Bilgi

Nöral aksonlar bunun gibi bağlantıların etrafında mı uzanıyor?

Nöral aksonlar bunun gibi bağlantıların etrafında mı uzanıyor?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Aksonların bazen böyle bağlanıp bağlanmadığını merak ediyordum:

Bu ağın yolunun eğri olduğu ve 3./4. nöronun 1. nörona 2. nöron kadar yakın olduğu durumlardan bahsetmiyorum, 3./4. nöronun fiziksel olarak olduğu durumlardan bahsediyorum. Birinci nörondan ikinci nörona göre 2-3 kat daha uzak veya daha fazla. Bu sinir simülasyonu ile ilgilidir.


Akson Teminatı Nedir? (Resimleri olan)

Çoğu nöronun, hücre gövdesinden veya "nöritler" olarak adlandırılan somadan filizlenen çoklu projeksiyonları veya süreçleri vardır. Nöronların çoğu dendrit olan birçok işlemi vardır, ancak çoğu nöronun akson adı verilen tek, benzersiz bir işlemi de vardır. Dendritler, diğer hücrelerin afferent projeksiyonlarından sinyal alan süreçlerdir, aksonlar ise beynin veya omuriliğin uzak bölgelerinde bile diğer hücrelere sinyal gönderen çıkıntı yapan nöritlerdir. Aksonlar çatallanır ve kendi hücresinin somasına doğru bir dal gönderebilir. Bu projeksiyonlar "akson teminatları" olarak bilinir.

Bir nöronun yalnızca bir aksonu olsa da, bu tek işlemin uzunluğu boyunca birden çok noktada çatallanması yaygındır. Bir aksonun bir ana çıkıntısı vardır, bu hücrenin nereye "yansıldığını" belirleyen terminal konumu ve dalları vardır. Birincil aksonu ikiye ayıran dallardan biri akson teminatıdır ve hücrenin kendisine doğru geri çıkar.

Bir aksonun terminalinde, genellikle alıcı hücrelerin dendritik süreçlerinde diğer hücrelerle sinapslar oluşturan "büyüler" vardır. Aksonun uzunluğu boyunca oluşan sinapslar da vardır. Miyelinli süreçler söz konusu olduğunda, sinapslar yalnızca "Ranvier Düğümleri" adı verilen miyelindeki kırılmalarda oluşur.

Bir akson teminatı genellikle bir hücrenin kendi ateşleme modelini düzenlemesine yardımcı olan geri bildirim mekanizmalarıyla ilişkilidir. Bu teminat, aksonun bağlı olduğu hücreye doğru geri yansıyacağından, hücrenin kendisiyle veya yakındaki diğer hücrelerle kolayca sinapslar oluşturabilir. Piramidal durumda, uyarıcı hücreler - memeli beynindeki yaygın bilgi entegrasyon hücreleri - genellikle inhibitör ara nöronlara yakındır. Bir akson teminatı, bu yakındaki inhibitör nöronlarla sinaps oluşturabildiğinden, bir düzenleme sistemi olarak hizmet eder. Uyarıcı hücreler, yakındaki engelleyici hücreleri uyarır ve bu da onların sık sık ateşlenmesini önler.

Akson kollateralleri miyelinsiz bölgelerde primer akson segmentlerinden çatallanır. Bu mantıklı çünkü bir oligodendrosit başka bir hücrenin aksonal süreci etrafında tekrar tekrar bir süreç gönderdiğinde miyelin bir sinir sargısı olarak işlev görür. Bununla birlikte, tek bir oligodendrositik süreç, tek bir noktada birleşen üç parçanın etrafını sarmak için zor bir zamana sahip olacaktır; bu, akson bölümleri dallar oluşturduğunda olan şeydir.

Bazı bilim adamları, bu tür teminatın, ateşleme modellerini kodlamak ve sinirsel yollar yoluyla sinyalleme bilgisini düzenlemek için uyarlanmış bir mekanizmadan daha fazla hücresel bir koruma mekanizması olduğuna inanıyor. Bunun nedeni, bazı uyarıcı hücrelerin çok fazla aktivite ile bir toksisite tepkisi için risk altında olmasıdır. Bir uyarıcı hücre ateşlenirse ve akson teminatı aynı hücreyi tekrar uyarırsa, kendi kendine yayılan ve "eksito-toksisite" olarak bilinen bir fenomene neden olan bir ateşleme kaskadı meydana gelir.


Malzemeler ve yöntemler

Yetişkin omuriliğinden NG2+ hücrelerinin saflaştırılması.

Yetişkin (Ϩ hafta) C57BL/6J farelerinden yüksek oranda saflaştırılmış NG2+ hücreleri elde etmek için yeni bir izolasyon protokolü (Bai ve diğerleri, 2013) kullandık. Omurilikleri kesip çıkardıktan sonra, yüzey kan damarları çıkarıldı ve doku, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca tripsin ve EDTA ile ayrıştırıldı. Sindirilen doku 800 × hızında döndürüldü G 5 dakika süreyle, üç kez yıkandı, ardından bir Percoll gradyanı üzerine yerleştirildi (GE Healthcare, katalog #17-0891-02). Gradyan 2000 rpm'de 30 dakika santrifüj edildi. Hücresel fraksiyonlar toplandı, yıkandı ve %10 fetal sığır serumu içeren 1 ml DMEM/F12 ortamında yeniden süspanse edildi. Hücreler, PLL kaplı 75 cm2'lik bir şişeye kaplandı ve 37°C'de %5 CO2 içinde büyütüldü.2 4 hafta boyunca, daha sonra arındırmak için pasajlandı. Geçişten sonra, hücrelerin %99'u NG2+ idi, <%5'i GFAP'yi ifade etti ve CNP veya MBP gibi olgun oligodendrosit belirteçlerinin saptanabilir bir ifadesi yoktu. Çoğu hücre (%84), genellikle oligodendrosit öncü hücreleri ile bağlantılı bir işaretçi olan PDGF'sx003b1 reseptörünü eksprese etti. Hücrelerin çoğunluğu (%99) oligodendrosit soy belirteçleri A2B5, Olig2 ve O4'ü (daha sonraki pasajlarda) ifade etti.

DRG nöronlarının kültürlenmesi.

DRG nöronları daha önce tarif edildiği gibi toplandı (Tom ve diğerleri, 2004b). Kısaca, DRG'ler yetişkin dişi Sprague Dawley sıçanlarından (Zivic-Miller Laboratories Harlan) çıkarıldı. Merkezi ve periferik kökler budandıktan sonra, DRG'ler HBSS içinde bir kolajenaz II (200 U/ml Worthington Biochemicals) ve dispase II (2.5 U/ml Roche) solüsyonunda inkübe edildi. Sindirilen DRG'ler, HBSS-CMF içinde yıkandı ve üç kez hafifçe ezildi, ardından düşük hızlı santrifüjleme yapıldı. Ayrışmış nöronlar, sayım için B-27, GlutaMAX ve penisilin–streptomisin (Invitrogen) ile takviye edilmiş Neurobasal A ortamında yeniden süspanse edildi.

En uzun nörit büyüme testi.

Lameller gece boyunca oda sıcaklığında poli-l-lisin (PLL 0.1 mg/ml Sigma-Aldrich) ile kaplandı, sonra ddH ile yıkandı.20. Lameller, HBSS-CMF'de laminin (5 μx003bcg/ml Invitrogen) içinde yıkandı ve hücreler kaplanmadan önce 2 saat (37's000b0C) inkübe edildi. NG2+ hücre tek tabaka deneyleri için, yetişkin fare omuriliği NG2+ glial hücreleri 24 saat boyunca yoğun bir şekilde kaplanmıştır (60.000 hücre/nokta). Hücreler, kültüre ayrışmış DRG nöronları (1500� nöron/lamel) eklenmeden önce 4 saat boyunca kondroitinaz ABC (salin Seikagaku içinde ch'ase 0.1 U/ml) ile muamele edildi. Taze ortamda ch'ase ile birlikte DRG'ler eklendi ve 24 saat boyunca büyümesine izin verildi. Laminin aşırı büyüme lamelleri için, PLL kaplı lamelleri CMF içinde 1 μg/ml veya 5 μg/ml laminin içinde yıkandı ve 37'x000b0C'de inkübe edildi. 2 saatlik inkübasyondan sonra, kültüre ayrışmış DRG nöronları eklendi. Büyümeye 24 saat izin verildi, ardından kültürler %4 paraformaldehit ile sabitlendi ve NG2 (Millipore Bioscience Research Reagents) ve β-III-tubulin (Sigma) için boyandı. Büyüme çalışmaları için, NG2+ hücrelerinin tam bir tek tabakası üzerinde büyüyen her bir nöronun en uzun nöriti MetaMorph yazılımı kullanılarak ölçüldü.

Tuzak tahlili.

Lameller PLL ve ardından nitroselüloz ile kaplanmıştır. Lameller daha sonra, Ca2+ /Mg2+ içermeyen HBSS'de (HBSS-CMF) çeşitli konsantrasyonlarda [0 μg/ml, 1 μg/ml veya 5 μg/ml substratlar oluşturmak üzere laminin içinde yıkandı. ) BTI] 37ଌ'de 2+ saat. Yetişkin fare omuriliği NG2+ hücreleri, 15.000 hücre/lamel yoğunluğunda lameller üzerine kaplanmıştır. Lameller inkübatöre yerleştirildi (37ଌ). NG2+ hücrelerinin kaplanmasından yirmi dört saat sonra, kültüre ayrışmış DRG nöronları eklendi (2000 hücre/lamel). 24 saat daha sonra kültürler 30 dakika boyunca %4 paraformaldehit ile sabitlendi, yıkandı ve %5 doğal keçi serumu içinde bloke edildi. Sabit hücreler NG2, β-III-tubulin ve DAPI için boyandı. Nörit büyümesi olan bir NG2+ hücresinde başlayan bir hücre gövdesine sahip her nöron, NG2+ hücresinin yüzeyinden süreçleri uzatabilen nöronların sayısı sayılarak görüntülendi ve nicelendirildi. NG2 ve diğer CSPG'lerin tuzaktaki rolünü incelemek için, NG2+ hücre kaplaması sırasında ortama (0.1 U/ml) kondroitinaz eklendi, ardından DRG nöronlarının eklenmesi sırasında tekrar ortama kondroitinaz eklendi. 5 günlük çalışmalar için ortam ve ch'ase günlük olarak değiştirildi.

Şerit tahlilleri.

Şerit tahlili deneyleri, Kn'x000f6ll ve diğerleri, 2007'den modifiye edilmiş bir protokole göre yapıldı. Lameller, gece boyunca oda sıcaklığında PLL içinde kaplandı, daha sonra ddH ile yıkandı.20. Lameller tamamen kurutuldu ve her bir lamel büyük bir Petri kabının ortasına yerleştirildi. Şerit matrisi (Karlsruhe Teknoloji Enstitüsü, Almanya), tüm şeritlerin lamel üzerinde olmasını sağlamak için lamel merkezine yerleştirildi. Çözüm A, bir laminin (1 μx003bcg/ml, 5 μg/ml veya 10 μg/ml Invitrogen)-agrekandan (50 μg/ml veya 100 μg/ml Sigma-Aldrich) oluşuyordu. karışımı veya bir laminin (2 μx003bcg/ml)-NG2 (7 μg/ml hediyesi Joel Levine, Stony Brook University, Stony Brook, NY) karışımı (CMF'de 488 ile konjuge BSA ile yapılmıştır). Yüz elli mikrolitre A solüsyonu giriş kanalına yerleştirildi ve şeritlerin substratla kaplı kalması için tüm solüsyonun aspire edilmemesine dikkat edilerek alevli bir cam pipet kullanılarak hatlardan hafifçe aspire edildi. Lameller daha sonra 30 dakika inkübatöre yerleştirildi. Çözelti matristen çıkarıldı ve %2 BSA ile değiştirildi. 37°C'de 10 dakika daha inkübasyondan sonra, BSA, matris ile birlikte lamellerden çıkarıldı. Lameller 24 oyuklu bir plakaya yerleştirildi, burada 400 μx003bcl solüsyon B [düşük laminin (1 μx003bcg/ml) veya fibronektin (5 μx003bcg/ml), CMF içinde BSA ile] yıkandı ve 37°C'de 30 dakika inkübe edildi. Solüsyon B daha sonra kuyucuklardan çıkarıldı ve 37°C'de 10 dakika daha inkübasyon için %2 BSA ile değiştirildi. Proteoglikanların GAG zincirlerini çıkarmak için, kondroitinaz (salin içinde 0.1 U/ml), DRG nöronlarının kaplanmasından 4+ saat önce lamellere ilave edildi. Ayrışmış DRG nöronları daha sonra lamellere 2000 hücre/lamel yoğunluğunda ilave edildi. Dış büyümeye 48 saat izin verildi ve ardından kültürler %4 PFA ile sabitlendi. Bu bileşenlerin mevcut olduğundan emin olmak için laminin (Sigma), CS56 (Sigma) ve fibronektin (BD Biosciences) için bazı lamellere immüno-lekelendi. Tüm lameller, nöronları görselleştirmek için β-III-tubulin ile boyandı. Hücre gövdelerinin iki katı uzunlukta büyüyen tüm nöronlar görüntülendi. Yeşil şeritte başlayan hücre gövdelerine sahip nöronlar, süreçleri siyah şeride genişletip genişletmediklerini ve bunun tersini görmek için analiz edildi.

İmmünositokimya.

Tüm kültürler %5 doğal keçi serumunda bloke edildi. Tüm antikorlar gece boyunca 4ଌ'de inkübe edildi. Kullanılan birincil antikorlar şunları içeriyordu: anti-NG2 (Millipore), anti-GFAP (Doğru), anti-vimentin (Sigma), anti-SV2 (Developmental Studies Hybridoma Bank), anti-PSD-95 (Abcam), anti- SNAP-25 (Sigma), anti-fibronektin (BD Biosciences), anti-laminin (Sigma), DAPI (Sigma), anti-Olig2 (Millipore), anti-A2B5 ve anti-O4 (Robert'in laboratuvarından cömert hediyeler) Miller, Case Western Reserve Üniversitesi, Cleveland, OH). Bunu uygun ikincil antikorlar, Alexa Fluor 350, 488, 594, 633 veya 647 izledi.

Sinaptoid sayısının ölçülmesi laboratuvar ortamında DRG aksonları ve NG2 hücreleri arasında.

Piksel yoğunluğu, kollokalizasyon çalışmaları için ImageJ yazılımı kullanılarak ölçüldü. Sinapsları ölçmek için Ippolito ve Eroğlu, 2010 tarafından açıklananlara benzer yöntemler kullanıldı. Tüm görüntüler, Zeiss LSM510 konfokal mikroskobunda aynı ayarlarla çekildi. Hücre gövdesinin etrafında, hücre gövdesi çapının iki katı büyüklüğünde bir ilgi alanı belirlendi. Punta analizörü kullanılarak ve 50 için eşik ayarlanarak, punkta sayısı hesaplandı.

Sinaptik vezikül döngüsü deneyi.

Tabaklar gece boyunca oda sıcaklığında poli-l-lizin ile kaplandı, durulandı ve 37°C'de 2 saat CMF içinde 1 μx003bcg/ml laminin içinde kaplandı. Laminin çıkarıldı ve NG2+ hücreleri bir tek tabaka oluşturmak üzere yoğun bir şekilde kaplandı (40 μx003bcl DMEM-F12 ortamında oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 40.000 hücre), daha sonra tabaklara 3 ml DMEM-F12 ilave edildi ve tabaklar inkübe edildi bir gecede. DRG nöronları 24 saat sonra eklendi. Bulaşıklar 5 gün inkübe edildi ve ortam, kültürleri korumak için 3. günde değiştirildi. Ortak kültürün 5. gününde ortam çıkarıldı ve yüksek bir K+ solüsyonu (5.37 m m KCl, 125 m m NaCl, 24 m m NaHCO)3) içeren FM boyası (FM1� Invitrogen) 3 dakika kültüre eklendi. Tabağa düşük Ca2+ (0.5 m m ) solüsyonu eklendi, ardından arka plan floresansını söndürmek için hemen ADVACEP-7 (Sigma) 5 dakika eklendi. Çözeltiler çıkarıldı ve 10 dakika boyunca düşük Ca2+ ile ilave bir yıkama yapıldı. Floresan bir Leica DMI6000 (AF) mikroskobunda görüntülendi. Daha sonra çözelti uzaklaştırılmış ve 3 dakika boyunca boyasız yüksek K+ eklenmiştir. Floresan tekrar görüntülendi. Tüm nöronu ana hatlarıyla belirtmek ve boya ile veya boyasız uyarımdan önce ve sonra nöron içindeki piksel yoğunluğunu karşılaştırmak için ImageJ yazılımı kullanıldı.

Western blot için hücre lizatı.

NG2+ hücreleri, 48 saat boyunca 1x000d7 PLL ile ön işleme tabi tutulmuş hücre kültürü tabaklarında birleşecek şekilde büyütüldü. Ch'ase ile ön işleme tabi tutulmuş hücreler için, RIPA tamponu eklenmeden 1 saat önce ortama enzim eklendi (0.1 U). Hücreler buz gibi soğuk PBS ile yıkandı ve 1 dakika boyunca RIPA tamponu (Thermo Scientific) ve 1:500 proteaz inhibitör kokteyli (Abcam) ile buz üzerinde inkübe edildi. Hücre kültürü kabından hücreleri sıyırmak için steril hücre kazıyıcıları kullanıldı. RIPA tamponunda süspanse edilen hücreler daha sonra 30 dakika boyunca 4°C'de vortekslendi ve 20 dakika boyunca 14.1 rcf'de döndürüldü. Her gruptan süpernatant alındı ​​ve protein konsantrasyonu bir BCA kiti (Thermo Scientific) kullanılarak test edildi.

Batı lekesi.

NG2 lizatları, 80°C'de 10 dakika boyunca β-merkaptoetanol ile denatüre edildi. On mikrogram protein, %7.5'lik bir TGX jeli (Bio-Rad) üzerinde 1.5 saat boyunca 125 V'de çalıştırıldı. Aktarım, PVDF membranları üzerinde gece boyunca 12 V'ta gerçekleşti. PVDF membranları oda sıcaklığında 1 saat çalkalanarak bloke edildi (Thermo Scientific Super Blocker) ve bir NG2 antikoru (NG2 Millipore) ile gece boyunca 4°C'de inkübe edildi. Membran daha sonra 1'x000d7 PBS ve %0.1 Tween 20 ile üç kez 15'er dakika süreyle oda sıcaklığında çalkalanırken yıkandı. Anti-tavşan HRP antikoru (Millipore Bioscience Research Reagents) 2 saat oda sıcaklığında çalkalanarak eklendi. Daha sonra lekeyi geliştirmek için Thermo Scientific ECL kullanıldı. Daha sonra lekeler, PBS-Tween 20'de yıkandı ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca Thermo Scientific Geri Yükleme Sıyırma Tamponunda bir orbital çalkalayıcıda inkübe edildi, ardından her biri 15 dakika boyunca PBS-Tween 20 ile üç yıkama yapıldı. Blotlar daha sonra, gece boyunca 4'x000b0C'de primer antikor anti-2B6 (Seikagaku 1:1000 seyreltme) ile inkübasyondan önce orbital çalkalayıcıda oda sıcaklığında 2 saat Thermo Scientific Bloke Etme Tamponu kullanılarak bloke edildi. ECL Western blot substratı ile geliştirmeden önce, blotlar, PBS-Tween 20 ile 15 dakikalık üç yıkamadan sonra 2 şapka oda sıcaklığında bir HRP konjuge sekonder antikor ile inkübe edildi.

Kortikal nöron kültürü ve tuzak tahlili.

Lameller PLL ile kaplandı, ardından çeşitli konsantrasyonlarda (0 μg/ml, 1 μg/ml veya 5 μg/ml) laminin substratlarında 2 saat 37ଌ'de yıkandı. Yetişkin fare omuriliği NG2+ hücreleri, 10.000 hücre/lamel yoğunluğunda lameller üzerine kaplandı ve 24 saat boyunca 37'sx000b0C'de inkübe edildi. 0-4 günlük BALBC/B6/129S farelerinin (The Jackson Laboratory) bütün korteksleri, bir HBSS ve kinurenat banyosunda diseke edildi ve Papain, kinurenat ve sistein içeren bir solüsyonda 30 dakika süreyle 37°C'de inkübe edildi. . Nöronlar daha sonra HBSS-CMF içinde yıkandı, ezildi ve süzüldü. Kısa bir düşük hızlı santrifüjlemeden sonra, ayrışan nöronlar, B-27 takviyesi, GlutaMAX ve penisilin–streptomisin (Invitrogen) içeren Neurobasal A ortamında yeniden süspanse edildi ve lamel başına 2000 hücre konsantrasyonunda lamellere kaplandı. Lameller, nöron kaplama sırasında bir anti-mitotik ajan (5'x02032fluoro-2'x02032-deoksi-üridin/üridin) ile işlendi ve belirtilen yerlerde ortama kondroitinaz ABC (0.1 U/ml Seikagaku) ​​eklendi. Lameller %4 paraformaldehit ile sabitlenmeden önce 24 saat inkübe edildi ve immüno-lekelendi.

Dorsal kolon ezilmesi, çift koşullanma lezyonu ve akson etiketlemesi.

Tüm ameliyatlar, Case Western Reserve Üniversitesi Hayvan Kaynakları Merkezi'nin prosedür ve protokollerine uygun olarak gerçekleştirildi. Dişi yetişkin Sprague Dawley sıçanlarına (250� g) daha önce tarif edildiği gibi bir dorsal kolon ezilme yaralanması verildi (Horn ve diğerleri, 2008). Kısaca, hayvanlara solunan izofluran gazı (oksijen içinde %2) ​​ve aseptik teknik altında anestezi uygulanırken, C8 segmentinin dorsal yönünü ortaya çıkarmak için bir T1 laminektomi yapıldı. Dumont #3 kuyumcu forsepslerinin dişleri, 1.5 mm aralıklı ve 1 mm derinliğindeki duradaki bir delikten sokuldu. Kordon daha sonra lezyonu oluşturmak için her biri 10 saniye boyunca üç kez ezildi. Yaralanma bölgesine jel film yerleştirildi ve kas tabakaları 4-0 naylon sütür ile dikildi. Deriyi kapatmak için cerrahi zımbalar kullanıldı, bu sırada hayvanlara deri altından Marcaine (1.0 mg/kg) ve kas içinden buprenorfin (0.1 mg/kg) verildi. 3000 MW Dextran-Texas Red (Invitrogen) kullanılarak, aksonlar, hayvan öldürülmeden 2 gün önce sağ siyatik sinir yoluyla etiketlendi. Hayvanlar 7 gün, 14 gün, 21 gün veya 28 günde öldürüldü (n = 6/grup). Doku daha sonra immünohistokimya veya elektron mikroskobu için kullanıldı. Çift koşullandırma lezyon çalışmaları için yukarıda bahsedildiği gibi dorsal kolon ezilme (DCC) prosedürü uygulandı ve yaralanmanın hemen ardından sağ siyatik sinir açığa çıkarıldı ve ezildi. Bir hafta sonra, sağ siyatik sinir yeniden ortaya çıkarıldı ve önceki sinir ezilmesinin 1 mm proksimalinde ikinci kez ezildi. İki hafta sonra (toplam 3 hafta), hayvanlar etiketlendi, perfüze edildi ve yukarıda tarif edildiği gibi bölümlere ayrıldı.

NG2 boyanması zamanla azaldığından, bir NG2 promotörü altında geliştirilmiş yeşil flüoresan proteini ifade eden fareler üzerinde paralel çalışmalar yürüttük. Bunlar Dr. Dwight Bergles'ten (Department of Neuroscience, Johns Hopkins University, Baltimore, MD) elde edildi. NG2 nakavt deneyleri, Dr. William Stallcup'tan (Sanford-Burnham Medical Research Institute, La Jolla, CA) elde edilen NG2 nakavt fareler üzerinde gerçekleştirilmiştir. Bu deneyler için DCC, T12'de gerçekleştirildi ve hayvanlar 14 gün veya 28 gün sonra öldürüldü.

Çift koşullandırma deneylerinde, SV2 ifadesi niteliksel olarak karşılaştırıldı. Beş farklı fareden alınan doku, lezyonun içinde veya kaudalinde kalanlarla karşılaştırıldığında lezyonun rostralinde bulunan Dekstran etiketli liflerde görünür SV2 boyaması açısından incelendi.

İmmünohistokimya.

Hayvanlara %4 PFA ile perfüze edildi. Kordon gece boyunca %4 PFA içinde sabitlendi, ardından gece boyunca %30 sakaroza daldırıldı. Doku, OCT yerleştirme ortamında donduruldu ve bir kriyostat üzerinde 20 μm uzunlamasına bölümlere ayrıldı. Kesitler, anti-GFAP (Accurate Chemical and Scientific Corporation), anti-SV2 (Developmental Studies Hybridoma Bank), anti-PSD-95 (Abcam), anti-SNAP-25 (Sigma), anti-vimentin (Sigma) ile boyandı. , anti-NG2 (Millipore) veya anti-fibronektin (BD Biosciences), ardından Alexa Fluor 405, 488 veya 633. Görüntüler bir Zeiss LSM510 konfokal mikroskobu kullanılarak elde edildi.

NG2+ hücreleri ile temas halinde olan distrofik sonlanmaların miktar tayini.

Dört sıçandan doku kullanıldı. Hayvanlar, yukarıda tarif edildiği gibi yaralanmadan 7 gün sonra uzmanlaştı. Z-yığın görüntüleri bir Zeiss LSM510 konfokal mikroskobu kullanılarak elde edildi. Bir NG2+ hücresiyle temas halinde olan Dextran-Texas Kırmızı etiketli uç toplarının sayısı sayıldı ve gözlemlenen toplam uç top sayısı ile karşılaştırıldı.

Elektron mikroskobu.

TEM analizi için hücreler, 24 oyuklu bir plakaya uyacak şekilde uygun büyüklükte parçalar halinde kesilmiş, sterilize edilmiş bir ACLAR Gömme Filmi (Electron Microscopy Sciences) üzerine ekildi. Yetişkin NG2+ hücreleri, lamel başına 40.000 hücre konsantrasyonunda 1 μx003bcg/ml laminin üzerine kaplandı. Yirmi dört saat sonra lamel üzerine DRG'ler (kayma başına 3500) eklendi ve kültürler 37'sx000b0C, %10 CO2'ye yerleştirildi.2 inkübatör ve �% izdihama ulaşmasına izin verildi. Hücreler bu birleşme düzeyine ulaştıktan sonra (birlikte kültürde 3 gün veya 5 gün), ACLAR tabakaları, bağlı hücreleriyle birlikte fiksatife daldırıldı. İlk fiksatif 0.1 m kakodilat tamponu, pH 7.3 içinde %2.5 glutaraldehit idi. Numune, ferrosiyanürü azaltılmış %1 osmiyum tetroksitte sonradan sabitlenmiştir (Karnovsky, 1971). Asitleştirilmiş uranil asetat (Tandler, 1990) içinde ıslatıldıktan sonra numune etanol içinde kurutuldu, propilen oksitten geçirildi ve Poly/Bed içine gömüldü. İnce kesitler önce %50 metanol içinde asitleştirilmiş uranil asetat ile boyandı (Tandler, 1990), ardından Hanaichi ve diğerleri tarafından modifiye edildiği gibi Sato'nun üçlü kurşun boyası ile boyandı. (1986). Bu kesitler bir JEOL 1200 EX elektron mikroskobunda incelendi.

İstatistiksel analiz.

Tüm deneyler üç kopya halinde yapıldı ve en az iki kez tekrarlandı. Araştırmacı, verileri analiz etmeden önce kör edildi. Veriler Öğrenci tarafından analiz edildi T testi, iki oranlı test veya Tukey's ile iki yönlü ANOVA olay sonrası Minitab 15 Yazılımını kullanarak veya Kruskal–Wallis testi ve ardından Mann–Whitney ile test edin sen uygun şekilde SPSS ile test edin. Tüm veriler ortalama ± SEM olarak sunulur. arasındaki farklar istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi. P değer π,05 idi.


1 Cevap 1

A: Tüm nöronların çok sayıda kısa dendritleri ve tek bir uzun aksonu yoktur. Aslında, çoğu bu şekle sahip değildir. Beyindeki en çok sayıda nöron olan serebellar granül hücreler (toplam sayı ortalamalarının tahminleri yaklaşık 50 milyardır, yani beynin nöronlarının yaklaşık 3/4'ünü oluştururlar)[Ref 1,2,3] bu şekil. Aşağıdaki şemada gösterildiği gibi uzun paralel liflere ayrılan bir aksonları vardır (Ref 2'deki şekilden değiştirilmiştir). Nöronların şekilleri büyük ölçüde değişir. Bunun nedeni, nöronların yapılarını işlevlerine uyacak şekilde geliştirmeleridir:

Bir nöronun morfolojisine (yani şekline) bakarak ne yaptığı hakkında çok şey öğrenebiliriz. Örneğin, büyük dallanma dendritlerine sahip bir nöron, büyük olasılıkla çok sayıda girdiden gelen bilgileri bütünleştirirken, somaya yakın dallanan, ancak çok fazla yayılmayan dendritlere sahip bir nöron, muhtemelen sadece ondan gelen bilgileri komşularının yakınında bütünleştirir. Aksonlarla aynı şey, projeksiyon nöronlarının uzak beyin bölgelerindeki nöronlarla iletişim kurmalarına izin veren uzun aksonları vardır, yerel bir internöron ise yalnızca yerel olarak dallanacak ve yakındaki hücrelerle konuşmasına izin verecek kısa bir akson olacaktır. Periferik sinir sistemindeki bazı hücreler, doğrudan dendritlerden çıkan aksonlara sahiptir ve bu da onların bilgiyi birinden diğerine verimli bir şekilde iletmesine izin verir. [Ref 4] (Aşağıdaki şekil de Ref 4'ten alınmıştır)

Böylece nöronlar, işlevlerini yerine getirmek için çeşitli şekillerini geliştirdiler. Sanırım bu başlıkta sorgulandığı gibi bunlardan bir şeklin mi, yoksa bu şekillerin birçoğunun veya tamamının, sinir ağlarını modellemek için kullanmamız için doğru mu yanlış mı olduğu şu anda cevaplanamaz. Ama bence onlardan öğrenmeye çalışmalıyız çünkü elimizdeki en iyi model bu. Unutmayın, bu nöronlar çeşitli şekilleri ve bağlantıları ile bu evrendeki en harika fenomenlerden birini yaratmada başarılıdır: bilinçli zihnimiz.

Richard H. Masland. Nöronal hücre tipi. Güncel Biyoloji. 2004 Cilt 14 Sayı 3: R497-R500.

Masland RH. Neurons Brown Üniversitesi'ne bakıyorum. Eylemde Nörobilim: Beynimizi ve Sinir Sistemimizi Anlamak.


SONUÇLAR

Sinek CNS'nin uzunlamasına öncüleri

Sinek CNS'deki intersegmental longitudinal bağlantılara dört internöron, pCC, MP1, dMP2 ve vMP2 öncülük eder (Şekil 1A) (Jacobs ve Goodman, 1989a Jacobs ve Goodman, 1989b Lin ve diğerleri, 1995 Hidalgo ve Brand, 1997). dMP2 ve vMP2, her segmental ganglionun ('nöromer') ortasında doğar ve 12. evrede aksonları genişletmeye başlar. dMP2 aksonu arkada büyür ve vMP2 öne doğru büyür, bir sonraki segmentten öncülük eden vMP2 ve dMP2 aksonlarına doğru çıkıntı yapar. Eşzamanlı olarak, PCC aksonunu vMP2 ile birlikte öne gönderirken, MP1 aksonu dMP2'nin etrafını sarar ve onunla birlikte arkaya doğru uzanır. Birbirini takip eden bölümlerden öncülerin karşılaşması, 13. aşamanın başlarında ilk bölümler arası bağlantıyı kurar. Bu dört aksonun öncü işlevleri, olgun sinirde ciddi bir kusur oluşturmak için hepsinin kesilmesi gerektiğinden, büyük ölçüde gereksizdir (Lin ve diğerleri, 1995 Hidalgo ve Marka, 1997). Aşağıda, dMP2 ve vMP2'ye odaklanacağız.

CNS'de uzunlamasına bağlantılar oluşturmak için çentik gereklidir

Embriyogenezin ortasında, sıcaklığa duyarlı bir mutasyon kullanılarak Çentik'in çıkarılması, olgun uzunlamasına akson yollarının oluşumunu engelledi (Şekil 1B,C) (Giniger ve diğerleri, 1993 Giniger, 1998). Erken evre 13 embriyoları incelemek, Çentik fenotip, bu yolların öncülüğünün ilk aşamalarında belirgindir. Sıcaklık-kaydırılan embriyolarda, dMP2 ve vMP2 aksonları uygun yönde büyüdü, ancak durdu, 13. aşamanın sonlarında bile temas kuramadı (Şekil 1D-F). Bu fenotipin dışavurumculuğu, sıcaklık kaymasının zamanlamasına bağlıdır (Crower ve diğerleri, 2003). İlişkili olmayan CNS kusurlarını en aza indirmek için koşulları çok mütevazı bir ifade (erken yarı segment bağlantıların %13±1.1'i eksik) verecek şekilde ayarladık. Bölümler arası bağlantıların kurulamaması, akson büyümesinin yönü ile gösterildiği gibi vMP2 ve dMP2 kimliklerinin transformasyonundan ve Odd atlanan moleküler markör için boyamadan kaynaklanmaz (Spana ve Doe, 1996) (veriler gösterilmemiştir). Boyuna öncülerin oyalanması da gözlemlendi Delta ts (Şekil 1G).

Uzunlamasına öncülerin büyümesi ve rehberliği için çentik gereklidir. (A) Dört öncü nöron, segmentler arası bağlantılar kurar. Meyve sineği CNS: pCC, MP1, dMP2 ve vMP2. İki nöromer ve aralarındaki intersegmental bölge gösterilmiştir. Yeşil ve beyaz kesikli çizgiler, şemanın B'deki mikrografa hizalandığını gösterir. Ön kısım üsttedir. (B,C) Olgun embriyonik sinir kordonunda akson deseni. Vahşi tip (WT B) veya çentik ts (C) embriyolar öncü aksonlar uzamadan önce 32°C'ye kaydırıldı, 15/16 aşamasına büyütüldü, sabitlendi ve mAb BP102 ile boyandı. C'deki oklar, vahşi tiple (B'deki ok uçları) karşılaştırıldığında mutanttaki bitişik bölümler arasındaki boşlukları gösterir. Braket, tek bir nöromeri gösterir. (NS,E,G) Erken CNS'de akson paterni. KT (D), çentik ts (E) veya Delta ts (G) embriyolar 32°C'ye kaydırıldı, ardından 13. aşamanın ortasında sabitlendi ve öncü aksonları ortaya çıkarmak için mAb 22C10 ile boyandı. Sarı oklar, vahşi tiple (D'deki ok başı) karşılaştırıldığında mutantlarda eksik uzunlamasına bağlantıları gösterir. Beyaz oklar, içinde durmuş dMP2 ve vMP2 büyüme konilerini vurgular. çentik ts . (F) dMP2 ve vMP2 nöronları çentik ts . Orta seviye 13 çentik ts kontrolü altında dMP2 ve vMP2'de mCD8-GFP ifade eden embriyo GAL4-15J2 D,E için tarif edildiği gibi hazırlandı ve anti-GFP ile görselleştirildi. Oklar, durmuş MP2 büyüme konilerini gösterir. Durmuş bir vMP2 büyüme konisinden gelen izdüşüm demetleri daire içine alınır. (H) Yabani tip erken evre 13 embriyo taşıyan bir lacZ Notch sinyalleme aktivitesi için muhabir [E(spl)mδ-lacZ], anti-β-galaktosidaz (β-gal kırmızı) ve mAb22C10 (yeşil) ile etiketlenmiştir. Oklar, öncü büyüme konilerinin aktive edilmiş Notch sinyaline sahip hücrelere yakınlığını vurgulamaktadır (lacZ + ). (ben,J) Evre 13 embriyoları taşıyan E(spl)mδ-lacZ raportör, anti-β-gal (kırmızı) ile etiketlenmiş ve arayüz glia, anti-Prospero (I, yeşil) veya anti-Repo (J, mavi) için belirteçler. Daireler, β-gal-pozitif hücre kümelerini vurgular. (K) çentik ts belirtilen transgenleri taşıyan embriyolar, D,E için tarif edildiği gibi hazırlandı ve 13. aşamanın orta-geç döneminde oluşamayan intersegmental bağlantılar nicelendirildi. Tüm sapmalar çentik ts istatistiksel olarak anlamlıdır (P<0.05 ANOVA). üzerindeki ince dikey çizgi Çentik bar s.e.m.'yi gösterir. Transgenlerin hiçbiri bu koşullar altında vahşi tipte bir arka planda baskın kusurlar üretmedi (hemisegmentlerin <%2'si).

Uzunlamasına öncülerin büyümesi ve rehberliği için çentik gereklidir. (A) Dört öncü nöron, segmentler arası bağlantılar kurar. Meyve sineği CNS: pCC, MP1, dMP2 ve vMP2. İki nöromer ve aralarındaki intersegmental bölge gösterilmiştir. Yeşil ve beyaz kesikli çizgiler, şemanın B'deki mikrografa hizalandığını gösterir. Ön kısım üsttedir. (B,C) Olgun embriyonik sinir kordonunda akson deseni. Vahşi tip (WT B) veya çentik ts (C) embriyolar öncü aksonlar uzamadan önce 32°C'ye kaydırıldı, 15/16 aşamasına büyütüldü, sabitlendi ve mAb BP102 ile boyandı. C'deki oklar, vahşi tiple (B'deki ok uçları) karşılaştırıldığında mutanttaki bitişik bölümler arasındaki boşlukları gösterir. Braket, tek bir nöromeri gösterir. (NS,E,G) Erken CNS'de akson paterni. KT (D), çentik ts (E) veya Delta ts (G) embriyolar 32°C'ye kaydırıldı, ardından 13. aşamanın ortasında sabitlendi ve öncü aksonları ortaya çıkarmak için mAb 22C10 ile boyandı. Sarı oklar, vahşi tiple (D'deki ok başı) karşılaştırıldığında mutantlarda eksik uzunlamasına bağlantıları gösterir. Beyaz oklar, içinde durmuş dMP2 ve vMP2 büyüme konilerini vurgular. çentik ts . (F) dMP2 ve vMP2 nöronları çentik ts . Orta seviye 13 çentik ts kontrolü altında dMP2 ve vMP2'de mCD8-GFP ifade eden embriyo GAL4-15J2 D,E için tarif edildiği gibi hazırlandı ve anti-GFP ile görselleştirildi. Oklar, durmuş MP2 büyüme konilerini gösterir. Durmuş bir vMP2 büyüme konisinden gelen izdüşüm demetleri daire içine alınır. (H) Yabani tip erken evre 13 embriyo taşıyan bir lacZ Notch sinyalleme aktivitesi için muhabir [E(spl)mδ-lacZ], anti-β-galaktosidaz (β-gal kırmızı) ve mAb22C10 (yeşil) ile etiketlenmiştir. Oklar, öncü büyüme konilerinin aktive edilmiş Notch sinyaline sahip hücrelere yakınlığını vurgulamaktadır (lacZ + ). (ben,J) Evre 13 embriyoları taşıyan E(spl)mδ-lacZ raportör, anti-β-gal (kırmızı) ile etiketlenmiş ve arayüz glia, anti-Prospero (I, yeşil) veya anti-Repo (J, mavi) için belirteçler. Daireler, β-gal-pozitif hücre kümelerini vurgular. (K) çentik ts belirtilen transgenleri taşıyan embriyolar, D,E için tarif edildiği gibi hazırlandı ve 13. aşamanın orta-geç döneminde oluşamayan intersegmental bağlantılar nicelendirildi. Tüm sapmalar çentik ts istatistiksel olarak anlamlıdır (P<0.05 ANOVA). üzerindeki ince dikey çizgi Çentik bar s.e.m.'yi gösterir. Transgenlerin hiçbiri bu koşullar altında vahşi tipte bir arka planda baskın kusurlar üretmedi (hemisegmentlerin <%2'si).

Yabani tipte bu aşamada Notch'in nerede etkinleştirildiğini belirlemek için Notch aktivitesi için bir transkripsiyonel raportör inceledik, E(spl)mδ-lacZ (Cooper ve Bray, 1999) ve ara yüz gliasının bir alt kümesinde β-galaktosidaz ifadesini buldu. Bu glia, ilerleyen uzunlamasına öncü aksonların izleyeceği yolu sıraladı ve bu aksonlar büyürken mevcuttu (Şekil 1H) (Jacobs ve Goodman, 1989a Hidalgo ve Booth, 2000). β-galaktosidaz + hücreleri, pozisyon ve morfoloji (Şekil 1H) bazında ve Prospero ve Repo için ortak etiketleme ile (Şekil 1I,J) arayüz glia olarak tanımlandı. En belirgin β-galaktosidaz ifadesi, nöromerler içindeki gliadadır (Griffiths ve Hidalgo, 2004), ancak bu aşamada, varsayımsal akson yolu boyunca, nöromerler arasındaki arayüz gliasında da ifade vardı (Şekil 1H, oklar).

Arayüz gliasındaki çentik aktivasyonu şaşırtıcıydı çünkü nöronlarda Çentik ifadesi, CNS aksonal fenotipinin geç evresini baskılıyor. çentik ts (Giniger, 1998 Le Gall ve diğerleri, 2008). Remarkably, we now found we could efficiently rescue the early axon phenotype of Notch ts by expressing Notch either just in the glia [repo-GAL4 (all glia): 72% rescue htl-GAL4 (interface glia): 92% rescue] or just in the dMP2 and vMP2 pioneers (15J2-GAL4: 85% rescue P<0.01 in all cases T-test) (Fig. 1K). We verified that in wild type Notch is expressed in interface glia and in both dMP2 and vMP2 (data not shown). We also verified that Notch activity in both cell types is physiologically relevant using loss-of-function experiments (Fig. 1K): RNAi against Çentik in interface glia significantly enhanced the Notch ts phenotype (2.5-fold P<0.005), and cell-autonomous reduction of functional Notch in dMP2 and vMP2 by cis-inhibition (Sprinzak et al., 2010) using expression of Delta lacking its intracellular domain (Itoh et al., 2003) enhanced the Notch ts phenotype by 92% (P<0.05). RNAi was not effective on the relevant timescale in dMP2 and vMP2 using 15J2-GAL4.

How can Notch rescue the growth of longitudinal pioneer axons both autonomously, acting in the pioneers, and non-autonomously, acting in the glia? We will first dissect the action of Notch in glia, and then turn to the Notch mechanism in pioneers.

Glial development in Notch ts

Notch becomes activated in interface glia by contact en passant with the axons of Delta-expressing commissural interneurons (Thomas and van Meyel, 2007). Interface glia were contacted by Delta + axons and displayed activated Notch signaling by early stage 13, in time to modulate growth of longitudinal pioneers (Fig. 2A). Moreover, expression in the glia of a Notch derivative lacking the ligand-binding domain could not rescue longitudinal axons (21% of intersegment connections were absent in Notch ts repo-GAL4UAS-Çentik Δ EGF(10-12) versus 13% for Notch ts , consistent with previous evidence showing a mild dominant-negative effect of this transgene) (Le Gall et al., 2008).

ByM6A__&Key-Pair-Id=APKAIE5G5CRDK6RD3PGA" alt="Interface glia recruit a cap of Frazzled+ neuronal processes. The CNS of stage 13 Drosophila embryos was analyzed by immunofluorescence. Embryos in E-G and J are very early stage 13, other panels are mid-stage 13. (A) Stage 13 embryos bearing E(spl)mδ-lacZ reporter, labeled with anti-β-gal (red) and anti-Delta (green). A z-projection is shown in A. White arrowheads indicate Delta-positive axons coursing medially from lateral neurons. Anterior is to the right. AL shows a longitudinal cross-section at the position of the yellow triangles. AT shows a transverse cross-section at the position of the orange triangles. Thin white arrows indicate Delta-positive axons (green) as they contact Notch signaling-positive glia (red). (B) Wild-type (WT) or Notchts embryos were temperature-shifted, fixed and labeled with anti-Repo. Each white bracket indicates one segment. White arrow indicates midline. Wild-type and Notchts embryos each have approximately ten Repo+ interface glia per hemisegment. A few non-interface glia are also visible in this section. (C) Wild-type or Notchts embryos prepared as described for B but visualized with anti-Htl. (D) Wild-type or Notchts embryos prepared as described for B but visualized with anti-Prospero. Five to six Pros+ cells are visible in each segment in wild type and in Notchts (bracket). Only one focal plane is shown so not all Pros+ cells are visible in all segments. (E-E″″) Wild-type embryo expressing mCD8-GFP in interface glia, under the control of htl-GAL4, labeled with anti-GFP (green), anti-Frazzled (red) and mAb 22C10 (blue). E shows the overlay of all channels. E′-E″″ are higher magnification views of the boxed region. Thin white arrows indicate the growth cones of dMP2 and vMP2. Glia (GFP, green) and growth cones (mAb 22C10, blue) are shown in E′. Anti-Frazzled (red) is shown in E″. Anti-Frazzled (red) and growth cones (mAb 22C10, blue) are shown in E‴. E″″ is the overlay of all markers. Yellow arrows highlight the gap between the vMP2 growth cone and the glial cell. Note close apposition of dMP2 and vMP2 growth cones with Frazzled. (F) Three-dimensional rendering of an image stack of an embryo prepared as described for E. vMP2 growth cone (mAb 22C10, cyan) migrates through a bed of Frazzled+ processes (red) that separate it from the associated interface glia (GFP green). Image has been inverted to put glia beneath axon. (G-G″″) Wild-type embryo labeled with anti-Frazzled (green), anti-HRP (red) and mAb BP102 (blue). G shows overlay of all channels. A single optical section is shown (

Interface glia recruit a cap of Frazzled + neuronal processes. The CNS of stage 13 Meyve sineği embryos was analyzed by immunofluorescence. Embryos in E-G and J are very early stage 13, other panels are mid-stage 13. (A) Stage 13 embryos bearing E(spl)mδ-lacZ reporter, labeled with anti-β-gal (red) and anti-Delta (green). A z-projection is shown in A. White arrowheads indicate Delta-positive axons coursing medially from lateral neurons. Anterior is to the right. AL shows a longitudinal cross-section at the position of the yellow triangles. AT shows a transverse cross-section at the position of the orange triangles. Thin white arrows indicate Delta-positive axons (green) as they contact Notch signaling-positive glia (red). (B) Wild-type (WT) or Notch ts embryos were temperature-shifted, fixed and labeled with anti-Repo. Each white bracket indicates one segment. White arrow indicates midline. Wild-type and Notch ts embryos each have approximately ten Repo + interface glia per hemisegment. A few non-interface glia are also visible in this section. (C) Wild-type or Notch ts embryos prepared as described for B but visualized with anti-Htl. (NS) Wild-type or Notch ts embryos prepared as described for B but visualized with anti-Prospero. Five to six Pros + cells are visible in each segment in wild type and in Notch ts (bracket). Only one focal plane is shown so not all Pros + cells are visible in all segments. (E-E″″) Wild-type embryo expressing mCD8-GFP in interface glia, under the control of htl-GAL4, labeled with anti-GFP (green), anti-Frazzled (red) and mAb 22C10 (blue). E shows the overlay of all channels. E′-E″″ are higher magnification views of the boxed region. Thin white arrows indicate the growth cones of dMP2 and vMP2. Glia (GFP, green) and growth cones (mAb 22C10, blue) are shown in E′. Anti-Frazzled (red) is shown in E″. Anti-Frazzled (red) and growth cones (mAb 22C10, blue) are shown in E‴. E″″ is the overlay of all markers. Yellow arrows highlight the gap between the vMP2 growth cone and the glial cell. Note close apposition of dMP2 and vMP2 growth cones with Frazzled. (F) Three-dimensional rendering of an image stack of an embryo prepared as described for E. vMP2 growth cone (mAb 22C10, cyan) migrates through a bed of Frazzled + processes (red) that separate it from the associated interface glia (GFP green). Image has been inverted to put glia beneath axon. (G-G″″) Wild-type embryo labeled with anti-Frazzled (green), anti-HRP (red) and mAb BP102 (blue). G shows overlay of all channels. A single optical section is shown (

0.7 μm). G′-G″″ show higher magnification views of the boxed region. G′ shows the overlay of channels G″-G″″ show separate channels as indicated. (H-I) An embryo expressing mCD8-GFP in interface glia (htl-GAL4), labeled with anti-GFP (green) and anti-Frazzled (red). H is a z-projection. Arrows highlight the correspondence of glial position and Frazzled. H′ is a magnified view of the region indicated in H. I shows a three-dimensional rendering of H, viewed obliquely. Frazzled is ventral to the glia (arrows). (J-J″) z-projection of an early stage 13 wild-type embryo expressing mCD8-GFP in interface glia (GAL4-605), labeled with anti-GFP (green) and anti-Frazzled (blue). Frazzled + cap is beginning to fill-in between successive segments (asterisks). J shows the overlay of channels. Arrows indicate an intersegmental region in which Frazzled is not yet detected but a glial cell is already present. J′ shows GFP signal in glia and J″ shows anti-Frazzled staining. At early stage 13 GAL4-605 is expressed primarily in interface glia later it will also be in some neurons.

Notch ts embryos had the normal number of interface glia, as assayed with anti-Repo (Fig. 2B). Moreover, the position and morphology of those glia appeared largely normal, and they expressed Htl and (where appropriate) Prospero (Fig. 2C,D). Thus, failure of overall glial development does not underlie the Çentik axonal phenotype.


Neural activity promotes brain plasticity through myelin growth, study finds

Steve Fisch

Michelle Monje is senior author of a paper that found neuronal activity causes changes in myelin, cells that insulate nerve fibers and make them more efficient.The brain is a wonderfully flexible and adaptive learning tool. For decades, researchers have known that this flexibility, called plasticity, comes from selective strengthening of well-used synapses — the connections between nerve cells.

Now, researchers at the Stanford University School of Medicine have demonstrated that brain plasticity also comes from another mechanism: activity-dependent changes in the cells that insulate neural fibers and make them more efficient. These cells form a specialized type of insulation called myelin.

“Myelin plasticity is a fascinating concept that may help to explain how the brain adapts in response to experience or training,” said Michelle Monje, MD, PhD, assistant professor of neurology and neurological sciences.

The researchers’ findings are described in a paper published online April 10 in Science Express.

“The findings illustrate a form of neural plasticity based in myelin, and future work on the molecular mechanisms responsible may ultimately shed light on a broad range of neurological and psychiatric diseases,” said Monje, senior author of the paper. The lead authors of the study are Stanford postdoctoral scholar Erin Gibson, PhD, and graduate student David Purger.

Sending neural impulses quickly down a long nerve fiber requires insulation with myelin, which is formed by a cell called an oligodendrocyte that wraps itself around a neuron. Even small changes in the structure of this insulating sheath, such as changes in its thickness, can dramatically affect the speed of neural-impulse conduction. Demyelinating disorders, such as multiple sclerosis, attack these cells and degrade nerve transmission, especially over long distances.

Myelin-insulated nerve fibers make up the “white matter” of the brain, the vast tracts that connect one information-processing area of the brain to another. “If you think of the brain’s infrastructure as a city, the white matter is like the roads, highways and freeways that connect one place to another,” Monje said.

In the study, Monje and her colleagues showed that nerve activity prompts oligodendrocyte precursor cell proliferation and differentiation into myelin-forming oligodendrocytes. Neuronal activity also causes an increase in the thickness of the myelin sheaths within the active neural circuit, making signal transmission along the neural fiber more efficient. It’s much like a system for improving traffic flow along roadways that are heavily used, Monje said. And as with a transportation system, improving the routes that are most productive makes the whole system more efficient.

In recent years, researchers have seen clues that nerve cell activity could promote the growth of myelin insulation. There have been studies that showed a correlation between experience and myelin dynamics, and studies of isolated cells in a dish suggesting a relationship between neuronal activity and myelination. But there has been no way to show that neuronal activity directly causes myelin changes in an intact brain. “You can’t really implant an electrode in the brain to answer this question because the resulting injury changes the behavior of the cells,” Monje said.

The solution was a relatively new and radical technique called optogenetics. Scientists insert genes for a light-sensitive ion channel into a specific group of neurons. Those neurons can be made to fire when exposed to particular wavelengths of light. In the study, Monje and her colleagues used mice with light-sensitive ion channels in an area of their brains that controls movement. The scientists could then turn on and off certain movement behaviors in the mice by turning on and off the light. Because the light diffuses from a source placed at the surface of the brain down to the neurons being studied, there was no need to insert a probe directly next to the neurons, which would have created an injury.

By directly stimulating the neurons with light, the researchers were able to show it was the activation of the neurons that prompted the myelin-forming cells to respond.

Further research could reveal exactly how activity promotes oligodendrocyte-precursor-cell proliferation and maturation, as well as dynamic changes in myelin. Such a molecular understanding could help researchers develop therapeutic strategies that promote myelin repair in diseases in which myelin is degraded, such as multiple sclerosis, the leukodystrophies and spinal cord injury.

“Conversely, when growth of these cells is dysregulated, how does that contribute to disease?” Monje said. One particular area of interest for her is a childhood brain cancer called diffuse intrinsic pontine glioma. The cancer, which usually strikes children between 5 and 9 years old and is inevitably fatal, occurs when the brain myelination that normally takes place as kids become more physically coordinated goes awry, and the brain cells grow out of control.

Other Stanford co-authors of the paper are Hannes Vogel, MD, professor of pathology and of pediatrics Ben Barres, MD, PhD, professor and chair of neurobiology, as well as professor of developmental biology and of neurology and neurological sciences postdoctoral scholar Bradley Zuchero, PhD graduate students Christopher Mount, Grant Lin, Lauren Wood and Gregor Bieri and undergraduate students Andrea Goldstein, Sarah Miller and Ingrid Inema.

This research was funded by the National Institutes of Health (K08NS070926 and R01EY10257) the California Institute for Regenerative Medicine Alex’s Lemonade Stand Foundation the McKenna Claire Foundation The Cure Starts Now the Lyla Nsouli Foundation the Dylan Jewett, Connor Johnson, Zoey Ganesh, Dylan Frick, Abigail Jensen, Wayland Villars and Jennifer Kranz Memorial Funds the Ludwig Foundation the Stanford Medical Scientist Training Program the Stanford Institute for Neuro-Innovation and Translational Neurosciences the Lucile Packard Foundation for Children’s Health Stanford’s Clinical and Translational Science Award (UL1RR025744) the Howard Hughes Medical Institute Fellowship of the Life Sciences Research Foundation the Bezos Family Foundation the Child Health Research Institute at Stanford and the Anne T. and Robert M. Bass Endowed Faculty Scholarship.


Notch Signaling

Ryoichiro Kageyama , . Toshiyuki Ohtsuka , in Current Topics in Developmental Biology , 2010

2.1 Hes7 oscillations by negative feedback

Somites are segmental axial structures of vertebrate embryos that give rise to vertebral column, ribs, skeletal muscles, and subcutaneous tissues. A bilateral pair of somites forms periodically at the anterior ends of the presomitic mesoderm (PSM), located at the caudal part of embryos ( Fig. 10.2A ). During this process, mesenchymal cells of the PSM are transformed into the epithelial sheet (mesenchymal–epithelial transition) at each somite border, which segments a block of somitic cells from the PSM (segmentation). A bilateral pair of somites is formed once every 2 h in mice, every 90 min in chick, and every 30 min in zebrafish. Thus, the segmentation period differs from species to species. In addition, the period becomes longer at lower temperatures ( Jiang ve diğerleri., 2000 ), indicating that it is also temperature dependent. However, within each species, the period length remains precise during development, so that the number of somites is used to identify the embryonic stages. The biological clock that regulates this periodic segmentation is called the segmentation clock ( Pourquié, 2003 ) its molecular mechanisms have been analyzed intensively in zebrafish, chick, and mice ( Dequéant and Pourquié, 2008 Mara and Holley, 2007 ).

Figure 10.2 . Hes7 oscillations in the PSM during somite segmentation. (A) The anterior ends of the PSM are segmented every 2 h in mouse embryos, forming a bilateral pair of somites (asterisk). Hes7 gene transcription is initiated in the posterior end of the PSM (phase I) and is propagated into the anterior region (phase II), stopping near the anterior end (phase III). Hes7 gene transcription and Hes7 protein expression occur in a mutually exclusive manner in all three phases, indicating that Hes7 gene transcription is repressed by Hes7 protein. (B) Dynamic Hes7 expression is caused by oscillation in individual cells [indicated by a dot in (A)]. Hes7 gene transcription and Hes7 protein expression oscillate in an antiphase manner. (See Color Insert.)

In mouse embryos, both Hes1 ve Hes7 are expressed dynamically in the PSM ( Bessho ve diğerleri., 2001a Jouve ve diğerleri., 2000). The expression cycle is initiated in the posterior tip of the PSM and is propagated toward the anterior, ending near the anterior boundary of the PSM, after which segmentation of one bilateral pair of somites occurs ( Fig. 10.2A ). This dynamic expression of Hes1 and Hes7 is caused by synchronized oscillation in PSM cells ( Fig. 10.2B ). Of these two genes, Hes7 is functionally more important than Hes1 for somite segmentation: somites fail to segment and thus are severely fused in the absence of Hes7 but not in the absence of Hes1 ( Bessho ve diğerleri., 2001b ). Interestingly, sustained expression of Hes7 also leads to severe somite fusion, suggesting that the oscillating expression of Hes7 is the key for maintaining periodic somite segmentation ( Niwa ve diğerleri., 2007 ).

What is the mechanism producing Hes7 oscillations? In the PSM, Hes7 gene transcription and translation are mutually exclusive ( Fig. 10.2A,B ), and in the absence of a functional Hes7 protein, the Hes7 gene is continuously transcribed in the PSM ( Bessho ve diğerleri., 2003). aktivasyonu Hes7 promoter induces synthesis of Hes7 mRNA which is then translated to generate Hes7 protein Hes7 protein levels reach a peak within about 1 h. Hes7 protein binds to the multiple N box sequences located in the Hes7 promoter, repressing its own expression ( Fig. 10.3 ). This repression leads to disappearance of Hes7 mRNA, and then the Hes7 proteins disappear within an hour by the ubiquitin–proteasome-mediated degradation. The disappearance of Hes7 protein relieves autorepression, allowing Hes7 transcription to restart. As a result, Hes7 expression oscillates with a period of about 2 h. Thus, the negative regulation of Hes7 expression by Hes7 protein forms a negative feedback loop that is critical for maintaining oscillations.

Figure 10.3 . Hes7 oscillations are regulated by negative feedback and rapid degradation of gene products. aktivasyonu Hes7 promoter induces synthesis of both Hes7 mRNA and Hes7 protein. Hes7 protein then binds to multiple N box sequences of Hes7 promoter and represses its own expression. This repression leads to disappearance of Hes7 mRNA and Hes7 protein because they are extremely unstable. Hes7 protein is polyubiquitinated and degraded by proteasome. Disappearance of Hes7 protein relieves negative autoregulation, allowing the next round of expression. As a result, Hes7 expression oscillates in the PSM.


Olfactory ensheathing cells: Biology in neural development and regeneration

Olfactory ensheathing cells (OECs) constitute a unique population of glia that accompany and ensheath the primary olfactory axons. They are thought to be critical for spontaneous growth of olfactory axons within the developing and adult olfactory nervous system, and have recently emerged as potential candidates for cell-mediated repair of neural injuries. Here, based on the current research, we give an overview of the biology of OECs in neural development and regeneration. This review starts with a detailed description of the cellular and molecular biological properties of OECs. Their functions in olfactory neurogenesis, olfactory axonal growth and olfactory bulb formation are sequently discussed. We also describe therapeutic applications of OECs for the treatment of a variety of neural lesions, including spinal cord injury, stroke, degenerative diseases, and PNS injuries. Finally, we address issues that may foster a better understanding of OECs in neural development and regeneration.

Research highlights

▶ Olfactory ensheathing cells (OECs) constitute a unique population of glia that accompany and ensheath the primary olfactory axons. ▶ They are thought to be critical for growth of olfactory axons within the developing and adult olfactory nervous system, and have recently emerged as potential candidates for cell-mediated repair of neural injuries. ▶ In this article we review current knowledge of OEC biology, including their molecular and cellular properties, and their role in olfactory development. ▶ We also describe therapeutic applications of OECs for a variety of neural lesions. ▶ This review, we think, may foster a better understanding of OECs biology in neural development and regeneration.


How are Interactions Between Neural Cells Established and Maintained?

The human embryo is a collection of clusters of non-specific cells, which then develop into the tissues of the adult human. In particular immature, non-specific neuroblasts must be differentiated into the highly specialised cells of the nervous system, each with a unique structure, function and synaptic interactions (Whatson 2004).

The whole function of the nervous system relies on the synaptic and other interactions between neural cells being developed appropriately and maintained throughout life. This account covers the initial development of specific neural cells from immature precursor stem cells and also the methods by which the growing specialised neurons grow along the correct routes to form their interactions with other cells, both neuronal and non neuronal.

Establishing neural cells from stem cells

Progenitor or stem cells are non-specific immature cells that are able to differentiate and form specialised cells in the adult organism. There are relatively few types of neural stem cells, with the potential to differentiate into many different types of specialised neural cells, depending on specific, localised requirements. Multipotent (able to form many types of daughter cells) neural stem cells were first identified in the early 1990s (Imitola et al. 2004) and subsequent research has focussed on specific examples of these immature progenitor cells.

Neural stem cells can give rise both to different types of mature cell, as a result of asymmetric cell division, as well as identical daughter cells via simple symmetric cell replication (Gage 2000). The exact form of the adult cell is controlled by the location of progenitors during differentiation, as well as by diffusible factors acting from a more distant site, usually the final location to which the differentiated cells will migrate.

Signalling molecules influence the differentiation of neural stem cells. For instance valproic acid (VPA) actively suppresses glial differentiation, instead encouraging the development of adult neurons, via upregulation of the neurogenic basic helix-loop-helix transcription factor (Hsieh, Gage 2004).

The mesenchymal stem cell (MSC) is derived from bone marrow and able to self regenerate and differentiate into several different types of cells in vivo (Kondo et al. 2005). MSCs are able to form both neuronal and glial cells the difference relating to the presence or absence or voltage gated ion channels indicative of the potential to develop into a full neuronal cell. Furthermore the presence of specific signalling molecules in the cell milieu can influence the development of specific types of neuronal cells. One such example involves the sonic hedgehog and retinoic acid signalling molecules, which have been shown to cause MSCs to define neurons adapted for the peripheral nervous system (Kondo et al. 2005). It is believed that this guidance of development occurs via the promotion of specific transcription factors appropriate to the adult neuronal cells. The diffusible signalling molecules would switch on the transcription factors.

A growing axon has an area of active tissue on the tip, known as the growth cone (Whatson 2004). It is the interactions between the growth cone and the surrounding structures and chemicals that govern the route along which the axon grows. Chemotactic guidance is the name given to guidance derived from close physical contact between the growth cone and structures it comes into contact with. For instance, physical obstacles such as bones or cartilage may prevent the axon from continuing along a specific route. Instead the filopodia (thin membrane extensions) would literally feel around for a route that the axonal growth could take.In the case of growth of the axons of the optic nerve, the growth of retinal neurites is influenced by the presence of laminin and fibronectin. Axons interact with these extracellular matrix components differently according to their origin with some adhering more strongly to laminin, with others showing greater allegiance to fibronectin (Whatson 2004). Hence some retinal neurites cross the optic chiasm whilst others do not.

Chemotactic guidance does not, however, operate in isolation, instead being linked to the presence of chemical signalling molecules, many of which are similar to those affecting the initial stem cell differentiation.

The idea that the gradient of chemical substances secreted by a target cell might be responsible for the ability of growth cones to find their way to a target cell was initially proposed by Ramon y Cajal more than a century ago (Ming et al. 2002). These chemotropic (literally movement in response to a chemical factor) factors are present in the extracellular matrix and act to either attract or repel the growth cone, along a chemical gradient. One example is netrin-1, which causes isolated xenopus spinal neurones to turn towards the greater concentration. However too high a concentration of netrin-1 (eg 5ng/ml-1 compared to 5 (g/ml-1) appears to desensitise the neurones, which no longer exhibit turning on a gradient (Ming et al. 2002). Netrin-1 (also known as unc-6) is also required by the worm C-elegans in order for differentiating neuroblasts to migrate along the dorsoventral axis the final direction determined by interactions between the neuroblasts and specific receptors (Hatten 2002).

Crossing the midline a detailed example

In the fruit fly drosophila the genes roundabout (deficient mutant – robo), commissureless (deficient mutant – comm) and slit (deficient mutant – sli) work together to influence axonal growth across the CNS midline (Kidd, Bland & Goodman 1999). Axons may cross the midline and become commissural or remain ipsilateral as longitudinal axons. Figure 1 below illustrates the effect that removal of each of the 3 chemotropic factors has on the appearance of longitudinal and commissural axons within the CNS axon scaffold, described as follows:

Wild type (all genes thus chemotropic factors intact) shows neat crossing of the midline, resulting in 2 commissures per segment and balanced commissural and longitudinal axons.

comm – no axons cross the midline, all remain longitudinal.

sli – axons enter the midline but then continue as longitudinal axons, within the midline.

robo – axons cross and recross the midline resulting in excessive commissural axons and very few longitudinal axons.

The authors concluded that slit acted as a short range repellent of axons with respect to the midline, thus was a chemotropic factor (Kidd, Bland & Goodman 1999). Subsequent research has shown that robo is actually repelled from the midline in response to slit, which has been found to be a large protein expressed by midline glia (Kraut, Zinn 2004).

Neuronal and Glial cell interactions

Much recent research into the methods by which developing neurons form interactions with other neural cells as well as the glial support cells, has come from study of insects such as drosophila.

Glia are crucial in the correct development of the developing eye disc in insects. The diffusible factors decapentaplegic and hedgehog both strongly influence glial proliferation, with decapentaplegic also having a role in glial motility. Glia motility is particularly crucial as axons will extend and grow in the correct direction in response to diffusible factors but will not enter the optic stalk without the chemotactic guidance of glia (Oland, Tolbert 2003).

Maintaining the connections in the adult nervous system

It has recently become apparent that, as a neuron matures, it’s responsiveness to signalling molecules such as netrin-1 changes (Salinas 2003). There is logic to this, as a maturing axon would expect to receive specific guidance cues to establish connections with other cells whereas a mature axon would not seek to continue to migrate towards the cells, rather wishing to maintain accurate connections. As there is a need to replace dead cells throughout life it would not be appropriate to completely switch off signalling molecules such as netrin-1, as every new axon would need to migrate towards the correct connections, but would then benefit from becoming effectively immune to the signalling capabilities of netrin-1 as there would be no need for further migration.

The importance of accurate migration from the stem cell germinal site to the area of axon-target interaction relates to the need for accurate synaptic connections in the adult nervous system. Organisms with a more simplistic nervous system have a low extent of migration, whilst the vertebrate nervous system involves a high degree of migration (Hatten 2002). Thus the eventual nervous system depends heavily on the accuracy of the guidance provided by both the signalling molecules and the chemotactic scaffold.

Whilst there is immense potential in understanding how stem cells develop, in terms of replicating this in order to replace damaged cells in the human adult thus far the research underlying the regulation of endogenous stem cells is in its infancy and mechanisms are poorly understood. Further, the method by which differentiated cells are able to accurately locate their target connections is also an area of current mystery.


Malzemeler ve yöntemler

Zebrafish lines

Embryos and larvae were obtained by natural spawning from wild-type, Tg(tilki D3:GFP) [12, 30], Tg(flh:eGFP) Tg(foxD3:GFP) [12], Tg(h2afz-GFP) [31], or Tg(ET16:GFP) fish (a gift from Dr Vladimir Korzh). The ET16 enhancer trap line carries a Tol2-GFP insertion and labels a subset of habenular neurons [32, 33]. Embryos were reared and staged according to standard procedures [34] and occasionally 0.002% phenylthiourea was added to the fish water from 24 hpf to inhibit pigment formation.

Dye labeling

Carbocyanine dye labeling of habenular efferent axons was performed as described previously [16].

Laser ablation

Laser ablation of parapineal precursors was performed at 24–28 hpf in Tg(flh:eGFP) Tg(foxD3:GFP) transgenic embryos as described previously [12]. Larvae were subsequently examined by laser-scanning confocal microscopy at 3 or 4 dpf to determine if any parapineal cells remained. Larvae lacking all parapineal cells were classed as 'ablated' whereas those retaining one or more parapineal cell(s) were classed as 'failed ablated'.

Focal electroporation

The electroporation technique was adapted from [35] to enable the efficient transfer of DNA to single cells or small group of cells in embryonic zebrafish CNS. Embryos at 48–72 hpf were mounted in 2% low melting point agarose (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) and using a microsurgical blade, a small chamber of agarose was cut out to expose the dorsal diencephalons/mesencephalon. Micropipettes with a tip diameter of 1–2 μm were pulled on a P-87 micropipette puller (Sutter Instrument Company, CA, USA) using AlSi glass capillaries containing a filament. Micropipettes were filled with a solution containing purified plasmid DNA resuspended in H2O at a concentration of 1 μg/μl. For most habenular neuron electroporations we used pCS2-GAP43-GFP (a gift from Dr E Amaya). GFP synthesized from this construct is localized to the cell membrane by virtue of two amino-terminal palmitoylation signals from the GAP43 protein. To visualize presynaptic terminals, we used a 1:1 mixture of pCS2-GAL4 plasmid DNA (a gift from Dr Masahiko Hibi) and pCS2-Syp:GFP-DSR [17]. This latter construct encodes both cytoplasmic DsRed fluorescent protein and a Syp-GFP fusion protein, driven from separate UAS elements. For IPN electroporations we used pCS2-lyn-Cherry, which encodes a membrane-targetted Cherry fluorescent protein (a kind gift from Henry Roehl). Micropipettes were guided into either the L or R habenula or the IPN using an MX3000 Huxley-style micromanipulator (Soma Scientific Instruments, Irvine, CA, USA) under ×40 water-immersion DIC optics (Axioskop 2 FS microscope, Carl Zeiss). The following stimulation parameters were used: 1–2 s long trains of 2 ms square pulses at 200 Hz and a potential difference of 30 V. Trains were delivered 3–5 times with approximately 0.5 s interval between trains. Pulses were generated with a Grass SD9 stimulator (Grass-Telefactor, West Warwick, RI, USA). After electroporation, embryos were cut out from the agarose and returned to embryo medium.

Whole mount yerinde hybridization and immunostaining

yerinde hybridization, antibody staining and histological sectioning were performed according to standard methods [36]. For antibody stainings, mouse anti-acetylated tubulin (T6793 Sigma) and rabbit anti-GFP (TP401 Torrey Pines Biolabs, San Diego, CA, USA) were used at 1:1,000 dilutions and rabbit anti-DsRed (632496 ClonTech, Palo Alta, CA, USA) was used at 1:600.

Microscopy and image manipulation

Fluorescent labeling was imaged by confocal laser-scanning microscopy (Leica SP2) using ×40 and ×63 water-immersion objective lenses. z-stacks were typically acquired at 1–2 μm intervals for epithalamic labeling and fluorescent dye-labeling of habenular axons or 0.5–1 μm intervals for imaging axonal arbors or IPN neurons labeled by electroporation. Bazı durumlarda, z-stacks were deconvolved using Huygen's Essential software (Scientific Volume Imaging, Hilversum, The Netherlands). Three-dimensional projections were generated from the stack of images using Volocity software (Improvision, Coventry, UK).

yerinde hybridization staining and plastic sections were photographed using a Jentopix C14 digital camera attached to a Nikon Eclipse E1000 compound microscope. For presentation, image manipulation was performed using Photoshop CS2 (Adobe) software.

Morphometric analyses

Radial distribution of neurites

To quantify the distribution of neurite branches from the center to periphery of each terminal arbor, we developed a method similar to Sholl analysis. Three-dimensional reconstructions of each arbor were orientated such that the base of the arbor lay on a flat plane and a two-dimensional image of the reconstruction, parallel to this plane, was used for further analysis. The incoming axon was cropped where it extended beyond the maximum width and length of the arbor. Next, the image was thresholded and the convex hull method was used to define the arbor perimeter (ImageJ software, US National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA Hull and Circle plug-in by A Karperien and TR Roy). Using custom-written MATLAB software (The MathWorks, Inc., Natick, MA, USA), a series of 10 equally spaced concentric shells were defined, centered upon the centroid of the convex hull (see Figure 3g, for example). The number of pixels (representing axon signal) in each shell was taken as a measure of axon density. This generated a plot of cumulative fraction of axon density versus radius, for each arbor. This method is resistant to differences in the absolute area covered by the arbor and the total axonal length. Because we analyzed two-dimensional images, our method will underestimate axon density where axon segments are aligned above or below one another. This occurs rarely for L-typical arbors but is more common at the perimeter of R-typical arbors. Thus, although our method detects a greater peripheral localization of axonal length in R-typical arbors, if anything this difference between the arbor sub-types is likely to have been underestimated.

To describe the distribution profiles for the different sub-types of arbor (L-typical, R-typical and Ab-L, Ab-R) non-linear regression was used to fit fourth order polynomial models to the raw data with the y-intersect constrained to zero (at 0% radius the cumulative fraction of axon density must be zero). To compare the curves for the different arbor sub-types, we used the AIC method [37, 38]. Briefly, we used the AIC method to compare two models an AICc score is computed for a 'global' model that treats all the data from two arbor sub-types as a single data set and for a second model with individual curves fit to each data set. A large difference in the AICc scores, ΔAICc, indicates there is a high probability of the model with the lower AICc score being correct. If this is the model with separate fits for the two arbor sub-types it follows that the sub-types can be considered distinct. In the Results text we report ΔAICc and the probability that the 'individual' model, with separate polynomial fits for the two arbor sub-types, is correct.

Width/length ratio

The maximum length (measured along the AP axis) and maximum width (measured perpendicular to the AP and DV axes) were measured (Volocity, Improvision). Width/Length ratios were compared using one-way ANOVA with Tukey's post-tests for pair-wise comparisons of arbor sub-types.

Derinlik

The depth over which each axon elaborated its terminal arbor was measured in YZ projections made using Volocity software. For L-typical arbors located in the dIPN, depth was measured parallel to the DV axis of the brain. Because the neuropil domain of the vIPN is inclined relative to the DV axis, accurate depth measurements for ventrally located R-typical, Ab-L and Ab-R arbors were made perpendicular to the plane of the vIPN neuropil domain. Depths were compared using one-way ANOVA with Tukey's post-tests for pair-wise comparisons of arbor sub-types.

Branching

The number of branch points was counted by hand in three-dimensional reconstructions of axonal arbors. Branch points giving rise to small filopodial extensions (less than 5 μm in length) were excluded from the analysis. Average numbers of branch points were compared by one-way ANOVA with Tukey's post-tests for pair-wise comparisons of arbor sub-types.

İstatistik

All statistical comparisons, nonlinear regression and comparison of curves using the AIC method were performed using Prism 4 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA).