunda jel filtrasyon kromatografisi tekniği tamamen etkiliydi. DNA ve RNA karışımı içeren örnekler, bazı DNA ve RNA fragmanlarının matristen aynı sürede geçtiğini göstermesi bakımından ilginçtir. DNA, RNA'dan daha ağır olduğu için, DNA'nın tamamı matristen herhangi bir RNA'dan önce geçmiş olmalıdır (JAC Biology NYA Laboratory Outlines, 2001). Bir karışım içeren numuneler, DNA'nın moleküler ağırlığına en yakın olan en ağır RNA fragmanlarını içermelidir. En ağır RNA ile en hafif DNA arasındaki fark, onları ayırmaya yetmeliydi. Sütunun uzunluğu, bunların tamamen ayrılmadığı sonucunu açıklayabilir. Daha uzun bir sütun kullanılmış olsaydı, muhtemelen RNA'yı daha fazla yavaşlatacak ve yine de DNA'nın çok az engel ile akmasına izin verecek ve böylece daha iyi bir ayrım sağlayacaktı. Ancak kullanılan kolon sadece RNA içeren 6, 7, 8 ve 9 numaralı numuneleri verdi. Bu numuneler sadece RNA içerdiğinden, bazı RNA kirleticilerinin DNA'dan tamamen çıkarıldığı açıktır, dolayısıyla hem RNA hem de DNA içeren numuneler en azından orijinal karışımdan daha saftır. Belki de hala bir karışım içeren numuneler matristen tekrar geçirilirse, ayırma gelişmeye devam ederdi. En hafif RNA fragmanları matristeki gözenekleri işgal etmeyeceğinden, gözenekler, matristen ilk geçiş sırasında DNA kadar hızlı geçen bazı ağır RNA'ları yavaşlatabilir. Onuncu numune, kromatografi işleminden geçmemiş olan karışımı içerdiğinden deneyin kontrolünü temsil ediyordu. Örnek, orijinal karışımın hem DNA hem de RNA içerdiğini gösteriyor.

Elektroforezin ayırma gücü, JAC Biology NYA Laboratory Outlines, 2001 tarafından tahmin edildiği gibi kromatografininkinden çok daha güçlüydü. Jel taraması, tüm DNA'nın anoda, RNA fragmanlarına göre daha az ilerlediğini gösteriyor. RNA, başlangıç ​​noktasından DNA bantlarından yaklaşık iki kat daha uzakta bloblar halinde görünür. Bu, RNA parçalarının DNA parçalarından daha küçük olması ve jeldeki polimer liflerin çalılıkları, daha uzun parçaları daha kısa olanlardan daha fazla engellediği için bu bekleniyordu (Campbell, 1999). Jel elektroforezinin etkisi, kromatografiden geçmemiş orijinal karışımı içeren onuncu numunede en açık şekilde görülmektedir. Kromatografinin ayırma etkisinin yardımı olmadan bile, DNA ve RNA jel içinde hala tamamen ayrıdır. Elektroforez çalıştırıldıktan sonra, DNA içeren bölümler kesilebilir ve saf bir DNA numunesi elde etmek için DNA jelden seyreltilebilirdi.

Campbell, Neil A. 1999. Biyoloji. Menlo Park, California: Addison Wesley Longman, Inc. s. 1175.

2001. Biyoloji NYA Laboratuvar Anahatları . Ste. Anne-de-Bellevue: John Abbott Koleji Kitabevi. s.9-1 s.9-10.

Etik Tartışma Belgesi: Kanada'da Doğan Her Bebek DNA Parmak İzi Almalı mı?

Bir bebeğin genetik yapısının bilinmesi ve çocuğun gelecekteki sağlığıyla ilgili tahminlerde bulunulabilmesi süreci olan DNA parmak izinin alınmasının lehinde ve aleyhinde birçok etik neden vardır. Şahsen genetik testlerin isteğe bağlı olması gerektiğini, ancak zorunlu olmaması gerektiğini düşünüyorum. Bazı insanlar geleceği bilmek istemez, hayatı olduğu gibi kabul etmeyi tercih eder ve çocuklarının sahip olduğu genetik bir hastalığın belirtilerini göstermeye başlayacağı günün korkusuyla yaşamaz. Öte yandan, bazı insanlar, hastalığın nihai başlangıcına daha iyi hazırlanabilmeleri için genetik problemlerin önceden bildirilmesini tercih eder. Bu iki seçenek arasındaki kararın hükümet tarafından verilmesi gerektiğini düşünmüyorum, bunun yerine ebeveynlerin seçimi kendileri yapabilmesi gerektiğini düşünüyorum.

DNA parmak izinin zorunlu olması gerektiğini düşünmememin bir nedeni de ayrımcılığa yol açabilmesi. Örneğin, sigorta şirketleri, yaşlandıklarında genetik bir hastalığa yakalanma olasılığı olan kişileri sigorta ettirmek istemeyecektir. İşverenlerin, genetik bir hastalık nedeniyle sağlık yardımı ödemesi alma olasılığı yüksek olan kişileri işe almak istememeleri de mümkündür. Anlaşılır bir şekilde, sigorta şirketi veya muhtemel bir işveren, şirketleri için para biriktirmek için insanlar hakkında genetik bilgiye sahip olmak isteyecektir. Ancak genetik faktörler nedeniyle ayrımcılık yapılmasını adil bulmuyorum. Esasen böyle hissediyorum çünkü insanlar genetik materyallerini kontrol edemiyorlar ve bence kararları insanların üzerinde kontrol edemeyecekleri bir şeye dayandırmak çok adaletsiz.

DNA parmak izinin bir başka yönü doğum öncesi testtir. Doğum öncesi DNA parmak izinin hükümet tarafından zorlanmasının ana nedenlerinden biri, genetik hastalıkları olan çocukları yetiştirmenin kamu maliyeti ile ilgilidir. Bazı insanlar genetik hastalıklar geliştirecek çocukların doğmaması gerektiğini düşünüyor. İnsanların, genetik hastalığı olan bir çocuğun sağlık faturalarını karşılamaya harcanan vergilere neden üzülebileceklerini anlasam da, toplumun iki ebeveyne çocuklarını kürtaj yapmaları gerektiğini söylemesinin adil olduğunu düşünmüyorum. çocuğun sahip olacağı hastalık. Eğer iki ebeveyn testi yaptırıp çocuğu aldırmayı seçerse, bununla bir sorunum yok. Ancak, anne-babanın çocuğu düşürmesi için baskı yapmasını kabul edilebilir bulmuyorum. Kürtajın, müstakbel ebeveynlerin kendi şartlarına göre yapabilmeleri gereken kişisel bir seçim olduğunu düşünüyorum.

Yine de, isteyenler için genetik testlerin mevcut olması gerektiğini düşünüyorum. Örneğin, bir hastalık taşıyıcısı olduklarını bilen iki ebeveyn, çocuklarının taşıdıkları hastalığa sahip olup olmayacağını bilmek isteyebilir. Ancak, genel olarak, testlerin sonuçlarına dayalı kararlar kişisel olduğu için testlerin zorunlu olmaması gerektiğini düşünüyorum ve toplumumuzun bu tür kararları insanlar için verme hakkına sahip olduğunu düşünmüyorum.


Elektroforez Nedir?

Jel elektroforezi, bilim adamlarının DNA gibi küçük moleküllerin sindirilmiş örneklerini görselleştirmesinin ve bu parçaların boyutlarını tahmin etmenin bir yoludur. Elektroforez gerçekleştirmek için bilim adamları, agarozu kaynar suda süspanse ederek bir jel hazırlar. Elde edilen polimerizasyon çapraz şeker polimerleri üretir, böylece jel kimyasal düzeyde biraz örümcek ağı gibi görünür.

Bilim adamları, jelde kuyular oluşturmak için bir kesme aleti kullanırlar, böylece kuyulara çok az miktarda sindirilmiş numune yükleyebilirler. Makinenin açılması, elektriğin jelden geçmesine neden olur ve numunelerdeki parçalar kuyulardan jelin diğer tarafına doğru hareket etmeye başlar. Jel ağ-benzeri olduğundan, daha küçük parçalar matris boyunca hızla ilerlerken, daha büyük parçaların matris boyunca tırmanması daha uzun sürer. Bittiğinde jel, farklı parçaların ne kadar uzağa gittiğini gösteren koyu bantlar içerir. Bilim adamları bu bantları ölçer ve ne kadar uzağa göç ettiğine bağlı olarak her bir parçanın boyutunu belirlemek için logaritmik bir hesaplama kullanır.

Bilim adamları net bantlar umuyorlar, ancak bazen bantlar bulaşıyor. Bu bulaşma genellikle kötü hazırlanmış jellerin, kuyulara seyreltilmemiş numunelerin yüklenmesinin veya düşük kaliteli numunelerin sonucudur.


Bir Mikobakteri Referans Biriminin Rutin Çalışmasında Kullanım İçin Moleküler Parmak İzi Stratejilerinin Değerlendirilmesi

İki hızlı PCR tabanlı tipleme yönteminin rolünü araştırdık, IS6110Ulusal bir tüberküloz referans servisi içinde, tabanlı PCR ve aralayıcı-oligonükleotid tiplemesi. IS'li kümelerin geçerliliği6110 6'dan az bantlı kısıtlama parçası uzunluk polimorfizmi parmak izleri de referans alınan izolatlar bağlamında incelenmiştir.

Moleküler tiplendirme, tüberküloz bulaşmasını araştırmak için önemli bir epidemiyolojik araç sağlar. Tanımlanmış bir topluluktan izolatları tarayarak, devam eden bulaşma derecesi araştırılabilir ve karakterize edilebilir, bu da etkili müdahale stratejilerinin tasarlanmasına yol açabilir. Daha mütevazı bir düzeyde, şüpheli epidemiyolojik bağlantı veya laboratuvar kontaminasyonu şüphesi bulunan izolatlar, parmak izi ile analiz için gönderilebilir.

IS'ye dayanan kısıtlama parçası uzunluk polimorfizmi (RFLP)6110 yerleştirme elemanı (10), parmak izi almak için standart yöntem haline gelmiştir. Tüberküloz. Bununla birlikte, izolat kümeleri altı veya daha fazla banda sahip olduğunda RFLP kümelemesinin görünür geçerliliğinin arttığı gösterilmiştir (1, 11) ve bu tür çalışmalardan elde edilen tüm düşük kopya numaralı kümelerin onaylanması gerektiği önerilmiştir. alternatif bir yazma yöntemi.Tüm RFLP tabanlı yaklaşımlarla ilgili bir sorun, karmaşık, zaman alıcı prosedürler olabilmeleri ve organizmanın kültürü ile önceden izolasyon gerektirmeleridir. Örneğin, IS ile yazmak6110 kültürlenmiş organizmadan 3 ila 4 gün sürebilir. Aralayıcı-oligonükleotid tipleme (spoligotipleme) (6) veya IS gibi PCR tabanlı yöntemler6110temelli yöntemler (4, 5, 7Ĺ, 12) daha hızlı olabilir ancak uygulanması karmaşık olabilir ve optimize edilmesi zor adımlar içerebilir. Daha basit IS6110tabanlı PCR yöntemleri, izolatların hızlı taranması için iyi yöntemler olarak tanımlanmıştır (3, 9).

Referans hizmetimizin bir parçası olarak, IS kullanımının aksine tipleme analizi için izolatlar alıyoruz.6110 büyük ölçekli epidemiyolojik sürveyans çalışmalarında tiplendirme yapıldığında, bulaşma veya olası laboratuvar kontaminasyon olayları için halihazırda kanıtlar mevcuttur. Bu koşullar altında, düşük IS'nin kümelenmesinin açık olup olmadığı belirsizdir.6110-kopya sayısı izolatları önemlidir veya ikincil tiplemenin gerekli olup olmadığı. Bu çalışmada, IS aracılığıyla oluşturulan düşük kopya sayılı kümelerin geçerliliğini ikincil tipleme yoluyla araştırdık.6110 Laboratuvarın referans hizmetinin bir parçası olarak RFLP. Mycobacterium Referans Birimi, Londra, Birleşik Krallık tarafından üretilenler gibi bir ulusal referans hizmetinde alternatif hızlı PCR tabanlı tarama yöntemlerinin rolü, RFLP ile karşılaştırma için iki PCR yaklaşımının seçilmesiyle de değerlendirilir.

toplam 73 izolat M. tüberküloz 21 farklı salgın araştırmasından moleküler tipleme ile karşılaştırma için 18 aylık bir süre boyunca Mikobakteri Referans Birimi'ne sevk edildi. Her izolat IS tarafından araştırıldı6110 RFLP ve iki PCR tabanlı yöntem. NS6110 RFLP daha önce tarif edildiği gibi yapıldı (10). PCR tabanlı tipleme için, IS için hazırlanan DNA6110 RFLP 1/100 oranında seyreltildi ve her PCR'de bu seyreltilmiş DNA'nın 10 µx003bcl'si (yaklaşık 10 ng) kullanıldı. Spoligotipleme daha önce tarif edildiği gibi yapıldı (6). bir IS6110tabanlı PCR yaklaşımı, IS'nin ters çevrilmiş tekrar dizisini hedef alan tek bir primer, 5'x02032-GAG TCT CCG GAC TCA CCG G-3'x02032 ile gerçekleştirildi.6110 ekleme. Reaksiyon hacimleri 40 μx003bcl idi ve 40 pmol primer içeriyordu. PCR koşulları şu şekildeydi: 93×000b0C’de 120 s 1 döngü 93×000b0C 20 s, 45’x000b0C 360 s ve 72’x000b0C 120 s 30 döngü 93×000b0C 20 s , 30 sn için 62′x000b0C ve 180 sn için 72′x000b0C ve 72′′x000b0C’de 10 dk son uzatma. PCR'den sonra ürünler agaroz jel elektroforezi ile analiz edildi.

21 araştırmadan 16'sında her üç yöntemle oluşturulan kümeleme uyum içindeydi (Tablo ​ (Tablo1). 1). Beş araştırma içinde 12 izolatın kümelenmesinde farklılıklar vardı. IS6110Uyumsuz sonuçlar içeren tüm araştırmaların PCR tabanlı sonuçları Şekil 1'de gösterilmektedir. 1.

TABLO 1

Çalışma izolatlarıyla üç tipleme stratejisinin sonuçlarının özeti

Soruşturma numarasıizole etmekRFLP bantlarının sayısıRFLP kümesiSpoligotype kümesiNS6110tabanlı PCR sonucu
11 A9Kuzey Amerika c Kuzey KoreKuzey Kore
1b11Kuzey Kore2 bir Kuzey Kore
1c14Kuzey KoreKuzey KoreKuzey Kore
22a4Kuzey Kore2 bir Kuzey Kore
2b10Kuzey KoreKuzey KoreKuzey Kore
33 A412 bir cd
3b412 bir C
3c412 bir C
3 boyutlu412 bir C
3e412 bir C
3f412 bir C
3g412 bir C
3 saat41Kuzey KoreKuzey Kore
44a2Kuzey KoreKuzey KoreKuzey Kore
4b6Kuzey Kore1 A Kuzey Kore
4c1125C
4d1125C
4e1125C
4f1125C
4g1125C
55a33 A 7 bir C
5b33 A 7 bir C
5c33 A 7 bir C
5d14Kuzey Kore15 bir Kuzey Kore
5e12Kuzey KoreKuzey KoreKuzey Kore
5f15Kuzey KoreKuzey KoreKuzey Kore
66a341 A C
6b341 A C
77a1Kuzey KoreKuzey KoreKuzey Kore
7b11Kuzey Kore11 bir Kuzey Kore
88a6Kuzey KoreKuzey KoreKuzey Kore
8b13Kuzey KoreKuzey KoreKuzey Kore
99a2510C
9b2510C
1010 A12611 bir C
10b12611 bir C
10c10Kuzey Kore11 bir Kuzey Kore
10 gün11Kuzey KoreKuzey KoreC
Soruşturma numarası izole etmek RFLP bantlarının sayısı RFLP kümesi Spoligotype kümesi NS6110tabanlı PCR sonucu
10e47 bir 12 bir C
10f12Kuzey KoreKuzey KoreKuzey Kore
1111a47 bir 12 bir C
11b47 bir 12 bir C
1212a287 bir C
12b287 bir C
1313a7Kuzey KoreKuzey KoreKuzey Kore
13b11Kuzey KoreKuzey KoreKuzey Kore
1414a8Kuzey Kore3 A Kuzey Kore
14b894C
14c894C
14 gün10108C
14e10108C
1515a5 b Kuzey Kore13C
15b4 b Kuzey Kore13C
1616a9 b Kuzey Kore3 A Kuzey Kore
16b6 b Kuzey Kore3 A Kuzey Kore
1717a10119C
17b10119C
17c10119C
1818a33 A 7 bir C
18b33 A 7 bir C
18c111216C
18 gün111216C
1919a15Kuzey KoreKuzey KoreKuzey Kore
19b8Kuzey Kore2 bir Kuzey Kore
2020a12132 bir C
20b12132 bir C
2121a131414C
21b131414C
21c13Kuzey KoreKuzey KoreKuzey Kore
21 gün9Kuzey KoreKuzey KoreKuzey Kore
21e12Kuzey KoreKuzey KoreKuzey Kore
21f15Kuzey Kore15 bir Kuzey Kore
21g16Kuzey Kore15 bir Kuzey Kore

IS6110Tutarsız sonuçlar ve düşük sayıda IS'ye sahip bazı izolatlar ile tüm araştırmaların temelli PCR kalıpları6110 kopyalar, 1'lik (ağ/hacim) bir agaroz jel üzerinde agaroz jel elektroforezinin ardından gösterilmektedir. Tutarsız izolatlar şeritlerde şu şekilde gösterilir: şerit 1 ila 8, inceleme 3, izole 3a ila 3h şerit 9 ila 14, inceleme 10, izole 10a ila 10f şerit 15 ve 16, inceleme 15, izole 15a ve 15b şerit 17 ve 18, araştırma 16, izoleler 16a ve 16b ve şeritler 19 ila 25, araştırma 21, izoleler 21a ila 21g. Düşük IS6110- kopya numarası izolatları şeritlerde şu şekilde gösterilir: şerit 26 ve 27, araştırma 9, izoleler 9a ila 9b (IS'nin iki kopyası)6110) ve şerit 28, soruşturma 7, izole 7a (IS'nin bir kopyası)6110). S, DNA boyutu standartları (baz çiftlerinde) kenar boşluğunda belirtilmiştir.

RFLP ve IS6110tabanlı PCR sonuçları sadece iki araştırmada farklılık gösterdi (inceleme 3 ve 10). İzolat 3h, araştırma 3'teki (RFLP kümesi 1) izolatların geri kalanıyla birlikte RFLP tarafından kümelendi, ancak IS tarafından6110tabanlı PCR, ikisi o araştırmanın diğer izolatlarında bulunanlarla aynı olan 3 banta sahipti (Şekil 1, 1, şerit 8). , şerit 1 ila 7) Bu izolat, diğer izolatlara yüksek derecede (97%) benzerliğe sahip olmasına rağmen, spoligotipleme ile de ayırt edildi.6110tabanlı PCR kümelenmiş izolatlar 10d ve 10e (Şek. ​ (Şek.1, 1 , şerit 12 ve 13), ancak RFLP ve spoligotiplendirme yapmadı.

Bir soruşturmada, soruşturma 15, spoligotipleme ve IS6110tabanlı PCR uyumluydu ancak IS'den farklıydı6110 İzolat 15a'nın, izolat 15b'ye kıyasla fazladan bir banda sahip olduğu RFLP.

Üç soruşturmada (10, 16 ve 21 numaralı soruşturmalar) RFLP ve IS6110tabanlı PCR tipleme yöntemleri uyum içindeydi ancak bazı izolatları ayırt etmekte başarısız olan spoligotiplemeden farklıydı.

Soruşturmalarda, tek taraflı tipleme, RFLP veya IS'den daha az ayrımcı görünüyor6110tabanlı PCR ve kümeler, RFLP tarafından kümelenmemiş farklı araştırmalarda izole edilir. Örneğin spoligotip 2, hiçbiri RFLP analizi tarafından kümelenmemiş 12 izolatı içeren 1, 2, 3, 19 ve 20 numaralı araştırmalarda meydana geldi.

7. soruşturmada, izole 7a'nın yalnızca bir IS'si vardı6110 insert henüz IS tarafından bir PCR ürünü oluşturabildi6110tabanlı PCR (Şekil ​ (Şekil 1 , şerit 28). Ross ve Dwyer (9), tarafından bildirilen benzer bir bulguda, IS tarafından üretilen PCR ürünleri6110-spesifik primerler tek IS üzerinde6110-kopya içeren izolatlar dizileme ile araştırıldı ve IS'ye sahip olduğu bulundu6110 ürünün her ikisinde, birinde veya hiçbir ucunda. Son soruşturmanın M. tüberküloz genom (2), IS ile bazı dizi homolojisine sahip daha önce karakterize edilmemiş birçok IS elementi olduğunu göstermiştir.6110, bu alternatif hazırlama sitelerini açıklayabilir. Alternatif olarak, spesifik olmayan hazırlama söz konusu olabilir ve bir veya birkaç IS'ye sahip izolatlardan ürün oluşturmak için bu tür spesifik olmayan etkileşimleri teşvik etmek için PCR'mizin ilk döngüsünde primer tavlama sıcaklığını düşürdük.6110 elementler.

Çalışmamızda, 21 araştırmadan 7'si, beş veya daha az banda sahip kümelenmiş izolatlara sahipti. Bu çalışmadaki yedi düşük kopya numaralı RFLP kümesinin tümü, spoligotipleme ve IS ile doğrulanmıştır.6110Düşük kopya numaralı kümelerin geçerliliğini değerlendirirken önceki epidemiyolojik bağlantı şüphesinin önemli bir husus olduğunu ve düşük kopya numaralı izolatların IS tarafından kümelenmesinin önemli olduğunu öne süren tabanlı PCR6110 RFLP, bir referans hizmeti bağlamında geçerlidir.

Mevcut biçiminde, problar olarak standart boşluk bölgeleri kullanılarak, spoligotipleme, tek tipleme yöntemi olarak kullanılabilecek kadar ayrımcı değildir, ancak diğer tekniklerle birlikte kullanıldığında değerlidir. Benzer şekilde, IS6110tabanlı PCR, agaroz jel elektroforezinden sonra yalnızca bir ila üç ana bant oluşturur ve izolatlar yalnızca tek bir bandın kimliği ile kümelenemez. Bu nedenlerle, popülasyon tarama çalışmaları için çift tipleme stratejisi uygun görünmektedir. Spoligotipleme, RFLP'den daha hızlı olduğu için birincil tarama yöntemi olarak kullanılabilir, ancak bu çalışmadan elde edilen kanıtlar, daha sonra RFLP tarafından çözülecek olan birçok yanlış kümenin oluşturulacağını göstermektedir.

IS6110Bu salgın araştırmalarında, temelli PCR yönteminin spoligotiplemeye göre daha ayrımcı olduğu gösterilmiştir, ancak bazı spesifik olmayan hazırlama söz konusu olduğundan, bant paterni, kullanılan tam PCR koşullarına bağlı olabilir. Bu, bir referans merkezinde alınan sevk edilen izolatlarda olduğu gibi, aynı PCR çalışmasında izolatları yan yana karşılaştırmak için bir sorun değildir, ancak IS kullanımını engelleyebilir.6110Büyük toplulukların epidemiyolojik araştırmalarında temelli PCR. IS'nin bir avantajı6110Temelli PCR, bunu doğrudan L'x000f6wenstein-Jensen yamaçlarından alınan organizmaların kaynatılmış süspansiyonları üzerinde rutin olarak gerçekleştirmemizdir. Bir referans tesisin günlük işlevleri bağlamında, atıfta bulunulan örneklerle ilgilenmek için, alt kültürden önce atıfta bulunulan kültürler üzerinde hızlı ve basit bir PCR tabanlı birincil tipleme yöntemi kullanan bu tür bir çift tipleme yaklaşımı hızlı bir tarama sunar. kümelenmemiş, bağlantısız izolatlar için, görünürde kümelenmiş herhangi bir izolat, klasik RFLP ile ikincil tipleme ile doğrulanabilir. Referans tesis, daha hızlı sonuç geri dönüşünden ve RFLP tiplemesi gerektiren izolatların sayısının azalmasından dolayı işçilikten tasarruf edilmesinden yararlanır.


Teşekkür

Fare bakımı ve DNA hazırlanmasında yardım için Bayan Xiang Shi, Bayan Junfeng Hao ve Bayan Jianhua Wang'a teşekkür ederiz. Ayrıca akış sitometri deneyleriyle ilgili mükemmel teknik yardım için Bay Junying Jia'ya teşekkür ederiz. Bu çalışma, Çin Bilimler Akademisi Hibe XDA01020203'ün "Stratejik Öncelikli Araştırma Programı", Çin Ulusal Anahtar Temel Araştırma Programı (2014CB964601) ve Çin Bilimler Akademisi'nin Yüz Yetenek Programından (Y.T.'ye) fonlarla desteklenmiştir.


MgCl'nin Rolü 2 PCR reaksiyonunda:

Mg+ iyonları enzimin katalitik bölgesine bağlanır ve reaksiyonu gerçekleştirme gücünü arttırır. Bu nedenle yeteneği tak Büyüyen DNA zincirine dNTP eklenmesinin DNA polimerazı artar.

Polimerazdan bahsetmek çok önemlidir. tak DNA polimeraz çünkü PCR reaksiyonunda kullanılan DNA polimeraz, replikasyon sırasında kullanılanla aynı değildir.

tak DNA polimeraz adı verilen bir bakteriden izole edilir. termofilus aquaticus ve normal DNA polimerazımız tarafından mümkün olmayan daha yüksek bir sıcaklıkta bile çalışabilir.

Ek olarak, MgCl 2 reaksiyonun Tm'sini arttırır. mg 2 + MgCl iyonları 2 PO'ya bağlan 3 – DNA omurgasının geçici olarak korunmasını sağlar ve DNA zincirleri arasındaki elektrostatik itmeyi azaltarak DNA omurgasının negatif yüklü fosfatını korur.

İki DNA dizisi arasındaki elektrostatik itme, primerin spesifik konumuna bağlanmasını engeller. Burada MgCl ilavesi 2 primerin tamamlayıcı dizisine uygun şekilde bağlanmasına yardımcı olur.

şimdiye kadar MgCl 2 PCR reaksiyonunun iki önemli aktivitesini içerir: artan tak bir kofaktör olarak çalışarak polimeraz aktivitesi ve primerlerin belirli bir yere bağlanmasına yardımcı olur.

"Çok fazla MgCl2, primerin şablon DNA ile spesifik olmayan bağlanmasını kolaylaştırır ve bu da agaroz jel elektroforezinde spesifik olmayan DNA bantları ile sonuçlanır."

Standart PCR tamponu MgCl içerir 2 normal bir PCR reaksiyonu için yeterlidir. Bununla birlikte, bazı koşullarda (kalıbun yüksek GC içeriği, uygun olmayan ileri ve geri primer ve diğer PCR modifikasyonları için) daha fazla MgCl miktarı 2 gerekli.

PCR reaksiyonu sırasında, deoksinükleotit trifosfatlar, bitişik nükleotidin 3'-OH ve 5'-P'si arasında bir fosfodiester bağı oluşturmak için deoksinükleotit monofosfata dönüşür.

Resim kredisi: Wikimedia Commons

Burada Mg 2 + iyonu, dNTP'lerden beta ve gama fosfatın çıkarılmasına yardımcı olan dNTP'lerin alfa fosfatına bağlanır (sadece alfa fosfatın bitişik dNTP'nin 3'-OH ile bir fosfodiester bağı oluşturmasına izin verir).

Genel olarak, PCR reaksiyonu için 1 mM ila 5 mM konsantrasyon kullanılabilir, ancak standart konsantrasyon, en iyi sonucu verecek olan 2 mM'dir.

2 mM'den fazla konsantrasyon, spesifik olmayan bağlanma ile sonuçlanacaktır. MgCl konsantrasyonu olarak 2 arttıkça, spesifik olmayan bağlanma şansı da artacaktır.

Daha yüksek MgCl konsantrasyonu 2 Agaroz jel elektroforezi sırasında daha fazla DNA bandı gözlemlenecektir, çünkü primerler tamamlayıcı dizilerinden başkasına bağlanabilir ve daha fazla fragmanı çoğaltabilir.

Agaroz jel elektroforezi ile ilgili bir dizi makaleyi burada okuduk,

MgCl'nin nasıl olduğunu anlayalım. 2 çalışıyor:

  1. PCR arabelleği eklemeden standart bir protokol.
  2. PCR arabelleğinin eklenmesi
  3. 2mM MgCl ilavesi 2 reaksiyonda
  4. 3mM MgCl ilavesi 2 reaksiyonda
  5. 4mM MgCl ilavesi 2 reaksiyonda
  6. 5mM MgCl ilavesi 2 reaksiyonda

6 tüpün hepsini bir negatif kontrol ile hazırladık. Pozitif kontrol için her tüpte 800bp fragmanı yükseltecek bir primer ekledik.

Görüntü, farklı PCR koşullarını temsil eder.

  1. DNA merdiveni
  2. Tamponsuz PCR reaksiyonu
  3. tampon ile PCR reaksiyonu
  4. 2mM MgCl ile PCR reaksiyonu 2
  5. 3mM MgCl ile PCR reaksiyonu 2
  6. 4mM MgCl ile PCR reaksiyonu 2
  7. 5mM MgCl ile PCR reaksiyonu 2
  8. Negatif kontrol

Sonuçlar, ilgilendiğimiz fragmanın (400bp fragman) bir PCR tamponu olmadan çok daha az amplifiye edildiğini ancak en iyi sonucu 2mM MgCl ilavesinden sonra verdiğini göstermektedir. 2 PCR tamponu ile birlikte (şerit 4).

MgCl konsantrasyonu olarak 2 birden fazla bantta spesifik olmayan bağlanma sonuçlarını arttırır, bu da MgCl konsantrasyonu olarak olduğunu gösterir. 2 artan primer bağlanma özgüllüğü azalır.

Sonuç olarak, PCR protokolünüzü değiştirmek istiyorsanız, uygun miktarda MgCl ilavesi yapın. 2 bir astarın tavlama sıcaklığını azaltabilir. Tek bir sıcaklıkta ikiden fazla protokol çalıştırabilirsiniz (Ancak, sonucun kalitesi düşebilir).


Finansman Beyanı

Bu çalışma, Alman Federal Eğitim ve Araştırma Bakanlığı tarafından desteklenmiştir, hibe 0315834 A (TR), hibe RU 631/5-1 AOBJ: 554592 Alman Araştırma Vakfı'ndan (DFG)(TR) Alman-İsrail Proje İşbirliği ve hibe B-192, Wuerzburg Üniversitesi (TR) Disiplinlerarası Klinik Araştırma Merkezi'nden. Bu yayın, Alman Araştırma Vakfı (DFG) ve Würzburg Üniversitesi tarafından Open Access Publishing finansman programı kapsamında finanse edildi. Finansörlerin çalışma tasarımı, veri toplama ve analizi, yayınlama kararı veya makalenin hazırlanmasında hiçbir rolü yoktu.


Videoyu izle: Agarose Gel Electrophoresis تطبيق عملي (Haziran 2022).


Yorumlar:

  1. Ahren

    Genel olarak, açıkçası, buradaki yorumlar mesajların kendilerinden çok daha eğlenceli. (Elbette yazara suç yok :))

  2. Akigore

    Tebrikler, ne gerekli sözler ..., mükemmel fikir

  3. Mekora

    Sadece bir tanrı bilir!

  4. Stanhope

    Fikrinizi tamamen paylaşıyorum. Bunda bir şey var ve iyi bir fikir var, sana katılıyorum.

  5. Mannleah

    Üzgünüm, ama bence hatalar yapıldı. Bunu kanıtlayabiliyorum. Bana PM'de yaz, konuş.

  6. Anscomb

    I have forgotten to remind you.



Bir mesaj yaz