Bilgi

Araştırma: Jel Elektroforezi - Biyoloji

Araştırma: Jel Elektroforezi - Biyoloji


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Duchenne Musküler Distrofi (DMD) Mutasyonunu Tespit Etme

*dan uyarlandı Washington Üniversitesi'nin Modern Genetik müfredatı

Tanıtım

Mary ve John Smith'in üç çocuğu var: Daniel, 5 yaşında; Alice, yaş 4; ve Michael, 1 yaşında. Mary iki aylık hamile. Son zamanlarda Mary ve John, Daniel'in merdivenleri çıkmakta zorlandığını fark ettiler. Ayrıca birkaç kez kız kardeşiyle künye oynadıktan sonra gerçekten yorulduğundan şikayet etti. Daniel'in doktoru çocuğu muayene etti ve hastalığın klasik semptomlarının çoğunu gösterdiği için Duchenne Musküler Distrofi (DMD) için test edilmesini önerdi. Mary çok korktu, amcasının çok küçükken hastalıktan öldüğünü hatırladı. Bu onun ailesinde olabilir mi?

Doktor, belki de tüm ailelerinin, hatta Mary'nin taşıdığı fetüsün test edilmesini önerdi. Onları hastalığın nasıl kalıtsal olduğunu açıklayan bir genetik danışmana yönlendirdi. DMD'nin cinsiyete bağlı bir genetik hastalık olduğunu öğrendiler, bu da X kromozomundaki bir genin zarar görmesinden kaynaklandığı anlamına geliyor. Bu nedenle DMD'li hemen hemen herkes erkektir. Bir kız, annesinden ve annesi gibi DMD geninin kusurlu bir kopyasına sahip bir X kromozomunu miras alabilir; DMD için bir taşıyıcı olacak. Ama kız büyük ihtimalle babasından aldığı normal X kromozomu tarafından DMD geliştirmekten korunacaktır. Buna karşılık, bir erkek çocuk babasından X kromozomu almaz ve annesinden aldığı X kromozomu DMD geninin kusurlu bir kopyasını taşıyorsa, DMD geliştirecektir.

Genellikle DMD'li erkek çocuklar, kasları zayıflamaya başladığı 4 veya 5 yaşına kadar sağlıklıdır. Doktor Smith'lere Daniel'in muhtemelen birkaç yıl içinde tekerlekli sandalyeye ihtiyacı olacağını ve muhtemelen 21 yaşından önce öleceğini söyledi. Bilim adamları bu hastalık için bir tedavi bulmaya çalışıyor olsalar da, şu anda DMD için etkili bir tedavi yok.

Genetik uzmanı, fetüs de dahil olmak üzere ailenin her bir üyesinden kan örnekleri aldı. Smith'in kan örnekleri ayrılacak ve DNA beyaz kan hücrelerinden izole edilecekti. Ancak Smith ailesinin analiz etmenizi istediği DMD geni, elde edilen DNA örneklerinin her birindeki binlerce genden yalnızca biriydi. Bu nedenle, çalışmak üzere bu belirli genden yeterince yararlanmak için analistler, PCR (kısa polimeraz zincirleme reaksiyonu) DMD genini içeren DNA'nın küçük bölümünü büyütmek (birçok kopyasını yapmak).

Daha sonra numuneler, hangilerinin yalnızca DMD alelinin vahşi tip kopyalarını (normal fenotip) içerdiğini, hangilerinin sadece mutant DMD alelinin kopyalarını içerdiğini ve hangilerinin her iki DMD alelinin kopyalarını içerdiğini belirlemek için analiz edilir.

Bu hastalığa neden olan mutasyonlar, DMD geninden DNA'nın bir kısmının silinmesini içerir., böylece mutant aleller vahşi tip alellerden daha kısa olacaktır. Şemada gösterildiği gibi, bu, muhtemelen DMD taşıyıcısı olan Mary'nin DMD lokusunda bir normal ve bir kısa (mutant) alele sahip olduğu anlamına gelir. John, erkek olduğu için sadece bir X kromozomuna sahip olduğundan ve DMD'ye sahip olmadığından, onun DMD aleli normal uzunlukta olmalıdır. Daniel'de DMD bozukluğu varsa, annesinden kusurlu DMD geni olan X kromozomunu almış olmalıdır.

Şimdi soru şu ki, aile üyelerinin hangi DMD alelleri var? Bunu belirlemeye çalışacaksınız.

Uzunlukları farklı olan DNA molekülleri, olarak bilinen bir işlemle ayrılabilir ve analiz edilebilir. jel elektroforezi. Bu yöntem, DNA moleküllerini agaroz adı verilen jel benzeri bir maddeden geçirmek için bir elektrik akımı kullanır. Küçük DNA molekülleri jelde büyüklerden daha hızlı hareket eder ve jelde daha büyük parçalara göre daha uzağa hareket eder.

Genetik danışma laboratuvarının ilgilenilen bir gene (DMD geni) göre aile üyelerinin genotiplerini belirlemek için kullanacağı prosedürü simüle etmek için jel elektroforezi kullanacaksınız. İşiniz, elektroforezin sonunda jeli inceleyerek Smith ailesinin her bir üyesinin hangi alel(ler)e sahip olduğunu belirlemek olacaktır.

LABORATUVAR ÖNCEKİ SORULAR

  1. Duchenne Musküler Distrofi'nin belirtileri nelerdir? Mary'nin amcasının bu hastalığa sahip olması doktor için neden önemlidir?
  2. Mary ve John'u gösteren kalıtım yöntemini ve Mary'nin hastalık için bir taşıyıcı olduğunu varsayarak yavrularında olası dört genotipi bir Punnett karesi kullanarak örnekleyin.
  3. Bir erkek çocuk, hastalığa yakalanmadan DMD taşıyıcısı olabilir mi? Neden veya neden olmasın?
  4. PCR prosedürünün amacı nedir?
  5. Yabani tip alelin, kromozoma göre mutant DMD alelinden nasıl farklı olduğunu açıklayın.
  6. Jel elektroforezi sırasında DNA parçalarının boyutu ile görünümleri arasındaki ilişki nedir?
  7. Duchenne Musküler Distrofi ile ilgili olarak genler ve kromozomlar arasındaki ilişki nedir.

1. Gün – Jelin Ayarlanması

MALZEMELER Her öğrenci grubu için (grup büyüklüğü, ekipman mevcudiyetine göre belirlenecektir):

  • %0.8 agaroz solüsyonu hazırlanır (1.6 g agarozdan 200 ml suya, 500 ml balonda ısıtın, kaynatırken dikkatli olun).
  • 1 jel döküm tepsisi artı maskeleme bandı, 1 veya 2 jel döküm tarak ve su içinde ~50 ml %0,8 agaroz (1. adımda hazırlanmıştır)
  • Jel elektroforez odası ve güç kaynağı
  • 1 10-20 µl mikropipet | 6 boya örneği ve 6 pipet ucu


PROSEDÜR - Jel Dökümlerin Oluşturulması

  1. Jel döküm tepsisinin uçlarını maskeleme bandıyla kapatın. Tarağı döküm tepsisinin bir ucuna yakın bir yere yerleştirin. Tepsiyi, jel katılaşırken rahatsız edilmeyeceği düz bir yüzeye yerleştirin.
  2. Erimiş agaroz çözeltisi içeren bir şişe elde edin. Sıcak ve sıvılaştırılmış olmalı, ancak elle tutulamayacak kadar sıcak olmamalıdır.
  3. Dikkatlice yaklaşık 50 ml dökün. Jel, tarak dişlerinin yüksekliğinin sadece yaklaşık üçte birini kaplamalıdır.
  4. Agaroz katılaşırken döküm tepsisini hareket ettirmeyin veya sarsmayın. Katı hale geldikçe (10-15 dakika), agaroz berraktan bulutluya değişecektir. Agaroz katı hale geldiğinde, tarak ve bandı sağlam bırakarak plastik sargıyla örtün. Döküm tepsisi soğutulacak ve ertesi gün kullanılacaktır.

*2. gün için talimatları okuyun*

2. Gün - Elektroforez

  1. Jel kalıbını, güç kaynağının yanında jel elektroforez odasının kurulduğu alana götürün. Jeli elektroforez haznesine yerleştirin, böylece tarağı içeren uç siyah elektroda doğru.

  2. Hazneyi dikkatlice jelin tüm yüzeyini kaplayacak şekilde musluk suyuyla doldurun, hazneyi doldururken jeli rahatsız etmeyin.

  3. Eğitmeniniz numuneleri jele yüklemek için mikropipetin nasıl kullanılacağını gösterecektir. Her kuyuya hangi örneğin yüklendiğini takip ettiğinizden emin olun.

  4. Odanızdan elektriği çalıştırmak için güç kaynağını açın. Bu, numunelerinizin hareket etmesine neden olacaktır.


DİKKAT: Elektrik çarpması tehlikesi! Güç kaynağı açıkken kutunun içine parmaklarınızı veya başka nesneleri sokmayın.

Elektroforezi yaklaşık 15 dakika çalıştırın, ardından güç kaynağını kapatın ve kabloları ayırın. Hareket eden numunelerin oluşturduğu bantları daha kolay görmek için jel kalıpları çıkarabilirsiniz.

Bantların nasıl göründüğünü gösteren kalıbınızı çizin. Her bir kuyuyu aile üyesinin adıyla etiketlediğinizden emin olun.

Test Sonuçları ve Teşhis

1. Aile üyelerinin her biri için genotipleri ve fenotipleri belirtin

Meryem Ana XNSxNS Peder John XNSY

Daniel ____________________ Alice ____________________

Michael ____________________ Fetüs ____________________

2. Hangi aile üyelerinin DMD alelinden etkilendiğini testin sonuçlarını özetleyin. Bunu, raporunuzu aileye teslim ediyormuşsunuz gibi yazın.

3. Jel elektroforez teknolojisine uygulanan genler ve kromozomlar arasındaki bu ilişki nasıldır? Cevabınızda, yaptığınız testin gen taşıyan bireyleri belirlemede neden işe yaradığını düşünün. Açıklamanızda kapsamlı olun.

KİMYASALLARIN İLERİ HAZIRLANMASI

Malzemeler Şunlardan Alınabilir:

Elektroforez Güç Kaynağı

Jel Elektroforez Odası

Ekstra Tarak-

Ekstra Jel Döküm Tepsisi

Agaroz (toz)

Pipet Uçları

Mikrosantrifüj tüpleri

Sigma Kimya Şirketi

Bromphenol Blue- katalog # B0126

Ksilen Siyanol- katalog # X4126

Ayrıca sipariş verebilirsiniz"JEL YÜKLEME Çözümü" ve Flinn Scientific'ten Bromphenol Blue

1. Grup başına 50 ml olacak şekilde %0.8 agaroz solüsyonu hazırlayın. Aşağıdaki tarif 200 ml (4 grup) içindir:

  • 500 ml'lik bir şişedeki 200 ml suya 1,6 gram agaroz ekleyin.
  • Şişeyi folyo ile kapatın ve sıcak bir plaka üzerinde dikkatlice ısıtın veya plastik sargı ile kapatın ve bir mikrodalga fırında 3-5 dakika dikkatlice ısıtın.
  • Güvenlik Notu: Agaroz solüsyonu aşırı ısınabilir ve ısıtma sırasında taşabilir veya balona dokunulduğunda şiddetli bir şekilde püskürebilir. Sıcak agarozu çok dikkatli tutun, koruyucu gözlük ve kalın eldiven giyin.
  • Şişeyi döndürün ve tüm agarozun çözüldüğünden emin olun.
  • Jeller hemen dökülecekse, dökmeden önce şişeyi yaklaşık 60°C'ye soğutun.
  • Jeller aynı gün içinde dökülecekse, balonu kullanana kadar 60°C'lik bir su banyosunda tutun.
  • Jeller başka bir gün dökülecekse, solüsyonu kapalı ve buzdolabında saklayın. (Birkaç hafta kalır.) Ardından, planlanan kullanımdan çok önce, agarozu bir sıcak plaka üzerinde veya bir mikrodalga fırında tamamen eriyene kadar dikkatlice yeniden ısıtın. Ardından jelleri dökmeden önce yaklaşık 60°C'ye getirin. (bilek iç kısmına değecek kadar serin) Jelleri kendiniz dökecekseniz, bu alıştırma için öğrenci sayfalarında verilen talimatları uygulayınız. Jeller katılaştığında, kurumasını önlemek için her birini plastik sargıya sarın.

2. Bromfenol mavisi ve ksilen siyanol stok çözeltileri hazırlayın. Bu alıştırmada, çeşitli Smith ailesi üyelerinin DNA örneklerini bir çift boya, bromfenol mavisi ve ksilen siyanol ile simüle edeceğiz. Bromfenol mavisi (BB) bir agaroz jelde daha hızlı hareket eder, bu nedenle distrofin (DMD) geninin kısmen silinmiş bir versiyonu olan "kusurlu alel"i temsil etmek için kullanılacaktır. Ksilen siyanol (XC) jel içinde daha yavaş hareket eder ve bu nedenle "normal" distrofin alelini temsil etmek için kullanılacaktır.

Stok çözeltilerini aşağıdaki gibi hazırlayın:

  • İki küçük beher veya şişeyi BB ve XC olarak etiketleyin. Her birine 10 ml deiyonize su ve 1 ml gliserol ekleyin. Karıştırmak için döndürün. Güvenlik Notu: Bazı boyalar kuru haldeyken sağlığınız için tehlikeli olabilir, ancak çözündüklerinde zararsız hale gelirler. Bu nedenle, tüm boyaları çeker ocakta tartın ve çözelti haline gelene kadar bir toz maskesi, gözlük ve eldiven takın.
  • 0.025 gram (25 mg) bromfenol mavisini tartın ve BB kabına ekleyin.
  • 0.025 gram (25 mg) ksilen siyanol tartın ve XC kabına ekleyin.
  • Boyalar tamamen eriyene kadar her iki kabı da dikkatlice karıştırın veya döndürün.

3. Stok boya solüsyonlarından simüle edilmiş Smith ailesi DNA örnekleri hazırlayın. Her grup için A–F harfli altı mikrosantrifüj tüpü kurun. Aşağıdaki tabloda gösterildiği gibi boyaları ekleyin. Daha sonra tüplerin ağzını kapatın ve her bir altılı seti her laboratuvar grubuna dağıtmak üzere bir sandviç poşetine veya başka küçük bir kaba koyun. Deneye başlarken hangi aile üyesinin hangi harfle temsil edildiğini öğrencilere bildirin, ancak tablodaki diğer bilgileri vermeyin.

Tüp Ailesi üyesi Genetik durum Kullanılan boya örneği

Bir Ana Taşıyıcı 25 µl BB ve 25 µl XC

B Baba Normal 50 µl BB

C Daniel Etkilenen 50 µl XC

D Alice Taşıyıcı 25 µl BB ve 25 µl XC

E Michael Normal 50 ul BB

F Fetus Taşıyıcı 25 µl BB ve 25 µl XC

Dan uyarlandı: Tüm Öğrenciler için Modern Genetik

İPUCU: Birçok kolej size elektroforez odaları, güç kaynakları ve mikropipetler gibi malzemeleri ödünç verir.


Agaroz jel Elektroforezi: İlke ve prosedür

Elektroforez, parçacıkların/moleküllerin bir tamponda uzamsal olarak düzgün bir elektrik alanı altında hareketidir.

Yüklü moleküller bir elektrik alanına yerleştirildiğinde, moleküldeki yüke göre +ve veya -ve kutbuna doğru hareket ederler. Moleküllerin göç hızı, elektrik alanının kuvvetine, net yüke, molekülün boyutuna ve şekline ve ayrıca iyonik bağ kuvvetine, viskozitesine ve ortamın (moleküllerin hareket ettiği) sıcaklığına bağlıdır. . Elektroforez moleküler biyoloji ve biyokimyada en yaygın kullanılan tekniktir.

Bu teknikte, bir jel hazırlanır. DNA için agaroz ve protein molekülleri için poliakrilamid. Jel, bir akım taşımak için iyonlar ve pH'ı nispeten sabit bir değerde tutmak için bir miktar tampon sağlamak için bir elektroforez tamponu ile daldırılır.

Elektroforez, çalışma mekanizmasına göre iki kısma ayrılabilir.

Dikey jel elektroforezi:

Yatay Jel elektroforezi:

Şekil :Agaroz jel elektroforez DNA(ImageRef 3)

Temel gereksinimler

Destek, Jel döküm cam levha/tepsiler, elektroforez ünitesi, güç kaynağı, numune

DNA JEL ELEKTROFOREZ

DNA jel elektroforezi ayırma tekniğidir. DNA görselleştirmek ve saflaştırmak için boyut ve yüke (-ve) dayalı. Bu teknikte, -ve yüklü DNA'yı bir agaroz jel matrisi yoluyla pozitif yüklü bir elektrota doğru hareket ettirmek için bir elektrik alanı kullanıyoruz. Bu matriste, daha kısa DNA parçaları, daha büyük parçalardan daha hızlı hareket eder. DNA fragmanlarının uzunluğunun doğru tespiti için, onu bir DNA merdiveni (bilinen uzunluklarda DNA fragmanları) ile agaroz üzerinde çalıştırıyoruz.

İki molekülün/parçanın boyutu benzerse, jel içinde birlikte göç edeceklerdir.

AGAROZ JEL

Agaroz, tekrar eden birimden yapılan doğrusal bir polisakkarittir. agarbiyozalternatif bir galaktoz ve 3,6-anhidrogalaktoz biriminden oluşan. Agaroz deniz yosunundan elde edilir. Elektroforez için agaroz konsantrasyonu %1-3 arasındadır.

Prosedür

Jelin hazırlanması, agaroz tozunun kaynayan tampon çözeltisinde (agarozun uygun şekilde karıştırılması için) çözülmesiyle yapılır. Jelin gözenek boyutu, agaroz konsantrasyonu ile ters orantılıdır. Daha sonra çözelti yakl. 55 °C Daha sonra döküm tepsisine dökülür. Jeldeki kuyuları oluşturmak için bir com eklenir ve daha sonra jel katılaştıktan sonra tarak çıkarılır.

Jel katılaştıktan sonra, +ve ve -ve elektrot içeren tamponla doldurulmuş bir elektroforez ünitesine yerleştirilir. Elektroforez odasının 1/3'ünde muhafaza edilen tamponun hacmi.

Numunenin Hazırlanması ve Yükleme

Numunenin hazırlanması için numune ile yükleme boyaları karıştırılır. Yükleme boyası 6X kons. (%0.25 bromofenol mavisi, %30 gliserol ve %0.25 ksilen siyanol). DNA bantlarının görselleştirilmesi için bu teknikte en yaygın olarak kullanılan boyalar Ethidium bromür veya metilen mavisi içerir.

Not: Etidyum bromür, dikkatle kullanılması ve yönergelere göre atılması gereken bir mutajendir.

Numuneler hazırlandıktan sonra numuneler hazırlanan jelin kuyularına yüklenir. Ve elektrotlar güç kaynağına bağlanır. Genellikle deney için 70-80V DC şarj sağlanır. Ardından DNA parçalarını + ve şarja doğru çalıştırması için bırakın.

Not: Jeli her zaman kuyular -ve elektrotuna yerleştirilecek şekilde elektroforez odasına yerleştirin.

Fragmanların Görselleştirilmesi

Deneyin tamamlanmasından sonra güç kaynağını kapatın ve haznenin kapağını çıkarın. Jeli hazneden alın ve fazla tamponu boşaltın. UV ışığı altında görselleştirmek için jeli jel doktora götürün.

DNA fragmanlarının hareketliliğini etkileyen faktör:

  1. Agaroz konsantrasyonu: Daha yüksek agaroz konsantrasyonları küçük DNA'ların ayrılmasını kolaylaştırırken, düşük agaroz konsantrasyonları daha büyük DNA'ların çözülmesine izin verir.
  2. Voltaj: Daha yüksek voltajda parçalar normalden daha hızlı hareket edebilir ve daha düşük voltajda parçanın hareketleri yavaşlar.
  3. Elektroforez tamponu: Elektroforez için çalıştırma tamponu olarak en yaygın olarak TAE(40mM tris asetat, 1mM EDTA) ve TBE(45mM tris borat, 1mM EDTA) kullanılır.

DNA fragmanlar, iyonik güçteki farklılıklar nedeniyle her iki tamponda da farklı şekilde hareket eder.


Jel elektroforezi

Jel elektroforezi, DNA'yı alıp içinden elektrik yükü geçirdiğimiz süreçtir, bu nedenle iki DNA örneğini karşılaştırmak için kullanabiliriz, dolayısıyla DNA parmak izi adı verilir.

Açıklama:

Jel elektroforezi temel olarak DNA'yı aldığımız ve içinden elektrik yükü geçirdiğimiz süreçtir. Varsayılan olarak negatif yüklü olan DNA, pozitif tarafa doğru hareket edecektir. Bu olurken, daha düşük yoğunluğa sahip DNA daha az mesafe kat edecektir. Bu, çok benzersiz bir DNA modeli yaratabilir.

Şimdi bunu başka bir DNA örneğine yapabilir ve bilinen örneğin frekanslarıyla eşleştirebilirsiniz. Eğer aynılarsa, büyük ihtimalle aynı kaynaktan gelmişlerdir. buna denir DNA parmak izi. Bu çoğunlukla suç mahallinde bulunan DNA'nın şüphelilerden alınan DNA ile karşılaştırıldığı suç soruşturmasında kullanılır.

Jel yapmaz, DNA örneğine yerleştirmeden önce bir boya eklersiniz ve jel, boyayı aktive eden bir kimyasalla (örn: etidyum bromür) işlendikten sonra UV ışığı altında bir miktar boya görülebilir.

Cevap:

Jel elektroforezi, DNA parçalarını ve RNA ve proteinler gibi diğer makromolekülleri boyutlarına ve yüklerine göre ayırmak için kullanılan bir biyotekniktir.

Açıklama:

Ayrılacak moleküller, küçük gözenekler içeren bir jel boyunca bir elektrik alanı tarafından itilir. Moleküller jeldeki bu gözeneklerden ters orantılı bir hızda hareket eder. Bu, küçük bir molekülün jelde daha büyük bir moleküle göre daha büyük bir mesafe kat edeceği anlamına gelir. Jelin bir ucu pozitif, diğer ucu negatif yüklüdür.

Yapısal olarak, DNA ve RNA negatif yüklü moleküllerdir, bu nedenle jelin pozitif yüklü ucuna doğru çekilirler. Proteinler söz konusu olduğunda, bunlar tamamen negatif yüklü değildir, bu nedenle ilk proteinler sodyum dodesil sülfat adı verilen bir anyonik deterjanla karıştırılır. Bu işlem, proteinlerin lineer bir şekle dönüşmesini sağlar ve onları jelin pozitif ucuna doğru hareket etmelerine ve ayrılmalarına izin veren negatif bir yükle kaplar.

Jel elektroforezinin adımları:

Jel elektroforezi ile DNA, RNA ve protein molekülleri ayrıştırıldığında UV aydınlatıcı ile farklı büyüklükteki bantlar tespit edilebilir.


Videoyu izle: เจลอเลกโตรโฟรซส วทยาศาสตร ชวะ (Mayıs Ayı 2022).