Bilgi

Ev Ödevi Problemleri - Literatür Öğrenme Modülü: CRISPR/Cas 9 KEY - Biyoloji

Ev Ödevi Problemleri - Literatür Öğrenme Modülü: CRISPR/Cas 9 KEY - Biyoloji


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Arama Kağıdı: Cas9 RNA-güdümlü Endonükleazın İki Nükleaz Alanıyla Kesin Yer Seçimi. Hongfan Chen, Jihoon Choi ve Scott Bailey. The Journal of Biological Chemistry, 289, 13284-13294 (2014)

Arka Plan ve İnceleme

Çok çeşitli organizmalarda genom manipülasyonu ve düzenlenmesi için umut verici bir araç, yakın zamanda CRISPR-Cas'ın (kümelenmiş düzenli aralıklarla kısa palindromik tekrar-CRISPR ile ilişkili) RNA güdümlü DNA endonükleaz aktivitesinde tanımlanmıştır. Kalıtsal bir prokaryotik bağışıklık sistemi olan CRISPR-Cas, RNA güdümlü hedef susturma yoluyla bakterileri ve arkeleri mobil genetik elementlere karşı korur. CRISPR-Cas sistemleri, değişken istilacı türevli diziler (aralayıcılar) ve bir cas operon tarafından serpiştirilmiş bir dizi kısa doğrudan tekrardan oluşur. İstila sırasında, faj veya plazmitlerden (protospacer) gelen istilacı DNA'nın küçük parçaları, konakçı CRISPR lokuslarına dahil edilir, kopyalanır ve küçük CRISPR RNA'ları (crRNA) oluşturmak için işlenir. İstilacı nükleik asit daha sonra crRNA'lar tarafından yönlendirilen Cas proteinleri tarafından tanınır ve susturulur. Her biri bir imza geninin varlığı ile karakterize edilen üç tip CRISPR-Cas sistemi vardır.

Programlanmış DNA bölünmesi, tip II CRISPR-Cas sistemindeki en az bileşen gerektirir ve yalnızca crRNA, bir trans-aktive edici crRNA (tracrRNA) ve tip II sistemin imza geni olan Cas9 endonükleaz gerektirir. Sistem, olgun crRNA ve tracrRNA'nın tek bir kılavuz RNA'da (sgRNA) birleştirilmesiyle daha da basitleştirilebilir. Hedef bölünmedeki rolüne ek olarak, tracrRNA ayrıca birincil crRNA transkriptleri ile RNA hibritleri oluşturarak crRNA olgunlaşmasına aracılık eder ve her iki RNA'nın endojen RNase III tarafından birlikte işlenmesine yol açar. Cas9, birlikte hedef DNA'da bir çift sarmal (ds) kopması oluşturan iki nükleaz alanı içerir. HNH nükleaz alanı, tamamlayıcı ipliği ayırır ve RuvC benzeri nükleaz alanı, tamamlayıcı olmayan ipliği ayırır.

Protospacer bitişik motif (PAM) olarak adlandırılan kısa bir imza dizisi, tip I ve tip II CRISPR-Cas sistemleri tarafından hedeflenen istilacı DNA'nın karakteristiğidir. PAM iki işleve hizmet eder. Yeni aralayıcı dizilerin edinilmesiyle bağlantılıdır ve hedef DNA'nın daha sonra tanınması ve susturulması için gereklidir. PAM'ın dizisi, uzunluğu ve konumu, CRISPR-Cas tipine ve organizmaya bağlı olarak değişir. Tip II sistemlerden gelen PAM'ler, protospacer'ın aşağı akışında bulunur ve 2-5 bp korunmuş dizi içerir. 4 bp'ye kadar değişken bir dizi, PAM'ın korunmuş dizisini protospacer'den ayırır. Bu değişken bölge genellikle PAM dizisinin tanımına dahil edilir, ancak basitlik için bu değişken bölgeye bağlayıcı ve korunan diziye PAM olarak atıfta bulunuruz. Bugüne kadar, Streptococcus pyogenes'ten Cas9, Streptococcus thermophilus'tan Cas9 DGCC7710 ve Neisseria meningitidis'ten Cas9, genom düzenleme veya düzenleme için araçlar olarak kullanılmıştır. Bu Cas9 ortologları için, PAM'ler GG, GGNG ve GATT'dir ve bağlayıcılar sırasıyla 1, 1 ve 4 bp'dir.

sgRNA tasarımının basitliği ve diziye özgü hedefleme, RNA güdümlü Cas9 makinesinin programlanabilir genom mühendisliği için büyük bir potansiyele sahip olduğu anlamına gelir. Cas9, dsDNA kırılmaları ekleyerek hücrelerde mutasyonlar oluşturmak için kullanılabilir. Cas9'un yetenekleri, nickazı (iki nükleaz alanından birinin inaktive edilmesiyle oluşturulan) veya nükleaz boş varyantları ile transkripsiyon baskısı veya aktivasyonu gibi çeşitli genom mühendisliği amaçlarına genişletilebilir. Cas9 sistemi için bir başka çekici olasılık, örneğin bir genin transkripsiyonel baskılanması ve diğerinin aktivasyonu gibi farklı Cas9 aracılı aktiviteleri birden fazla hedef bölgeye hedeflemektir. Bunu başarmak için, birden fazla Cas9 ortologunun kullanılması gerekecek, çünkü tek bir ortolog aynı anda birden fazla sahada farklı faaliyetlere aracılık edemez. Bu nedenle Cas9 proteinleri hakkındaki anlayışımızı genişletmek için, LMG18311 Cas9 olarak adlandırdığımız S. thermophilus LMG18311'den Cas9 ortologunu karakterize ettik.


Sorular:

1. Araştırmacılar, S. thermophilus LMG18311'in tip II CRISPR-Cas sistemini inceledi.

a. Şekil A, Cas9, Cas9 D9A, Cas9 D599A ve Cas9 D9A,D599A'nın Coomassie Blue ile boyanmış bir SDS-poliakrilamid jelini göstermektedir, burada D aspartik asittir ve A alanindir ve D#A, D'nin değiştirildiği spesifik mutasyon bölgesini yansıtır. A. Bu deneyi neden yaptılar?

Cevap: mutantların aynı moleküler ağırlığa sahip olduğunu ve denatüre jel elektroforezinde benzer şekilde davrandığını doğrulamak için.

B. LMG18311 Cas9 için PAM dizisini doğrulamak için yazarlar, CRISPR-1'den 33 ayırıcı dizilimden herhangi biriyle eşleşen viral ve plazmit genomlarındaki potansiyel protospacerleri belirlemek için BLAST aramaları gerçekleştirdi. Bu arama, S. thermophilus'u enfekte ettiği bilinen bakteriyofaj genomlarından 41 benzersiz hedef dizi üretti. Daha sonra, 30 nükleotit protospacer ve 10 nükleotit yan bölgeleri dahil olmak üzere tanımlanan hedef genomlardan 50 nükleotit segmentlerini hizaladık. Şekil b, B'yi, LMG18311 Cas9 için PAM'yi gösteren logo çizimini göstermektedir. Protospacer, PAM ve linker konumları belirtilmiştir.

PAM dizisinin en olası konsensüs dizisi nedir? Protospacer'den ne kadar uzakta:

Cevap: GYAA, değişmez olarak 2 bp uzaklıkta bulunur.

C. Şekil C, CRISPR nükleik asit komplekslerinin şematik bir temsilini göstermektedir. Hedef DNA, crRNA, tracrRNA, protospacer, PAM ve bağlayıcıyı etiketleyin. Hem crRNA'yı hem de tracRNA'yı içeren tek bir kılavuz RNA oluşturmak istiyorsanız, bağlantılı bir RNA parçası çizin. Bu şekildeki spesifik PAM dizisi nedir?

Cevap

41 hedef dizinin 7'sinde bulunan en yaygın olarak gözlenen PAM dizisi GCAAA idi.

2. Belirlenen PAM'ın işlevsel olduğunu doğrulamak için araştırmacıların bir seçim sistemine ihtiyacı vardı. Eksojen tip II CRISPR-Cas sistemi içeren E. coli hücrelerinin plazmit transformasyonuna dirençli olduğu, buna karşın sistemden yoksun hücrelerin transformasyon için yetkin olduğu bir transformasyon tahlili kullandılar. Belirli PAM'lerin işlevsel olup olmadığını belirlemek için bu sistemin nasıl kullanılabileceğini açıklayın?

Cevap: Eklenmiş bir CRISRP-Cas sistemine sahip E. Coli hücreleri, hücre tarafından alınan herhangi bir plazmid DNA'yı parçalayabilmelidir, çünkü plazmit DNA, faj DNA'sına çok benzer şekilde "hedef" olarak hizmet edecektir. Eksojen CRISRP-Cas sistemi olmayan hücreler, hücre tarafından alınan plazmidi parçalayamaz, bu da bozulmamış plazmitli hücrelerin, plazmit tarafından getirilen ve eksprese edilen spesifik genler tarafından dönüştürülmesine izin verebilir.

a. Şekil A, transformasyon tahlilinin şematik bir temsilini göstermektedir.

Hedef plazmit, protospacer-1 (sekansı CRISPR-1'in ilk ayırıcısı ile aynıydı), bir 2-bp bağlayıcı ve tanımlanan PAM'yi içeriyordu. Birinci kontrol plazmidi sadece protospacer-1 içeriyordu, oysa ikinci kontrol plazmidi hem protospacer-1 hem de PAM'den yoksundu. Hedef ve kontrol plazmitleri daha sonra dönüştürülmüş hücreler için kullanıldı. IPTG ve uygun antibiyotiklerin varlığında.

Müfettişler neden IPTG ekledi? Testlerinde sağdakine kıyasla sol paneldeki hücrelerde ne gibi bir fark bulmayı beklersiniz?

Cevap: Cas9 proteininin protein ifadesi, bir CRISPR sistemi işlevi için gereklidir. Muhtemelen protein, laktoz, allolaktoz veya IPTG ile ortaya çıkan bir lac promotörünün kontrolü altındadır. Fonksiyonel bir Cas9 proteini ve sgRNA'ya sahip olan soldaki hücreler, hücre transformasyonunu tetikleyecek plazmidi parçalayabilecek ve dolayısıyla transforme olmayacaklardır.

B. Şekil 2B, E. coli hücrelerinde LMG18311 Cas9 ve sgRNA tarafından plazmit transformasyonunu gösterir. Dönüşüm verimliliği, 5 ng plazmit DNA başına cfu olarak ifade edilir. En az üç biyolojik kopyadan elde edilen ortalama değerler, 1 S.D.'yi temsil eden hata çubuklarıyla gösterilmiştir. Sonuçları yorumlayın ve açıklayın.

Cevap: Kontrol plazmitleri, benzer verimliliğe sahip her iki suşa da dönüştürülmüştür (Şekil 2B). Hedef plazmit, CRISPR+ hücrelerine dönüşmeyi başaramadı ancak CRISPR−'ye dönüştü. bu, Cas9 proteininin plazmidi parçalaması ve transformasyonu bloke etmesi için bir fonksiyon PAM dizisinin gerekli olduğunu gösterir.

C. Şekil C için, araştırmacılar CRISPR+ plazmitinin PAM dizisinde tek nükleotid değişiklikleri yaptılar ve plazmit transformasyon verimliliği üzerindeki etkiyi incelediler. Sonuçları yorumlayın.

Cevap: . Sadece pozisyon 1 guanozinde (yani protospacer'e en yakın PAM nükleotidi) bir mutasyon içeren plazmit, bozulmamış PAM sekansı ile karşılaştırıldığında azaltılmış (yaklaşık %66) bir transformasyon verimliliği ile de olsa transforme edildi. Diğer dört pozisyonun herhangi birinde tek mutasyonlar içeren plazmitler, dönüşüme dirençliydi. Bu sonuçlar, konum 1'deki guanozinin PAM işlevi için önemli olduğunu ancak ayrı ayrı diğer dört konumun PAM işlevi üzerinde çok az etkisi olduğunu gösterir.

NS. Şekil D için, bağlayıcı uzunluğunun uzunluğunun plazmit transformasyon verimliliği üzerindeki etkisi incelenmiştir. PS, protospacer dizisini belirtir. Sonuçları yorumlayın.

CRISPR+ hücreleri, bağlayıcı uzunluğu 2 bp veya 3 bp olan bir plazmit hedefi tarafından transformasyona eşit derecede dirençliydi. Diğer bağlayıcı uzunluklarına sahip plazmitler, kontrol plazmitine daha benzer verimliliklerle dönüştürülmüştür; bu, bu bağlayıcılara sahip plazmitlerin CRISPR-Cas susturma işleminden kaçabildiğini düşündürmektedir.

3. Araştırmacılar daha sonra sistemlerini incelediler laboratuvar ortamında bileşenleri yeniden yapılandırarak. Bir aktivite ölçüsü olarak LMG18311 Cas9 ile DNA bölünmesini izlediler.

a. Şekil 3A, 5 nm hedef plazmit, 25 nm Cas9, 25 nm crRNA (CRISPR-1'in ilk ayırıcısından türetilen diziyi içeren 42 nükleotid crRNA), 25 nm (42-nükleotid) tracrRNA ve 10 mm mg2+ 37°C'de 30 dakika inkübe edildiÖC. Agaroz jelleri etidyum bromür ile boyanmıştır. Sonuçları yorumlayın. Doğrusal kontrol neden kesilmemiş plazmitten daha az göç ediyor?

Cevap: Plazmit hedefinin bölünmesi Cas9, tracrRNA, crRNA ve Mg varlığında meydana geldi.2+. Kesilmiş plazmit, süper sarmal dairesel plazmitten daha büyük bir hidrodinamik yarıçapa sahiptir.

B. Şekil B'de, ayrı crRNA ve tracrRNA molekülleri için aynı kökenli bir sgRNA ikame edilmiştir. Jel sonuçlarını yorumlayın..

Cevap: Bölünme, tracrRNA ve crRNA yerine bir sgRNA kullanıldığında da meydana geldi.

C. Şekil C'de, farklı sgRNA dizilerinin varlığında bölünme üzerinde çalıştılar. Sonuçları açıklayın.

Cevap: Bir plazmit hedefinin bölünmesi, sgRNA dizisi tarafından belirlenir.

NS. Şekil D için, Cas 9'un kullanılan farklı aktif bölge mutantları. (D9A) mutantı RuvC benzeri alandaydı, H599A mutantı ise HNH alanındaydı. Sonuçları açıklayın. Çift mutantın aktivite üzerinde nasıl bir etkisi var?

Cevap: RuvC benzeri alanda (D9A) veya HNH alanında (H599A) aktif bölge mutasyonlarına sahip Cas9 varyantları, plazmit hedeflerini çentiklerken, çift mutasyonlu bir varyant (D9A, H599A) hiçbir aktivite göstermedi.

e. Şekil E'de yazarlar, hedef DNA'nın her bir zincirinin (kılavuz DNA'yı veya tamamlayıcı olmayan zinciri tamamlayıcı) bölünmesine hangi alanın dahil olduğunu inceledi. dsDNA, tamamlayıcı zincirin (sol el jeli) veya tamamlayıcı olmayan sarmalın (sağ el jeli) 5' ucunda radyoetiketlenmiştir. Reaksiyonlar A'daki gibi gerçekleştirildi ve ürünler %10 denatüre edici PAGE ile ayrıldı. Yarılma bölgeleri şematik diyagramda (altta) oklarla gösterilmiştir. 50 nt, 50 nükleotid; 37 nt, 37 nükleotid. Sonuçları yorumlayın.

Cevap: Kısa oligonükleotit substratları kullanan bölünme analizleri, HNH bölgesinin (H599A) kılavuz RNA'yı tamamlayıcı ipliği ayırdığını, oysa RuvC benzeri alanın (D9A) tamamlayıcı olmayan ipliği ayırdığını doğruladı. Kesilen bölgelerin konumunun haritalanması, diğer Cas9 ortologlarında görüldüğü gibi, protospacer içinde, PAM proksimal ucundan 3 bp olan her iki zincirin bölünmesinin, kör uçlu bir dsDNA kırılması ürettiğini ortaya çıkardı.

F. PAM'deki mutasyonlar veya bağlayıcı uzunluğundaki değişiklikler DNA etkileşimi üzerinde aynı etkiye sahip midir? laboratuvar ortamında yaptıkları gibi canlıda? Araştırmacılar, rekombinant LMG18311 Cas9 ile bu varyant plazmitlerin bölünmesini izledi. Şekil F'deki sonuçları yorumlayın.

Cevap: Konum 1'deki guanozinin mutasyonu en büyük etkiye sahipti ve PAM'ın diğer dört konumuna yönelik bireysel mutasyonlar, plazmit bölünmesi üzerinde yalnızca mütevazı bir etkiye sahipti. Farklı bağlayıcı uzunluklarına sahip plazmit hedeflerinin bölünmesi 2 veya 3 bp'de optimaldi ve daha sonra artan veya azalan uzunluklarla istikrarlı bir şekilde azaldı

G. Şekil G'de belirtilen bağlayıcı uzunluklarını içeren plazmit hedeflerinin bölünmesi incelenmiştir. A–C ve E–F'de, negatif aşırı sargılı (nSC), lineer (L) ve çentikli veya açık daire (OC) plazmit konumları belirtilir. Doğrusal kontrol, kısıtlama enzimi AgeI ile plazmit hedefinin sindirilmesidir.

Cevap: Farklı bağlayıcı uzunluklarına sahip plazmit hedeflerinin bölünmesi 2 veya 3 bp'de optimaldi ve daha sonra artan veya azalan uzunluklarla istikrarlı bir şekilde azaldı.

H. Mutasyon analizinde, alanin yerine asparatik asit ikame ettiler. D ve A'nın yan zincirlerinin yapılarını çizin. Neden D yerine A'yı seçtiler? Yabani tip proteinde katalizde D'nin rolü ne olabilir?

Cevap:

Alaninin yan zinciri aspartik asitten daha büyük değildir ve yan zincirlerin paketlenmesine ve dolayısıyla enzim aktivitesini genel bir şekilde etkileyebilecek protein katlanmasına potansiyel olarak müdahale edebilecek büyük ve hidrofobik değildir. Yabani tip proteinde aspartik asit, H bağ etkileşimleri yoluyla substrat bağlanmasına dahil olabilir. Büyük olasılıkla, hedef zincirin gerçek katalitik bölünme mekanizmasında genel bir asit/baz görevi görür.

4. Mg2+ dışındaki diğer iki değerlikli katyonların Cas9 tarafından DNA bölünmesini etkinleştirip etkinleştiremeyeceğini değerlendirmek için yazarlar, aşağıdaki iki değerlikli katyonlardan birinin varlığında plazmit bölünme deneyleri gerçekleştirdiler: Ca2+, Mn2+, Ortak2+, Ni2+ve Cu2+.

a. Şekil A, Cas9 tarafından bir hedef plazmitin, metalsiz veya 1 mm belirtilen metal iyonları ile bölünmesini gösterir. Tüm reaksiyonlar, metal ilavesinden önce 0.5 mm EDTA ile işlendi. Sonuçları yorumlayın.

Cevap: Ca içeren reaksiyonlar2+ lineer plazmit yerine çentikli verdi, bu da Ca2+ Cas9 nükleaz alanlarından sadece birini aktive eder

B. Hangi alanın aktive edildiğini belirlemek için, Ca içeren bir reaksiyon tamponunda Cas9'un (D9A veya H599A) tek aktif bölge mutantlarını test ettik.2+. Her iki panelde de negatif olarak süper sarmal (nSC), lineer (L) ve çentikli veya açık daire (OC) plazmit pozisyonları belirtilmiştir. Doğrusal kontrol, kısıtlama enzimi AgeI ile plazmit hedefinin bir sindirimidir.

Cevap: HNH mutantında (H599A) küçük bölünme vardı, ancak RuvC benzeri mutantta (D9A) güçlü bölünme vardı, bu da HNH'nin RuvC benzeri alanın değil, HNH'nin Ca tarafından aktive edildiğini düşündürdü.2+ .

5. PAM dizisinin ve bağlayıcı uzunluğunun LMG18311 Cas9'un DNA hedeflerine bağlanması üzerindeki etkisini belirlemek için yazarlar, doğal jel elektroforezi kullanarak Cas9-sgRNA kompleksinin 5' uç etiketli dsDNA hedeflerine bağlanma afinitesini (Kd) belirlediler.

a. Neden jele SDS eklemediler?

Cevap: SDS güçlü bir denatüre edicidir ve Cas9'u denatüre eder ve kompleksi ayırırdı.

B. Mg varlığında Cas9'un nükleaz eksikliği olan mutantı (D9A,H599A) ile bağlanma deneyleri yapıldı.2+. dsDNA hedeflerinin sabit konsantrasyonları, artan Cas9-sgRNA kompleksi konsantrasyonları ile inkübe edildi. Neden Cas9'un çift mutantını kullandılar?

Cevap: Enzimin hedef DNA'yı parçalamasını engellemek, bu da kompleksin saptanmasını engelleyecektir.

C. Aşağıdaki Şekil A, Cas9-sgRNA için temsili bir jel kaydırma tahlilini ve tahlilden ölçülen bağlanma eğrisini göstermektedir. Grafiğin incelenmesinden, etkileşim için yaklaşık Kd nedir? Üstteki kama, Cas9-sgRNA'nın artan konsantrasyonunu gösterir.

Cevap: yaklaşık 2 nM Cas9-sgRNA (eğrinin yarı maksimum bağlanmasındaki ligand konsantrasyonu gerçekten bir hiperboldür.

B. PAM mutasyonlu (kırmızı etiketli) DNA hedefleri için Kd değerlerini çizen bir çubuk grafik aşağıda gösterilmiştir (B). En az üç kopyadan elde edilen ortalama değerler, 1 S.D.'yi temsil eden hata çubuklarıyla gösterilir. Bağlanmanın gözlemlenmediği hedefler, alt sınırdaki (> 1000 nm) Kd değerleriyle gösterilir. Sonuçları yorumlayın.

Cevap: Tamamlayıcı bir protospacer, bir 2-bp bağlayıcı ve Cas9-sgRNA'ya 0.94 ± 0.27 nm afinite ile bağlı bir fonksiyonel PAM içeren bir hedef. Araştırmacılar, tamamlayıcı olmayan bir protospacer içeren bir hedefe veya bir PAM'den yoksun bir hedefe bağlanmayı tespit edemediler. PAM'ın 1. pozisyonundaki guanozinin mutasyonu, yaklaşık 100 katlık bir artışla sonuçlandı. KNS, oysa 2 ila 5 arasındaki pozisyonlardaki mutasyonlar afiniteyi önemli ölçüde değiştirmedi (hepsi konsensüs PAM'de yaklaşık 4 kat içinde).

C. Daha sonra bağlayıcı uzunluğu ve bağlanmasını araştırdılar. Şekil C, farklı bağlayıcı uzunluklarına (kırmızı etiketli) (C) sahip DNA hedefleri için Kd değerlerini çizen bir çubuk grafiği göstermektedir. Sonuçları yorumlayın.

Cevap: Bağlayıcı uzunluğundaki değişikliklerin bağlanma afinitesi üzerinde daha büyük bir etkisi oldu. Test edilen koşullar altında, 0, 4 veya 5 bp'lik (Kd > 1000 nm) bağlayıcı uzunlukları içeren plazmit hedeflerine bağlanmayı tespit edemedik, oysa 1 ve 3 bp'lik bağlayıcılar afiniteyi yaklaşık 400 ve yaklaşık 20 kat azalttı. , sırasıyla.


Açıklayıcı: CRISPR nasıl çalışır?

Bilim adamları, DNA'yı düzenlemek için CRISPR/Cas9 adlı bir araç kullanıyor.

Bunu Paylaş:

Bilim adamları genellikle bu kelimeyi kullanmaktan çekinirler. mucize. CRISPR adlı gen düzenleme aracından bahsetmiyorlarsa, yani. Bazıları “CRISPR ile her şeyi yapabilirsiniz” diyor. Diğerleri buna sadece harika diyor.

Gerçekten de, o kadar çok insanı hayrete düşürdü ve o kadar hızlı ki, keşfettikten sadece sekiz yıl sonra, Jennifer Doudna ve Emmanuelle Charpentier 2020 Nobel Kimya Ödülü'nü evlerine götürdüler.

CRISPR, "kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrar eder.” Bu tekrarlar bakterinin DNA'sında bulunur. Bunlar aslında küçük virüs parçalarının kopyalarıdır. Bakteriler, onları kötü virüsleri tanımlamak için sabıka koleksiyonu gibi kullanır. Cas9 bir enzim DNA'yı parçalayabilir. Bakteriler, koleksiyonda kupa vuruşu olan virüsleri parçalamak için Cas9 enzimini göndererek virüslerle savaşır. Bilim adamları son zamanlarda bakterilerin bunu nasıl yaptığını anladılar. Şimdi, laboratuvarda araştırmacılar, mikrobun virüsle mücadele sistemini en yeni laboratuvar aracına dönüştürmek için benzer bir yaklaşım kullanıyor.

Bu CRISPR/Cas9 aracı ilk olarak 2012 ve 2013'te tanımlandı. Dünyanın dört bir yanındaki bilim laboratuvarları kısa süre sonra onu bir organizmanın genomunu, yani DNA talimatlarının tamamını değiştirmek için kullanmaya başladı.

Eğitimciler ve Ebeveynler, Cheat Sheet'e Kaydolun

Kullanmanıza yardımcı olacak haftalık güncellemeler Öğrenciler için Bilim Haberleri öğrenme ortamında

Bu araç, herhangi bir bitki veya hayvandaki hemen hemen her gende hızlı ve verimli bir şekilde ince ayar yapabilir. Araştırmacılar bunu hayvanlardaki genetik hastalıkları düzeltmek, virüslerle savaşmak ve sivrisinekleri sterilize etmek için zaten kullandılar. Ayrıca insan nakli için domuz organlarını hazırlamak ve beagle'larda kasları güçlendirmek için kullandılar.

Şimdiye kadar CRISPR'nin en büyük etkisi temel biyoloji laboratuvarlarında hissedildi. Bu düşük maliyetli gen düzenleyicinin kullanımı kolaydır. Bu, araştırmacıların yaşamın temel gizemlerini keşfetmelerini mümkün kıldı. Ve bunu imkansız olmasa da eskiden zor olan şekillerde yapabilirler.

Robert Reed, New York Ithaca'daki Cornell Üniversitesi'nde gelişim biyoloğudur. CRISPR'ı bir bilgisayar faresine benzetiyor. "Onu genomdaki bir yere doğrultabilirsin ve o noktada istediğin her şeyi yapabilirsin."

İlk başta, bu, DNA'yı kesmeyi içeren herhangi bir şey anlamına geliyordu. Orijinal haliyle CRISPR/Cas9, moleküler makasları (Cas9 enzimi) DNA'nın hedef bir bölümüne yönlendiren bir hedef arama cihazıdır (CRISPR kısmı). Birlikte, bir geni devre dışı bırakan veya onaran ya da Cas9 makasının bazı kesikler yaptığı yere yeni bir şey sokan bir genetik mühendislik seyir füzesi olarak çalışırlar. CRISPR'nin daha yeni sürümlerine "temel düzenleyiciler" denir. Bunlar, genetik materyali kesmeden bir seferde bir bazda düzenleyebilir. Makastan çok kurşun kaleme benziyorlar.

İşte nasıl çalıştığı

Bilim adamları RNA ile başlar. Bu, DNA'daki genetik bilgiyi okuyabilen bir molekül. RNA, içindeki noktayı bulur. çekirdek bazı düzenleme etkinliklerinin gerçekleşmesi gereken bir hücrenin (Çekirdek, bir hücrede genetik materyalin çoğunun depolandığı bir bölmedir.) Bu kılavuz RNA, Cas9'u DNA üzerinde bir kesimin gerekli olduğu kesin noktaya yönlendirir. Cas9 daha sonra çift sarmallı DNA'ya kilitlenir ve fermuarını açar.

Bu, kılavuz RNA'nın hedeflediği DNA'nın bazı bölgeleriyle eşleşmesini sağlar. Cas9 bu noktada DNA'yı keser. Bu, DNA molekülünün her iki zincirinde de bir kırılma yaratır. Hücre, bir sorunu sezerek, kırılmayı onarır.

Arayı düzeltmek bir geni devre dışı bırakabilir (yapılması en kolay şey). Alternatif olarak, bu onarım bir hatayı düzeltebilir veya hatta yeni bir gen ekleyebilir (çok daha zor bir süreç).

Hücreler genellikle DNA'larındaki bir kırılmayı, gevşek uçları tekrar birbirine yapıştırarak onarır. Bu özensiz bir süreç. Genellikle bazı genleri devre dışı bırakan bir hatayla sonuçlanır. Bu kulağa kullanışlı gelmeyebilir - ama bazen öyle.

Bilim adamları, gen değişiklikleri yapmak için DNA'yı CRISPR/Cas9 ile kestiler veya mutasyonlar. Bilim adamları, mutasyonlu ve mutasyonsuz hücreleri karşılaştırarak bazen bir proteinin normal rolünün ne olduğunu anlayabilirler. Veya yeni bir mutasyon, genetik hastalıkları anlamalarına yardımcı olabilir. CRISPR/Cas9, örneğin kalıtsal hastalıklarda rol oynayan belirli genleri devre dışı bırakarak insan hücrelerinde de faydalı olabilir.

Gene Yeo, "Orijinal Cas9, tek bir uygulama ile bir İsviçre çakısı gibidir: Bu bir bıçaktır" diyor. San Diego, California Üniversitesi'nde bir RNA biyoloğudur. Ancak Yeo ve diğerleri, körelmiş bıçaklara başka proteinler ve kimyasallar bağladılar. Bu, bıçağı çok işlevli bir alete dönüştürdü.

CRISPR/Cas9 ve ilgili araçlar artık tek bir nükleotid bazını (genetik koddaki tek bir harf) değiştirmek veya DNA'da bilim adamlarının izlemek istediği bir noktayı etiketlemek için bir floresan protein eklemek gibi yeni şekillerde kullanılabilir. Bilim adamları ayrıca bu genetik kes ve yapıştır teknolojisini genleri açmak veya kapatmak için kullanabilirler.

CRISPR'ı kullanmanın bu yeni yollarının patlaması sona ermedi. Feng Zhang, Cambridge'deki Massachusetts Teknoloji Enstitüsü'nde moleküler biyologdur. Cas9 makasını kullanan ilk bilim adamlarından biriydi. “Alan çok hızlı ilerliyor” diyor. “Ne kadar yol kat ettiğimize bakınca… Bence önümüzdeki birkaç yıl içinde göreceğimiz şey harika olacak.”

Bu hikaye 8 Ekim 2020'de Nobel komitesinin CRISPR'nin keşfine 2020 kimya ödülünü verme kararını not etmek için güncellendi.

Güç Kelimeleri

başvuru Bir şeyin belirli bir kullanımı veya işlevi.

temel (genetikte) Nükleobaz teriminin kısaltılmış hali. Bu bazlar, DNA ve RNA moleküllerinin yapı taşlarıdır.

Biyoloji Canlıların incelenmesi. Onları inceleyen bilim adamları olarak bilinirler. biyologlar.

Cas9 Genetikçilerin şimdi genleri düzenlemeye yardımcı olmak için kullandıkları bir enzim. DNA'yı keserek, bozuk genleri düzeltmesine, yenilerini eklemesine veya belirli genleri devre dışı bırakmasına izin verebilir. Cas9, bir tür genetik kılavuz olan CRISPR'ler tarafından kesinti yapması gereken yere yönlendirilir. Cas9 enzimi bakterilerden geldi. Virüsler bir bakteriyi istila ettiğinde, bu enzim mikrop DNA'sını parçalayarak onu zararsız hale getirebilir.

hücre Bir organizmanın en küçük yapısal ve işlevsel birimi. Tipik olarak çıplak gözle görülemeyecek kadar küçüktür, bir zar veya duvarla çevrili sulu sıvıdan oluşur. Hayvanlar, büyüklüklerine bağlı olarak binlerce ila trilyonlarca hücreden oluşur. Mayalar, küfler, bakteriler ve bazı algler gibi bazı organizmalar sadece bir hücreden oluşur.

kimyasal Sabit bir oranda ve yapıda birleşen (birbirine bağlanan) iki veya daha fazla atomdan oluşan bir madde. Örneğin su, bir oksijen atomuna bağlı iki hidrojen atomundan oluşan bir kimyasaldır. Kimyasal sembolü H2O'dur.

CRISPR "Düzenli aralıklı kümelenmiş kısa palindromik tekrarlar" terimi için bir kısaltma - daha net olarak telaffuz edilir -. Bunlar, bilgi taşıyan bir molekül olan RNA parçalarıdır. Bakterileri enfekte eden virüslerin genetik materyalinden kopyalanırlar. Bir bakteri daha önce maruz kaldığı bir virüsle karşılaştığında, o virüsün genetik bilgisini içeren CRISPR'nin bir RNA kopyasını üretir. RNA daha sonra Cas9 adlı bir enzime virüsü parçalayıp zararsız hale getirmesi için rehberlik eder. Bilim adamları şimdi kendi CRISPR RNA sürümlerini oluşturuyorlar. Bu laboratuvar yapımı RNA'lar, enzime diğer organizmalardaki spesifik genleri kesmesi için rehberlik eder. Bilim adamları bunları, genetik bir makas gibi, belirli genleri düzenlemek veya değiştirmek için kullanırlar, böylece daha sonra genin nasıl çalıştığını inceleyebilir, bozuk genlerdeki hasarı onarabilir, yeni genler ekleyebilir veya zararlı olanları devre dışı bırakabilirler.

gelişimsel (biyolojide) Bir organizmanın gebe kalmadan yetişkinliğe kadar geçirdiği değişiklikleri ifade eden bir sıfat. Bu değişiklikler genellikle kimyayı, boyutu ve hatta bazen şekli içerir.

DNA (deoksiribonükleik asidin kısaltması) Genetik talimatlar taşıyan çoğu canlı hücrenin içinde bulunan uzun, çift sarmallı ve spiral şekilli bir molekül. Fosfor, oksijen ve karbon atomlarından oluşan bir omurga üzerine inşa edilmiştir. Bitki ve hayvanlardan mikroplara kadar tüm canlılarda bu talimatlar hücrelere hangi molekülleri yapacaklarını söyler.

mühendislik Pratik problemleri çözmek için matematik ve bilimi kullanan araştırma alanı.

alan Bir çalışma alanı: Araştırma alanı biyolojiydi. Ayrıca denizde, ormanda, dağın tepesinde veya bir şehrin caddesinde olduğu gibi bazı araştırmaların yürütüldüğü gerçek dünya ortamını tanımlamak için kullanılan bir terimdir. Araştırma laboratuvarı gibi yapay bir ortamın tam tersidir.

floresan Işığı absorbe etme ve yeniden yayma yeteneğine sahiptir. Bu yeniden yayılan ışık, bir floresan olarak bilinir.

gen (sıf. genetik) Bir protein üretmek için kodlayan veya talimatları tutan bir DNA parçası. Yavrular, ebeveynlerinden genleri miras alır. Genler, bir organizmanın nasıl göründüğünü ve nasıl davrandığını etkiler.

genetik şifre Bir hücre veya organizmadaki genlerin veya genetik materyalin tamamı. Hücreler içinde yer alan bu genetik mirasın incelenmesi, genomik olarak bilinir.

kas Kas lifleri olarak bilinen hücrelerini kasarak hareket üretmek için kullanılan bir doku türü. Kas bir protein açısından zengindir, bu nedenle yırtıcı türler bu dokudan bol miktarda içeren av ararlar.

mutasyon (v. mutasyon) Bir organizmanın DNA'sındaki bir gende meydana gelen bazı değişiklikler. Bazı mutasyonlar doğal olarak meydana gelir. Diğerleri, kirlilik, radyasyon, ilaçlar veya diyetteki bir şey gibi dış faktörler tarafından tetiklenebilir. Bu değişikliğe sahip bir gen, bir mutant olarak adlandırılır.

çekirdek Çoğul çekirdektir. (biyolojide) Birçok hücrede bulunan yoğun bir yapı. Tipik olarak, bir zar içine yerleştirilmiş tek bir yuvarlak yapı olan çekirdek, genetik bilgiyi içerir.

organ (biyolojide) Bir veya daha fazla belirli işlevi yerine getiren bir organizmanın çeşitli bölümleri. Örneğin, yumurtalık yumurta yapan bir organdır, beyin sinir sinyallerini yorumlayan bir organdır ve bir bitkinin kökleri besin ve nem alan organlardır.

palindrom (sıf. palindromik) İleriye veya geriye doğru okunduğunda aynı harf sırasına sahip olan bir kelime, isim veya cümle. Örneğin, baba ve anne ikisi de palindromdur.

protein Bir veya daha fazla uzun amino asit zincirinden oluşan bileşik. Proteinler tüm canlı organizmaların önemli bir parçasıdır. Canlı hücrelerin, kasların ve dokuların temelini oluştururlar, hücrelerin içindeki işleri de yaparlar. Kandaki hemoglobin ve enfeksiyonlarla savaşmaya çalışan antikorlar, daha iyi bilinen bağımsız proteinler arasındadır. İlaçlar sıklıkla proteinlere kilitlenerek çalışır.

RNA DNA'da bulunan genetik bilgiyi "okumaya" yardımcı olan bir molekül. Bir hücrenin moleküler mekanizması, RNA oluşturmak için DNA'yı okur ve ardından proteinleri oluşturmak için RNA'yı okur.

etiket (biyolojide) Bir hayvana sağlam bir bant veya alet paketi takmak. Bazen etiket, her bireye benzersiz bir kimlik numarası vermek için kullanılır. Bir yaratığın bacağına, kulağına veya vücudunun başka bir kısmına takıldığında, hayvanın “adı” haline gelebilir. Bazı durumlarda, bir etiket, hayvanın çevresindeki ortamdan da bilgi toplayabilir. Bu, bilim adamlarının hem çevreyi hem de hayvanın içindeki rolünü anlamalarına yardımcı olur.

Alıntılar

Günlük:​ S. Wang ve ark. RNA-aptamer tabanlı iki renkli CRISPR etiketleme sistemi. Bilimsel Raporlar. Cilt 6, 27 Mayıs 2016, s. 26857. doi: 10.1038/srep26857.

Günlük:​ bir C. Komor ve ark. Çift sarmallı DNA bölünmesi olmadan genomik DNA'da bir hedef bazın programlanabilir düzenlenmesi. Doğa. Cilt 533, 19 Mayıs 2016, 20 Nisan 2016, s. 420. doi:10.1038/nature17946.

Günlük:​ D.A. Nelles et al. CRISPR/Cas9 ile canlı hücrelerde programlanabilir RNA takibi. Hücre. Cilt 165, 7 Nisan 2016, s. 488. doi: 10.1016/j.cell.2016.02.054.

Tina Hesman Saey hakkında

Tina Hesman Saey, moleküler biyoloji konusunda kıdemli yazar ve raporlardır. Doktora derecesi var. Louis'deki Washington Üniversitesi'nden moleküler genetik alanında ve Boston Üniversitesi'nden bilim gazeteciliği alanında yüksek lisans derecesi aldı.

Bu Makale için Sınıf Kaynakları Daha fazla bilgi edinin

Bu makale için ücretsiz eğitimci kaynakları mevcuttur. Erişmek için kaydolun:


Ders Öğrenme Hedefleri

Bu dersin sonunda öğrenciler olacak.

  • CRISPR/Cas9 ters genetik deneyleri için moleküler araçlar tasarlamak için mevcut biyoinformatik araçların nasıl kullanılacağını anlayın.
  • Aşağıdaki öğrenme hedeflerine ilişkin daha derin bir bilgi veya ustalık kazanın.

Genetik Temel Yetkinliklerden:

  • Öğrenciler bilimin disiplinlerarası doğasından yararlanabilmelidir.
  • Öğrenciler, araştırma makaleleri yazmak ve sunumlar yapmak da dahil olmak üzere deneysel sonuçları etkili bir şekilde iletebilmelidir.

COVID-19 Tespiti için CRISPR/Cas Tabanlı Sistemler

CRISPR sistemi, araştırmacıların gen fonksiyonunu değiştirebilecek genomik dizilerde istenen değişiklikleri yapmalarını sağlayan basit, verimli ve güvenilir bir sistemdir. Bir çift moleküler makas gibi çalışan ve DNA ipliklerini kesebilen bu sistem, bakteri ve arke gibi prokaryotlarda bulunan bir DNA dizileri ailesidir. 54� Genel olarak, CRISPR sistemi iki ana sınıfa ve altı türe ayrılır.

SHERLOCK ve DETECTR iş akışının şematik gösterimi ve CRISPR tabanlı tanı sistemlerinde yer alan ana mekanizmalar.

SARS-CoV-2'nin tespiti için en yaygın kullanılan CRISPR sistemleri olan CRISPR-Cas'ın (Cas3, Cas9, Cas12 ve Cas13) şematik gösterimi.

Tablo 1, COVID-19'un hızlı ve hassas teşhisi için CRISPR tabanlı teşhis sistemlerinin geliştirilmesi ve tasarımına ilişkin çalışmaları özetlemektedir.

Tablo 1

sistemCas tipitest zamanlamasıavantajlareksikliklerreferans
DEDEKTÖRCas12a30� dkdoğru, uygulaması kolay, hızlı geri dönüş süresi, ısı döngüsüne gerek yok, tek nükleotid hedef özgüllüğü ve karmaşık laboratuvar altyapısına gerek yoknükleik asit ekstraksiyonu ihtiyaçları, ekstraksiyon, kitler ve reaktiflere sınırlı erişim, kişisel koruyucu ekipman ihtiyaçları(16)
AIOD-CRISPRCas12a40਍khızlı, son derece hassas, son derece spesifik, tek kap reaksiyonu, ayrı ön amplifikasyona ve amplifiye ürün aktarımına gerek yok, sonuçların çıplak gözle görünürlüğü, hem DNA hem de RNA durumlarında nükleik asit tespiti, tek adımda gerçekleştirilebilir, tek molekül duyarlı ve sağlamnükleik asit ekstraksiyonu ihtiyacı, ekstraksiyona, kitlere ve reaktiflere sınırlı erişim(75)
CRISPR-Cas12 tabanlıCas12a60਍k'dan aztaşınabilir, hassas, hızlı ve düşük maliyetlihasta numuneleri kullanılmaz ve belirli kitler gerektirir(76)
CRISPR/Cas12a-NERCas12a45਍ktaşınabilir, basit, hassas, spesifik, özel alet gerektirmeyen, hızlı ve sonuçların çıplak gözle görülebilmesinükleik asit ekstraksiyonu ihtiyacı, ekstraksiyona, kitlere ve reaktiflere sınırlı erişim(77)
CRISPR-FDSCas12a� minhassas, sağlam, hızlı ve mevcut ekipmanlarla yapılabilirviral yükü ölçmek için uygun olmayan nükleik asit ekstraksiyonu ihtiyacı(78)
PARLAMAKCas13a50਍khassas, spesifik, tek aşamalı reaksiyon, hastaneler ve laboratuvarlar dışında kullanılabilir ve nükleik asit ekstraksiyonuna gerek yoktur (79)
CONANCas340਍khızlı, hassas, düşük maliyetli, aletsiz ve tek baz çifti ayrımınükleik asit ekstraksiyonu ihtiyacı, ekstraksiyona, kitlere ve reaktiflere sınırlı erişim(80)
iSCANCas12a1 hhassas, spesifik, verimli, hızlı, kullanıcı dostu, doğru, sahada konuşlandırılabilir ve büyük ölçeklinükleik asit ekstraksiyonu, ekstraksiyona, kitlere ve reaktiflere sınırlı erişim gerektirir(81)
CASdetecCas12b1 hçapraz reaktivite yok, düşük yanlış pozitif oran ve doğruluknükleik asit ekstraksiyonu ihtiyacı, ekstraksiyona, kitlere ve reaktiflere sınırlı erişim(82)
ÖncüCas12a30਍ksağlam, hızlı, hassas, uygun fiyatlı, özel (83)
KRESTCas13a𢏂 hölçeklenebilir, düşük maliyetli, özel enstrümantasyona gerek yok, son derece hassas, dağıtımı kolaynükleik asit ekstraksiyonu, ekstraksiyona, kitlere ve reaktiflere sınırlı erişim gerektirir(84)
DURCovidCas12b1 hbasit, bakım noktası (POC) analizi için uygun, hassas, düşük maliyetli, test bileşenlerinin mevcudiyeti, RNA ekstraksiyonuna gerek yok (85)
ITP-CRISPRCas12a30਍kotomasyona ve minimum miktarda reaktif kullanımına uygun (86)
SHERLOCKCas13a1 h'den azhızlı, hassas ve gelişmiş ekipmana gerek yokklinik örnekleri test etmek için uygun değil(87)

Genom düzenleme için hedeflenen nükleazların geliştirilmesi

Araştırmacılar, yukarıda belirtilen bu sınırlamaların üstesinden gelmek için alternatif yaklaşımlar aradılar. İlk atılımlardan biri, hedeflenen bir bölgede çift zincirli bir kırılmanın (DSB) tanıtılmasının, hedeflenen gen entegrasyonu 9,10 frekansında birkaç büyüklük mertebesinde artışla sonuçlandığının anlaşılmasından geldi. Bu nedenle, birçok araştırma grubu, hedeflenen DSB'lere ulaşmak için farklı stratejiler geliştirmeye odaklandı. İlk çalışmalarda, araştırmacılar, 18-bp kesici gibi nadir kesme endonükleaz enzimlerini kullandılar. I-SceI, fare genomunda 10 belirli DSB'leri tanıtmak. Bu tür meganükleazlar (14-40 bp DNA'nın uzun uzantılarını tanıyan endonükleazlar) genom düzenleme verimliliğini arttırsa da, yaklaşım iki ana dezavantajla kısıtlandı. İlk olarak, yüzlerce doğal olarak bulunan meganükleazın varlığına rağmen, her birinin benzersiz bir tanıma dizisi vardır. Bu nedenle, istenen bir lokusu hedefleyen bir meganükleaz bulma olasılığı hala düşüktü. İkincisi ve daha kritik olarak, indüklenmiş DSB'lerin çoğunluğu, hataya açık homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) DNA onarım mekanizması yoluyla onarılır. Böylece, sadece eksojen olarak sokulan DNA şablonu DSB'lerde yer almayabilir, aynı zamanda NHEJ onarım mekanizması da DNA parçalarını kırılma noktalarında 11 rasgele ekleyebilir veya silebilir. Bu tür zorlukların üstesinden gelmek için, araştırmacılar, DNA hedefleme özgüllüklerini değiştirmek için doğal olarak var olan meganükleazları yeniden tasarlamaya başladılar 12,13,14. Bu çabalar, hedeflenen düzenleme olanaklarını önemli ölçüde geliştirmesine rağmen, meganükleazlar kullanılarak genomların yalnızca çok küçük bir kısmı özel olarak hedeflenebilir.

Bu amaçla ökaryotik çinko parmak proteinlerinin keşfi ve kullanımı, genom hedefleme ve düzenlemede yeni bir dönem başlattı. Çinko parmaklar, DNA'ya diziye özgü bir şekilde bağlanan çinko iyonu tarafından düzenlenen küçük protein motifleridir. Her çinko parmak modülü 3-bp DNA dizisi 15 tanır. Bu nedenle, meganükleazlardan farklı olarak, daha yüksek DNA bağlanma özgüllüğü elde etmek için çoklu çinko parmak modülleri daha büyük bir kompleks halinde birleştirilebilir. Çinko parmakların yapısı ortaya çıktıktan kısa bir süre sonra araştırmacılar, çinko parmak proteinlerini çinkonun DNA bölünme alanı ile birleştirerek programlanabilir nükleaz proteinleri oluşturmaya başladılar. fok ben endonükleaz 16. Fok I kısıtlama enziminin seçimi, birkaç nedenden dolayı iyi düşünülmüş, kasıtlı bir seçimdi. İlk olarak, diğer birçok kısıtlama enziminden farklı olarak Fok I, farklı DNA tanıma ve DNA bölünme alanına sahiptir. Bunu bilen araştırmacılar, Fok I'in DNA dizi tanıma alanını çıkardılar ve yalnızca DNA bölünme alanını çinko parmak protein modüllerine kaynaştırdılar. Bir diğer kritik nokta, Fok I'in DNA'yı parçalamak için hedef bölgede homodimerizasyon gerektirmesidir. Bu nedenle, yan yana iki proksimal bölgeyi hedef alan iki ayrı çinko parmak modülünün tasarlanması, Fok I'in homodimerize olmasına ve hedef bölgelerde DNA zinciri kopmalarına neden olmasına izin verir. Çinko parmak nükleazlarının (ZFN'ler) sadece model organizmalarda değil, aynı zamanda insan hücrelerinde de hedeflenen homolog rekombinasyonu önemli ölçüde arttırdığı gösterilmiştir 17,18. ZFN'lerin tasarımındaki geliştirilmiş verimlilik, canlı hücrelerin genomlarını özel olarak hedeflenen sitelerde düzenleme yeteneklerini büyük ölçüde artırdı ve bu tür genom düzenleme araçlarının terapötik uygulamaları için kapılar açtı 19,20. Her çinko parmak, 3-bp'lik bir DNA kodunu tanıdığından, benzersiz 64 parmak havuzundan (4 3 kombinasyon) 6-7 çinko parmağın kombinatoryal montajı, herhangi bir 18-21 bp genomik diziyi 21 benzersiz bir şekilde hedefleyebilir. ZFN'ler bir genom mühendisliği aracı olarak önemli bir heyecan yaratırken, transkripsiyon aktivatör benzeri efektör (TALE) proteinlerinin Ksantomonas bakterilerin özellikle üç baz yerine tek bir bazı tanıyabilmesi, bu proteinler hakkında daha fazla heyecan uyandırdı 22,23. Çinko parmaklar gibi, Fok I DNA bölünme alanının bir TALE modülleri kombinasyonuna kimerik füzyonu, TALEN 24,25,26,27 olarak adlandırılan etkili bir programlanabilir nükleaz görevi görür (Şekil 1).


Kraliyet Cemiyeti tarafından yayınlandı. Her hakkı saklıdır.

Referanslar

. 2018 Genom düzenleme ve ötesi için CRISPR araç kiti . Nat. Komün. 9, 1911. (doi:10.1038/s41467-018-04252-2) Crossref, PubMed, ISI, Google Akademik

. 2015 CRISPR tabanlı teknolojiler ve gıda biliminin geleceği. J. Gıda Bilimi. 80, R2367-R2372. (doi:10.1111/1750-3841.13094). Crossref, PubMed, ISI, Google Akademik

Pursey E, Sunderhauf D, Gaze WH, Westra ER, van Houte S.

2018 CRISPR-Cas antimikrobiyalleri: zorluklar ve gelecekteki beklentiler. PLoS Patog'u. 14, e1006990. (doi:10.1371/journal.ppat.1006990). Crossref, PubMed, ISI, Google Akademik

Noble C, Adlam B, Kilise GM, Esvelt KM, Nowak MA

. 2018 Mevcut CRISPR gen sürücü sistemlerinin vahşi popülasyonlarda oldukça istilacı olması muhtemeldir. Elif 7, e33423. (doi:10.7554/eLife.33423) Crossref, PubMed, ISI, Google Akademik

Webber BL, Raghu S, Edwards VEYA

. 2015 Görüşü: CRISPR tabanlı gen, bir biyokontrol gümüş kurşun mu yoksa küresel koruma tehdidi mi yaratıyor? Proc. Natl Acad. bilim Amerika Birleşik Devletleri 112, 10 565-10 567. (doi:10.1073/pnas.1514258112) Crossref, ISI, Google Akademik

. 2015 BİYOGÜVENLİK. Laboratuvarda gen sürücü deneylerinin korunması. Bilim 349, 927-929. (doi:10.1126/science.aac7932) Crossref, PubMed, ISI, Google Akademik

. 2019 CRISPR etiği: güçlü bir aracın uygulamaları için ahlaki düşünceler. J. Mol. Biol. 431, 88-101. (doi:10.1016/j.jmb.2018.05.044) Crossref, PubMed, ISI, Google Akademik

Mojica FJ, Diez-Villasenor C, Garcia-Martinez J, Soria E

. 2005 Düzenli aralıklı prokaryotik tekrarların araya giren dizileri, yabancı genetik elementlerden türer. J. Mol. Evrim. 60, 174-182. (doi:10.1007/s00239-004-0046-3) Crossref, PubMed, ISI, Google Akademik

Bolotin A, Quinquis B, Sorokin A, Ehrlich SD

. 2005 Kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindrom tekrarları (CRISPR'ler), kromozom dışı kökenli aralayıcılara sahiptir. Mikrobiyoloji 151, 2551-2561. (doi:10.1099/mic.0.28048-0) Crossref, PubMed, ISI, Google Akademik

Pourcel C, Salvignol G, Vergnaud G

. 2005 CRISPR öğeleri Yersinia pestis bakteriyofaj DNA'sının tercihli alımı ile yeni tekrarlar elde eder ve evrimsel çalışmalar için ek araçlar sağlar. Mikrobiyoloji 151, 653-663. (doi:10.1099/mic.0.27437-0) Crossref, PubMed, ISI, Google Akademik

Makarova KS, Grishin NV, Shabalina SA, Wolf YI, Koonin EV

. 2006 Prokaryotlarda varsayılan bir RNA parazitine dayalı bağışıklık sistemi: öngörülen enzimatik makinelerin hesaplamalı analizi, ökaryotik RNAi ile fonksiyonel analojiler ve varsayımsal etki mekanizmaları. Biol. doğrudan 1, 7. (doi:10.1186/1745-6150-1-7) Crossref, PubMed, ISI, Google Akademik

Grissa I, Vergnaud G, Pourcel C

. 2007 CRISPRdb veritabanı ve CRISPR'leri görüntülemek ve aralayıcılar ve tekrarlar sözlükleri oluşturmak için araçlar. BMC Bioinf. 8, 172. (doi:10.1186/1471-2105-8-172) Crossref, PubMed, ISI, Google Akademik

Barrangou R, Fremaux C, Deveau H, Richards M, Boyaval P, Moineau S, Romero DA, Horvath P

. 2007 CRISPR, prokaryotlarda virüslere karşı kazanılmış direnç sağlar. Bilim 315, 1709-1712. (doi:10.1126/science.1138140) Crossref, PubMed, ISI, Google Akademik

Marraffini LA, Sontheimer EJ

. 2008 CRISPR interferansı, DNA'yı hedefleyerek stafilokoklarda yatay gen transferini sınırlar. Bilim 322, 1843-1845. (doi:10.1126/science.1165771) Crossref, PubMed, ISI, Google Akademik

. 2016 CRISPR–Cas uyarlaması: eylem mekanizmasına dair içgörüler. Nat. Rev. Mikrobiyol. 14, 67-76. (doi:10.1038/nrmicro.2015.14) Crossref, PubMed, ISI, Google Akademik

Westra ER, Dowling AJ, Broniewski JM, van Houte S.

2016 CRISPR'nin Evrimi ve Ekolojisi . Annu. Rev. Ecol. Evrim. Sist. 47, 307-331. (doi:10.1146/annurev-ecolsys-121415-032428) Crossref, ISI, Google Akademik

. 2010 CRISPR aracılı faj direnci ve birlikte evrimin hayaleti geçmişi. Proc. R. Soc. B 277, 2097-2103. (doi:10.1098/rspb.2010.0055) Bağlantı, ISI, Google Akademik

Jansen R, Embden JD, Gaastra W, Schouls LM

. 2002 Prokaryotlarda DNA tekrarlarıyla ilişkili genlerin belirlenmesi . Mol. Mikrobiyol. 43, 1565-1575. (doi:10.1046/j.1365-2958.2002.02839.x) Crossref, PubMed, ISI, Google Akademik

Shmakov SA, Makarova KS, Wolf YI, Severinov KV, Koonin EV

. 2018 Gen komşuluk analizi ile fonksiyonel olarak CRISPR-Cas sistemlerine bağlı genlerin sistematik tahmini. Proc. Natl Acad. bilim Amerika Birleşik Devletleri 115, E5307-E5316. (doi:10.1073/pnas.1803440115) Crossref, PubMed, ISI, Google Akademik

2017 Sınıf 2 CRISPR–Cas sistemlerinin çeşitliliği ve evrimi. Nat. Rev. Mikrobiyol. 15, 169-182. (doi:10.1038/nrmicro.2016.184) Crossref, PubMed, ISI, Google Akademik

Koonin EV, Makarova KS, Zhang F

. 2017 CRISPR-Cas sistemlerinin çeşitliliği, sınıflandırılması ve evrimi. Kör. Görüş. Mikrobiyol. 37, 67-78. (doi:10.1016/j.mib.2017.05.008) Crossref, PubMed, ISI, Google Akademik

2015 CRISPR–Cas sistemlerinin güncellenmiş bir evrimsel sınıflandırması. Nat. Rev. Mikrobiyol. 13, 722-736. (doi:10.1038/nrmicro3569) Crossref, PubMed, ISI, Google Akademik

van der Oost J, Westra ER, Jackson RN, Wiedenheft B.

2014 CRISPR–Cas sistemlerinin yapısal ve mekanik temellerinin çözülmesi. Nat. Rev. Mikrobiyol. 12, 479-492. (doi:10.1038/nrmicro3279) Crossref, PubMed, ISI, Google Akademik

. 2015 CRISPR–Prokaryotlarda Cas bağışıklığı. Doğa 526, 55-61. (doi:10.1038/nature15386) Crossref, PubMed, ISI, Google Akademik

Jackson SA, McKenzie RE, Fagerlund RD, Kieper SN, Fineran PC, Brouns SJ

. 2017 CRISPR-Cas: değişime uyum sağlamak . Bilim 356, aa15056. (doi:10.1126/science.aal5056) Crossref, ISI, Google Akademik

Charpentier E, Richter H, van der Oost J, Beyaz MF.

2015 RNA kılavuzlarının arke ve bakteriyel CRISPR-Cas adaptif bağışıklığındaki Biyogenez yolları. FEMS Mikrobiyol. Rev. 39, 428-441. (doi:10.1093/femsre/fuv023) Crossref, PubMed, ISI, Google Akademik

Weinberger AD, Wolf YI, Lobkovsky AE, Gilmore MS, Koonin EV

. 2012 Prokaryotlarda adaptif bağışıklık için viral çeşitlilik eşiği. MBio 3, e00456-12. (doi:10.1128/mBio.00456-12) Crossref, PubMed, ISI, Google Akademik

Iranzo J, Lobkovsky AE, Wolf YI, Koonin EV

. 2013 Açık bir ekolojik bağlamda prokaryotik adaptif bağışıklık sistemi CRISPR-Cas'ın evrimsel dinamikleri. J. Bakteriyol. 195, 3834-3844. (doi:10.1128/JB.00412-13) Crossref, PubMed, ISI, Google Akademik

Anderson RE, Brazelton WJ, Baross JA

. 2011 Yaygın akışlı hidrotermal havalandırma kanalı viral topluluğunun mikrobiyal konaklarını tanımlamak için metagenomik bir araç olarak CRISPR'leri kullanma. FEMS Mikrobiyol. ekol. 77, 120-133. (doi:10.1111/j.1574-6941.2011.01090.x) Crossref, PubMed, ISI, Google Akademik

Burstein D, Sun CL, Brown CT, Sharon I, Anantharaman K, Probst AJ, Thomas BC, Banfield JF

. 2016 Başlıca bakteri soyları, esasen CRISPR–Cas viral savunma sistemlerinden yoksundur. Nat. Komün. 7, 10613. (doi:10.1038/ncomms10613) Crossref, PubMed, ISI, Google Akademik

Weissman J, Laljani R, Fagan W, Johnson P

. 2018 Ekoloji, mikrobiyal bağışıklık stratejisini şekillendiriyor: CRISPR uyarlanabilir bağışıklığın görülme sıklığının belirleyicileri olarak sıcaklık ve oksijen. biorxiv. (doi:10.1101/326330) Google Akademik

van Houte S, Buckling A, Westra ER.

2016 Prokaryotik bağışıklık mekanizmalarının evrimsel ekolojisi. Mikrobiyol. Mol. Biol. Rev. 80, 745-763. (doi:10.1128/MMBR.00011-16) Crossref, PubMed, ISI, Google Akademik

2015 Parazit maruziyeti, yapıcı savunmaya karşı uyarılabilir savunmanın seçici evrimini yönlendirir. Kör. Biol. 25, 1043-1049. (doi:10.1016/j.cub.2015.01.065) Crossref, PubMed, ISI, Google Akademik

Chabas H, van Houte S, Hoyland-Kroghsbo NM, Buckling A, Westra ER.

2016 Duyarlı konakçıların göçü, alternatif parazit savunma stratejilerinin evrimini tetikler. Proc. R. Soc. B 283, 20160721. (doi:10.1098/rspb.2016.0721) Bağlantı, ISI, Google Akademik

2013 CRISPR/Cas sistemleri tarafından sitotoksik kromozomal hedefleme, bakteri genomlarını yeniden şekillendirebilir ve patojenite adalarını dışarı çıkarabilir veya yeniden modelleyebilir. PLoS Genet. 9, e1003454. (doi:10.1371/journal.pgen.1003454) Crossref, PubMed, ISI, Google Akademik

Stern A, Keren L, Wurtzel O, Amitai G, Sorek R

. 2010 CRISPR ile Kendi Kendini Hedefleme: gen regülasyonu mu otoimmünite mi? Trendler Genet. 26, 335-340. (doi:10.1016/j.tig.2010.05.008) Crossref, PubMed, ISI, Google Akademik

Bikard D, Hatoum-Aslan A, Mucida D, Marraffini LA

. 2012 CRISPR girişimi, in vivo bakteriyel enfeksiyon sırasında doğal dönüşümü ve virülans kazanımını önleyebilir. Hücre Konak Mikrobu 12, 177-186. (doi:10.1016/j.chom.2012.06.003) Crossref, PubMed, ISI, Google Akademik

van Sluijs L, van Houte S, van der Oost J, Brouns SJ, Buckling A, Westra ER

. Basında. Bağımlılık sistemleri bakteriyel adaptif bağışıklığı antagonize eder. FEMS Mikrobiyol. Lett. Google Akademik

Bernheim A, Calvo-Villamanan A, Basier C, Cui L, Rocha E.PC, Touchon M, Bikard D

. Bakterilerde tip II-A CRISPR–Cas sistemleri ile NHEJ onarımının 2017 inhibisyonu . Nat. Komün. 8, 2094. (doi:10.1038/s41467-017-02350-1) Crossref, PubMed, ISI, Google Akademik

Levy A, Goren MG, Yosef I, Auster O, Manor M, Amitai G, Edgar R, Qimron U, Sorek R

. 2015 CRISPR adaptasyon önyargıları, yabancı DNA edinme tercihini açıklıyor. Doğa 520, 505-510. (doi:10.1038/nature14302) Crossref, PubMed, ISI, Google Akademik

Paez-Espino D, Sharon I, Morovic W, Stahl B, Thomas BC, Barrangou R, Banfield JF

. 2015 CRISPR bağışıklığı, hızlı faj genom evrimini yönlendiriyor streptokok termofilus . MBio 6, e00262-15. (doi:10.1128/mBio.00262-15) Crossref, PubMed, ISI, Google Akademik

2016 Prokaryotik adaptif bir bağışıklık sisteminin çeşitlilik yaratan faydaları . Doğa 532, 385-388. (doi:10.1038/nature17436) Crossref, PubMed, ISI, Google Akademik

. 2008 Virüs popülasyon dinamikleri ve doğal mikrobiyal topluluklarda kazanılmış virüs direnci. Bilim 320, 1047-1050. (doi:10.1126/science.1157358) Crossref, PubMed, ISI, Google Akademik

Düzenlenen NL, Herrera A, Whitaker RJ

. 2013 yılında CRISPR tekrar-aralayıcı lokuslarının yeniden sınıflandırılması sulfolobus adacık . Çevre. Mikrobiyol. 15, 3065-3076. (doi:10.1111/1462-2920.12146) PubMed, ISI, Google Akademik

. 2008 Hızla gelişen CRISPR'ler, mikroorganizmaların virüslere karşı kazanılmış direnciyle ilişkilidir. Çevre. Mikrobiyol. 10, 200-207. (doi:10.1111/j.1462-2920.2007.01444.x) PubMed, ISI, Google Akademik

Düzenlenen NL, Herrera A, Cadillo-Quiroz H, Whitaker RJ

. 2010 CRISPR ile ilişkili çeşitlilik sulfolobus adacık . PLoS BİR 5, e0012988. (doi:10.1371/journal.pone.0012988) Crossref, PubMed, ISI, Google Akademik

Emerson JB, Andrade K, Thomas BC, Norman A, Allen EE, Heidelberg KB, Banfield JF

. 2013 Archaea baskın hipersalin Lake Tyrrell, Victoria, Avustralya'da Virüs-host ve CRISPR dinamikleri. Arkea 2013, 370871. (doi:10.1155/2013/370871) Crossref, PubMed, ISI, Google Akademik

Tomida J, Morita Y, Shibayama K, Kikuchi K, Sawa T, Akaike T, Kawamura Y

. 2017 yılında CRISPR lokuslarının çeşitliliği ve mikroevrimi Helicobacter cinaedi . PLoS BİR 12, e0186241. (doi:10.1371/journal.pone.0186241) Crossref, PubMed, ISI, Google Akademik

İngiltere BİZ, Kim T, Whitaker RJ

. 2018 yılında CRISPR-Cas bağışıklığının metapopülasyon yapısı Pseudomonas aeruginosa ve virüsleri. mSistemler 3, e00075-18. (doi:10.1128/mSystems.00075-18) Crossref, PubMed, ISI, Google Akademik

Basında. megafajlar bulaşır Prevotella ve varyantları bağırsak mikrobiyomlarında yaygındır. Nat. Mikrobiyol. (doi:10.1038/s41564-018-0338-9) Google Akademik

. Nüfus darboğazları bağlamında 2019 CRISPR evrimi ve bakteriyofaj kalıcılığı. RNA Biol. 5, 1-7. (doi:10.1080/15476286.2019.1578608) Crossref, Google Akademik

. 2010 Küçük, yavaş ve uzmanlaşmış CRISPR ve anti-CRISPR Escherichia ve Salmonella . PLoS BİR 5, e11126. (doi:10.1371/journal.pone.0011126) Crossref, PubMed, ISI, Google Akademik

Semenova E, Jore MM, Datsenko KA, Semenova A, Westra ER, Wanner B, van der Oost J, Brouns SJ, Severinov K.

2011 Kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrar (CRISPR) RNA'sı tarafından girişim, bir tohum dizisi tarafından yönetilir. Proc. Natl Acad. bilim Amerika Birleşik Devletleri 108, 10 098-10 103. (doi:10.1073/pnas.1104144108) Crossref, ISI, Google Akademik

Deveau H, Barrangou R, Garneau JE, Labonte J, Fremaux C, Boyaval P, Romero DA, Horvath P, Moineau S

. 2008'de CRISPR kodlu dirence faj yanıtı streptokok termofilus . J. Bakteriyol. 190, 1390-1400. (doi:10.1128/JB.01412-07) Crossref, PubMed, ISI, Google Akademik

Levin BR, Moineau S, Bushman M, Barrangou R

. 2013 CRISPR aracılı bağışıklığa sahip faj ve bakterilerin popülasyonu ve evrimsel dinamikleri. PLoS Genet. 9, e1003312. (doi:10.1371/journal.pgen.1003312) Crossref, PubMed, ISI, Google Akademik

Childs LM, İngiltere WE, Young MJ, Weitz JS, Whitaker RJ

. 2014 Mikrobiyal popülasyonlarda CRISPR kaynaklı dağıtılmış bağışıklık. PLoS BİR 9, e101710. (doi:10.1371/journal.pone.0101710) Crossref, PubMed, ISI, Google Akademik

Chabas H, Lion S, Nicot A, Meaden S, van Houte S, Moineau S, Wahl LM, Westra ER, Gandon S.

2018 Heterojen ev sahibi popülasyonlarda bulaşıcı hastalıkların evrimsel ortaya çıkışı . PLoS Biol. 16, e2006738. (doi:10.1371/journal.pbio.2006738) Crossref, PubMed, ISI, Google Akademik

Westra ER, Sunderhauf D, Landsberger M, Burkulma A

. 2017 Çeşitlilik yaratan bağışıklık stratejilerinin mekanizmaları ve sonuçları. Nat. Rev. İmmünol. 17, 719-728. (doi:10.1038/nri.2017.78) Crossref, PubMed, ISI, Google Akademik

Bondy-Denomy J, Pawluk A, Maxwell KL, Davidson AR

. 2013 CRISPR/Cas bakteriyel bağışıklık sistemini etkisiz hale getiren bakteriyofaj genleri . Doğa 493, 429-432. (doi:10.1038/nature11723) Crossref, PubMed, ISI, Google Akademik

Borges AL, Zhang JY, Rollins MF, Osuna BA, Wiedenheft B, Bondy-Denomy J

. 2018 Bakteriyofaj işbirliği, CRISPR-Cas3 ve Cas9 bağışıklığını bastırır. Hücre 174, 917-925. (doi:10.1016/j.cell.2018.06.013) Crossref, PubMed, ISI, Google Akademik

Landsberger M, Gandon S, Meaden S, Rollie C, Chevallereau A, Chabas H, Buckling A, Westra ER, van Houte S.

2018 Anti-CRISPR fajları, CRISPR-Cas bağışıklığının üstesinden gelmek için işbirliği yapıyor. Hücre 174, 908-916. (doi:10.1016/j.cell.2018.05.058) Crossref, PubMed, ISI, Google Akademik

Vale PF, Lafforgue G, Gatchitch F, Gardan R, Moineau S, Gandon S

. 2015 yılında CRISPR-Cas aracılı direncin maliyetleri streptokok termofilus . Proc. R. Soc. B 282, 20151270. (doi:10.1098/rspb.2015.1270) Bağlantı, ISI, Google Akademik

. 2010 Çoklu ilaca dirençli enterokoklarda CRISPR- eksikliğicas . MBio 1, e00227-10. (doi:10.1128/mBio.00227-10) Crossref, PubMed, ISI, Google Akademik

Jiang W, Maniv I, Arain F, Wang Y, Levin BR, Marraffini LA

. 2013 CRISPR bağışıklığının evrimsel dezavantajı ile başa çıkmak: bakteriler ve faydalı plazmitler . PLoS Genet. 9, e1003844. (doi:10.1371/journal.pgen.1003844) Crossref, PubMed, ISI, Google Akademik

. 2014 İyi ve kötü enfeksiyonlara karşı direncin evrimi. J. Evol. Biol. 27, 303-312. (doi:10.1111/jeb.12291) Crossref, PubMed, ISI, Google Akademik

Paez-Espino D, Morovic W, Sun CL, Thomas BC, Ueda K, Stahl B, Barrangou R, Banfield JF

. 2013 Faj bağışıklığı sağlayan bakteriyel CRISPR öğelerinde güçlü önyargı. Nat. Komün. 4, 1430. (doi:10.1038/ncomms2440) Crossref, PubMed, ISI, Google Akademik

. 2014 Verimli bir şekilde iletilen RNA güdümlü nükleazları kullanan diziye özgü antimikrobiyaller . Nat. Biyoteknoloji. 32, 1141-1145. (doi:10.1038/nbt.3011) Crossref, PubMed, ISI, Google Akademik

Gomaa AA, Klumpe HE, Luo ML, Selle K, Barrangou R, Beisel CL

. 2013 Genom hedeflemeli CRISPR-Cas sistemleri kullanılarak bakteri suşlarının programlanabilir şekilde uzaklaştırılması . MBio 5, e00928–13. (doi:10.1128/mBio.00928-13) Crossref, ISI, Google Akademik

Bikard D, Euler CW, Jiang W, Nussenzweig PM, Goldberg GW, Duportet X, Fischetti VA, Marraffini LA

. 2014 Diziye özgü antimikrobiyaller üretmek için CRISPR-Cas nükleazlarından yararlanma . Nat. Biyoteknoloji. 32, 1146-1150. (doi:10.1038/nbt.3043) Crossref, PubMed, ISI, Google Akademik

Dong H, Xiang H, Mu D, Wang D, Wang T

. 2019 Konjugatif bir CRISPR/Cas9 sisteminden yararlanarak plazmidi barındıran mcr-1 gen Escherichia koli . Int. J. Antimikrobiyal. Temsilciler 53, 1-8. (doi:10.1016/j.ijantimicag.2018.09.017) Crossref, PubMed, ISI, Google Akademik

Buchthal J, Evans SW, Lunshof J, Telford SR, Esvelt KM

. 2019 Kenelere Karşı Fareler: Paylaşılan ortamı değiştirerek kene kaynaklı hastalıkları önlemek için topluluk rehberliğinde deneysel bir çaba. Phil. Trans. R. Soc. B 374, 20180105.(doi:10.1098/rstb.2018.0105) Bağlantı, ISI, Google Akademik

Esvelt KM, Smidler AL, Catteruccia F, Kilise GM

. 2014 Yabani popülasyonların değiştirilmesi için RNA güdümlü gen sürücüleri ile ilgili. Elif 3, e03401. (doi:10.7554/eLife.03401) Crossref, PubMed, ISI, Google Akademik

Godfray H.CJ, Kuzey A, Burt A

. 2017 Tahrik edici endonükleaz genleri, haşereler ve hastalık vektörleriyle mücadelede nasıl kullanılabilir? BMC Biol. 15, 81. (doi:10.1186/s12915-017-0420-4) Crossref, PubMed, ISI, Google Akademik

DiCarlo JE, Chavez A, Dietz SL, Esvelt KM, Kilise GM

. 2015 Mayada CRISPR–Cas9 gen sürücülerini koruma . Nat. Biyoteknoloji. 33, 1250-1255. (doi:10.1038/nbt.3412) Crossref, PubMed, ISI, Google Akademik

Gantz VM, Jasinskiene N, Tatarenkova O, Fazekas A, Macias VM, Bier E, James AA

. 2015 Sıtma vektör sivrisinek popülasyon modifikasyonu için yüksek verimli Cas9 aracılı gen sürücüsü anofel stephensi . Proc. Natl Acad. bilim Amerika Birleşik Devletleri 112, E6736-E6743. (doi:10.1073/pnas.1521077112) Crossref, PubMed, ISI, Google Akademik

. 2015 Genom düzenleme. Mutajenik zincir reaksiyonu: heterozigozu homozigot mutasyonlara dönüştürmek için bir yöntem. Bilim 348, 442-444. (doi:10.1126/science.aaa5945) Crossref, PubMed, ISI, Google Akademik

Grunwald HA, Gantz VM, Poplawski G, Xu XS, Bier E, Cooper KL

. Dişi fare germ hattında CRISPR–Cas9'un aracılık ettiği 2019 Süper Mendel kalıtımı . Doğa 566, 105-109. (doi:10.1038/s41586-019-0875-2) Crossref, PubMed, ISI, Google Akademik

Champer J, Liu J, Oh SY, Reeves R, Luthra A, Oakes N, Clark AG, Messer PW

. 2018 CRISPR gen sürücüsünde direnç alel oluşumunun azaltılması. Proc. Natl Acad. bilim Amerika Birleşik Devletleri 115, 5522-5527. (doi:10.1073/pnas.1720354115) Crossref, PubMed, ISI, Google Akademik

Unckless RL, Clark AG, Messer PW

. 2017 CRISPR/Cas9 gen sürücüsüne karşı direncin evrimi. Genetik 205, 827-841. (doi:10.1534/genetics.116.197285) Crossref, PubMed, ISI, Google Akademik

Noble C, Olejarz J, Esvelt K, Kilise G, Nowak M.

2017 CRISPR gen sürücülerinin evrimsel dinamikleri. bilim reklam . 3, e1601964. (doi:10.1126/sciadv.1601964) Crossref, PubMed, ISI, Google Akademik

Kyrou K, Hammond AM, Galizi R, Kranjc N, Burt A, Beaghton AK, Nolan T, Crisanti A

. 2018 Bir CRISPR–Cas9 gen sürücüsü hedeflemesi çift ​​seks kafeslerde tam popülasyon baskılanmasına neden olur anofel gambia sivrisinekler. Nat. Biyoteknoloji. 36, 1062-1066. (doi:10.1038/nbt.4245) Crossref, PubMed, ISI, Google Akademik

2018 Sahra altı Afrika'da sıtmanın ortadan kaldırılması için potansiyel bir biyokontrol aracı olarak gen tahrikli sivrisineklerin konuşlandırılmasının yolu: Bilimsel Çalışma Grubunun tavsiyeleri. NS. J. Trop. Med. Hig. 98(Ek 6), 1-49. (doi:10.4269/ajtmh.18-0083) Crossref, PubMed, ISI, Google Akademik

Min J, Smidler AL, Najjar D, Esvelt KM

. 2018 Gen sürücüsünün kullanılması . J. Sorumlu Innov. 5(Ek 1), S40-S65. (doi:10.1080/23299460.2017.1415586) Crossref, ISI, Google Akademik

. 2019 CRISPR-Cas sistemlerinin kökenleri ve evrimi. Phil. Trans. R. Soc. B 374, 20180087. (doi:10.1098/rstb.2018.0087) Bağlantı, ISI, Google Akademik

Gurney J, Pleška M, Levin BR

. 2019 Direniş varken neden bağışıklığa katlanmak: popülasyona bir gezi ve kısıtlama-modifikasyon ve CRISPR-Cas'ın evrimsel dinamikleri. Phil. Trans. R. Soc. B 374, 20180096. (doi:10.1098/rstb.2018.0096) Bağlantı, Google Akademik

Bernheim A, Bikard D, Touchon M, Rocha EPC

. 2019 Arka plan meselesi: Bakterilerde CRISPR-Cas sistemlerinin seyrek dağılımının olası bir nedeni olarak DNA onarım yolları. Phil. Trans. R. Soc. B 374, 20180088. (doi:10.1098/rstb.2018.0088) Bağlantı, Google Akademik

Chevallereau A, Meaden S, van Houte S, Westra ER, Rollie C.

2019 Bakteriyel mutasyon oranının CRISPR-Cas adaptif bağışıklığının evrimi üzerindeki etkisi. Phil. Trans. R. Soc. B 374, 20180094. (doi:10.1098/rstb.2018.0094) Bağlantı, Google Akademik

Bradde S, Mora T, Walczak AM

. 2019 Kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrarlı ayırıcı edinmenin maliyeti ve faydaları . Phil. Trans. R. Soc. B 374, 20180095. (doi:10.1098/rstb.2018.0095) Bağlantı, Google Akademik

Lopatina A, Medvedeva S, Artamonova D, Kolesnik M, Sitnik V, Ispolatov Y, Severinov K

. 2019 CRISPR ayırıcılarının doğal çeşitliliği termos: yerel ayırıcı ediniminin ve küresel ayırıcı değişiminin kanıtı . Phil. Trans. R. Soc. B 374, 20180092. (doi:10.1098/rstb.2018.0092) Bağlantı, Google Akademik

Pauly MD, Bautista MA, Siyah JA, Whitaker RJ

. 2019 virüslerine karşı çeşitlendirilmiş yerel CRISPR-Cas bağışıklığı sulfolobus adacık . Phil. Trans. R. Soc. B 374, 20180093. (doi:10.1098/rstb.2018.0093) Bağlantı, Google Akademik

Hoikkala V, Almeida GMF, Laanto E, Sundberg L-R

. 2019 Su Ürünleri Yetiştiriciliği, CRISPR-Cas ve faj arasındaki birlikte evrim için ampirik bir kanıt kaynağı olarak. Phil. Trans. R. Soc. B 374, 20180100. (doi:10.1098/rstb.2018.0100) Bağlantı, Google Akademik

Ortak J, Morley D, Westra ER, van Houte S

. 2019 CRISPR-Cas bağışıklığı, aralarında ortak evrimsel bir silahlanma yarışına yol açar. streptokok termofilus ve litik faj. Phil. Trans. R. Soc. B 374, 20180098. (doi:10.1098/rstb.2018.0098) Google Akademik

Chabas H, Nicot A, Meaden S, Westra ER, Tremblay DM, Pradier L, Lion S, Moineau S, Gandon S

. 2019 CRISPR-Cas bağışıklığının dayanıklılığındaki değişkenlik. Phil. Trans. R. Soc. B 374, 20180097. (doi:10.1098/rstb.2018.0097) Bağlantı, Google Akademik

Watson BNJ, Easingwood RA, Tong B, Wolf M, Salmond GPC, Staals RHJ, Bostina M, Fineran PC

. 2019 Tek veya çoklu CRISPR-Cas ayırıcılar tarafından hedeflenen fajlar için farklı genetik ve morfolojik sonuçlar. Phil. Trans. R. Soc. B 374, 20180090. (doi:10.1098/rstb.2018.0090) Bağlantı, Google Akademik

McKitterick AC, LeGault KN, Angermeyer A, Alam M, Seed KD

. 2019 Mobil genetik unsurlar arasındaki rekabet, faj kodlu bir CRISPR-Cas sisteminin optimizasyonunu yönlendiriyor: doğal bir silahlanma yarışından içgörüler. Phil. Trans. R. Soc. B 374, 20180089. (doi:10.1098/rstb.2018.0089) Google Akademik

Hatoum-Aslan A, Marraffini LA

. 2014 CRISPR bağışıklığının bakteriyel patojenlerin ortaya çıkması ve virülansı üzerindeki etkisi. Kör. Görüş. Mikrobiyol. 17C, 82-90. (doi:10.1016/j.mib.2013.12.001) Crossref, ISI, Google Akademik

Gophna U, Kristensen DM, Wolf YI, Popa O, Drevet C, Koonin EV

. 2015 Evrimsel zaman çizelgelerinde CRISPR-Cas tarafından yatay gen transferinin inhibisyonuna dair kanıt yok. ISME J. 9, 2021-2027. (doi:10.1038/ismej.2015.20) Crossref, PubMed, ISI, Google Akademik

Shehreen S, Chyou T-y, Fineran PC, Kahverengi CM

. 2019 Genom çapında korelasyon analizi, çeşitli türlerde antibiyotik direnç genlerinin edinilmesinde CRISPR-Cas sistemlerinin farklı rollerini önerir. Phil. Trans. R. Soc. B 374, 20180384. (doi:10.1098/rstb.2018.0384) Bağlantı, Google Akademik

. 2019 Mikrobiyomu CRISPR yöntemiyle düzenleme . Phil. Trans. R. Soc. B 374, 20180103. (doi:10.1098/rstb.2018.0103) Bağlantı, Google Akademik

de Graeff N, Jongsma KR, Johnston J, Hartley S, Bredenoord AL.

2019 İnsan olmayan hayvanlarda genom düzenleme etiği: akademik literatürde bildirilen nedenlerin sistematik bir incelemesi. Phil. Trans. R. Soc. B 374, 20180106. (doi:10.1098/rstb.2018.0106) Bağlantı, Google Akademik


Yöntemler

Veri toplama ve ön işleme

Bu çalışmada kullanılan tüm Cas proteinleri, mevcut sınıflandırılmış arkeal ve bakteriyel CRISPR-Cas sistemlerinden seçilmiştir [2–4]. Fasta [23] kullanarak bu veriler üzerinde hepsine karşı dizi benzerliği karşılaştırması yaptık. Daha sonra, özel benzerlik kriterlerine [9, 16] dayalı olarak Markov Küme Algoritmasını (MCL) [24] kullanarak proteinleri kümelendirdik. Bu kriterler proteinlerin boyutunu, uzunluk hizalamasını ve karşılaştırılan 2 protein arasındaki benzer bölgelerin nispi konumlarını dikkate alır. Spesifik bir Cas protein ailesinden gelen protein dizilerini kümeledikten sonra, MUSCLE [25] kullanarak çoklu dizi hizalaması oluşturduk. Daha sonra bu hizalamalar hmmbuild [17] kullanılarak HMM profil modellerine dönüştürülmüştür. MCL hariç, diğer tüm araçlar varsayılan parametrelerle çalıştırıldı.

Metin boyunca, eğitim ve test veri kümelerimizdeki her kaset, kasetin tüm genlerini içeren genomik dizisinden ve açıklamalı tüm Cas proteinlerinin listesinden oluşan bir demet ile temsil edilir. Genomik dizileri aşağıdaki gibi çıkardık: Makarova ve diğerlerinden Ek Tablo S7'yi aldık. [ 2], "(alt)Tip / Koordinatlar" sütunundaki tüm gen lokuslarını (yani genomik pozisyonları) içerir ve dizileri NCBI'den indirir. İkinci kısım, yani tüm Cas proteinlerinin listesi için, açıklamalı her Cas proteini için genomik diziyi ayrı ayrı, yine “koordinatlar” sütunundan çıkardık ve 50 baz bağlam ekledik. İlişkili amino asit dizileri, ilgili gen dizileri üzerinde Prodigal aracı v2.6.3 [26] çalıştırılarak üretildi ve "" sütunundaki Cas notu ile birlikte saklandı.cas geni”, Makarova ve ark. [ 2].

Özellik vektörlerini oluşturmak için, tüm kasetlerin dizilerine karşı hmmsearch kullanarak tüm HMM profil modellerini çalıştırdık. Bu alt tip için açıklamalı tüm proteinler için isabetli olan kasetleri seçtik ve bunu sınıflandırma hattı için eğitim ve test seti olarak kullandık. Eksik bir proteini olan kasetler, regresyon modellerimiz ve tam boru hattı için bağımsız bir test durumu olarak kullanıldı.

Cas kasetlerinin sınıflandırılması

Bu görev için, veri matrisi gösterimi kullanarak Cas kasetlerini ilgili alt tiplerine sınıflandırabilen tahmine dayalı modeller elde etmek için CRISPR verilerinin sonlu bir örneğine ML algoritmaları uygularız (bkz. Sonuçlar ve Tartışma). Bu nedenle, sonlu veri örneğine dayanarak, bir kaset ve alt tipi arasındaki ilişkiyi genelleştirebilen bir fonksiyonu tahmin eden sınıflandırma algoritmalarının uygulamasını araştırıyoruz. Sonuç olarak, bu işlevi, eğitim aşamasında görülmeyen yeni kasetleri yüksek düzeyde doğrulukla ilgili alt türlerine sınıflandırmak için kullanmayı amaçlıyoruz.

Eksik Cas proteinlerinin tahmini

Ayrıca, normalleştirilmiş bit puanlarını tahmin ederek eksik Cas proteinlerini tahmin etme (muhtemelen) problemini de araştırıyoruz. Bu problem için aşağıdaki gibi modelledik. verilen m Cas proteinleri, her bir alt tip için kendi setini filtreleriz. ben < m proteinler (yani, alt tipin ≥1 kaseti için bit puanı >gt0 olan tüm Cas proteinleri). Sonra, eğitiyoruz ben regresörler, nerede Jinci gerici, J ∈ <1, ⋅⋅⋅, ben>, bit puanını tahmin eder Jth Cas proteini kalanını kullanarak ben − Girdi olarak 1 protein.

ML algoritmalarının deneysel değerlendirmesi

Sınıflandırma ve regresyon modellerini eğitmek için önceden işlenmiş veri kümesine üç ML algoritması uygulandı:

Bir karar ağacı tarafından temsil edilen bir tahmine dayalı modeli eğiten Sınıflandırma ve Regresyon Ağaçları (CART) [ 27]. Bu algoritma, sınıflandırma (sınıflandırma ağaçları) ve regresyon (regresyon ağaçları) görevleri için karar ağaçlarını eğitebilir. Bir karar ağacı, eğitim veri setinden çıkarılan bir dizi yorumlanabilir kuraldan oluşur. Bu kurallar, daha önce görülmemiş yeni örnekler için sınıf veya regresyon değerini tahmin etmek için model tarafından verilen kararları açıklar.

Örnekleri mümkün olan maksimum ayırma payı ile 2 sınıftan ayıran bir hiperdüzlem tarafından temsil edilen ikili bir sınıflandırıcıyı eğiten Destek Vektör Makineleri (SVM) [ 28]. Çekirdek fonksiyonlarını kullanarak, doğrusal olarak ayrılamayan problemlere bir SVM uygulanabilir. Çok sınıflı sınıflandırma görevleri için, çok sınıflı bir veri kümesi genellikle ilk önce birkaç sınıflandırma ikili veri kümesine ayrıştırılır. SVM'ler daha sonra her ikili veri kümesine uygulanabilir ve tahminleri çok sınıflı bir sınıflandırma için birleştirilir.

Son derece Rastgele Ağaçlar (ERT) [ 29], her ağacın orijinal özelliklerin rastgele bir alt kümesi kullanılarak eğitildiği bir karar ağaçları topluluğu kullanır. ERT, klasik karar ağaçlarında olduğu gibi, bir bölme için düşünülen her özellik için en iyi ayırt edici eşiği seçmek yerine rastgele bir eşik değeri seçer. Son tahminler, topluluktaki tüm karar ağaçlarının tahminlerinin ortalamasıdır. Gruptaki karar ağaçlarından sınıflandırma veya regresyon görevindeki her bir özelliğin önemini çıkarabiliriz. Önem, özelliği bölen bir düğümün neden olduğu kirlilikteki azalma ile temsil edilir, böyle bir düğümde [30] bulunan örneklerin sayısı ile ağırlıklandırılır ve topluluğun tüm ağaçlarının ortalaması alınır.

Model seçimi ve tahmine dayalı modellerin değerlendirilmesi, makine öğrenimi literatüründe yaygın olarak çalışılan bir problemdir. Birkaç çalışma (örneğin, [31–33]), farklı metodolojilerin avantajlarını ve dezavantajlarını araştırır. Bu önceki çalışmalara dayanarak, iç içe çapraz doğrulama prosedürünü kullanıyoruz. Bir dizi veri verildiğinde, klasik çapraz doğrulama yaklaşımı, verileri ikiye böler. K Kıvrımlar olarak adlandırılan, birbirini dışlayan ve benzer büyüklükteki alt kümeler. Ardından, her yinelemede, K − 1 kat bir ML modelini eğitmek için, kalan kat ise onu test etmek için kullanılır [ 34, 35]. Yuvalanmış çapraz doğrulama yaklaşımı, 2 farklı çapraz doğrulama döngüsü kullanarak model seçimi ve değerlendirme adımlarını ayırır: verileri ikiye bölen bir dış döngü. K1 katlanır ve model değerlendirmesi ve eğitim verilerini ikiye bölen bir iç döngü için kullanılır. K2 katlanır ve model seçimi için kullanılır. Bu yazıda belirlediğimiz K1 = K2 = 10 ve farklı bölmeler göz önüne alındığında sonuçların varyansı nedeniyle değerlendirme prosedürünü 50 kez tekrarlayın [ 33]. Deneylerimiz sırasında, her dış kıvrımda tüm sınıflardan örneklerin bulunduğunu garanti etmek için sadece ≥10 örnek içeren sınıfları kullandığımızı belirtmek önemlidir.

Her çapraz doğrulama yinelemesi için, özellikle veri kümesi dengesiz olduğunda ortaya çıkabilecek ortalama problemlerinden kaçınmak için tüm katlardan tahminleri toplar ve tek bir tahmine dayalı performans değerlendirmesi hesaplarız [36]. Sınıflandırma deneyleri için, aşağıdaki değerlendirme ölçülerini kullandık: ayarlanmış dengeli doğruluk puanı [ 37, 38], daha küçük sınıflardan örneklere daha yüksek ağırlıklar veren orijinal doğruluk ölçüsünün bir uyarlaması ve makro ortalamalı F-skoru [ 39] , tüm sınıflar arasındaki ortalama F puanıdır. Her iki önlem de farklı alt türleri eşit olarak ele alır. Bu nedenle, en fazla kasete sahip olanları tercih etmezler. Regresyon deneyleri için, beklenen ve tahmin edilen hedef değerler arasındaki ortalama mutlak fark olan ortalama mutlak hatayı [ 40] kullandık.

Kullanılan her bir ML algoritmasının model seçim adımıyla ilgili olarak, scikit-learn paketindeki yönergelere dayalı olarak 20 farklı hiperparametre kombinasyonu üzerinde bir ızgara araması gerçekleştirdik [41]. Bu hiperparametre ızgaralarını daha sonra açıklayacağız. CART algoritması için, karar ağacının maksimum derinliğini ve bir düğümün yaprağa dönüşmesi için gereken minimum örnek sayısını belirleyen hiperparametreleri değiştirdik. İlki için <5, 10, 15, max > değerlerini göz önünde bulundurduk, burada max, ağacın mümkün olduğunca derin büyümesine izin verir. İkincisi için değerleri <5, 6, 7, 8, 9> olarak değiştirdik. SVM algoritması için, doğrusal olmayan karar sınırlarını modelleme yeteneği ve yaygın olarak kullanılan bir başka doğrusal olmayan çekirdek olan polinom çekirdeği ile karşılaştırıldığında azaltılmış hiperparametre sayısı nedeniyle bir Gauss çekirdeği kullandık [42]. Maliyet hiper parametresi için C, <1 10 100 1.000> içindeki değerleri dikkate aldık. Çekirdek katsayısı γ ile ilgili olarak, <0.01, 0.1, 1, 10, 100> içindeki değerleri değerlendirdik. Son olarak, ERT algoritması için, <25, 50, 75, 100> içindeki değerleri ve |$lbrace 25 içindeki değerler kümesinden bir bölme gerçekleştirirken dikkate alınması gereken özelliklerin miktarını kullanarak topluluk boyutunu değiştirdik. %, %50\%, 75\%, %100\%, sqrt brace$|⁠ , nerede m bilinen Cas protein ailelerinin sayısıdır.


5 SONUÇ VE GELECEK PERSPEKTİFLERİ

CRISPR-Cas sistemlerinin biyolojik mekanizması üzerine yapılan çalışmalar, prokaryotik edinilmiş bağışıklık sisteminin çeşitliliğini ve karmaşıklığını göstermiştir. Geçmiş yıllarda yapılan bir dizi araştırma, öğrenmemiz için bir çerçeve oluşturmuş olsa da, bu savunma sistemlerinin anlaşılması hala daha kapsamlı çizimlere ihtiyaç duyuyor.

Bakterilerin ve virüslerin plastisitesi, gRNA hedeflerinin genetik polimorfizmine yol açabilir ve bu da CRISPR-Cas tabanlı tedavi ve teşhisi etkisiz hale getirir. PAM dizilerindeki mutasyonlar, fajların CRISPR-Cas sistemlerinden uzak durabildiğini de ortaya çıkarmıştır. Farklı gRNA'ları farklı hedefleme dizileriyle teslim ederek ve paketleyerek sorunun çözülüp çözülemeyeceğini henüz göreceğiz.

Araç setinde gerekli biyomoleküllerin depolanması ve aktivasyonu ile ilgili teknik problemler, ticarileştirme yolunda hala kaçınılmazdır. RNA enzimlerinin yaygın varlığı nedeniyle RNA kırılgandır, hedef nükleik asitlerin tespiti kolayca etkilenir. Burada, CRISPR-Cas sistemlerinde sinyal amplifikasyonu için kullanılan daha uzun sgRNA'ların her yerde bulunan RNase tarafından kesilmediğinden veya bozulmadığından emin olmak önemlidir, bu da negatif yanlışa yol açar. Ek olarak, CRISPR-Cas sistemlerinin in vivo hedef ilaç dağıtımı, hedefte veya hedef dışı belirgin toksisite olup olmadığı konusunda hala bir zorluktur.

Belirli nükleik asit dizilerini tanımlamanın farklı özellikleriyle, DNA veya RNA'daki daha spesifik değişikliklere yanıt veren CRISPR-Cas tabanlı "akıllı" materyaller tasarlamak da gelecekteki gelişim yönüdür. Ayrıca, bu "akıllı" malzemelerin, biyoalgılama, tıbbi implant, ilaç salımı ve tedavi için kullanılan kontrollü salimli kaplamalar, duyarlı biyomateryaller, kendi kendine birleşen hidrojeller, şekil hafızalı ajanlar ve algılama platformları gibi uygulamaları vardır. Örneğin, hidrojel nanosfer yüklü spesifik bir dolaşımdaki tümör DNA'sına yanıt veren antitümör ilaçlar, dolaşımdaki hedef tümör DNA'sına yanıt olarak tam olarak demonte edilen ve tümör hücrelerinin geniş metastazını kontrol eden tasarlanmış gRNA'ların çapraz bağlanmasıyla üretilebilir. Ayrıca, COVID-19 gibi solunum yolu enfeksiyon hastalıkları için sezgisel ve hassas koruyucu ekipman sağlayan esnek maskelere entegre edilmiş spesifik patojenik nükleik asit dizileri sensörü ve renk göstergesine sahip akıllı bir esnek pansuman da üretilebilir. Daha spesifik olarak, hedef nükleotid dizilerinin mevcudiyeti üzerine, Cas proteininin bölünme fonksiyonu tetiklenir, floresan habercinin aktivasyonunu veya salınımını üretir ve görünür bir renk değişikliği üretir.


Soyut

CRISPR–Cas, arke ve bakterilerdeki yabancı genetik elementleri bozan adaptif bağışıklık sistemleridir. CRISPR–Cas sistemleri, bağışıklık işlevlerini yerine getirirken büyük ölçüde RNA bileşenlerine güvenir. Bu CRISPR (cr) RNA'ları, CRISPR dizilerinin transkripti olan pre-crRNA'nın işlenmesiyle üretilen ve Cas proteinlerini aynı kökenli istilacı nükleik asitlere yönlendirerek onların yok edilmesini sağlayan tekrar-aralayıcı birimlerdir. Yalnızca DNA dizilerine dayanan CRISPR dizilerini tespit etmek için çeşitli biyoinformatik araçları geliştirilmiştir, ancak tüm bu araçlar, CRISPR dizi tekrarlarına karşılık gelebilecek tekrarlayan kalıpları aramak için aynı stratejiyi kullanır. Tanımlanan modeller, sabit, yerleşik bir puanlama işlevi kullanılarak değerlendirilir ve bir kesme değerini aşan diziler rapor edilir. Burada bunun yerine, çeşitli özelliklere dayalı olarak gerçek CRISPR dizilerini yanlış olanlardan algılamak ve ayırt etmek için makine öğrenimini kullanan veri odaklı bir yaklaşım sunuyoruz. CRISPR algılama aracımız CRISPRidentify, üç adım gerçekleştirir: CRISPR dizilerinin manuel olarak seçilmiş pozitif ve negatif örnek kümelerine dayalı olarak algılama, özellik çıkarma ve sınıflandırma. Tanımlanan CRISPR dizileri daha sonra ayrıntılı açıklamalarla birlikte kullanıcıya bildirilir. Yaklaşımımızın yalnızca önceden tespit edilen CRISPR dizilerini değil, aynı zamanda diğer araçlar tarafından tespit edilmeyen CRISPR dizi adaylarını da tanımladığını gösteriyoruz. Diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, aracımız önemli ölçüde azaltılmış bir yanlış pozitif oranına sahiptir. Mevcut araçların aksine, yaklaşımımız kullanıcıya yalnızca tanımlanmış CRISPR dizileri hakkında temel istatistikler sağlamakla kalmaz, aynı zamanda belirli bir genomik bölgenin bir CRISPR dizisi olma olasılığının pratik bir ölçüsü olarak bir kesinlik puanı da üretir.


Öğretmek için Vaka Çalışmalarını Kullanma

Birçok öğrenci, tümdengelimli akıl yürütücülerden daha tümevarımlıdır; bu, temel ilkelerden başlayarak mantıksal gelişimden ziyade örneklerden daha iyi öğrendikleri anlamına gelir. Bu nedenle vaka çalışmalarının kullanımı çok etkili bir sınıf tekniği olabilir.

Vaka çalışmaları uzun süredir işletme okullarında, hukuk fakültelerinde, tıp fakültelerinde ve sosyal bilimlerde kullanılmaktadır, ancak eğitmenler öğrencilerin öğrendiklerinin gerçek dünya durumlarına nasıl uygulanacağını keşfetmelerini istediklerinde herhangi bir disiplinde kullanılabilirler. Vakalar, basit bir “Bu durumda ne yapardınız?” sorusundan, analiz edilecek verilerle birlikte bir durumun ayrıntılı açıklamasına kadar birçok biçimde gelir. Basit bir senaryo tipi vaka mı yoksa karmaşık ayrıntılı bir vaka mı kullanacağınız, kurs hedeflerinize bağlıdır.

Çoğu vaka ödevi, öğrencilerin açık uçlu bir soruyu yanıtlamalarını veya birden fazla olası çözüm içeren açık uçlu bir soruna çözüm geliştirmelerini gerektirir. Gereksinimler, tek paragraflık bir yanıttan tam olarak geliştirilmiş bir grup eylem planına, teklife veya karara kadar değişebilir.

Ortak Vaka Öğeleri

Çoğu "tam gelişmiş" vakada şu ortak unsurlar bulunur:

  • Çözülmesi gereken bir soru veya problemle boğuşan bir karar verici.
  • Sorunun bağlamının bir açıklaması (yasa, endüstri, aile).
  • Veri tablolarından URL'lere bağlantılara, alıntılanan ifadelere veya tanıklıklara, destekleyici belgelere, resimlere, videoya veya sese kadar değişebilen destekleyici veriler.

Öğrencilerin çözümler üzerinde beyin fırtınası yapabilmeleri ve iş yükünü paylaşabilmeleri için vaka atamaları bireysel veya ekipler halinde yapılabilir.

Bu konuyla ilgili aşağıdaki tartışma, Yönetim Okulu'ndan Robb Dixon ve Halk Sağlığı Okulu'ndan Rob Schadt tarafından CEIT çalıştaylarında sunulan materyalleri içermektedir. Profesör Dixon ayrıca tartışmanın içerdiği bazı yazılı yorumlarda bulundu.

Sınıfta vaka çalışmaları kullanmanın avantajları

Vaka çalışmalarıyla öğretimin önemli bir avantajı, öğrencilerin örneklerden soyutlayarak ilkeleri anlamaya aktif olarak katılmalarıdır. Bu, becerilerini şu konularda geliştirir:

  1. Problem çözme
  2. Analitik araçlar, duruma bağlı olarak nicel ve/veya nitel
  3. Karmaşık durumlarda karar verme
  4. Belirsizliklerle başa çıkmak

Sınıfta vaka çalışmalarını kullanma yönergeleri

En basit uygulamada, vaka çalışmasının sunumu, analiz için bir çerçeve oluşturur. Vakanın ifadesinin, öğrencilerin çözümleri bulması ve ardından bu çözümlerin diğer benzer durumlarda nasıl uygulanacağını belirlemesi için yeterli bilgi sağlaması yararlıdır. Eğitmenler, öğrencilerin vakalar arasındaki hem benzerlikleri hem de farklılıkları belirleyebilmeleri için birkaç vaka kullanmayı seçebilir.

Ders hedeflerine bağlı olarak, eğitmen öğrencileri analizlerine sistematik bir yaklaşım izlemeye teşvik edebilir. Örneğin:

  • Sorun nedir?
  • Analizin amacı nedir?
  • Sorunun bağlamı nedir?
  • Hangi temel gerçekler dikkate alınmalıdır?
  • Karar verici için hangi alternatifler mevcuttur?
  • — için ne önerirsiniz ve neden?

Vaka analizine yenilikçi bir yaklaşım, öğrencilerin vakaya dahil olan kişilerin rolünü oynamalarını sağlamak olabilir. Bu sadece öğrencileri aktif olarak meşgul etmekle kalmaz, aynı zamanda onları vaka karakterlerinin bakış açılarını gerçekten anlamaya zorlar. Vakanın bulunduğu yeri gösteren videolar ve hatta saha gezileri öğrencilerin analiz etmeleri gereken durumu görselleştirmelerine yardımcı olabilir.

Eşlik eden okumalar

Vaka çalışmaları, vaka için geçerli olan bir kavramı veya analitik yöntemi tanıtan veya açıklayan bir okuma ödevi ile eşleştirilirse özellikle etkili olabilir. Vaka tartışması sırasında okumanın kullanımına verilen önem, kavramın veya yöntemin karmaşıklığına bağlıdır. Eğer basitse, tartışmanın odak noktası analitik sonuçların kullanımına verilebilir. Yöntem daha karmaşıksa, eğitmenin öğrencilere yöntemin uygulanmasında ve sonuçların yorumlanmasında yol göstermesi gerekebilir.

Vaka Tartışmasına Önderlik Etme ve Performansı Değerlendirme

Karar vakaları tanımlayıcı olanlardan daha ilginçtir. Sınıfta tartışmayı başlatmak için eğitmen, tüm öğrencilerin kolayca cevaplayabilmesi gereken kolay, tartışmasız bir soru ile başlayabilir. Bununla birlikte, en iyi vaka tartışmalarından bazıları, öğrencileri bir tavır almaya zorlayarak başlar. Bazı eğitmenler, bir öğrenciden tüm analizini özetleyen resmi bir vaka “aç” yapmasını isteyecektir. Diğerleri, öğrencileri problem tanımlamadan çözümlere taşıyan sorularla tartışmaya rehberlik etmeyi seçebilir. Yetenekli bir eğitmen, sınıfın yolunda gitmesini ve makul bir hızda ilerlemesini sağlamak için soruları ve tartışmayı yönlendirir.

Öğrencileri ödevi dersten önce tamamlamaya motive etmek ve ders sırasında dikkati teşvik etmek için, öğretmen vakanın tartışılması sırasında katılımı - niceliği ve özellikle niteliği - derecelendirmelidir. Bu basit bir kontrol, artı artı, eksi veya sıfır olabilir. Eğitmen mümkün olduğunca çok sayıda öğrenciyi dahil etmelidir. Tüm öğrencilerin katılımını sağlamak için eğitmen onları gruplara ayırabilir, vakayla ilgili bir sorunun nasıl yanıtlanacağını tartışmaları için her gruba birkaç dakika verebilir ve ardından her gruptan rastgele seçilen bir kişiden grubun yanıtını sunmasını isteyebilir. ve muhakeme. Rastgele seçim, her biri bir öğrencinin adı, bir çıkrık vb. olan zarlar, karıştırılmış dizin kartlarının yuvarlanması yoluyla gerçekleştirilebilir.

Kaynaklar

Bu tekniği bir bilim dersinde kullanmakla ilgileniyorsanız, Buffalo Üniversitesi'nde bilimlerde vaka çalışmalarının kullanımı hakkında iyi bir web sitesi var.


Videoyu izle: 30 นาท (Haziran 2022).