Bilgi

Akış sitometrisi için kalp dokusundan tek hücre süspansiyonu hazırlamak için hangi enzimleri kullanmalıyım?

Akış sitometrisi için kalp dokusundan tek hücre süspansiyonu hazırlamak için hangi enzimleri kullanmalıyım?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Kalp dokusundan tek hücre süspansiyonu hazırlamak için hangi enzimleri kullanacağımı öneren var mı? Hem hücre yüzeyine hem de kardiyomiyositleri ve fibroblastları içeren hücre içi antijenlere bakacağım.


Dış zar vezikül bazlı ilaç akış mekanizması kullanılarak yeni nanoantibiyotiklerin geliştirilmesi

Bakteriler, yüksek akış pompası ekspresyonu ve OMV sekresyonu yoluyla büyük miktarlarda antibiyotik yüklü veziküller salgılar.

OMV'ler antibiyotikleri etkili bir şekilde yükler ve antibiyotik stabilitesini artırır.

Antibiyotik yüklü OMV, ilaç salınımı ve bakteri istilası yoluyla pasif ve aktif bakterisidal etkiler gösterir.

Antibiyotik yüklü OMV'ler mükemmel biyouyumluluğa sahiptir.

Antibiyotik yüklü OMV'ler, oral uygulama ile bağırsak bakteriyel enfeksiyonlarına karşı etkili bir şekilde koruma sağlayabilir.


Soyut

Kalp hastalıkları dünya çapında başlıca ölüm nedenlerinden biridir. Bilim adamları için en büyük zorluk, bu tür rahatsızlıklar için yeni tedavi yöntemleri geliştirmektir. Kök hücre (SC'ler) tedavisi, kalp hücrelerinin yenilenmesi ve kalp hastalıklarının tedavisi için kullanılan umut verici bir teknik olabilir. Geleneksel laboratuvar ortamında kalp rejenerasyonunun araştırılması için kullanılan teknikler, doğal kalp fizyolojisini taklit etmez. Çip üzerinde laboratuvar sistemleri, bir kalp kası modelinin oluşturulmasına izin verebilecek ve buna benzer koşullarda kalp hücrelerinin büyümesini sağlayan bir çözüm olabilir. canlıda koşullar. Mikrosistemler, kök hücrelerin kalp hücrelerine farklılaşması için de başarıyla kullanılabilir. Bu hücrelerin çoğalma ve yenilenme yeteneklerinin daha iyi anlaşılmasına yardımcı olacaktır. Bu derlemede sunduğumuz çip üzerinde kalp kardiyak hücre kültürü ve kök hücre biyolojisine dayalı sistemler. Bu derleme, fizyolojik ortamın ve kalbin işlevlerinin tanımlanmasıyla başlamaktadır. Daha sonra, kök hücrelerin kalp hücrelerine farklılaşmasının geleneksel tekniklerini kısaca tanımladık. Bu inceleme çoğunlukla tanımlamaya odaklanmıştır. Çip üzerinde laboratuvar kardiyak doku mühendisliği için sistemler. Bu nedenle, bu makalenin sonraki bölümünde, hem kardiyak hücre kültürü hem de SC'lerin kardiyak hücrelere farklılaşması için mikrosistemler açıklanmaktadır. SC'lerin kalp hücrelerine farklılaşmasıyla ilgili bölüm, biyokimyasal, fiziksel ve mekanik uyarıları açıklayan bölümlere ayrılmıştır. Son olarak, mevcut zorlukların ve gelecekteki araştırmaların ana hatlarını çiziyoruz. çip üzerinde kalp kök hücre biyolojisine dayalıdır.


2.4 Araştırma ve Tıpta Uygulamalar:

Akış sitometrisinin kombinasyonu SMDC verimli sağlar yeni strateji için standartlaştırılmış laboratuvarlar arası ifadesi hastalık teşhisi, hastalık prognozu kontrolü için de terapötik etkinlik içinde klinik ilaç kullanarak hücre biyokimyasal birlikte klinik kimya veya diğeri klinik parametreler. Bu yaklaşımın pratik uygulaması için çabalar devam etmektedir; içinde AB tarafından finanse edilen Avrupa Klinik Hücre Analizi Çalışma Grubu (EWGCCA).


Murin Kardiyak Perisitlerinin İzolasyonu ve Saflaştırılması

Biyoloji ve terapötik potansiyellerinin temel araştırma ve araştırılması için murin kardiyak perisitlerini izole etmek ve saflaştırmak için bir protokolü optimize ettik.

Protokolümüz fare modeli için optimize edilmiştir ve tüm araştırmacıların kolayca kullanabileceği malzemeleri kullanır. Bu teknik, sağlıklı, hastalıklı veya genetiği değiştirilmiş fare modellerine uygulanabilir. Protokolümüz, araştırmacıların, herhangi bir fare hastalık veya genetik varyasyon modelinden kardiyak perisit biyolojisi hakkında herhangi bir soruyu yanıtlamasına olanak sağlayacaktır.

Bu prosedür, kardiyak perisit biyolojisi hakkında bilgi sağlayacak ve hem sağlıkta hem de hastalıkta kardiyak homeostaza ve hemodinamiğe katkılarını anlamamıza yardımcı olacaktır. Anestezi uygulanmış fareyi sırtüstü pozisyonda yerleştirin ve ön ayaklarını bantlayın. Göğüs boşluğunu dikkatlice açın ve 25 gauge kelebek iğne kullanarak inen aorta kanüle edin.

Sağ atriyumda bir çentik yapın. Ardından, değişken akışlı bir peristaltik pompa ile kalbi dakikada iki mililitrede en az 20 mililitre mililitrede 250 birim heparinize, kalsiyum-magnezyum içermeyen Dulbecco'nun fosfat tamponlu salini ile perfüze edin. Sağ kulakçıktan temiz PBS çıktığında perfüzyon tamamlanmıştır.

Kalbi aorttan kesin ve buz gibi kalsiyum-magnezyum içermeyen DPBS'ye yerleştirin. Ardından kalbi 15'e 15 santimetrelik bir Petri kabına aktarın. Yaylı makas ve parçaları kaplayacak kadar enzim solüsyonuyla ince uçlu pens kullanarak kalbi küçük parçalara ayırın.

Şimdi parçaları ve solüsyonu 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve parafin plastik filmle kapatın. 75 dakika boyunca 120 rpm'de bir orbital çalkalayıcı üzerinde 37 santigrat derecede inkübe edin. Enzim solüsyonuyla kolajenaz sindiriminden sonra, sıvıyı 100 mikronluk hücre süzgecinden 50 mililitrelik yeni bir tüpe boşaltın ve parçaların kurumaması için yeterli solüsyon bırakın.

İnce uçlu forseps kullanarak dokuyu tüpten alın ve birkaç parçayı bir mikroskop lamı üzerine yerleştirin. Ardından, dokuyu parçalamak için dokuyu iki mikroskop lamı arasında öğütün. Slaytları enzimsiz kültür ortamıyla yeni bir 50 mililitrelik konik tüpe durulayın.

Tüm doku parçaları ayrışana kadar bu adımı tekrarlayın. Süzülmüş çözeltiyi ve öğütülmüş dokuyu bir tüpte birleştirin. Elde edilen süspansiyonu 100 mikronluk bir hücre süzgecinden yeni bir 50 mililitrelik konik tüpe süzün.

Numuneyi 220 kez g ve dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin. Önceki çözeltiyi aspire edin ve DPBS ve sığır serum albümini içeren soğuk FACS boyama tamponunda hücre peletini nazikçe yeniden süspanse edin. Hücreleri sayın ve bir hücre sayacı kullanarak canlılığı kontrol edin.

DPBS ve sığır serum albümini içeren soğuk FACS boyama tamponu ile hücreleri mililitrede bir milyon hücreye seyreltin. Hücreler artık lekelenmeye ve sıralanmaya hazırdır. Tüm kontroller ve hücre numuneleri için beş mililitrelik FACS tüplerini hazırlayın ve etiketleyin.

Boyanmamış bir numune, floresan eksi bir kontrol ve izotip uyumlu kontroller için tüp başına bir mililitre hücre alikuotlayın. Sıralama için kalan hücreleri kullanın. Tüm kontroller ve numuneler aynı anda hazırlanabilir ve boyanabilir.

Ayrıca beş mililitrelik FACS tüplerini toplam dokuz kompanzasyon kontrolü, iki çeşit boyanmamış boncuk ve işaret panelinden yedi farklı florokrom için hazırlayın ve etiketleyin. Floresan kompanzasyon kontrollerini optimize etmek için, her tüpe sıkma flakonundan bir damla kompanzasyon boncuk ekleyin. Ardından, boncuklara bir mikrolitre antikor ekleyin.

İşaret panelinden her antikor için tekrarlayın. Spektral örtüşme nedeniyle arka plan boyamasını optimize etmek için FMO kontrollerini kullanın. FMO kontrol tüplerindeki hücrelere, işaret panelindeki tüm antikorları bire 100 dilüsyonda ekleyin, ancak bir antikoru hariç tutun.

Toplam yedi kontrol için her antikor için tekrarlayın. Spesifik olmayan boyama için izotip uyumlu kontrol antikorları kullanın. İzotip uyumlu etiketli tüplerdeki hücrelere, bir ila 100 dilüsyonda izotip uyumlu kontrol antikoru ekleyin.

Ardından, sıralanacak hücreleri hazırlayın. Taze izole edilmiş hücrelere, bir ila 100 dilüsyonda bir antikor kokteyli ekleyin. Ayrıca, bire 1.000 seyreltmede hücre canlılığı boyası ekleyin.

Darbe vorteksleme ile kompanzasyon kontrollerini kuvvetlice karıştırın. Işıktan korunarak oda sıcaklığında bırakılabilen hücre canlılığı boncukları hariç, ışıktan korunarak dört santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. FMO kontrollerini, izotip uyumlu kontrolleri ve darbe vorteksleme ile sıralanacak hücreleri nazikçe karıştırın.

Işıktan koruyarak dört santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Her bir kompanzasyon kontrolüne, FMO kontrolüne ve izotip kontrolüne üç mililitre FACS boyama tamponu ekleyin. Tüpleri dört santigrat derecede beş dakika boyunca 300 kez g'de santrifüjleyin.

Çözeltiyi aspire edin ve her peleti 400 mikrolitre FACS boyama tamponunda yeniden süspanse edin. Telafi kontrolleri, FMO kontrolleri ve izotip kontrolleri artık kullanılmaya hazırdır. Boyamanın ardından hücreleri, dört santigrat derecede beş dakika boyunca 300 kez g'de santrifüjleyerek FACS boyama tamponu ile yıkayın.

Çözeltiyi aspire edin ve hücre peletini FACS boyama tamponunda mililitrede 0,5 milyon hücre olacak şekilde yeniden süspanse edin. 35 mikron filtre üstlerine sahip yeni FACS tüplerini kullanarak, tek hücreli süspansiyonlar elde etmek için lekeli hücre örneklerini kapaklara pipetleyin ve yerçekimi ile süzün. Buz üzerinde tutun.

Hücreleri arındırmak için bir hücre sıralayıcı kullanın. Voltajları ayarlamak ve arka plan sinyalini düzeltmek için hücre sıralayıcıdaki boyanmamış hücreleri çalıştırın. Her kanal için voltajları ayarlamak ve kapıları pozitif sinyal için ayarlamak için her bir tek renkli telafi boncuk örneğini birer birer çalıştırın.

Verileri toplayın. Telafi matrisini hesaplayarak spektral örtüşmeyi hesaplamak için yazılımı kullanın. Tüm voltajlar hazır ve ayarlanmış.

Her izotip denetimini birer birer çalıştırın. Bu veriler, varsa, spesifik olmayan bağlama için kapıları ayarlamak için kullanılabilir. Her FMO örneğini birer birer çalıştırın.

Çok renkli bir panel nedeniyle spektral geçişi düzeltmek için her kanal için voltajları ayarlayın. Hücre sıralayıcıda lekeli hücre örneklerini çalıştırın. 15 mililitrelik bir konik toplama tüpünde 10 mililitre enzim içermeyen kültür ortamında hücreleri toplayın.

Aşağıdaki geçit stratejisini kullanın. İlk olarak, tek hücreler için kapı. Ardından, canlı hücreler için kapı.

Ardından, CD45-negatif hücreler için kapı. CD34 ve CD31-negatif hücreler için kapı. Ardından, NG2-pozitif hücreler için kapı.

Ve son olarak, CD146 ve CD140b-pozitif hücreler için kapı. Perisitleri kültürlemek için, kaplanmış 24 oyuklu bir plaka üzerinde enzim içermeyen kültür ortamında taze elde edilen hücreleri tohumlayın. Hücreleri 37 santigrat dereceye, %5 karbon dioksit ve %95 oksijene ayarlanmış bir hücre kuluçka makinesinde kültürleyin.

Tüm kalbin enzimatik sindirimi ve ayrışmasından sonra ve hücrelerin FACS ile saflaştırılmasından önce hücreler, kalpten birçok farklı hücre tipini içeren ham bir karışımdır. FACS saflaştırma ve kültürlemeden sonra hücreler homojendir. Tek çekirdekli, oldukça düzdürler ve tipik perisit eşkenar dörtgen morfolojisine sahiptirler.

FACS kullanılarak hücreler homojen hale getirilmek üzere saflaştırılır. İlk olarak, ileri ve yan saçılma dağılımlarına dayalı olarak enkaz ve çiftler kapatıldı. Daha sonra, canlı hücrelerden daha büyük ve daha yoğun bir sinyal üreten boya ile amin reaksiyonu nedeniyle ölü hücreler dışarı atıldı.

Canlı hücrelerden hematopoietik hücreler CD45-pozitif olarak kapı dışarı edildi. Hematopoietik ve endotelyal hücreleri daha da uzaklaştırmak için CD34-pozitif ve CD31-pozitif hücreler kapı dışarı edildi. Son olarak, NG2-pozitif ve CD140b/CD146-pozitif hücreler, tipik perisit belirteçlerinin ekspresyonuna sahip perivasküler hücreler olarak seçilmiştir.

İnsan beyni perisitleri ile karşılaştırıldığında, hücreler benzer bir morfolojiye sahipti. Fare ve insan düz kas hücreleri ile karşılaştırıldığında, hücreler farklı bir morfolojiye sahipti. Yedinci pasajda perisit belirteçleri için immünositokimya ile hücrelerin fenotipik karakterizasyonu, morfoloji veya belirteç ifadesinde gözlenen hiçbir değişiklik göstermedi. Benzer şekilde, yedinci pasajdaki perisitlerin akış sitometrisi ile yapılan analiz, popülasyonun homojen kaldığını doğruladı.

Hücre canlılığı, iyi bir verim elde etmek için çok önemlidir. Tedarik sırasında dokuyu soğuk tutun ve hücre boyaması sırasında hücreleri soğuk tutun. Ayrıca enzimatik solüsyonun her seferinde taze olarak hazırlandığından emin olun.

Kültürleme sonrası doğru hücrelerin izolasyonunu sağlamak için, bunları akış sitometrisi ve immünofloresan boyama ile karakterize edin. Bu hücreler, fonksiyonel bariyer çalışmaları için endotel hücreleri ile birlikte kültür deneylerinde ve biyolojik ve fizyolojik fonksiyonlarını ve özelliklerini incelemek için tahlillerde kullanılabilir. Kardiyak perisitler, vasküler bütünlük ve stabilitede temel bir rol oynar ve bunların disfonksiyonu, global kardiyak fonksiyonun sonucudur.

Tekniğimizle araştırmacılar, kardiyak perisitlerin terapötik potansiyelini keşfedebilirler.


Soyut

Gerekçe:

Miyokard enfarktüsünden (MI) sonraki optimal sonuç, hem enkaz gidermenin hem de miyokardiyal hücre dışı matrisin onarımının önemli bir rol oynadığı koordineli bir iyileşme yanıtına bağlıdır. Bununla birlikte, olumsuz yeniden şekillenme ve aşırı inflamasyon, kalp yetmezliğini destekleyebilir, lökositleri merkezi kahramanlar ve doku onarımında ve MI sonrası yara iyileşmesinde potansiyel terapötik hedefler olarak konumlandırabilir.

Amaç:

Bu çalışmada, miyeloid hücreler-1(TREM-1) üzerinde eksprese edilen tetikleyici reseptörün MI'yı takip eden inflamatuar yanıtı düzenlemedeki rolünü inceledik. Nötrofiller ve olgun monositler tarafından ifade edilen TREM-1, doğuştan gelen bağışıklık tepkisinin bir yükselticisidir.

Yöntemler ve Sonuçlar:

Enfarktüsten sonra, farelerde ve insanlarda iskemik miyokardda TREM-1 ekspresyonu yukarı doğru düzenlenir. Sentetik bir peptit (LR12) kullanılarak Trem-1 genetik geçersizliği veya farmakolojik inhibisyon, miyokardiyal inflamasyonu azaltır, nötrofil alımını ve monosit kemoatraktan protein-1 üretimini sınırlar, böylece klasik monositlerin kalbe mobilizasyonunu azaltır. Ayrıca farelerde sol ventrikül fonksiyonunu ve sağkalımı iyileştirir (grup başına n=20-22). Hem kalıcı hem de geçici miyokard iskemisi sırasında, Trem-1 blokajı ayrıca kardiyak fonksiyonu iyileştirir ve florodeoksiglukoz-pozitron emisyon tomografik görüntüleme ve iletkenlik kateteri çalışmaları ile değerlendirildiği üzere ventriküler yeniden şekillenmeyi sınırlar (grup başına n=9-18). TREM-1 aktivasyonunun bir belirteci olan çözünür TREM-1 formu (sTREM-1), akut MI (n=1015) olan hastaların plazmasında saptanabilir ve konsantrasyonu, ölümün bağımsız bir öngördürücüsüdür.

Sonuçlar:

Bu veriler, TREM-1'in akut MI sırasında yeni bir terapötik hedef oluşturabileceğini düşündürmektedir.

Tanıtım

Akut miyokardiyal iskemi, sitokin ve kemokin üretimine 1,2 ve enfarktüslü alanda nötrofillerin ve mononükleer hücrelerin toplanmasına yol açan bağışıklık sisteminin yoğun bir aktivasyonunu indükler. 3,4 Erken proinflamatuar sinyaller, yaralanmaya yanıta aracılık etmede, ölü kardiyak miyositlerin temizlenmesini düzenlemede ve yara iyileşmesi için gerekli hücresel olayları başlatmada çok önemlidir. Bununla birlikte, optimal iyileşme, sitokin ve kemokin sentezini baskılayan ve inflamatuar infiltratın çözülmesine aracılık eden inhibitör mekanizmaların aktivasyonunu gerektirir. 5

Bu nedenle, inflamatuar yanıt amplifikasyonunun sınırlandırılması, yaralanmanın kontrol altına alınması ve optimal enfarktüs iyileşmesi için önemli görünmektedir. Miyeloid hücreler-1 (TREM-1) üzerinde eksprese edilen tetikleyici reseptör, doğal immün yanıtın bir yükselticisi olarak görev yapan nötrofiller, makrofajlar ve olgun monositler tarafından eksprese edilen bir immün reseptördür. 6 Kısa inhibitör peptitler veya füzyon proteini tarafından TREM-1 aktivasyonunun bloke edilmesinin, çeşitli şiddetli enfeksiyon modellerinde aşırı tepki ve ölümden korunduğu gösterilmiştir. 7-12 TREM-1 aracılı immün yanıtı hedeflemenin akut miyokard enfarktüsünde (MI) faydalı olup olmayacağı hala bilinmemektedir.

Bu çalışmada, MI'yı takip eden inflamatuar yanıtı düzenlemede TREM-1'in rolünü inceledik. Trem-1 genetik geçersizliğinin veya farmakolojik inhibisyonunun miyokardiyal inflamasyonu azalttığını, lökosit alımını sınırladığını ve kalp fonksiyonunu iyileştirdiğini gösteriyoruz. Ayrıca, TREM-1'in (sTREM-1) çözünür formu, akut MI olan hastaların plazmasında bulunur ve konsantrasyonu, ölümün bağımsız bir öngördürücüsüdür.

Yöntemler

Hayvanlar

Trem-1, bez-1 nakavt yetişkin erkek C57BL/6 (6-8 hafta) ve vahşi tip yavrular ve ayrıca yetişkin erkek Wistar sıçanları (Charles River, Lyon, Fransa) kullanıldı. Trem-1 -/- fareleri yakın zamanda Weber ve diğerleri tarafından ayrıntılı olarak tarif edilmiştir. 11 deney, kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulumuz tarafından onaylandı.

Cerrahi işlemler

MI, daha önce tarif edildiği gibi kalıcı koroner ligasyon ile farelerde indüklendi. 10 Kısaca, farelere izofluran (%2/2L O) ile anestezi uygulandı.2/dk), entübe edildi ve Inspira Advanced Safety Tek Hayvanlı Basınç/Hacim Kontrollü Ventilatör (Harvard Aparatı) ile ventile edildi. Göğüs duvarı traş edildi ve sol dördüncü interkostal aralıkta sol torakotomi yapıldı. Sol ventrikül (LV) görüntülendi ve sol koroner arter, sol atriyumun altından çıktığı yere monofilament naylon 8-0 sütürlerle (Ethicon) kalıcı olarak bağlandı. Göğüs duvarı 7-0 naylon dikişlerle, cilt 6-0 naylon dikişlerle kapatıldı. Sıçanlarda kalıcı koroner arter ligasyonu için benzer bir prosedür uygulandı. Sıçanlarda geçici (1 saat) koroner arter ligasyonu yoluyla iskemi-reperfüzyon modeli elde edildi. Sahte ameliyatlı kontrol fareleri, bağın çözülmemiş bırakılması dışında aynı müdahaleye tabi tutuldu.

TREM-1 İnhibitör Peptit

LR12 (LQEEDAGEYGCM) ve LR12-scramble (etkin olmayan kontrol peptididir) COOH terminal olarak amidlenmiş peptidler olarak kimyasal olarak sentezlendi (Pepscan Presto BV, Lelystad, Hollanda). Doğru peptitler >%99 verimle elde edildi ve kütle spektrometrisi ve analitik ters fazlı yüksek performanslı sıvı kromatografisi ile onaylandığı gibi hazırlayıcı saflaştırmadan sonra homojendi. Bu peptitler endotoksin içermiyordu.

Hayvanlar, 5 gün boyunca günde bir kez intraperitoneal olarak 5 mg/kg LR12 veya LR12-karıştırılabilir peptidler almak üzere koroner ligasyondan 2 saat sonra kör olarak randomize edildi.

Histoloji

LV'ler apeksten tabana enine dilimler halinde kesildi ve immünohistokimya için optimal kesme sıcaklığı bileşiğine (Tissue-Tek) gömüldü. Miyeloperoksidaz, CD68 veya CD163'e (Serotec) bir sıçan monoklonal antikoru (mAb) veya TREM-1'e (katalog numarası AF1278, R&D Systems) bir keçi poliklonal antikoru ile 5 um kalınlığında kesitler boyadık. Polimorfonükleer hücreleri, tipik bir çok çekirdekli morfolojiye sahip MPO + hücreleri ve monositleri ve makrofajları CD68 + /CD163 + tek çekirdekli hücreler olarak tanımladık. Fare MMP9'a (katalog numarası AF911, R&D Systems) karşı bir keçi antikoru ile matris metalloproteinaz 9'u (MMP9) tespit ettik. MI sonrası kardiyak iyileşme 1., 14. ve 42. günlerde değerlendirildi. Kalpler çıkarıldı, fosfat tamponlu salin içinde durulandı ve sıvı nitrojen içinde donduruldu. Kalpler bir kriyostat (CM 3050S Leica) ile 7 um kalınlığında kesitler halinde kesildi. Enfarktüs boyutu ve miyokardiyal fibrozis değerlendirmesi için Masson's Trichrome ve Sirius Red boyamaları yapıldı.

Akış Sitometrisi

Enfarktüslü dokulardan tek hücreli süspansiyonlar hazırlamak için kalpler, bir kolajenaz I, kolajenaz XI, DNase I ve hiyalüronidaz (Sigma-Aldrich) kokteyli içine yerleştirilmiş ince makaslarla kıyılmış ve 37°C'de 1 saat çalkalanmıştır. Hücreler daha sonra toz haline getirildi ve santrifüjlendi (15 dakika, 500g, 4°C).

Dalaklar çıkarıldı, 3 mL'lik bir şırınganın ucuyla 4°C'de Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) içinde ezildi ve 70 um naylon filtrelerden (BD) süzüldü. Hücre süspansiyonu, 300°C'de santrifüjlendi.G 4°C'de 10 dakika. Kırmızı kan hücreleri parçalandı (Kırmızı Kan Hücreleri Lizis solüsyonu Miltenyi) ve splenositler HBSS ile yıkandı ve %0.2 (ağırlık/hacim) sığır serum albümini ile takviye edilmiş HBSS içinde yeniden süspanse edildi. Antikoagülan olarak sitrat solüsyonu ile kardiyak ponksiyon yoluyla periferik kan alındı ​​ve kırmızı kan hücreleri parçalandı. Son olarak, femurlardan 1 mL HBSS ile yıkandıktan, 70 um naylon filtrelerden süzüldükten ve 300°C'de santrifüjlendikten sonra kemik iliği tek hücreli süspansiyonları elde edildi.G 4°C'de 10 dakika. Toplam canlı hücre sayıları, Trypan blue (BioRad) ile bir hemasitometre kullanılarak alikuotlardan belirlendi.

Hücre süspansiyonları, CD4+ veya CD8+ T hücrelerine (CD4- veya CD8-APC, CD3ε-PE, CD45-FITC), B hücrelerine (CD19-PE, CD45-FITC), granülositlere (CD11b-) karşı bir mAb kokteyli içinde inkübe edildi. PB, CD45-PerCP, Ly-6G-PE) ve monosit alt kümeleri (Ly-6C-FITC, F4/80-APC), tümü Miltenyi Biotech'ten antikorlar. Raporlanan hücre sayıları, toplam canlı hücrelerin (mL başına toplam canlı lökositler) ve seçilen geçit içindeki hücre yüzdesinin çarpımı olarak hesaplandı ve mg doku (kalp), organ (femur ve dalak) veya mL (kan) başına rapor edildi. ). Veriler FACScalibur sitometresinde (BD) elde edildi.

Protein Fosforilasyon Analizi

İzole miyokardiyal hücreler PhosphoSafe Ekstraksiyon Reaktifinde (Novagen Merck Biosciences, Nottingham, Birleşik Krallık) parçalandı ve 5 dakika 16 000'de santrifüjlendi.G süpernatantı toplamak için 4°C'de. Protein konsantrasyonu belirlendi (BCA Protein Assay Kit, Pierce ThermoScientific, Brebières, Fransa). Daha sonra lizatlar, antifosfo-p38, antipERK1/ 2, antipGSK3β, anti-iNOS ve yaban turpu peroksidazına (Cell Signaling Ozyme, Saint-Quentin en Yvelines, Fransa) ve SuperSignal West Femto Substrate (Pierce ThermoScientific) konjuge edilmiş karşılık gelen ikincil antikor. Normalizasyon için fosforile edilmemiş formlar veya tübülin (Hücre Sinyali) kullanıldı. Toplama ve nicel sinyal yoğunluğu analizleri, bir LAS-4000 görüntüleyici (FSVT, Courbevoie, Fransa) ve Multi-Gauge yazılımı (LifeScience Fujifilm, Fransa) tarafından gerçekleştirilmiştir.

Kantitatif Ters Transkriptaz-Polimeraz Zincir Reaksiyonu

Toplam RNA'lar, RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen, Courtaboeuf, Fransa) kullanılarak miyokarddan (enfarktüslü veya uzak alanlar) ekstrakte edildi ve iScript cDNA sentez kiti (BioRad) kullanılarak retrotranskript edilmeden ve nicel polimeraz zincir reaksiyonu ile nicelleştirilmeden önce NanoDrop (ThermoScientific) ile ölçüldü. (PCR) için Qiagen mevcut probları (Quantitect Primer) kullanarak Trem-1, il-6, Tnf-α, Timp1, Mmp9, ve ActB. ActB temizlik geni olarak görev yapar. Alternatif olarak, toplam RNA'lar, PCR dizileri (Mouse Innate Immune/Endotelial Cells RT° Profiler PCR Arrays SABiosciences) için RT° First Strand Kit (SABiosciences, Tebu-bio, Le Perray-en-Yvelines, Fransa) ile retrotranskript edildi. Tüm PCR'ler, bir MyiQ Thermal Cycler'da gerçekleştirildi ve iQ5 yazılımı (Qiagen) ile ölçüldü. PCR dizisi sonuçları, PCR Dizi Veri Analiz Yazılımı (SABiosciences) kullanılarak analiz edildi ve 5 temizlik geni ile normalleştirildi.

Sitokin konsantrasyonu ölçümleri, enzime bağlı immünosorbent deneyi (fare Quantikine ELISA Kitleri R&D Systems) ve sitokin paneli deneyleri (Proteome Profiler Mouse Cytokine Array Kit R&D Systems) kullanılarak yapıldı.

Jel içi zimografi ve jelatinaz aktivite tahlili, daha önce tarif edildiği gibi yapıldı. 13

Ekokardiyografik Ölçümler

Transtorasik ekokardiyografi, anestezi uygulanmış farelerde (izofluran inhalasyonu) ameliyattan 14 ve 42 gün sonra, 14 MHz lineer transdüksiyonlu bir ekokardiyograf (ACUSON S3000 Siemens AG, Erlangen, Almanya) kullanılarak yapıldı. Araştırmacı (P.B.) grup atamasına karşı kördü. Diyastol sonu ve sistol sonunda LV iç çapının, interventriküler septal duvar kalınlığının ve arka kalınlığın rehberli M-mod ölçümleri için LV'nin iki boyutlu parasternal uzun eksen görüntüleri elde edildi. Yüzde fraksiyonel kısalma şu şekilde hesaplandı: fraksiyonel kısalma yüzdesi=[(diyastol sonu LV çapı – sistol sonu LV çapı)/diastol sonu LV çapı]×100.

Florodeoksiglukoz-Pozitron Emisyon Tomografik Görüntüleme

Acipimox (50 mg/kg) ile metabolik bir premedikasyondan sonra, kısa bir anestezi altında (izofluran inhalasyonunun %1.5-2.5'i) ≈70 MBq 18F-florodeoksiglukoz intravenöz olarak enjekte edildi. Altmış dakika sonra, özel bir küçük hayvan PET sistemi (Inveon, Siemens, Knoxville, TN) kullanılarak izofluran ile sürekli anestezi altında 20 dakikalık bir PET kaydı başlatıldı. Hayvanlar standart bir EKG monitörüne bağlandı ve görüntüler daha sonra 16 kardiyak aralıkta yeniden oluşturuldu ve ortak kalp hızı değerleri için 11 ila 15 ms'lik bir zamansal çözünürlük sağlandı. Eksenel uzaysal çözünürlük <1.5 mm idi. Nekrotik miyokardın kapsamı, LV'nin 17 segmentli bir bölümünde özel QPS yazılımı kullanılarak florodeoksiglukoz alımının <%50'sini gösteren LV segmentlerinin yüzdesi olarak belirlendi. LV ejeksiyon fraksiyonunun yanı sıra sistol sonu ve diyastol sonu hacimleri, tam otomatik QGS yazılımı kullanılarak belirlendi. Bu koşullarda, yetişkin sıçanlarda LV sistol sonu hacminin alt sınırına karşılık gelen 100 μL seviyesinin üzerinde gerçek kavite hacimlerinin kesin bir tespiti sağlanır.

İletkenlik Kateter Çalışmaları

Sıçanlara izofluran ile anestezi uygulandı ve 2F yüksek kaliteli mikromanometre kateteri (SPR-407 Millar Enstitüsü, Houston, TX) sağ karotid arter yoluyla LV'ye yerleştirildi. Millar kateteri, AcqKnowledge III yazılımı (ACQ 3.2) ile bir PC ile arayüzlenmiş bir Harvard Veri Toplama Sistemine bağlandı.

Klinik çalışma

Fransız Akut ST-segment-yüksekliği ve ST-segment-yüksekliği olmayan MI (FAST-MI) popülasyonu ve yöntemleri önceki yayınlarda ayrıntılı olarak açıklanmıştır. 14,15 Kısaca, kreatin kinaz, kreatin kinaz-MB veya yüksek troponinler için normalin üst sınırının iki katından daha yüksek miyokardiyal nekroz serum belirteçleri olan ve semptomlardan herhangi biri ile uyumlu olan ≥18 yaşındaki tüm hastalar kayıt defterine dahil edildi. patolojik Q dalgaları veya kalıcı ST yükselmesi veya depresyonu olan en az 2 bitişik derivasyonda akut MI veya elektrokardiyografik değişiklikler olan. Semptomların başlangıcından yoğun bakım ünitesine kabulüne kadar geçen süre <48 saat olmalıdır. Hastalar olağan uygulamaya göre yönetildi, tedavi kayıtlara katılımdan etkilenmedi. Fransa'da o sırada akut MI hastalarını tedavi eden 374 merkezden 223'ü (%60) kayıtlara katıldı. Bunlar arasında 100 merkez, bir serum bankasına katkıda bulunan 1015 hastayı işe aldı. Her hasta yazılı bilgilendirilmiş onam verdi. Hastaların %99'undan fazlası beyazdı. Takip, hastaların doktorları, hastaların kendileri veya aileleri ve doğum yerlerinin kayıt ofisleri ile yapılan temaslar yoluyla toplanmıştır. 2 yıllık takip %98'in üzerinde tamamlandı. Sonuç olayları, sTREM-1 ölçümlerinin sonuçlarına kör olarak değerlendirildi. Çalışma, Saint Antoine Üniversite Hastanesi Biyomedikal Araştırmalarında İnsan Deneklerin Korunması Komitesi tarafından gözden geçirildi ve veri dosyası Commission Nationale Informatique et Libertés'e bildirildi. sTREM-1'in plazma konsantrasyonları, enzime bağlı immünosorbent tahlili (RnD Systems) ile iki kopya halinde belirlendi.

İstatistiksel analiz

Hayvan Çalışmaları

Belirtilmedikçe tüm veriler normal olarak dağıtıldı ve ardından ortalama±SD olarak sunuldu ve gruplar arasındaki farklılıkların istatistiksel önemi Student kullanılarak analiz edildi. T testi veya Kruskal-Wallis testi. Kaplan-Meier hayatta kalma eğrileri, log-rank testi kullanılarak analiz edildi. A P <0.05 değeri anlamlı kabul edildi.

Klinik çalışma

Bir sonuç olayı, 2 yıllık takip süresi boyunca tüm nedenlere bağlı ölüm veya ölümcül olmayan MI olarak tanımlandı. Dahil edildiğinde epizod indeksi olarak tanımlanan tüm nedenlere bağlı ölüm ve ölümcül olmayan MI'nin bir bileşimi olan birincil son nokta, üyeleri hastaların kullandığı ilaçlardan ve kan ölçümlerinden habersiz olan bir komite tarafından karara bağlandı. Sürekli değişkenler ortalama±SD, kategorik değişkenler ise frekans ve yüzde olarak tanımlanmıştır. sTREM-1 tertillerine göre hayatta kalma eğrileri Kaplan-Meier tahmincisi kullanılarak tahmin edilir. 2 yıllık takip süresi boyunca birincil bitiş noktası olan değişkenlerin bağımsız prognostik değerini değerlendirmek için çok değişkenli bir Cox orantılı tehlike modeli kullandık. Çok değişkenli model, cinsiyet, yaş, önceki veya mevcut sigara içiciliği, vücut kitle indeksi, ailede koroner hastalık öyküsü, hipertansiyon öyküsü, akut MI, kalp yetmezliği, böbrek yetmezliği, diyabetes mellitus, başvuruda kalp hızı, Killip sınıfı, sol ventrikül ejeksiyonunu içeriyordu. fraksiyon, hastane yönetimi (reperfüzyon tedavisi, statinler, β-blokerler, klopidogrel, diüretikler, dijitalis ve heparin dahil) ve log C-reaktif protein seviyeleri. Sonuçlar, %95 güven aralığı ile Cox modelleri için tehlike oranları olarak ifade edilmiştir. Tüm istatistiksel testler 2 taraflıydı ve SAS yazılım versiyonu 9.1 kullanılarak yapıldı.

Sonuçlar

Trem-1 İnhibisyonu, Farelerde MI Sonrası Kalp Fonksiyonunu İyileştirir

Farelerde, kalıcı sol ventriküler iskemi, enfarktüslü alanda Trem-1 ekspresyonuna neden oldu (Şekil 1A). Bu ifade geçiciydi ve esas olarak sızan nötrofillerde gözlendi. Trem-1 ayrıca insan iskemik miyokardında da ifade edildi (Şekil 1B).

Şekil 1. Miyeloid hücreler-1 (TREM-1) üzerinde eksprese edilen tetikleyici reseptör, enfarktüslü miyokardda eksprese edilir ve inhibisyonu, farelerde miyokard enfarktüsünden (MI) sonra kalp fonksiyonunu iyileştirir. A, Farelerde MI sonrası enfarktüslü ve enfarktüslü olmayan alanlarda Trem-1 mRNA ve protein ekspresyon seviyeleri, kantitatif ters transkriptaz-polimeraz zincir reaksiyonu, Western blot ve akış sitometrisi ile analiz edildi. Sham fareler ameliyattan 24 saat sonra analiz edildi n=5 her zaman noktasında *P<0.01 ve sahte ameliyat edilen hayvanlar **P<0,001 enfarktüslü vs enfarktüslü olmayan alan. B, akut MI sonrası hastaların kalbinde TREM-1 ekspresyonu. TREM-1 ekspresyonu, akut MI'dan 48 saat sonra koroner arter baypas greftleme yapılan 5 hastada elde edilen miyokardiyal apeks örneklerinde immünohistokimya ile belirlendi. Monositler/makrofajlar ve nötrofiller sırasıyla anti-CD163, CD68 ve miyeloperoksidaz (MPO) ile boyandı. Temsili görüntüler sunulmuştur. C, Farelerde MI sonrası ekokardiyografik analiz. Sol ventrikül (LV) fraksiyonel kısalma (FS) başlangıçta, 14. günde ve MI sonrasında 42. günde ölçülmüştür n=grup başına 7 ila 11 fare*P<0.05 ve LR12scr ile tedavi edilen hayvanlar. NS, LV alanı, risk altındaki alan (AAR) ve enfarktüs alanı (IA) ölçüldü (TTC [2,3,5-trifenil-2H-tetrazolium klorür] boyaması) ve 1. günde enfarktüs boyutunun kantitatif analizi, 14 ve 42, grup başına n=7 ila 11 yapıldı *P<0.02 ve **P<0.01 vs LR12scr. E, Kardiyak fibrozis Sirius Red boyamasından sonra değerlendirildi (Tepe) 14. ve 42. günde ve apoptoz TUNEL (terminal deoksinükleotidil transferaz aracılı dUTP nick uç etiketleme) analizi ile değerlendirildi (alt) 14. günde enfarktüslü alanların sayısı n=grup başına 4 ila 5 fare *P<0.02, **P<0.01 vs LR12scr, ***P<0.05 LR12 vs Trem-1 −/− fareler. F, Trem-1 -/- , LR12 - veya kontrol peptidi (LR12scr) ile tedavi edilen ve anti-Trem-1 monoklonal antikor (mAb) ile tedavi edilen farelerde (n=20-22 grup başına) MI sonrası Kaplan-Meier hayatta kalma tahmini ). Hayatta kalma eğrileri, log-rank testi kullanılarak karşılaştırılır. *P=0,008 ve **P<0,001 ve LR12scr. CF, Yabani tip fareler, koroner ligasyondan 2 saat sonra LR12, LR12-karıştırılabilir peptid (kontrol peptidi olarak hizmet etmek için), Trem-1 mAb (0.2 mg/kg) veya alakasız mAb (kontrol Ab olarak hizmet etmek için) almak üzere kör olarak randomize edildi. . Tedaviler 5 gün boyunca günde bir kez intraperitoneal olarak uygulandı.

izledik Trem-1 −/− fareler ve vahşi tip yavrular, sol koroner arter ligasyonundan 2 ve 6 hafta sonra ekokardiyografi ile (Şekil 1C). Trem-1 genetik geçersizlik, sol ventrikül fraksiyonel kısalmanın iyileşmesine yol açtı (P<0.05). 1. günde fark olmamasına rağmen, enfarktüs boyutu 14. günde önemli ölçüde azaldı. Trem-1 −/− fareler ve bu azalma 6 haftada hala belirgindi (Şekil 1D). Ayrıca, apoptotik hücre sayısı kadar kardiyak fibrozis de (hangi hücre tipinin apoptoza uğradığını ayırt edemesek de) azalmıştı. Trem-1 −/− iskemik miyokard sonrası (Şekil 1E). Hayvanlarda hayatta kalma, hayvanlara göre daha yüksekti. Trem-1 +/+ (%91'e karşı %64, P=0,008 Şekil 1F). Yabani türlerin %62,5'inde ve %25'inde ölüm nedeninin kalp rüptürü olduğu tespit edilmiştir. Trem-1 −/− fareler, sırasıyla (P<0.02).

Trem-1 Genetik Geçersizlik Böylece Kalp Fonksiyonunu İyileştirdi ve MI Sonrası Ölümden Korundu

Bu bulguları doğrulamak için 2 tamamlayıcı yaklaşım kullandık. TREM-1 aktivasyonu, daha önce septik şok sırasında koruyucu etkileri olduğunu bildirdiğimiz bir inhibitör peptit (LR12) kullanımı ile sınırlandırılabilir. 8–10 Tersine, TREM-1 agonistik bir mAb (Trem-1 mAb) tarafından devreye alınabilir. 6 mAb uygulamasının sağkalımı azaltmasına rağmen, LR12 tedavisi ölüm oranında azalma ile ilişkilendirildi, Trem-1 -/- (Şekil 1F). Ayrıca, LR12 uygulaması ayrıca kardiyak fonksiyonu iyileştirdi, enfarktüs boyutunu, apoptozu ve fibrozu azalttı (Şekil 1C–1E).

Trem-1, Enfarktüslü Miyokardda Lökosit Alımını ve Aktivasyonunu Kontrol Eder

TREM-1, doğuştan gelen bağışıklık sisteminin bir yükselticisi olduğundan, modülasyonunun inflamatuar yanıtı düzenleyip düzenleyemeyeceğini araştırdık.

İncelediğimiz doğuştan gelen bağışıklığa dahil olan 168 gen arasında, koroner arter ligasyonundan sonra, çoğunlukla MI'dan 24 saat sonra miyokardda 156'nın ifadesi değişti. MI kaynaklı gen aktivasyonuna karşı LR12 uygulaması (Çevrimiçi Tablo I). Dikkat çekici bir şekilde, ifadesi Tnf-α, Il6, ve Trem-1 LR12 ile tedavi edilen grupta azaltıldı ve ilgili proteinlerin plazma konsantrasyonları azaldı (Şekil 2A). LR12 uygulaması ayrıca p38-MAPK ve ERK1/2 fosforilasyonunu azalttı, iNOS ekspresyonunu azalttı ve GSK-3β fosforilasyonunu arttırdı (Çevrimiçi Şekil I).

Şekil 2. Miyeloid hücreler-1 (Trem-1) üzerinde eksprese edilen tetikleyici reseptör, enfarktüslü miyokardda lökosit alımını ve aktivasyonunu kontrol eder. A, miktar tayini Tnf-α, Il6, ve Trem-1 Miyokard enfarktüsünden (MI) sonra çeşitli zaman noktalarında enfarktüslü miyokardda gen ekspresyonu sol) ve karşılık gelen proteinlerin plazma konsantrasyonları (sağ) 24 saatte n=5 ila 7 puan başına *P<0.01 LR12scr ve diğer gruplar, **P=0.008 Trem-1 −/− LR12'ye karşı. B, Miyokardiyal kantifikasyon Timp1 ve Mmp9 LR12 veya LR12scr ile tedavi edilen vahşi tip (WT) farelerde MI sonrası birkaç zaman noktasında gen ekspresyonu (sağ) MI sonrası çeşitli zaman noktalarında enfarktüslü bölgenin jel içi zimografisi (orta) ve MI'dan 24 saat sonra, matris metalloproteinaz 9 (MMP9) ekspresyonunu gösteren enfarktüslü alanların temsili immünohistokimya doku kesitleri (sol) grup ve zaman noktası başına n=5, *P<0.01, LR12'ye karşı. C, MI'dan 24 saat sonra enfarktüslü alanların temsili immünohistokimyası ile akış sitometrik geçitleme stratejisi ve monositlerin ve makrofajların nicelenmesi. NS, Enfarktüslü miyokardın nötrofil infiltrasyonunun ve miyeloperoksidazın miyokardiyal konsantrasyonunun ve nötrofil infiltrasyonunu gösteren MI'dan 24 saat sonra iskemik kalbin temsili doku kesitlerinin akış sitometrik ölçümü. Bu deneyler için (C ve NS), n= grup ve zaman noktası başına 7 ila 10 fare *P<0.01, **P<0,001 ve LR12scr.

MI'dan 24 saat sonra, Mmp9 Enfarktüslü alanlarda mRNA ifadesi arttı (Şekil 2B). LR12 tedavisi artmış Timp-1 ve azaltılmış Mmp9 ifade.

Daha sonra, enflamasyonun modülasyonunun, enfarktüslü kalpte enflamatuvar infiltre edici hücrelerin sayısının azalmasıyla açıklanıp açıklanamayacağını inceledik.

Akış sitometrisini kullanarak, koroner ligasyondan sonra lökositlerin miyokard içine infiltrasyonunu analiz ettik. monosit ve makrofaj sayısı önemli ölçüde azalmıştır. Trem-1 -/- ve LR12 ile tedavi edilen fareler ile karşılaştırıldığında Trem-1 +/+ (Şekil 2C). Trem-1 silinmesi veya farmakolojik inhibisyon, enfarktüslü miyokardın inflamatuar Ly-6C yüksek monositleri tarafından infiltrasyonunu neredeyse tamamen ortadan kaldırırken, Ly-6C düşük alımı üzerinde çok az etkisi oldu (Şekil 2C). Nötrofillerin infiltrasyonu, kontrol farelerinde erken (6 saat) başladı ve ayrıca LR12 tedavisi ile bloke edildi. Trem-1 −/− hayvanlar (Şekil 2D). Bu fenomen daha önce yaralı akciğerde gösterilmişti. 12

Etkisi Trem-1 nötrofillerin göçünde delesyon in vitro olarak da gözlendi: kemik iliğinden saflaştırılan nötrofillerin, MI hayvanlarından veya iskemik kalp lizatlarından elde edilen plazma ile uyarım üzerine gözenekli bir filtreden geçiş yapmasına izin verildi. Nötrofiller Trem-1 −/−, vahşi tip hücrelere kıyasla daha düşük bir göçe sahipti. Lipopolisakkarit ile indüklenen nötrofil aktivasyonu, yokluğunda da azalmıştır. Trem-1 (Çevrimiçi Şekil II).

Lenfositler tarafından ifade edilmemesine rağmen, TREM-1, B- ve T-hücre mobilizasyonunu etkilemiştir: B- ve CD8+-lenfosit infiltrasyonu azalırken, LR12 ile tedavi edilen ve nakavt farelerde CD4+-hücre alımı değişmemiştir (Çevrimiçi Şekil III).

TREM-1 modülasyonu böylece iskemik miyokardiyuma lökosit alımını sınırlar.

Trem-1 Uzak Bölmelerden Lökosit Mobilizasyonunu Düzenler

Kontrol hayvanlarında koroner ligasyondan sonra, daha önce bildirildiği gibi16, 24 saatte kemik iliği ve dalaktan türetilen monosit sayısında bir azalma ve ardından 72 saatte dolaşımdaki monosit sayısında belirgin bir artış gözlemledik (Şekil 3A). İlginç bir şekilde, Trem-1 genetik delesyonu veya farmakolojik modülasyonu, 24 saatte dalakta ve kemik iliğinde monosit birikimini indükledi ve H72'de kanda bir azalma, Trem-1'in bloke edilmesinin monosit mobilizasyonunu azalttığını düşündürdü.

Figür 3. Miyeloid hücreler-1 (Trem-1) üzerinde eksprese edilen tetikleyici reseptör, uzak bölmelerden lökosit mobilizasyonunu düzenler. A, Monositlerin akış sitometrik ölçümü ve (B) miyokard enfarktüsünden (MI) sonra farklı zaman noktalarında dalak, kan ve kemik iliğinde nötrofiller. CMI sonrası Ccl-2, Ccl-7 ve Cx3cl1 plazma konsantrasyonları. NS, Kalpteki nötrofiller tarafından Ccl-2 konsantrasyonu ve ifadesi. n=6 ila 8 her zaman noktasında *P<0.05 LR12scr vs LR12 veya Trem-1 -/- . MCP, monosit kemoatraktan proteini gösterir.

MI'dan 6 saat sonra periferik kan nötrofil sayısı arttı. Bu nötrofili şurada gözlenmedi: Trem-1 -/- veya LR12 ile tedavi edilen fareler (Şekil 3B). MI'dan 72 saat sonra dolaşımdaki B lenfosit sayısı artarken, CD4+ ve CD8+ lenfosit sayısı önemli ölçüde değişmedi. Trem-1'in bloke edilmesi, bu B-lenfosit kinetik modellerinden kısmen önlenmiştir (Çevrimiçi Şekil IV).

Trem-1 inhibisyonu tarafından indüklenen lökosit mobilizasyon kusurunu açıklamak için daha sonra kemokinlere odaklandık. Monosit kemoatraktan protein 1 (MCP-1 veya Ccl2), Cx3cl1 (veya Fractalkine) ve Mcp-3 (veya Ccl7) sırasıyla Ly-6C yüksek, Ly-6C düşük monositlerin ve lenfositlerin alımında yer alan önemli kemokinlerdir. inflamatuar bölgelere. Ccl-2'nin plazma ve kalp konsantrasyonları erken (6 saat) artarken, Ccl-7 ve Cx3cl1'in plazma seviyeleri MI sonrası daha sonra (24 saat) arttı. Ccl-2 ve Ccl-7 seviyeleri azalırken, Cx3cl1 konsantrasyonu değişmedi. Trem-1 -/- ve LR12 ile tedavi edilen fareler (Şekil 3C). Miyokardiyal nötrofiller tarafından Ccl-2 üretimi azalmıştır. Trem-1 -/- ve LR12 ile tedavi edilen fareler (Şekil 3D).

MI'dan sonra nötrofiller, monositlerden birkaç saat önce iskemik miyokardiyuma sızar (Şekil 2C ve 2D). Bu nedenle nötrofillerin, daha sonra inflamatuar monositleri kalbe çekecek olan Ccl-2 üretiminden sorumlu olabileceğini varsaydık. 1A8 antikorunun uygulanmasıyla farelerde nötrofilleri verimli bir şekilde tüketmeyi başardık (Şekil 4A). Nötrofilden yoksun hayvanlarda, Ccl-2'nin plazma konsantrasyonu azalmıştır ve iskemik miyokardda zar zor saptanabilir (Şekil 4b). Bu veriler, nötrofillerin kalpte Ccl-2'nin önemli bir hücresel kaynağı olduğunu düşündürür, ancak başka bir hücre tipinin salınımını tamamen dışlayamayız.

Şekil 4. Nötrofiller, miyeloid hücreler-1 (TREM-1) modülasyonunda ifade edilen tetikleyici reseptörün ana hücresel hedefidir.. A, 1A8 antikoru tarafından nötrofiller üzerinde tükenmiş miyokard enfarktüsü (MI) farelerinde farklı zaman noktalarında kan ve kalp nötrofillerinin akış sitometrik ölçümü. B, Plazma ve kalpteki Ccl-2 konsantrasyonlarının ölçümü. A ve B, n=grup ve zaman noktası başına 4 ila 5 fare *P<0.05 vs 1A8 hayvanlar. C, 1A8 antikoru tarafından nötrofiller üzerinde tükenmiş MI farelerinde farklı zaman noktalarında kan ve kalp monositlerinin akış sitometrik ölçümü. n=grup başına ve zaman noktası başına 4 ila 5 fare *P<0.05 vs 1A8 hayvanlar. NS, miktar tayini Tnf-α, Il6, ve Trem-1 nötrofil eksikliği olan farelerde MI'dan 24 saat sonra enfarktüslü miyokardda gen ekspresyonu n=nokta başına 4 ila 5 *P<0.01 1A8-LR12 vs 1A8. MCP, monosit kemoatraktan proteini gösterir.

Sonuç olarak, kalpte monosit infiltrasyonunun azalmasıyla ilişkili nötrofil tükenmesinin gözlemledik (Şekil 4C). LR12 ila 1A8 ile tedavi edilen farelerin uygulanması, kardiyak inflamatuar yanıtı daha da azaltmasına rağmen, hücresel infiltrasyon (gösterilmemiştir) üzerinde ek etkilere yol açmadı (Şekil 4D).

Son olarak, bu hücreler üzerinde Trem-1 ekspresyonunun olmaması nedeniyle son derece olası olmayan, lenfositler üzerinde LR12'nin bir etkisini dışlamak için, aşağıdakileri kullanarak deneyler yaptık. bez-1 -/- hayvanlar. Lenfositlerin yokluğunda, LR12 hala miyokardiyal nötrofil infiltrasyonunu ve aktivasyonunu (gösterilmemiştir) önleyebilmiştir.

Birlikte ele alındığında, bu veriler MI'dan sonra, Trem-1 inhibisyonunun nötrofil alımını ve aktivasyonunu azalttığını ve bunun da uzak bölmeden monosit mobilizasyonunun azalmasına yol açtığını göstermektedir.

Trem-1 Modülasyonu, Sıçanlarda MI Sonrası Kardiyak Fonksiyonu İyileştiriyor

Fonksiyonel analizleri daha da genişletmek için bir sıçan MI modeline geçtik. Kalıcı koroner arter ligasyonundan sonraki 1 saat içinde, sıçanlar enfarktüs uzamasını ve ventriküler hacimleri belirlemek için 18F-florodeoksiglukoz ile pozitron emisyon tomografisi ile görüntülendi ve daha sonra 5 günlük LR12 veya kontrol peptidi (LR12scr) için günlük intraperitoneal enjeksiyon almak üzere kör olarak randomize edildi. MI'dan altı hafta sonra, sıçanlar yeniden florodeoksiglukoz-pozitron emisyon tomografik görüntülemesine (Çevrimiçi Şekil V) ve bir sol ventriküler iletkenlik kateteri kullanılarak invaziv hemodinamik çalışmalara tabi tutuldu. 2 hayvan grubu başlangıçta benzerdi. MI'dan altı hafta sonra, kontrol hayvanlarında ciddi bir sol ventrikül genişlemesi meydana geldi: bu patolojik ventriküler yeniden şekillenme LR12 tarafından kısmen önlendi (Tablo). Geri kalan sıçanlardaki ventriküler aritmiler nedeniyle, 18 LR12scr'den 12'si ve LR12 ile tedavi edilen 17 hayvandan 12'si için invazif hemodinamik veriler mevcuttu. Ana yükten bağımsız sistolik ve diyastolik miyokardiyal fonksiyon parametreleri LR12 tedavisi ile iyileştirildi (Çevrimiçi Şekil VI). Bir iskemi-reperfüzyon modelinde de benzer sonuçlar elde edildi (Çevrimiçi Şekil VII).

Tablo. MI Sonrası 1. ve 6. Haftalarda Sıçanlarda Kalp Fonksiyonunun FDG-PET ile Değerlendirilmesi

P değerler LR12scr ve LR12 gruplarının karşılaştırmaları içindir. EDV, diyastol sonu hacmi ESV, sistolik sonu hacmi FDG-PET, florodeoksiglukoz-pozitron emisyon tomografisi HR, kalp hızı MI, miyokard enfarktüsü ve SAP, sistolik arter basıncını gösterir.

Böylece, TREM-1 modülasyonu, sıçanlarda MI sonrası ventriküler yeniden şekillenmeyi ve sistolik-diyastolik disfonksiyonu önledi.

Akut Koroner Hastalığı Olan Hastalarda Çözünür TREM-1'in Plazma Konsantrasyonu

TREM-1 aktivasyonu, plazmada çözünebilir formunun (sTREM-1) ölçülmesi yoluyla değerlendirilebilir. Prospektif, çok merkezli Fast-MI'ye (NCT00673036) kayıtlı 1015 hastadan oluşan bir kohortta dolaşımdaki sTREM-1 plazma konsantrasyonları ile hayatta kalma arasındaki ilişkiyi değerlendirerek deneysel bulgularımızın insan hastalığıyla ilişkisini ele aldık. 14,15 Kaydedilen 1015 hastanın 154'ü (%15) 2 yıllık takip döneminde öldü. Akut MI hastalarında başvuru sırasında artan sTREM-1 konsantrasyonlarının, yaş, cinsiyet, vücut kütlesi gibi çok değişkenli risk faktörleri için ayarlama yapıldıktan sonra bile, 2 yıllık takipten sonra daha yüksek ölüm riski ile ilişkili olduğunu bulduk. indeks, diabetes mellitus, sigara içme durumu, hipertansiyon, önceden MI, inme, kronik kalp veya böbrek yetmezliği öyküsü, sol ventrikül ejeksiyon fraksiyonu, reperfüzyon tedavisi dahil hastane yönetimi, statinler dahil önerilen ilaç tedavileri ve C-reaktif protein. 1 pg/mL sTREM-1 artışıyla ilişkili düzeltilmiş ölüm tehlike oranı 2,22 idi (%95 güven aralığı, 1,69-2,93 P<0,0001), 2 0,29 (%95 güven aralığı, 1,71–3,06) P<0.0001) modele eklenen kreatin kinaz ile ve 2.18 (%95 güven aralığı, 1.61-2.94) P<0.0001) troponin I ile.

sTREM-1 ve kreatin kinaz arasında hiçbir korelasyon yoktu (r=0.018 P=0.57) veya sTREM-1 ile troponin I arasında (r=0.012 P=0.72).

sTREM-1'in taban çizgisi tertil seviyelerinin bir fonksiyonu olarak sonuç olaylarının olasılığı Şekil 5'te sunulmuştur. Yukarıdakiyle aynı değişkenlerle ayarlamadan sonra, sTREM-1 plazma konsantrasyonu 2 yılda ölüm riski ile bağımsız bir korelasyon olarak kaldı ( tehlike oranı, referans olarak seçilen üçüncül 1 ile karşılaştırıldığında, sırasıyla tertile 2 ve tertile 3 için 1,65 [0,87–3,10] ve 3,11 [1,72–6.64] olarak ayarlanmıştır, P<0.0001).

Şekil 5. Miyeloid hücreler-1 (sTREM-1) üzerinde eksprese edilen çözünür tetikleyici reseptörün plazma konsantrasyonu, insanlarda miyokard enfarktüsünden (MI) 2 yıl sonra ölümü öngörür. Akut MI olan hastalarda çözünür TREM-1'in plazma konsantrasyonuna göre hayatta kalma eğrileri. Hayatta kalma tahminleri, log-rank testi kullanılarak karşılaştırılır. HR, tehlike oranını gösterir.

Tartışma

MI klinik denemelerinde ele alınabilecek hücresel veya moleküler hedefleri deşifre etmek için hayal kırıklığı yaratan sonuçlarla birlikte önemli çalışmalar yapılmıştır. 17,18,19 Burada, MI tarafından tetiklenen inflamatuar yanıtı düzenlemede TREM-1'in rolünü göstermek için hasta örneklerinin yanı sıra birkaç tamamlayıcı hayvan modeli kullandık. Trem-1'in genetik geçersizliği veya farmakolojik blokajı, enflamatuar hücrelerin enfarktüslü miyokarda alınmasını ve aktivasyonlarını engeller. Bu, enfarktüs boyutunda bir azalma ve kardiyak fonksiyon ve hayatta kalmada bir iyileşme anlamına gelir. Akut MI için başvuran ülke çapında bir hasta kohortunu kullanarak, başvuru sırasındaki çözünür TREM-1 plazma konsantrasyonunun (TREM-1 aktivasyonunun bir belirteci) 2 yıllık takip sırasında ölümün güçlü bir prediktif faktörü olduğunu gözlemledik.

Enfarktüs iyileşmesinin ve skar oluşumunun çok önemli bir belirleyicisi, toplanan lökositlerin türü ve miktarı arasındaki hassas dengede bulunur. 3 İskemiden hemen sonra, hasarlı miyokardda nötrofiller birikir ve aşırı olduğunda böyle bir ekstravazasyonun zararlı olduğu düşünülür. Trem-1 inhibisyonu, nötrofillerle miyokardiyal infiltrasyonu neredeyse tamamen ortadan kaldırdı. Böyle bir fenomen yakın zamanda, Trem-1 inhibisyonunun nötrofillerin transepitelyal göçünü bloke ettiği pnömoni sırasında tarif edilmiştir. 12 Nötrofillerden kısa bir süre sonra, kontrol edilmediği takdirde enfarktüs genişlemesine ve ventriküler yeniden şekillenmeye neden olabilecek inflamatuar Ly-6C yüksek monositleri toplanır. Bu enflamatuvar alt küme, enflamasyonun çözülmesini ve hücre dışı matrisin yeniden düzenlenmesini destekleyen onarıcı Ly-6C düşük monositleri ile aşamalı olarak değiştirilir. 2 Dalak, MI sırasında monositler için önemli bir rezervuardır. 16 Burada Trem-1'in sadece dalak monositlerinin çıkışına aracılık etmede değil, aynı zamanda kemik iliğinden mobilizasyona ve miyokardiyal infiltrasyona aracılık etmede önemli olduğunu gözlemledik. Ayrıca, Trem-1 inhibisyonu Ccl-2 üretimini azaltmasına ve böylece Ly-6C yüksek hücrelerinin birikmesini önlemesine rağmen, Cx3cl1 tarafından tetiklenen Ly-6C düşük monosit alımını tehlikeye atmaz. Lenfositler de enfarktüslü bölgede az sayıda da olsa mevcuttur ve MI sonrası hızla çoğalırlar. Lenfosit alt kümelerinin kesin rolü net değildir, ancak son kanıtlar B hücrelerinin zararlı bir etkisi olduğunu gösterirken, 4 CD4 + T hücreleri muhtemelen yara iyileşmesini ve Ly-6C yüksekten Ly-6C düşük monositlere geçişi kolaylaştırır. 20 Yine Trem-1, özellikle sitotoksik CD8+ ve B hücreleri olmak üzere lenfosit alımına aracılık etmede önemli görünmektedir. Buna karşılık, Trem-1 inhibisyonu, CD4+ alımını değiştirmez. Kesin mekanizmalar açıklanmaya devam etse de, tüm bu veriler Trem-1'in hem nicel hem de nitel olarak lökositlerin alınmasında önemli bir rol oynadığını göstermektedir.

Trem-1, çeşitli inflamatuar hastalıklar sırasında bağışıklık tepkisinin bir yükselticisidir. 6 Aynı şeyin MI'dan sonra da geçerli olduğunu gösteriyoruz: Trem-1 inhibisyonu, inflamatuar gen ve protein aktivasyonunu azaltır ve sitokin/kemokin üretimini azaltır. MMP'lerin inhibisyonu, MI sonrası ölümcül kardiyak rüptür ve ventriküler yeniden şekillenme riskini azaltır. Miyeloid hücreler, özellikle nötrofiller, enfarktüslü miyokardda önemli bir Mmp9 kaynağıdır. 13 Trem-1 inhibisyonu, miyeloid hücre infiltrasyonunu azaltmada Mmp9 ekspresyonunu ve aktivitesini azaltırken Timp1 ekspresyonunu iyileştirir. Bu, hasarlı miyokardda genel bir MMP aktivitesinde azalmaya yol açar ve böylece yeniden şekillenmeyi önleyebilir.

Ani sağkalımı iyileştirmenin yanı sıra, MI tedavisinin amaçları, geç başlangıçlı ana sonucu olan kronik kalp yetmezliği gelişimini önlemektir. Bu nedenle sıçanlarda MI sonrası Trem-1 modülasyonunun sonuçlarını 2 tamamlayıcı teknik kullanarak inceledik: mikroTEP görüntüleme ve invaziv hemodinamik çalışma. Kalıcı bir miyokard iskemisinin başlamasından altı hafta sonra, sol ventrikül fonksiyonu tehlikeye girmiş ve önemli ventriküler yeniden şekillenme meydana gelmiştir. Trem-1 inhibitörü ile hayvanların kısa bir tedavisi (ilk 5 gün için) bu ventriküler genişlemeye karşı çıkar ve sistolik ve diyastolik ventriküler fonksiyonları iyileştirir. Miyokardiyal iskemi-reperfüzyon sırasında bu kalp fonksiyonundaki iyileşmeyi de doğruladık.

Trem-1'in inhibisyonunun sadece MI'dan sonraki ilk 5 gün içinde meydana geldiği düşünüldüğünde (LR12 yarı ömrü kısadır), 8 bu nedenle, bu geç başlangıçlı ventriküler fonksiyon iyileşmesinden inflamatuar yanıtın ilk modülasyonunun sorumlu olması gerektiğini düşünüyoruz.

Hayvan bulgularının insan patolojisine çevrilmesiyle ilgili sorular sıklıkla ortaya çıkıyor. 5 TREM-1'in insanlarda da bir rol oynayıp oynayamayacağını deşifre etmek için, akut MI'lı hastaların plazmasında çözünebilir formunu ölçtük. Akut MI için başvuran ülke çapında bir hasta kohortunu kullanarak, başvurudaki çözünür TREM-1 plazma konsantrasyonunun 2 yıllık takip sırasında ölüm riski ile bağlantılı olduğunu gözlemledik. Önemli olarak, sTREM-1 konsantrasyonu, reperfüzyon tedavisi ve önerilen tıbbi ilaçlar gibi terapötik yönetim de dahil olmak üzere sonucu etkilediği bilinen tüm parametreler için ayarlama yapıldıktan sonra bile öngörücü olmaya devam eder. Bu nedenle TREM-1, hastalarda MI sırasında da önemli bir aracı gibi görünmektedir.

Sonuç olarak, sonuçlarımız TREM-1'in MI sonrası inflamatuar hücre alımını ve aktivasyonunu kontrol etmede önemli bir rolü olduğunu göstermektedir. TREM-1 modülasyonu ventriküler disfonksiyonu önleyebilir. Son olarak, TREM-1 aktivasyonu, akut MI sonrası hastalarda ölümün bağımsız bir sonuç belirleyicisidir. Terapötik etkiler elde etmek için TREM-1 aktivitesini manipüle etme yeteneği umut verici görünmektedir ve nihayetinde enfarktüs sonrası kronik kalp yetmezliğinin salgın gelişimini azaltmak amacıyla daha fazla araştırılması gerekmektedir.


Reaktif Oksijen Türlerine Giriş - Hücrelerde ROS Ölçümü

Reaktif Oksijen Türlerinin (ROS), bağışıklık hücrelerinin mikrobiyal istilaya karşı öldürme tepkisinin bir bileşeni olduğu uzun zamandır bilinmektedir. Son kanıtlar, ROS'un normal hücre sinyal iletiminde ve hücre döngüsünde bir haberci olarak önemli bir rol oynadığını göstermiştir. Bu reaktif moleküller bir dizi farklı mekanizma ile oluşturulur ve çeşitli tekniklerle tespit edilebilir. Burada, bu moleküllerin bazılarının arkasındaki biyolojiyi ve bunların saptanması için araçları kısaca açıklıyoruz.

Tanıtım

Reaktif Oksijen Türleri (ROS), moleküler oksijenden türetilen bir dizi reaktif molekülü ve serbest radikali tanımlamak için kullanılan bir ifadedir. Oksijen bazlı radikallerin üretimi, tüm aerobik türler için felakettir. Aerobik solunumun mitokondriyal elektron taşınması sırasında veya oksidoredüktaz enzimleri ve metal katalizli oksidasyon tarafından yan ürünler olarak üretilen bu moleküller, bir dizi zararlı olaya neden olma potansiyeline sahiptir. Başlangıçta, konak hücre savunma mekanizmalarının bir parçası olarak ROS üretiminden yalnızca fagositik hücrelerin sorumlu olduğu düşünülüyordu. Son çalışmalar, ROS'un apoptoz gen ekspresyonu ve hücre sinyal kaskadlarının aktivasyonu dahil olmak üzere hücre sinyalleşmesinde bir rolü olduğunu göstermiştir [1]. ROS'un hem hücre içi hem de hücreler arası haberciler olarak hizmet edebileceğine dikkat edilmelidir.

Reaktif Oksijen Türlerinin Türleri

Çoğu reaktif oksijen türü, mitokondriyal elektron taşınması sırasında yan ürünler olarak üretilir. Ek olarak ROS, metal katalizli oksidasyon reaksiyonlarının gerekli ara ürünleri olarak oluşturulur. Atomik oksijen, dış elektron kabuğunda ayrı yörüngelerde iki eşleşmemiş elektrona sahiptir. Bu elektron yapısı oksijeni radikal oluşumuna duyarlı hale getirir. Elektronların eklenmesi yoluyla oksijenin sıralı indirgenmesi, süperoksit hidrojen peroksit hidroksil radikali hidroksil iyonu ve nitrik oksit dahil olmak üzere bir dizi ROS oluşumuna yol açar. (Şekil 1).

Şekil 1. Yaygın reaktif oksijen türlerinin elektron yapıları. Her yapıya kendi adı ve kimyasal formülü verilmiştir. Kırmızı & boğa eşleşmemiş bir elektronu belirtir.

ROS'a Karşı Hücresel Savunma

Reaktif oksijen türlerinin detoksifikasyonu, tüm aerobik yaşam formlarının hayatta kalması için çok önemlidir. Bu nedenle, bu ihtiyacı karşılamak ve ROS'un üretimi ve kaldırılması arasında bir denge sağlamak için çok sayıda savunma mekanizması gelişti. Pro-oksidatif duruma yönelik bir dengesizlik genellikle &ldquoOksidatif stres&rdquo olarak adlandırılır.

Hücreler, ROS'un zararlı etkilerini iyileştirmek için çeşitli savunma mekanizmalarına sahiptir. Süperoksit dismutaz (SOD), iki süperoksit anyonunun bir hidrojen peroksit (H) molekülüne dönüşümünü katalize eder.2Ö2) ve oksijen (O2) [3] (Eşi. 1). Ökaryotik hücrelerin peroksizomlarında katalaz enzimi H'yi dönüştürür.2Ö2 suya ve oksijene dönüştürür ve böylece SOD tarafından başlatılan detoksifikasyonu tamamlar (Eq. 2). Glutatyon peroksidaz, hidrojen peroksitin yanı sıra organik peroksitlerin alkollere parçalanmasını da katalize eden selenyum içeren bir enzim grubudur.

Detoksifikasyonda rol oynayan bir dizi enzimatik olmayan küçük moleküllü antioksidan vardır. Glutatyon, reaktif oksijen türlerinin zararlı etkilerine karşı en önemli hücre içi savunma olabilir. Bu tripeptid (glutamil-sisteinil-glisin), saldırı için bol bir hedef olarak hizmet eden açığa çıkmış bir sülfidril grubu sağlar. ROS molekülleri ile reaksiyonlar glutatyonu okside eder, ancak indirgenmiş form NADPH'ye bağlı bir redüktaz tarafından bir redoksta yeniden üretilir. C vitamini veya askorbik asit, ROS'u azaltabilen suda çözünür bir molekülken, E vitamini (&alfa-tokoferol) zarlarda benzer bir rol oynadığı öne sürülen yağda çözünür bir moleküldür.

Oksitlenmiş glutatyon formunun (GSSG) ve indirgenmiş formunun (GSH) oranı, bir organizmanın oksidatif stresinin dinamik bir göstergesidir [2].

Oksidatif Strese Tepki

Reaktif oksijen türlerinin hücresel süreçler üzerindeki etkisi, maruz kalma bağlamının yanı sıra maruz kalmanın gücü ve süresinin bir fonksiyonudur. Strese karşı tipik hücresel tepki, hücre döngüsünü terk etmek ve G'ye girmektir.0. Sürekli maruz kalma ve/veya yüksek seviyelerde ROS ile apoptoz mekanizmaları tetiklenir. Döngüsel hücrelerde, oksidanlar veya oksidatif stres gibi strese yanıt olarak p21 aktive edilir ve hücre döngüsü ilerlemesini bloke eder [4]. Aynı şekilde p27 üretimi G'ye yol açar1 hücrelerin tutuklanması. Döngüsel hücrelerde, p53 ve p21, retinoblastomun (RB) fosforilasyonunu indükleyerek oksidanlara yanıt verir. H gibi oksidanlara maruz kalma2Ö2 veya nitrik oksit ayrıca p53 veya p21'den bağımsız olarak RB'nin defosforilasyonu ile sonuçlanır. Her iki durumda da hücreler S fazında tutuklanır. p27'nin ekspresyonu, kısmen hücre döngüsü ilerlemesi, metabolizma ve oksidatif stres yanıtında yer alan genlerin ekspresyonunu kontrol ettiği bilinen Foxo transkripsiyon faktörleri tarafından kontrol edilir [5]. Örneğin, PI3K/Akt yolu ile mitojenik stimülasyon, sitoplazmada Foxo3a'yı korur, ancak stimülasyonun yokluğunda Foxo3a çekirdeğe girer ve p27 gibi oksidan metabolizması ve hücre döngüsü durması için genleri yukarı düzenler [5]. Bazı koşullar altında Foxo3a, bim gen ekspresyonunu doğrudan aktive edebilir ve apoptozu teşvik edebilir. [6]. Bu nedenle, Foxo3a, bir stres yanıtı sağlayarak oksidatif stres altında döngü halindeki hücrelerin hücre hayatta kalmasını destekler, ancak koşullar gerektirdiğinde hücre ölümünü indükler. Nöronlar gibi döngüsel olmayan hücreler de Foxo3a'yı içeren oksidatif stresle başa çıkma mekanizmalarına sahiptir. Foxo3a, oksidatif strese yanıt olarak manganez SOD formunun ekspresyonunu indükler [7].

ROS Üretiminin Düzenlenmesi

Fagositik hücreler tarafından uyarılmış reaktif oksijen türlerinin üretimine, bu hücreler tarafından artan oksijen tüketimi nedeniyle başlangıçta "solunum patlaması" adı verildi [8]. Bu süreç, çok bileşenli bir zara bağlı enzim kompleksi olan NADPH oksidazın etkisiyle katalize edilir ve fagositlerin bakterisidal etkisi için gereklidir [8].

Birkaç enzimin ROS parçaları üretebildiği kabul edilirken, NADPH oksidaz en önemlisidir [9]. NADPH oksidaz aktivitesi, G-protein Rac'ı içeren karmaşık bir düzenleyici sistem tarafından kontrol edilir [10] (Şekil 2).

Dinlenme hücrelerinde, iki polipeptidin (p22-phox ve gp91-phox) bir membrana gömülü heterodimeri, ayrıca iki hem grubu hem de bir FAD grubu içerir, elektronların sitozolik NADPH'den membran boyunca moleküler oksijene NADPH oksidaz olmadan moleküler oksijene transferini sağlar. aktivite [9].

gp91-phox polipeptidi aynı zamanda bir H+ iyon kanalı olarak hareket ettiğinde yük telafisinin meydana geldiğine inanılmaktadır. Uyarılma üzerine, bir dizi polipeptit (p47-phox, p67-phox ve p40phox), NADPH oksidaz aktivitesine sahip tamamen aktif bir enzim kompleksi oluşturmak için plazma zarının iç yüzüne yer değiştirir. Benzer bir sürecin fagositik olmayan hücrelerde de gerçekleştiğine inanılmaktadır [11].

Şekil 2. NADPH Oksidaz aktivasyonunun şematik gösterimi.

Reaktif oksijen türlerinin bir dizi hücresel süreçte rolü vardır. Hücresel hasara, oksidatif strese ve DNA hasarına yol açabilen yüksek ROS seviyeleri, maruz kalmanın ciddiyetine ve süresine bağlı olarak hücre hayatta kalmasını veya apoptoz mekanizmalarını ortaya çıkarabilir. Nitrik oksitin (&bullNO) hücreden hücreye haberci olarak hizmet ettiği ve kan basıncını düşürme gibi etkilerden sorumlu olduğu gösterilmiştir [12]. Hücre içi olarak, ROS türlerinin, antioksidan enzimlerle birlikte, cAMP ikinci haberci sistemine benzer bir şekilde redoks sinyalleriyle enzimleri açıp kapatmada rol oynadığına inanılmaktadır [12]. Örnekler arasında süperoksit anyonu, hidrojen peroksit bulunur. &bullO'nun kararlı durum seviyesi2 - çok düşük olduğu tahmin edilmektedir, ancak etkinliği mekansal olarak sınırlıdır. Hidrojen peroksit (H2Ö2) normalde katalize edici ajanların (örneğin enzimler, & rdquo multivalent metaller vb.) yokluğunda tiyollerle reaktif değildir, tiyolat anyonu (S-) ile reaksiyona girerek sülfenat (SO-) oluşturmak üzere iyonize olan sülfenik asit oluşturur. . Bu ara madde glutatyonun etkisi ile tersine çevrilebilir [13].

Mitojenik sinyalleşme, hücre yüzeyinde, proliferasyon için gerekli olan önemli MAP kinaz basamaklarını aktive eden reseptör tirozin kinazların ligand bağımlı aktivasyonu ile başlar. Bu kaskadlar H nesline yol açar.2Ö2 NADPH oksidazlar dahil olmak üzere çeşitli enzim katalizörlerinden [14]. H üretimi olduğu tahmin edilmektedir.2Ö2 büyüme faktörlerine yanıt olarak proliferasyon için nanomolar seviyelerde gereklidir [15]. Hidrojen peroksit, hem SOS-Ras-Raf-ERK hem de PI3K/Akt yolları ile çeşitli mekanizmalar yoluyla ve do-bağımlı bir şekilde etkileşime girer (Şekil 3). H'de küçük artışlar olduğu öne sürülmüştür.2Ö2, Nox1 ekspresyonunun bir sonucu olarak, hücre döngüsüne yeniden girişin artmasıyla sonuçlanırken, yüksek H seviyeleri sürdürülür.2Ö2 Uzun süreli tutuklamadan sonra hücre durmasına ve nihai apoptoza yol açar.

Peroksidoksinler, H'nin önemli düzenleyicileri olarak hizmet eder.2Ö2 ve mitojenik sinyalleşme. Bu tiyol bağımlı peroksidazlar aktive edilir ve mitojenik stimülasyonun bir parçası olarak reseptörlere alınır ve ROS ile ilişkili stimülasyonun mitojen kaskadının aşağı akış hedefleri üzerindeki etkisini sınırlamaya hizmet eder [16]. (Figür 3).

Hücre Döngüsü Kontrolü: Redoks Sinyali

Hücreler çoğaldıkça, hücre döngüsü olarak adlandırılan koordineli bir hücre büyümesi, DNA kopyalanması ve mitoz sürecinden geçerler. Hücre döngüsü, birkaç kontrol noktası ile sıkı bir şekilde düzenlenmiş bir süreçtir. Bu kontrol noktalarının her biri, hücrenin oksidatif durumundan etkilenen proteinler ve protein kompleksleri tarafından düzenlenir. Redoks durumu ve hücre döngüsü kontrolü arasındaki ilişki, Heintz ve Burhans [5] tarafından yapılan bir incelemede çok ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Çok hücreli hayvanlarda hücrelerin çoğu çoğalmaz ve terminal farklılaşma yoluyla geçici veya kalıcı olarak hücre döngüsünden çekilir. G çıkışı0 ve G'ye giriş1 hücre dışı büyüme faktörlerine yanıt olarak oksidanlar tarafından kontrol edilir. Redoks bağımlı sinyal yolakları, hücre döngüsüne yeniden giriş için anahtar protein olan Cyclin D1'in [17] ekspresyonunu destekler. Bu nedenle, siklin D1 ekspresyonunun başarılı mitojenik stimülasyon için bir belirteç olduğu bildirilmiştir [15]. G'deki kilit düzenleyici nokta1 hücrelerin S-fazına girmeye kararlı hale geldiği kısıtlama noktasıdır (veya R noktası). R noktasında, retinoblastoma (pRB) proteini, Cyclin D/CDK kompleksleri tarafından fosforile olur. İlginç bir şekilde, yeterince çalışma, pRB fosforilasyonu için yaklaşık -207 mV'luk bir redoks potansiyeli olduğunu, bunun üzerinde hücrelerin pRB'nin fosforilasyona uğradığını ve hücrelerin döngüyü durdurduğunu göstermiştir [18]. Senkronize hücrelerde, hücre döngüsü sırasında ROS üretiminin arttığı ve G2/M fazında pik seviyelerin meydana geldiği kaydedilmiştir [19].

Reaktif oksijen türleri apoptozda rol oynar. Rel transkripsiyon faktörleri ailesini tanımlamak için ortak bir terim olan NF-kB, birkaç antiapoptotik geni yukarı regüle ederek apoptozu inhibe eder [17]. Tersine, c-Jun N-terminal kinazı (JNK), uzun süreler boyunca aktive edildiğinde apoptozu teşvik eder [20]. Uzun süreli aktivasyonun, doğrudan ROS'a maruz kalmanın yanı sıra MAP Kinaz fosfatazlar gibi JNK inhibitörlerinin inaktive edilmesinden kaynaklandığı gösterilmiştir [20]. TNF-alfa kaynaklı ROS birikiminin baskılanması, NF-kB'nin JNK aktivasyonunu aşağı regüle ettiği mekanizma gibi görünmektedir.

Figür 3. ROS ve Mitojenik Kaskadların Rapor Edilen Etkileşimlerinin Şematik Gösterimi.

Reaktif Oksijen Türlerinin Ölçülmesi

Reaktif oksijen türlerinin ölçümü, söz konusu reaktif oksijen türleri ile birlikte analitik hedefe bağlıdır. Hücresel düzeyde, spesifik ROS doku kültüründen ayrı ayrı değerlendirilebilirken, hayvan düzeyinde tipik olarak oksidatif stresin etkileri kan ürününden (örneğin serum veya plazma) veya idrar örneklerinden ölçülür.

Glutatyon, enzimatik olmayan en önemli oksidan savunma mekanizmasıdır. Nispeten büyük miktarlarda (mM seviyeleri) bulunur ve peroksitleri detoksifiye etmeye ve bir dizi önemli antioksidanı (örn. &alfa-tokoferol ve askorbik asit) yenilemeye hizmet eder [21].

İndirgenmiş glutatyon (GSH), oksitlenmiş formundan (GSSG) NADPH'ye bağlı bir redüktazın (Eq. 3) etkisi ile rejenere edilir.

Denk. 3. GSSG + NADPH + H+ &rarr 2 GSH + NADP+

GSSG'nin sentezine veya salgılanmasına göre azalmasının hızlı doğası nedeniyle, GSH'nin GSSG'ye oranı hücreler içindeki oksidatif stresin iyi bir göstergesidir. GSH ve GSSG seviyeleri HPLC [22], kapiler elektroforez [23] veya mikroplakalarda [24] biyokimyasal olarak belirlenebilir.

Numunelerdeki glutatyonu ölçmek için birkaç farklı deney tasarlanmıştır. Glutatyon S-transferaz enzimi ile birlikte bir lusiferin türevi kullanıldığında, GSH miktarı, sonraki bir adımda lusiferaz eklendiğinde üretilen ışıldayan sinyalle orantılı olacaktır [25]. Toplam glutatyon, GSH'nin glutatyon redüktaz varlığında DTNB (Ellman&rsquos reaktifi) ile reaksiyona sokulmasıyla kolorimetrik olarak belirlenebilir. Glutatyon redüktaz, GSSG'yi GSH'ye indirger, bu daha sonra DTNB ile reaksiyona girerek 412 nm'de emen sarı renkli 5-tiyo-2-nitrobenzoik asit (TNB) üretir.

GSH'nin hücre altı tespiti ve lokalizasyonu, hücresel redoks durumunun modülasyonunu, ilaçların etkisini ve detoksifikasyon mekanizmalarını anlamada önemlidir. Ayrıca, hücre alt popülasyonlarında oksidatif strese yanıt olarak GSH seviyelerindeki farklılıklar rapor edilmiş olup, akış sitometrisine ve otomatik floresan saptamaya uygun saptama yöntemlerinin önemi vurgulanmıştır.

Konjuge oluncaya kadar esasen floresan olmayan biman bileşikleri monobromobiman ve monoklorobiman, glutatyon dahil olmak üzere düşük moleküler ağırlıklı tiyollerle kolayca reaksiyona girerek 394 nm uyarma dalga boyuna ve 490 nm'de bir emisyona sahip floresan eklentileri oluşturur [26] (Şekil 4). Bu reaktifler, disülfidlerin kimyasal indirgenmesinden önce ve sonra hücrelerde protein tiyollerinin dağılımını saptamak için faydalıdır. Monobromobimane göre daha fazla tiyol seçici olan monoklorobiman, hücrelerde glutatyon seviyelerinin nicelenmesi ve GST aktivitesinin ölçülmesi için uzun süredir tercih edilen tiyol reaktif prob olmuştur [27]. Monoklorobimanın mavi-floresan glutatyon eklentisi sonunda çekirdekte biriktiğinden, hücresel glutatyonun nükleer ve sitoplazmik dağılımının güvenilir bir göstergesi değildir [28].

Şekil 4. Biman yapısı ve tiyollerle reaksiyonu. Monobromobiman ve monoklorobiman, sırasıyla 3 konumlu metil grubunda bulunan bir Br veya bir Cl atomuna sahiptir ve floresan değildir. Bu reaktif grup, 394 nm'lik bir uyarma maksimumu ve 490 nm'lik bir emisyon dalga boyu ile floresan eklentileri oluşturmak için düşük moleküler ağırlıklı tiyollerle etkileşime girer.

ThiolTracker&trade Violet (Life Technologies), akış sitometrisi ve floresan mikroskobu kullanılarak hücresel analizde kullanım için bozulmamış hücrelerde indirgenmiş tiyollerle reaksiyona girer. ThiolTracker&trade Violet reaktifi, canlı hücre zarlarını geçerek hücresel tiyollerle reaksiyona girdikten sonra hücre geçirimsiz hale gelebilir. 404 nm uyarma ve 526 nm emisyon dalga boyları, DAPI filtre setleri ile görüntüleme için uygundur. Üreticisi tarafından biman bileşiklerinden 10 kat daha parlak olduğu bildirilmektedir.

Lipid peroksidasyonu, oksidatif stresin önemli bir göstergesi olan serbest radikal oluşumunun en yaygın kullanılan göstergelerinden biridir. Hücre zarlarında bulunanlar gibi doymamış yağ asitleri, serbest radikaller için ortak bir hedeftir. Reaksiyonlar tipik olarak, bir serbest radikalin su oluşturmak için doymamış bir karbondan bir hidrojen parçasını yakaladığı bir zincir reaksiyonu olarak meydana gelir. Bu, yağ asidi üzerinde daha sonra oksijeni yakalayabilen ve bir peroksi radikali oluşturabilen eşleşmemiş bir elektron bırakır (Şekil 5). Lipid peroksitler kararsızdır ve malondialdehit (MDA) gibi reaktif karbonil bileşiklerini içeren karmaşık bir dizi bileşik oluşturmak üzere ayrışır.

Şekil 5. Lipid peroksidasyonunun çizimi.

Lipid peroksidasyonunun ölçümü, tarihsel olarak, lipid peroksidasyon ürünlerinin ayrışmasından üretilen malondialdehit gibi tiobarbitürik asit (TBA) reaktif bileşiklerin saptanmasına dayanmıştır [25]. Bu yöntem, oldukça duyarlı olması, ancak MDA'ya spesifik olmaması nedeniyle tartışmalı olsa da, lipid peroksidasyonunu belirlemek için en yaygın kullanılan yöntem olmaya devam etmektedir. 90-100 ºC'de asidik koşullar altında gerçekleşen bu reaksiyon, 532 nm'de kolorimetrik olarak veya 530 nm uyarma dalga boyu ve 550 nm emisyon dalga boyu kullanılarak floresan ile ölçülebilen bir eklenti ile sonuçlanır [29] (Şekil 6). Absorbans veya floresan algılama teknolojilerini kullanan bu test için bir dizi ticari test kiti mevcuttur.

Şekil 6. MDA-TBA eklenti oluşumu.

Araşidonik asidin F2-izoprostanlar (IsoP) olarak adlandırılan F2 benzeri prostanoid türevlerinin oluşumunun lipid peroksidasyonuna özgü olduğu gösterilmiştir [30]. TBA testinden farklı olarak, IsoP ölçümü lipid peroksitlere özgü gibi görünmektedir, bunlar stabildir ve herhangi bir enzimatik yolla üretilmemiştir, bu da yorumlamayı kolaylaştırır.

IsoP'ler için geliştirilmiş bir dizi ticari ELISA kiti vardır, ancak numunelerde girişime neden olan ajanlar, tahlili çalıştırmadan önce numunelerin kısmi saflaştırılmasını gerektirir. Tespit için tek güvenilir yol, pahalı kılan ve verimi sınırlayan GC/MS kullanımıdır [31].

Canlı hücrelerdeki lipid peroksidasyonu, zarlara lokalize olan floresan türevleri kullanılarak görselleştirilebilir. Örneğin, BODIPY® 581&frasl591 undekanoik asit floroforunun çoklu doymamış bütadienil kısmının oksidasyonu, floresan emisyonunun 590 nm'den 510 nm'ye kaymasına neden olur [32, 33] (Şekil 7). Ticari olarak Image-iT® Lipid Peroksidasyon Kiti (Life Technologies) olarak temin edilebilen bu reaktif, canlı hücrelerde hücresel lipidlerin oksidatif bozunmasını saptamak için basit bir rasyometrik yöntem sağlar [34]. Kırmızı flüoresansın yeşil flüoresansa oranı, tek emisyonlu problarla ölçümü etkileyebilecek lipid yoğunluğu gibi faktörlerden bağımsız bir lipid peroksidasyonu ölçüsü sağlar. Bu reaktif canlı hücrelerle uyumlu olduğundan, ölçümler fiksasyon ve boyama olmadan gerçek zamanlı olarak gerçekleştirilebilir. Bu reaktif aynı zamanda plazmanın [35] ve lipid veziküllerinin [36] antioksidan kapasitesini göstermek için de kullanılmıştır.

Şekil 7. C11-BODIPY'nin Yapısı (581/591).

Sabit hücrelerde lipid peroksidasyonu kaynaklı protein modifikasyonları, Click-iT® kimyası (Life Technologies) ile birlikte linoleamid alkin (LAA) kullanılarak tespit edilebilir. Linoleik asit, memelilerde bulunan en bol çoklu doymamış yağ asididir ve lipit peroksidasyon ürünleri, muhtemelen lipit türevi protein karbonillerinin çoğunluğunu oluşturur [37]. Canlı hücrelerle inkübe edildiğinde, LAA hücresel membranlara dahil olur. Lipid peroksidasyonu üzerine, zara bağlı LAA oksitlenir ve 9- ve 13-hidroperoksi-oktadekadienoik asit (HPODE) üretir. Bu hidroperoksitler, kendilerini çevreleyen proteinleri kolayca değiştiren &alfa,&beta-doymamış aldehitlere ayrışır. Hücreler sabitlendikten sonra, elde edilen alkin içeren proteinler, Alexa Fluor® 488 azid ile reaksiyona girerek saptanabilir (Şekil 8).

Şekil 8. Click-iT® LAA'nın Eylem Mekanizması.

Süperoksit tespiti, ölçülebilir bir sonuç oluşturmak için süperoksidin başka bir bileşikle etkileşimine dayanır. Ferrisitokrom c'nin ferrositokrom c'ye indirgenmesi birçok durumda süperoksit oluşum oranını değerlendirmek için kullanılmıştır [38]. (Eşit 4)

Süperoksit için tamamen spesifik olmasa da bu reaksiyon 550 nm'de kolorimetrik olarak izlenebilir. CN- gibi enzim inhibitörlerinin veya katalaz gibi reaktif türlerin süpürücülerinin eklenmesi, herhangi bir yeniden oksidasyonu en aza indirebilir. Aconitase, sitratın izositrata dönüşümünü katalize eder. Süperoksit, kübik <4Fe-4S> kümesinden Fe(II) parçasını oksitleyerek bu enzimi inaktive eder. Böylece süperoksit konsantrasyonları, enzim inaktivasyon derecesi ile tahmin edilebilir. Enzimin aktivitesi, 240 nm'de absorbans kullanılarak 20 mM izositratın sikakonitata dönüştürülmesi takip edilerek izlenebilir. Akonitaz ürünü olan izositratın daha sonra NADP+ bağımlı izositrat dehidrojenaz tarafından &alfa-ketoglutarat'a dönüştürüldüğü birleştirilmiş bir tahlil de kullanılabilir. Bu reaksiyonda NADPH üretimi 340 nm'de kolorimetrik olarak izlenebilir [21].

Kemilüminesan reaksiyonlar, absorbans bazlı tespit yöntemlerine göre hassasiyetlerindeki potansiyel artış için kullanılmıştır. En yaygın olarak kullanılan kemilüminesan substrat Lucigenin'dir, ancak bu bileşiğin redoks döngüsü için bir eğilimi vardır, bu da süperoksit üretiminin nicel oranlarını belirlemede kullanımı hakkında şüpheler uyandırmıştır [39]. Bu bileşiğin düşük konsantrasyonlarının kullanılması, bu sorunu en aza indirmenin bir yolu olarak önerilmiştir. Coelenterazin ayrıca kemilüminesan bir substrat olarak kullanılmıştır. Bu lipofilik bileşik redoks döngüsü yapmaz ve Lucigenin'den daha parlaktır. Bununla birlikte, peroksinitritin mevcudiyeti kemilüminesans ile sonuçlanacağından, süperoksite karşı tamamen spesifik değildir [40].

Hidrosiyanin boyaları, süperoksit ve hidroksil radikali için florojenik sensörlerdir. Bu boyalar, siyanin (Cy) boyalarının iminyum katyonunun sodyum borhidrür ile indirgenmesiyle sentezlenir. Zayıf floresan iken, oksidasyon üzerine floresan yoğunluğu 100 kat artar. Oksidasyon, floresan olmasının yanı sıra, molekülü zar geçirgen olmaktan iyonik geçirimsiz bir parçaya dönüştürür [41]. Bu probların en karakteristik olanları Hydro-Cy3 ve Hydro-Cy5'tir.

Süperoksitin hücresel üretimi, hidroetidin olarak da adlandırılan dihidroetidyum ile görselleştirilebilir. Bu bileşik, esas olarak süperoksit ve çok daha az ölçüde diğer reaktif oksijen veya reaktif nitrojen türleri tarafından oksitlenene kadar sitozolde mavi bir floresan sergiler. Dihidroetidiumun oksidasyonu, 2-pozisyonda 2-hidroksietidyum oluşturan hidroksilasyon ile sonuçlanır (Şekil 9). Oksidasyon ile bileşik, hücresel DNA ile interkalasyona uğrar ve çekirdeğin, sırasıyla 535 nm ve 635 nm'lik bildirilen uyarım ve emisyon dalga boyları ile parlak bir floresan kırmızısına boyanır [42].

Şekil 9. Dihidroetidiumun Süperoksit ile 2-Hidroksietidiyuma Oksidasyonu.

Mitokondriye özgü süperoksit, MitoSOX&trade Red reaktifi (Life Technologies) ile floresan mikroskobu kullanılarak görüntülenebilir. MitoSOX&trade Red reaktifi, seçici olarak mitokondriyi hedef aldığı canlı hücrelere nüfuz eden dihidroetidiumun katyonik bir türevidir. MitoSOX Red göstergesinin katyonik trifenilfosfonyum ikamesi, aktif olarak solunum yapan mitokondride probun elektroforetik olarak yönlendirilen alımından sorumludur (Şekil 10). Dihidroetidyumda olduğu gibi, bu bileşik mitokondriyal DNA ile birleşerek kırmızı floresan ile sonuçlanır. 590 nm'de bir emisyon tespiti ile 510 nm'lik tepe uyarma dalga boyu kullanılarak floresan ölçümleri yapılabilirken,

Süperoksit dışındaki reaktif oksijen türleri tarafından üretilen etidyum oksidasyon ürününün uyarma spektrumunda bulunmayan 400 nm, süperoksitin daha iyi ayırt edilmesini sağlayabilir [42].

Şekil 10. Oksitlenmiş MitoSox&trade Kırmızı mitokondriyal süperoksit göstergesinin yapısı.

Mitokondriyal reaktif oksijen türlerinin oluşumu, MitoSOX&trade ile boyanmış hücrelerin görüntülenmesiyle gözlemlenebilir. Örnek olarak, steroid olmayan antienflamatuar ilaç Diklofenak, reaktif oksijen türlerinin indüklenmesi yoluyla hepatotoksisite ile ilişkilendirilmiştir [43]. Mitokondriyal oksidatif stres, üç gün boyunca karaciğer mikrodokusunun diklofenak dozunun üç log titrasyonunu takiben MitoSOX testi kullanılarak doğrulandı, kırmızı floresan probdan önemli ölçüde artan bir sinyal sadece en yüksek dozda (300 &uM) görüldü, bu da yüksek süperoksit seviyelerine ulaşıldığında artık nötralize edilemez (Şekil 11).

Şekil 11. Üç Günlük Diklofenak Dozunun Ardından Mitokondriyal Oksidatif Stres Değerlendirmesi. Sırasıyla DAPI veya RFP Cytation 3 görüntüleme kanalları kullanılarak yakalanan Hoechst 33342 (mavi) ve MitoSOX&trade Red (kırmızı) ile boyanmış 3D karaciğer mikrodokularının üst üste bindirilmiş görüntüleri. DAPI ile boyanmış hücreler üzerinde gerçekleştirilen otofokus [44].

CellROX® reaktifleri, Life Technologies'in bir dizi tescilli reaktifidir. Bu hücre geçirgen boyalar, indirgenmiş durumdayken zayıf floresandır ve reaktif oksijen türleri (ROS) tarafından oksidasyon üzerine fotostabil floresan sergiler.CellROX® green, yalnızca DNA'ya bağlanarak floresan hale gelir ve varlığını çekirdek veya mitokondri ile sınırlar. Bu bileşik, 485 nm'lik bir uyarma dalga boyuna ve 520 nm'lik bir emisyon dalga boyuna sahiptir, bu da onu Yeşil GFP filtre setlerini kullanarak görüntülemeye uygun hale getirir. Bu reaktif formaldehitle sabitlenebilir ve sinyali deterjan işleminden kurtularak diğer uyumlu boyalar ve antikorlarla çoğullanmasına izin verir. CellROX® Orange ve CellROX® Deep Red, floresan için DNA bağlanmasını gerektirmez ve sitoplazmada lokalizedir. CellROX® turuncu 545 uyarma dalga boyuna ve 565 emisyona sahiptir ve bir RFP filtre küpü ile görüntülenebilir, CellROX® Deep Red ise 640 nm uyarma zirvesine ve 665 nm emisyon zirvesine sahiptir ve bir CY5 küpü ile görüntülenebilir.

Hidrojen peroksit (H2Ö2), mitojenik stimülasyon veya hücre döngüsü düzenlemesi açısından en önemli ROS'tur. Yoğun floresan ürünler üretmek için yaban turpu peroksidaz (HRP) enzimi ile birlikte kullanılan hidrojen donörleri olarak hizmet eden bir dizi florojenik substrat vardır [21]. Liste oldukça geniş olmakla birlikte, daha yaygın olarak kullanılan substratlar arasında diasetildikloro-floresein [45], homovanilik asit [46] ve Amplex® Red [47] bulunur. Bu örneklerde, artan miktarlarda H2Ö2 artan miktarlarda floresan ürün oluşturur. Örneğin, Amplex Red, HRP varlığında hidrojen peroksit tarafından oksitlenir ve bunu yaparken resorufine dönüştürülür [47]. Amplex Red'den farklı olarak resorufin, 570 nm'de kolorimetrik olarak veya 570 nm'lik eksitasyon ve 585 nm'lik emisyon kullanılarak floresan ile tespit edilebilen oldukça renkli bir bileşiktir [48] (Şekil 12).

Şekil 12. Amplex Red'in HRP kullanılarak HRP tarafından resorufine dönüştürülmesi2Ö2.

Homovannilik asit, yaban turpu peroksidaz katalizi yoluyla hidrojen peroksit tarafından oksitlendiğinde dimerleşir. Amplex kırmızısında olduğu gibi, homovanilik asit monomeri floresan değildir, ancak bir dimmer olarak, 425 nm'lik bir emisyon dalga boyu ile 315 nm'lik bir tepe uyarma dalga boyuna sahiptir (Şekil 13). Hidrojen peroksit üretimini değerlendirmek için bu bileşiği kullanırken dikkatli olunmalıdır. Floresan ölçümleri için uyarma ve emisyon dalga boylarının UV'ye yakın doğası, bu bileşiği, özellikle polistiren mikroplakalar kullanıldığında, aşırı arka plan sinyaline eğilimli hale getirir. Birkaç peroksidaz benzeri metalloporforinin HRP'ye ek olarak reaksiyon için katalitik olduğu gösterilmiştir [49].

Şekil 13. HRP ve hidrojen peroksitin etkisiyle homovanilik asidin dimerizasyonu.

Hidrojen peroksit konsantrasyonlarını ölçmek için HRP ile birlikte tetrametilbenzidin (TMB) ve fenol kırmızısı gibi bir dizi kolorimetrik substrat da kullanılmıştır. Genel olarak kolorimetrik araçlar, floresan algılama yöntemlerinden daha az hassastır, ancak enstrümantasyon maliyetleri, tüp bazlı veya mikroplaka bazlı algılama metodolojileri kullanıldığında floresan bazlı ölçümler için gerekli olanlardan önemli ölçüde daha düşüktür.

Hidrojen peroksiti ölçmek için HRP katalizli substratları kullanırken dikkat edilmesi gereken birkaç konu vardır. Tiyoller gibi hücresel bileşikler, HRP için bir substrat görevi görebilir. Endojen katalaz aktivitesi H2 miktarını yapay olarak azaltabilir.2Ö2 sunmak. Hücresel bileşenler, homovanilik dimerde olduğu gibi, uyarma ve emisyon dalga boylarına bağlı olarak floresan sinyali etkileyebilirken, diğer dalga boyları sinyal sönmesinden zarar görebilir.

Tarpley et. al. Yöntem(ler)in H'nin nicelleştirilmesi için oldukça yararlı olduğunu belirterek, HRP bağlantılı tahlillerin faydasını oldukça kısa ve öz bir şekilde özetledi.2Ö2- kültürlenmiş hücreleri, organ kültürlerini ve izole edilmiş tamponla perfüze edilmiş doku preparasyonlarını seviyeler. Ancak bu yöntemler H tayinleri için uygun değildir.2Ö2 plazmada veya serumda, çünkü hücre dışı sıvıda birçok indirgeyici madde mevcuttur&rdquo[21].

2&rsquo-7&rsquo diklorofloresin (H2DCF)'nin 2&rsquo-7&rsquodichlorofluorescein (DCF)'ye oksidasyonu, H'nin nicelleştirilmesi için oldukça yaygın bir şekilde kullanılmıştır.2Ö2. Diasetat formu, H2DCFDA ve onun asetometil esteri H2DCFDA-AM, spesifik olmayan hücresel esterazların lipofilik grupları ayırmak için etki ettiği hücreler tarafından alınır ve hücre içinde tutulduğuna inanılan yüklü bir bileşik ile sonuçlanır. H2DCF'nin ROS tarafından oksidasyonu, molekülü yüksek oranda floresan olan 2&rsquo,7&rsquo diklorodihidrofloreseine (DCF) dönüştürür (Şekil 14). DCF floresansının ölçümü için rapor edilen dalga boyları, uyarma için 498 nm ve emisyon için 522 nm'dir.

Şekil 14. ROS ile floresan Bileşik DCF oluşumu.

Başlangıçta DCF'nin hidrojen peroksit için spesifik olduğu düşünülüyordu, ancak son kanıtlar nitrat ve hipokloröz asit gibi diğer ROS'ların H2DCF'yi oksitleyebileceğini göstermiştir [66]. En önemlisi, H2Ö2H2DCF'nin bağımlı oksidasyonu, demirli demir gerektirir [50]. Ayrıca H2DCF artık iyonik olmadığı için hücre dışına göç etmesi ve oksidanlarla etkileşime girmekte serbest olduğu ortamda birikmesi engellenmez. PMT tabanlı floresan ölçümlerine ek olarak, oksitlenmiş DCF floresansı, FITC veya GFP filtre setleri kullanılarak görüntülenebilir. Örneğin, DNA topoizomeraz I'i inhibe eden sitotoksik kinolin alkaloid kamptotesin, kültürlenmiş primer hepatositlerde oksidatif strese neden olur [51]. Şekil 15'te gösterildiği gibi, kamptotesinin mikromolar konsantrasyonları tipik olarak görüş alanındaki hücrelerin yaklaşık %10-20'sinde ROS üretimini indükler.

Şekil 15. Hepatositlerde oksitlenmiş DCF floresansı. 800 nM kamptotesin ile 0 ve 30 dakikalık tedavilerden sonra yakalanan kültürlenmiş hepatositlerin görüntüleri. Hücre çekirdekleri Hoechst 33342 (mavi) ile boyandı, mitokondri MitoTracker® Red (Kırmızı) ile boyandı ve oksitlenmiş DCF reaktifi yeşil olarak görüntülendi [68]. Görüntüler, 20x objektif kullanılarak Cytation&trade 3 Imaging çok modlu mikroplaka okuyucu (BioTek Instruments) kullanılarak yakalandı.

DCF floresansının zayıflıklarını gidermek için birkaç yeni floresan prob geliştirilmiştir. Bu tür iki prob, Peroxy Green 1 (PG1) ve Peroxy Crimson 1 (PC1)'dir. Bu boronat bazlı H2Ö2 probların görünür dalga boyu uyarma ve emisyon dalga boyları ile birlikte yüksek seçiciliğe, membran geçirgenliğine sahip olduğu bildirilmiştir [50]. Hidrojen peroksit ile reaksiyona girmek, PG1 ve PC1 için floresanda sırasıyla 10 kat ve 40 kat artışla sonuçlanır. PG1, 510 nm'de emisyon maksimumu ile 460 nm'lik bir uyarma dalga boyuna sahiptir (Şekil 16). PC1, otofloresansı azaltan (uyarma: 480 nm emisyon: 584 nm) kırmızıya kaydırılmış uyarım ve daha büyük stokes kaymasının gelişmiş özelliklerini gösterir [52].

Şekil 16. Peroxy Green 1 ve Peroxy Crimson 1'in Yapısı.

Bu moleküller, H ile gözlenmeyen hidrojen peroksit ile doğrudan bir reaksiyon sergiler.2DCF. Ayrıca bu moleküller, hem proteinlerinden türetilen yüksek değerli metal-okso türlerine karşı reaktif değildir ve H.2Ö2. DCFH normalde bu kombinasyona H'ye göre daha büyük bir tepki gösterir.2Ö2.

Kalsein-asetoksimetilester (Calcein-AM) ayrıca hücre içi oksidatif aktivitenin detektörü olarak rapor edilmiştir [53]. Kalsein-AM, hücre içi esterazlar tarafından floresan olan hücre geçirimsiz anyon kalseine dönüştürülen florojenik hücre geçirgen bir bileşiktir (Şekil 17). Tarihsel olarak hücre içi kalsein üretimi, canlı hücrelerin bir göstergesi olarak hem mikroskopi hem de florometrede kullanılmıştır. ROS'un tespiti ile ilgili olarak, ROS reaksiyonunun kinetiği, esterazın kalseine dönüşümüne göre uygundur.

Calcein AM'nin ROS ile oksitlenmiş ürününün, ince tabaka kromatografisi yoluyla Calcein-AM'den kimyasal olarak farklı olduğu gösterilmiştir [53], ancak yine de hücre zarlarını geçme kabiliyetini korur ve floresan kalseine benzer spektral özelliklere sahiptir. Bu nedenle, hücre canlılığı için bileşik kullanıldığında tipik olarak gerçekleştirilen hücre yüklemesinden sonra onu yıkamak yerine bileşiği ortamda tutmak önemlidir. Boyanın çıkarılması, reaksiyona giren bileşiğin bir konsantrasyon gradyanı üzerinde hücrenin dışına geri hareketiyle sonuçlanır. Calcein AM'nin fiziksel özellikleri, boya birikme ve hücre içinde yoğun floresan lokalizasyonlar oluşturma eğiliminde olduğundan, Calcein-AM veya Calcein'den de farklıdır. Bu boya, hücresel lokalizasyonun mümkün olduğu konfokal mikroskopi ile olanaklara sahipken, ROS ile reaksiyona giren kalsein-AM ile esterazla reaksiyona giren ürün arasında spektral olarak ayrım yapamama, bu boyanın mikroplakalarda kullanımını sorunlu hale getirir.

Şekil 17. Kalsein-AM yapısı.

Serbest radikal nitrik oksit (&bullNO), çeşitli biyolojik fonksiyonlara sahip bir dizi farklı hücre tipi tarafından üretilir. Nitrik oksit, enzim nitrik oksit sentaz (NOS) tarafından katalize edilen iki aşamalı bir işlemde L-argininin L-sitrüline oksidasyonunun bir ürünüdür. Nitrik oksit sentazın iki ana izoformu tanımlanmıştır. Nöronlarda ve endotel hücrelerinde bulunan kurucu izoform, kalsiyum ve kalmodulin bağımlı bir şekilde çok düşük miktarlarda nitrik oksit üretir. &bullNO, hedef hücrelerde çözünür guanliat siklazı aktive ederek artan cGMP seviyeleri ile sonuçlanır, bu da nöronal iletimi ve vasküler gevşemeyi kolaylaştırır ve trombosit agregasyonunu inhibe eder [54].

Makrofajlarda, fibroblastlarda ve hepatositlerde bulunan indüklenebilir izoform, inflamatuar veya mitojenik uyaranlara yanıt olarak nispeten büyük miktarlarda &bullNO üretir ve oksidatif toksisitesi yoluyla bir konakçı savunma rolü oynar [55]. Kaynağı veya rolü ne olursa olsun, serbest radikal &bullNO çok kısa bir yarı ömre sahiptir (t½= 4 saniye), normalde mevcut olan birkaç farklı molekülle reaksiyona girerek nitrat (NO) oluşturur.3 -) veya nitrit (NO2 -)

&bullNO'nun dolaylı tayini için yaygın olarak kullanılan bir yöntem, bileşimindeki nitrat ve nitrit ürünlerinin kolorimetrik olarak belirlenmesidir. Bu reaksiyon, nitratın (NO3) önce nitrite indirgenir (NO2), tipik olarak nitrat redüktazın etkisiyle (Şekil 18).

Şekil 18. Nitrat Redüktazın etkisiyle nitratın nitrite dönüştürülmesi.

Nitritin iki aşamalı bir işlemle sonraki belirlenmesi (Şekil 19), nitrat ve nitritin "toplam"ı hakkında bilgi sağlar. Hidrojen iyonlarının varlığında nitrit, bir diazonyum iyonu üretmek için sülfanilamid ile reaksiyona giren nitröz asit oluşturur. Bu daha sonra N-(1-naftil) etilendiamine bağlanarak 543 nm'de absorbe eden kromoforu oluşturur [56].

Sadece nitrit tayinleri, kolorimetrik analizden önce numunelerin indirgenmediği paralel bir analizde yapılabilir. Gerçek nitrat seviyeleri daha sonra toplamdan nitrit seviyelerinin çıkarılmasıyla hesaplanır. Bu tahlil nispeten ucuzdur ve gerçekleştirmesi kolaydır. Reaktifler kolayca elde edilir ve bu tahlil için çok sayıda ticari kit mevcuttur.

Şekil 19. Nitrat tayini için Greiss reaksiyonu.

&bullNO için Griess reaktif testinin hassasiyetini geliştirmek için bir dizi florometrik analiz geliştirilmiştir. Griess reaksiyonu gibi, dinitrojen trioksite veya nitröz aside (N2Ö3), nitritin asitlenmesiyle kendiliğinden oluşan (NO2 -). En yaygın olarak kullanılan yöntem, nispeten floresan olmayan 2, 3-diaminonaftalini (DAN) kullanarak nitröz asit ile reaksiyona girerek 375 nm uyarma dalga boyuna ve emisyon dalga boyuna sahip oldukça floresan olan 2,3 naftotriazol (NAT) oluşturur. 415 nm (Şekil 20).

Şekil 20. 2, 3-diaminonaftalin (DAN) kullanılarak nitritin florometrik tespiti.

Genetik Olarak Kodlanmış Sensörler

ROS'un gerçek zamanlı olarak yerinde araştırılması için floresan protein bazlı biyosensörler geliştirilmiştir. Bu yeni nesil canlı hücre floresan sensörleri, redoks durumundaki değişime veya spesifik hedef analitteki dalgalanmalara yanıt olarak floresanda değişiklikler üretir. Bu sensörler, tek bir floresan proteine ​​dayalı olarak genetik olarak kodlanmıştır ve başka herhangi bir reaktifin eklenmesini veya hücre lizizini gerektirmez, bu da onları çoğullamaya çok uygun hale getirir.

İndirgeme-oksidasyona duyarlı yeşil floresan proteini (roGFP), redoks duyarlı bir biyosensör örneğidir. Aequorea victoria'dan elde edilen GFP proteininin disülfid bağlarını oluşturmak için uygun pozisyonlarda beta fıçı yapısının yüzeye maruz kalan kalıntılarına iki sistein yerleştirildi. Tasarlanmış tiyollerin oksidasyon durumu, sensörün floresan özelliklerini belirler [57]. Başlangıçta, bitkilerdeki sitozol (roGFP2) gibi indirgeyici bölümlerin in vivo görüntülenmesine izin vermek için farklı roGFP versiyonları sunuldu [58], 147 ve 204 amino asit pozisyonlarında eklenen sisteinlerin en büyük değişikliği ürettiği bulundu [59]. . roGFP2'nin glutatyon için özgüllüğü, insan glutaredoksin 1'e (Grx1) [60] bağlanarak daha da arttırılır. Glutaredoksinler, substratlar tarafından oksitlenen ve glutatyon tarafından enzimatik olmayan şekilde indirgenen küçük enzimlerdir. Grx1-roGFP füzyon sensörlerini ilgilenilen organizmada eksprese ederek ve/veya proteini hücresel bir bölmeye hedefleyerek, belirli bir hücresel bölmedeki glutatyon redoks potansiyelini gerçek zamanlı olarak ölçmek mümkündür, bu da invazivlere göre önemli bir avantajdır. statik yöntemler. Bu probun doğrudan ROS bileşiklerini ölçmediğini unutmayın. Ancak oksitlenmiş/indirgenmiş (GSH/GSSG) glutatyon dengesindeki kaymayı tespit eder. Tespitle ilgili olarak, roGFP'ler, in vitro ve in vivo redoks potansiyelindeki değişikliklere yanıt olarak flüoresansta hızlı ve geri dönüşümlü rasyometrik değişiklikler gösteren ortak bir 515 emisyonu ile yaklaşık 400 ve 490 nm'de iki flüoresan uyarma maksimumuna sahiptir. Disülfid oluşumu, 510 nm'de emisyon çıkışı belirlendiğinde 488 nm uyarma sinyalleri pahasına 405 uyarma sinyali artışlarıyla GFP'nin protonlanmasıyla sonuçlanır. Böylece 405 ve 488 nm'de uyarımdan kaynaklanan floresan oranı oksidasyonun derecesini gösterir. Bu ölçüm rasyometrik olduğundan, biyosensör seviyelerindeki değişiklikler veya matris kaynaklı optik hassasiyet düzeltilir.

Şekil 21. Oransal redoks duyarlı GFP'lerin ilkesi. roGFP'lerin iki uyarma maksimumunun nispi floresan yoğunluğu redoks durumuna bağlı olarak değişir: indirgeme 400 nm'de uyarmada bir azalmaya ve 480 nm'de uyarmada bir artışa neden olur (oklar). [61]'den.

H'yi doğrudan algılamak için2Ö2 roGFP yapısı, H ile reaksiyon üzerine disülfid oluşturan bir maya proteini olan peroksidaz Orp1 ile bağlantılıdır.2Ö2bir tiyol-disülfid değişim mekanizması yoluyla roGFP'ye aktarılır [62]. Reaksiyon, hücresel tioredoksin (Trx) veya GRx/GSH sistemlerinin etkisiyle tersine çevrilebilir. Bu problar, kolay transfeksiyona izin vermek için Premo&trade takma adı (Life Technologies) altında BacMam 2.0 yapıları olarak da mevcuttur.

H'yi algılamak için başka bir yöntem2Ö2 doğrudan doğruya dairesel olarak izin verilen floresan proteinleri redoks reaktif protein alanları ile konjuge etmektir, öyle ki redoks aktivitesinin getirdiği konformasyonel değişiklikler floresan proteine ​​çevrilir. HyPer adlı böyle bir kimera, Sergey A. Lukyanov'un laboratuvarında tasarlandı [63]. HyPer, prokaryotik H'nin düzenleyici alanına yerleştirilmiş dairesel olarak izin verilen bir sarı floresan proteinden (cpYFP) oluşur.2Ö2- algılama proteini, OxyR [64, 65]. Probun geliştirilmiş bir versiyonu olan HyPer2, vahşi tip OxyR'de [64] A233V'ye karşılık gelen HyPer'den A406V tek nokta mutasyonu ile oluşturulmuştur. roGFP-Orp1 kimerasının aksine, transfer tiyol-disülfid transferi yoktur, bunun yerine iki OxyR sisteini, cpYFP parçasına transfer edilen bir konformasyonel değişikliği indükleyen tersinir bir disülfid bağı oluşturur [65]. HyPer, hidrojen peroksite submikromolar afinite gösterir ve süperoksit, oksitlenmiş glutatyon, nitrik oksit ve peroksinitrit gibi diğer oksidanlara karşı duyarsız olduğu gösterilmiştir.

Genetik olarak kodlanmış sensörler, kimerik molekülün bir parçası olarak hücresel kaçakçılık dizileri kullanılarak belirli hücresel bölmelere hedeflenebilir. Örneğin peptitler, pozitif yüklü lizinlerin ve protein yüzeyinde açığa çıkan argininlerin kısa dizilerinden oluşan nükleer lokalizasyon sinyalinin (NLS) tekrarlarının eklenmesiyle çekirdeğe hedeflenebilir. Bu diziler, nükleaza taşınmasına aracılık eden hücresel proteinler (importin &alfa ve importin & beta) tarafından tanınır. ROS sensörlerini mitokondriye, peroksizomlara veya sitoplazmaya yönlendirmek için benzer diziler kullanılabilir.

Tartışma

Reaktif oksijen türlerine olan ilgi, başlangıçta, aerobik solunumun zararlı etkileriyle ilişkili patoloji etrafında dönüyordu: mitokondrideki elektron taşıma zincirinden sızıntının neden olduğu gerekli kötülük. Bu bağlamda araştırmalar, bu ajanların yaşlanma, kronik hastalıklar ve kanserde oynadığı rolü içeriyordu.

Fagositik hücreler tarafından "oksidatif patlamanın" aslında reaktif oksijen türlerinin kasıtlı üretiminin sonucu olduğunun keşfiyle yeni bir sınır doğdu. Bunun, istilacı mikroorganizmaları öldürmek için yalnızca toksik ajanlar olarak tanımlanabilecek belirli hücrelerin ürettiği çok özel bir uygulama olduğu düşünülüyordu. Daha sonraki çalışmalar, ROS'un tüm hücre tiplerinde üretildiğini ve hem hücre içi hem de hücreler arası iletişim için önemli hücresel haberciler olarak hizmet ettiğini göstermiştir. ROS'u içeren çok karmaşık bir hücre içi düzenleyici sistemin hücreler içinde var olduğu artık açıktır. Hücreler, sinyallemenin yoğunluğuna, süresine ve bağlamına bağlı olarak ROS kısımlarına farklı şekillerde yanıt verir. Hücre içi sinyalleşme ile ilgili olarak, hidrojen peroksitin (H2Ö2) en ilginç adaydır, nitrik oksit (&bullNO) ise esas olarak hücreler arası sinyalleşme ile ilgilidir.

Başlangıçta ROS tespiti için kullanılan kimya, esas olarak absorbans ölçümüne dayalıydı. Araştırmalar genellikle doku veya tüm vücut düzeyinde oksidatif stresi değerlendirmek için glutatyon düzeylerinin ölçülmesini içeriyordu. Bilgilendirici ve kantitatif olmak için fazlasıyla yeterli olan analit absorbansına dayalı ölçümlerin milimolar seviyeleri ile. ROS'un hücre içi haberciler ve düzenleyiciler olarak kullanıldığının keşfedilmesiyle, mikromolar algılama gereksinimleri göz önünde bulundurularak yeni kimyalar geliştirildi. Bu ajanlar esas olarak floresan bazlıdır, ancak son zamanlarda lüminesan bazlı tespitler tanıtılmıştır.

Küçük moleküllü floresan sensörler veya genetik olarak kodlanmış sensörler kullanılarak görüntü tabanlı analizin ortaya çıkışı, ROS araştırmalarına ilişkin yeni anlayışlar sağlamıştır. Görüntü analizi sadece nicel bilgi sağlamakla kalmaz, aynı zamanda hücresel lokalizasyon da sağlayabilir. Bu, muhabir tasarımı veya görüntü analizi yoluyla gerçekleştirilebilir.Kimyasal ROS raportörleri veya genetik olarak kodlanmış ROS sensörleri, sırasıyla, dedektörün belirli hücresel organellere (örn., çekirdek, mitokondri, lizozomlar, vb.) Bu nedenle, görüntülerdeki herhangi bir değişiklik, doğrudan belirli bir hücresel konumla ilişkilendirilebilir. Alternatif olarak, organele özgü olmayan muhabirlerle ROS değişikliklerinin lokalizasyonu, lokasyona özgü ROS ile ilgili olmayan lekelerle birlikte yapılabilir. Ayrı renkli görüntülerin üst üste bindirilmesiyle hücresel konumlar belirlenebilir.

Hücresel ROS araştırmalarının çoğunda bildirilen en büyük zorluk, ayrı moleküller için spesifik raportör ajanların eksikliği ile olmuştur. ROS parçaları, yapıları gereği, bir dizi farklı molekülle reaktiftir, çünkü bu tür haberci ajanların tasarlanması zor olmuştur. Özellikle hidrojen peroksit için daha spesifik kimyalarla, düzenleme için spesifik mekanizmalar açıklanacaktır.


Tanıtım

Hem doğuştan hem de sonradan kazanılan kalp hastalıklarında çok sayıda miyokard hücresi zarar görür ve normal işlevleri kaybolur. Bağışlanan doku ve organlar genellikle hasarlı doku ve organların değiştirilmesi için kullanılır, ancak nakledilebilir doku ve organlara olan ihtiyaç temin edilebilir. Son zamanlarda, kalp hastalığının tedavisine yönelik klinik yaklaşımlardan biri, kalp fonksiyonlarını iyileştirmek ve yeni kılcal damarların oluşumunu indüklemek için kök hücrelerin dolaşıma enjeksiyonu veya doğrudan yaralı kalp dokusuna transplantasyonu yoluyla hasarlı dokuları onarmak ve değiştirmektir. [1–3]. Ancak, bu yaklaşım klinik deneylerde önemli bir potansiyel gösteremedi. Bu çalışmalarda test edilen kök hücre popülasyonları çok değişkendir, çünkü enjekte edilen hücreler kan akışıyla hızla yıkanır ve transplantasyondan sonra konakçı kalp dokusuyla kolayca bütünleşemez [4, 5]. Ayrıca, hücrelerin kalp dokusuna doğrudan enjeksiyonu, dolaşım yollarının olası tıkanıklıkları nedeniyle tehlikelidir ve ventriküler aritmi gibi hayatı tehdit eden daha fazla komplikasyona neden olur [6]. Bu sorunların üstesinden gelmek için hücre temelli tedaviler için yeni bir strateji gereklidir. Bu nedenle, nakledilen hücreler ve kalp dokusu arasındaki yapışmayı iyileştirmek önemlidir. Yapışmayı arttırmak için, yazarlar tarafından sıcaklığa duyarlı bir kültür tabağına sahip yenilikçi bir hücre tabakası mühendislik tekniği geliştirilmiştir [7, 8]. On yılı aşkın bir süredir, bu teknikle hazırlanan hücre tabakaları, hayvan çalışmalarında ve ayrıca kornea [9, 10], kalp [11-14], özofagus [15, 16], periodontium dahil olmak üzere klinik deneylerde çeşitli doku ve organların onarılması için uygulanmıştır. [17, 18], karaciğer [19, 20], böbrek [21], vb.

Kültür sıcaklığı 37'den 20°C'ye düşürüldüğünde, tek katmanlı bir hücre tabakası, hasat için tripsin gibi herhangi bir proteolitik enzim kullanmadan sıcaklığa duyarlı kültür kabının yüzeyinden kendiliğinden ayrılır. Bu kültür yöntemi, hücre-hücre bağlantılarının ve etkileşimlerinin korunmasına izin verir ve bazı kollajenler, lamininler, fibronektin, vitronektin, elastin ve özel proteinler dahil olmak üzere hücre dışı matris (ECM) bileşenlerini salgılayan ve organize eden hücrelerin varlığını korur [22, 23]. ECM, hücre yapışması ve doku organizasyonu için yapısal destek sağlar. Bu nedenle, hücre tabakaları, dikiş gibi herhangi bir mekanik cihaz kullanmadan çeşitli doku ve organlara doğrudan nakledilebilir. Bu yöntem, tek hücre süspansiyon enjeksiyonundan daha üstündür ve hücre tabakasında ECM'nin korunması, hücrenin hayatta kalmasını, şeklini, çoğalmasını, göçünü ve farklılaşmasını etkileyerek hücre davranışını düzenler [24]. ECM, doku rejenerasyonunun erken aşaması için çok önemlidir.

Son yıllarda, en yaygın hücre kaynaklarından biri olan MSC'ler, karmaşık doku ve çoklu hücre tiplerinden oluşan iç organları yenilemek için araştırılmaktadır [1]. Hayvanlarda yapılan ön araştırmalar, hasarlı kalp dokusuna nakledilen mezenkimal kök hücrelerin faydalı etkileri olabileceğini göstermektedir [2]. Yazarların sonuçları, sıcaklığa duyarlı bir tabakta kültürlenen yağ dokusundan türetilen MSC'lerin, sıçanların enfarktüslü miyokardını onarmak için kullanılabilecek bir hücre tabakası oluşturabildiğini bildirmiştir [11]. Fare ve sıçan modellerinde araştırılmış olmasına rağmen, küçük hayvan deneyleri, sonuçlarını insanlara tahmin etmek için yetersizdir. Bu uygulamanın domuz gibi daha büyük hayvan modellerinde uygulanabilir olduğunun gösterilmesi gerekmektedir. Bu sonuçlar, insan kalp hastalıklarının tedavisine yönelik klinik uygulama için bu tekniğin kullanımını teşvik edecektir. Açık kalp ameliyatı sırasında nakledilen hücre tabakalarının hasarlı kalp dokusuna sıkıca yapışması için gereken süreyi belirlemek de önemlidir.

Bu çalışmada, domuz kemik iliğinden elde edilen MSC tabakaları sıcaklığa duyarlı tabaklar üzerinde kültürlendi ve elde edilen hücre tabakaları kalbin sol ventrikülüne nakledildi. Başarılı bir yapışma elde etmek için gereken minimum süreyi belirlemek için hücre tabakası ve kalp dokusu arasındaki yapışma histolojik olarak incelendi. Ek olarak, maksimum yapışmayı elde etmek için hücre yaprağının hangi ECM bileşeninin gerekli olduğunu doğrulamak için hücre yaprağının bazal tarafı veya apikal tarafı kalp dokusu ile temas halinde olacak şekilde transplantasyon da yapıldı. Bu çalışma, MSC tabakalarının miyokarda başarılı bir şekilde transplantasyonu için klinik kanıt ve parametreler sağlayan ilk rapordur ve bu çalışmada elde edilen bilgiler, kardiyovasküler hastalıklar için potansiyel bir hücre bazlı tedavi olarak hücre tabakası teknolojisinin geliştirilmesinde kritik bir adımdır.


Yazar bilgileri

Bağlantılar

Kök Hücre ve Rejeneratif Tıp Merkezi, Zhejiang Üniversitesi Tıp Fakültesi, Hangzhou, 310058, Çin

Xiaoping Han, Haide Chen, Daosheng Huang, Lijiang Fei & Guoji Guo

Hematoloji Enstitüsü, 1. Bağlı Hastane, Zhejiang Üniversitesi Tıp Fakültesi, Hangzhou, 310003, Çin

Xiaoping Han, He Huang ve Guoji Guo

Dr. Li Dak Sum & Yip Yio Chin Kök Hücre ve Rejeneratif Tıp Merkezi, Zhejiang Eyaleti Doku Mühendisliği ve Rejeneratif Tıp için Anahtar Laboratuvarı, Hangzhou, 310058, Çin

Biyoistatistik ve Hesaplamalı Biyoloji Bölümü, Dana-Farber Kanser Enstitüsü, Harvard Chan Halk Sağlığı Okulu, Boston, MA, 02115, ABD

Huidong Chen & amp Guo-Cheng Yuan

Hayvan Bilimi Koleji, Zhejiang Üniversitesi, Hangzhou, 310058, Çin

Bilgisayar Bilimi ve Teknolojisi Bölümü, Tongji Üniversitesi, Şanghay, 201804, Çin

Yaşam Bilimleri Fakültesi, Zhejiang Üniversitesi, Hangzhou, 310058, Çin

Kök Hücre Enstitüsü, Zhejiang Üniversitesi, Hangzhou, 310058, Çin

Xiaoping Han, Daosheng Huang, Lijiang Fei, He Huang ve Guoji Guo

Bu yazarı PubMed Google Scholar'da da arayabilirsiniz.

Bu yazarı PubMed Google Scholar'da da arayabilirsiniz.

Bu yazarı PubMed Google Scholar'da da arayabilirsiniz.

Bu yazarı PubMed Google Scholar'da da arayabilirsiniz.

Bu yazarı PubMed Google Scholar'da da arayabilirsiniz.

Bu yazarı PubMed Google Scholar'da da arayabilirsiniz.

Bu yazarı PubMed Google Scholar'da da arayabilirsiniz.

Bu yazarı PubMed Google Scholar'da da arayabilirsiniz.

Bu yazarı PubMed Google Scholar'da da arayabilirsiniz.

Katkılar

XH ve HC, EB ve hematopoietik farklılaşma dahil deneyler tasarladı ve yürüttü. HH, hematopoietik farklılaşma için kılavuz sağladı. HC, DH, HC, LF ve CC verileri analiz etti ve istatistiksel analiz yaptı. GG ve GY, çalışmayı tasarladı ve denetledi ve makaleyi yazdı. Tüm yazarlar son makaleyi okudu ve onayladı.


SONUÇLAR

Organlar ve yaşlar arasında vasküler mikro ortamların heterojenliği

Doku mikroçevrelerindeki yaşa bağlı değişiklikleri anlamak için test ettik.

Seçilen örneklerde doku çapında dağılımlarını anlamak için endotel hücre (EC), perisit, stromal hücre ve matrisi haritalamak için 100 antikor. Daha sonra seçtik

Bu antikorların 50 tanesi vasküler mikro-ortamları tanımlamada en bilgilendiriciydi ve analizi böbrek, rektus femoris kası, dalak, timus, karaciğer, akciğer, rahim, kalp, mesane, beyin, deri ve bağırsak boyunca genişletti. Bu organları ve dokuları kapsayan kalın uzunlamasına bölümler oluşturuldu ve birincil antikorların (tablo S1) optimal florofor etiketli ikincil antikor kombinasyonları ile eşleştirilmesiyle çoklu immün etiketlemeye tabi tutuldu. Bu antikorlar tarafından işaretlenen çalışma koşulları ve hücre tipleri hakkında tam bilgi ve negatif kontrollerin örnek görüntülerini sunuyoruz (tablo S1 ve şekil S1A).

EC belirteçleri Endomucin (Emcn), Endoglin (CD105), CD31 (PECAM1) ve CD102 (ICAM2) damar yoğunluğu analizi için de kullanıldı, Tie-2, Bcam1, VEGFR2 (vasküler endotelyal büyüme faktörü reseptörü 2 gibi diğer hücre yüzeyi belirteçleri) ) ve Podocalyxin kan damarlarını görüntülemek ve analiz etmek için kullanıldı. Arter kantifikasyonları için α–Düz kas aktin (α-SMA) boyaması kullanıldı ve perisitler trombosit türevli büyüme faktörü reseptörü β (PDGFRβ) ve nöral/glial antijen 2 (NG2) ile tanımlandı. Genç ve yaşlı dokulardaki fibroblastları görüntülemek için fibroblasta özgü protein-1 (FSP1) ve Podoplanin antikorları kullanıldı. Matriksi tanımlamak için HSPG2, Laminin, Collagen IV ve Vimentin kullanıldı. Mezenkimal hücreleri görüntülemek için Desmin, Decorin, PDGFRa ve SM22a kullanıldı. Kesitlerin üç boyutlu (3B) karo taramaları, tek hücre çözünürlüğüne sahip bir lazer taramalı konfokal mikroskopta oluşturulmuştur (Şekil 1, A ve B). Farklı organlardan alınan örnek karo taramaları, EC'lerin, perisitlerin ve mezenkimal stromal hücrelerin organizasyonunu, ekspresyon modellerini ve uzamsal dağılımlarını gösterdi ve vasküler mikro-ortamların 3D haritalarının oluşturulmasını sağladı (Şekil 1B). Daha sonra, karo taramalı 3D görüntülerden (Şekil 1C ve Şekil S1B) tek hücre düzeyinde bilgi sağlayan ilgi alanları (ROI'ler) üzerinde hesaplamalı yüzey oluşturma gerçekleştirildi. Ayrıca, bu yüksek çözünürlüklü görüntüler, tek hücre çözünürlüğünde lokalizasyon ve hücre-hücre ve hücre-matris etkileşimlerinin analizine izin verdi (Şekil 1C ve şekil S1B). Örneğin, korteksteki kılcal damarların medulla bölgelerine karşı yapısal heterojenliği, böbreğin karo taramaları ile vurgulanmıştır (Şekil 1C). Bu görüntülerle kanıtlandığı gibi, Desmin eksprese eden stromal hücreler esas olarak medulla bölgesine lokalizeydi, ancak böbreğin korteksine değil (Şekil 1C). Buna karşılık, Podoplanin glomerül bölgesiyle sınırlıydı (Şekil 1C). Benzer şekilde, İzolektin ifadesi korteks bölgesi ile sınırlandırılmıştır (Şekil 1C). Bu tür yüksek çözünürlüklü karo tarama görüntüleme, yaşa bağlı değişiklikleri araştırmak için genç ve yaşlanan farelerin çeşitli organlarına uygulandı. Genç farelere karşı yaşlı farelerden elde edilen böbreklerden alınan örnek 3D karo tarama görüntüleri yaşa bağlı değişiklikler sergilemiştir (Şekil 1D). Organ ve yaşa bağlı heterojenlik, 3B tüm organ doku haritalarının analizi yoluyla ortaya çıkarıldı. 1000'den fazla bu tür 3B doku haritası (yaklaşık 6 terabayt veri) ücretsiz bir kaynak olarak indirilebilir (tablo S2) ve OMERO web arayüzü (http://homeros.kennedy.ox.ac.uk/) aracılığıyla daha fazla analiz yapılabilir. pub/chen-et-al-2021-3dOrgans).

(A) Genç ve yaşlı vahşi tip (WT) farelerde analiz edilen organların şematik gösterimi. Multipleks boyama (üç ila beş antikor) yapıldı ve konfokal mikroskopi ile tüm organ döşeme tarama görüntüleri elde edildi. Bundan fazla

Çalışma sırasında, paylaşılan bir veri tabanı olarak mevcut tüm ham verilerle 1000 tarama elde edildi. (B) Belirtildiği gibi antikorlarla boyanmış genç farelerden alınan kas, dalak, kalp, mesane, bağırsak, cilt, rahim, karaciğer, timus ve akciğerin temsili görüntüleri. Sağdaki ekler, farklı organlardaki belirli alanların yüksek oranda büyütüldüğünü gösterir. (C) Desmin, Podoplanin, Isolectin ve CD102 ile boyanmış genç bir fare böbreğinin temsili tek hücreli çözünürlüklü 3D görüntüleri. Ekler (orta), böbrekteki belirli bölgelerin yüksek oranda büyütüldüğünü gösterir. Sağdaki yıldız işareti, tüm işaretçiler için yüzey işleme ile daha yüksek büyütmeleri gösterir. (NS) Podocalyxin, SM22α ve CD102 ile immüno-lekelenmiş genç ve yaşlı böbreğin örnek 3D görüntüleri. Ekler, kan damarı yüzeyinin böbrek cisimcikleri (RC) etrafında mavi anahatlar oluşturduğu daha yüksek büyütmeler gösterir. Çekirdekler: TO-PRO-3 veya belirtildiği gibi DAPI. Ölçek çubukları, (B'den D'ye) Kas, rahim, mesane, cilt, bağırsak ve timusun karo taramaları için 200 μm dalak, böbrek, kalp, akciğer ve karaciğer insetleri için 400 μm, 50 μm ve tek hücre çözünürlüklü görüntüler , 10 um.

Farklı vasküler hücre tiplerinin, doğal ortamlarında hücre-hücre ve hücre-matriks etkileşimleriyle toplu olarak spesifik 3B organizasyonu ve uzaysal dağılımı, bir organ içindeki işlevlerini etkiler ve belirler.13, 14). Örneğin, timus, hücresel bileşimde ve doku mimarisinde yaşa bağlı belirgin değişikliklerle organ yaşlanması için bir model sağlar ve bu, timus boyutunun azalmasına ve T hücresi gelişimini destekleme işlevinin kaybına yol açar (15). Kan damarları, dokuya özgü bölgesel oksijenlenme durumunu ve hipoksik kompartmanları içeren timusta metabolik mikro-ortamları korur.16). Ayrıca, timustaki doku kaynaklı sinyaller, damar ağının büyümesini düzenler ve bu da T hücresi gelişimi için koşulları oluşturur (17, 18). Timus görüntü veri tabanımızdaki genç farelerden alınan timusun 3 boyutlu haritalarının kapsamlı bir incelemesi, kılcal damar organizasyonu ve korteks ve medulla bölgelerindeki dağılımdaki farklılıkları vurguladı (şekil S1, C'den E'ye). Çok sayıda EC belirteci ile immün boyama, medulla ile karşılaştırıldığında kortekste daha yüksek bir kan damarı yoğunluğu gösterdi (şekil S1, C ve D). Ayrıca arter dalları kortekse girdi ve kortikal kılcal damarlara bağlandı (şekil S1C). Kılcal dağılımlar ve yoğunluk ile uyumlu olarak, hipoksi ile indüklenebilir faktör la (HIF1a) immün boyama, medulla hipoksik iken korteksin oksijenlendiğini gösterdi (şekil S1C). Dikkate değer bir başka özellik, korteksin değil, medullanın SM22a ve Desmin eksprese eden mezenkimal stromal hücreler ve FSP1 ve Podoplanin ekspresyonu ile tanımlanan fibroblastlarla doldurulmasıydı (şekil S1, D ve E). Dahası, korteks değil medulla, Collagen IV ve Laminin gibi çoklu hücre dışı matris proteinleri ve adezyon kompleksi ile ilişkili proteinler Vimentin ve Vinculin (şekil S1, D ve E) bakımından zengindi. Bu nedenle, çok sayıda belirteç analizine sahip tek hücreli çözünürlüklü 3B doku haritalarımız, bölgesel hücre dışı matris ve hücre dağılımlarının heterojenliği hakkında kapsamlı bilgi sağladı. Bu vasküler haritaların birkaçı tablo S3'te sunulmaktadır.

Farelerde ve insanlarda yaşlanan dokularda vasküler ve perisit bolluğu kaybı

Ardından, genç ve yaşlanan organları kapsamlı bir şekilde görüntüledik ve karşılaştırdık. Bölgesel farklılıklar, hücre ve matris belirteçlerinin ifadesi, kan damarı dağılımları, kan damarı yoğunluğu, kılcal damar çapları, atardamar çapları ve atardamar sayıları için görüntülerin analizini gerçekleştirdik (Şekil 2 ve şekiller S1, F ila H ve S2 ila S5). Hematoksilen ve eozin (H&E) boyaması yaşlı dokuların sağlıklı durumunu doğruladı (şekil S2A). Bu analiz, çok sayıda organın vasküler bollukta yaşa bağlı dikkate değer bir kayıp sergilediğini ortaya çıkardı (Şekil 2A ve şekil S2, B'den D'ye). a-SMA boyama ile belirlenen arteriyel sayılar, böbrek, dalak, timus, karaciğer ve kalp dahil olmak üzere yaşlanan murin organlarında azaldı (Şekil 2A ve şekil S2, B ve D). Ek olarak, yaşlandıkça böbrek, kas, dalak, timus, karaciğer ve beyinde mikrovasküler yoğunluk azaldı (Şekil 2A ve Şekil S2B). Ayrıca, çok sayıda EC belirteci analizimiz, vasküler yoğunluktaki düşüşün, belirli hücre yüzeyi belirteçlerinin ekspresyonundaki düşüşün bir eseri olmadığını doğruladı. Vasküler yoğunluğun azalmasına ek olarak, bir diğer dikkat çekici özellik bu organlardaki PDGFRβ + perisitlerin kaybıydı (Şekil 2B ve Şekil S2C). Farklı dokular arasındaki vasküler değişikliklerin araştırılması, hücre ve matris belirteçlerinde dokuya özgü yaşa bağlı başka değişiklikleri de gösterdi. Örneğin, hem timus hem de dalak, yaşlanma üzerine artan Desmin eksprese eden hücreler gösterdi (şekil S1G, S4, C ve D ve S5B). Böbrekteki temel bir mimari değişiklik, yaşlanmayla birlikte renal korpüskül sayılarının azalması ve renal korpüskül boyutunun artmasıyla ilgiliydi (şekil S5A). Buna karşılık, değerlendirilen organlardan deri, bağırsak, rahim ve akciğer gibi yüksek yeniden şekillenme kapasitesine sahip dokular, yaşlanma üzerine damar yoğunluğunda belirgin bir değişiklik göstermedi (Şekil 2C ve şekil S5K). Böylece, 12 organdan 9'u (böbrek, kas, dalak, timus, kalp, karaciğer, beyin, mesane ve akciğer) yaşa bağlı vasküler yıpranma gösterirken, geri kalan organlar (bağırsak, deri ve rahim) yaş göstermedi. ilgili vasküler değişiklikler (Şekil 2D ve şekil S2, B'den D'ye ve S5K). Böbrek, kas, dalak ve timus, hem damar yoğunluğu kaybında hem de perisit kaybında en belirgin değişiklikleri gösterdi. Bu nedenle, yaşa bağlı bu tür vasküler yıpranmanın altında yatan sonraki moleküler ve fonksiyonel analiz için, bu üç ila dört organdan oluşan çekirdek sete odaklandık.

(A ve B) Belirtildiği gibi immün boyama ile genç ve yaşlı böbrek, kas, dalak ve timusun temsili 3D karo taramaları. Ok uçları arterleri temsil eder. Yıldız işaretleri, yüzeyde işlenmiş kılcal damarları gösteren daha yüksek büyütmeli ekleri belirtir. (A) Damar yoğunluğu miktarlarını gösteren birleşik grafikler (sağda) (n = 5). (B) Kombo grafikler (altta) genç ve yaşlı böbrek, kas, dalakta PDGFRβ + perisitlerin miktarlarını gösterir (n = 5) ve timus (n = 6). (C) Kombo grafikler genç ve yaşlı cilt, bağırsak, rahim ve akciğerdeki damar yoğunluğu miktarlarını gösterir (n = 5). (NS) Diyagram, yaşa bağlı vasküler düşüşe sahip dokuz organı ve yaşa bağlı vasküler değişiklikleri olmayan üç organı göstermektedir. NS P iki kuyruklu eşleştirilmemiş değerden türetilen değer T Tüm grafikler için testler verilmiştir. ns, önemli değil, *P < 0.05 **P < 0.01 ***P < 0,001 ****P < 0.0001. Çekirdekler: DAPI veya TO-PRO-3. Birleşik çizimde, kutu ortalama ± SD'yi temsil eder, kutudaki satır medyanı temsil eder, alt ve üst satırlar minimum ve maksimum değerleri gösterir ve kutunun sağ tarafındaki satır örnek dağılımını temsil eder. Ölçek çubukları, (A) dalak ve böbreğin karo taramaları, timus ve kas için 400 μm, insetler için 200 μm 50 μm (B) 20 μm.

Ayrıca, bitişik EC'lerin çekirdekleri arasındaki mesafe analizi ile belirlendiği gibi, yaşlanan dokulardaki EC'lerin boyutundaki yaşa bağlı uzama ve artışa rağmen vasküler kayıp gözlendi (Şekil 3A ve şekil S5L). Bir proliferasyon markörü Ki67 ile floresanla aktive olan hücre sınıflandırması (FACS) miktarları ile EC proliferasyonunun analizi, prolifere olan EC'lerde yaşa bağlı bir düşüş gösterdi (şekil S6, A ve B).Görüntüleme tabanlı TUNEL testi ile apoptotik hücre ölümünün analizi (şekil S6C), timus ve kasta EC apoptozunda bir artış olduğunu gösterdi, ancak böbrek ve dalak dokularında değil, yaşa bağlı vasküler regülasyonda organa özgü mekanizmaların dahil olduğunu düşündürdü. kayıp.

(A) 3D görüntüler (solda) genç (6 haftalık) ve yaşlı (60 haftalık) fare böbrek, kas ve dalağındaki kan damarlarını gösterir. Birleşik grafikler (sağda), genç ve yaşlı organlarda (böbrek, n = Yedi biyolojik kopya kastan 42, n = Sekiz biyolojik kopya dalaktan 47, n = yedi biyolojik kopyadan 37). (B) α-SMA, PDGFRβ ve Endoglin ile boyanmış genç ve yaşlı insan dokusunun temsili görüntüleri. Birleşik grafikler (sağda) böbrekte damar yoğunluğunda önemli bir düşüş gösterir (n = 5), kas (n = 5) ve dalak (n = 4) yaşlanma üzerine. Birleşik grafikler (sol alt), genç ve yaşlı insan böbrek ve kasındaki PDGFRβ + hücrelerinin miktarlarını gösterir (n = 5). Birleşik çizim (sağ alt), genç ve yaşlı insan dalağındaki a-SMA kapsamının (%) miktarını gösterir (n = 4). (C) Genç ve yaşlı insan derisi dokusunun temsili görüntüleri. Birleşik çizim (sağda) genç ve yaşlı ciltte damar yoğunluğunun miktarını gösterir (n = 4). Veriler, ortalama ± SD'yi temsil eder. NS P iki kuyruklu eşleştirilmemiş değerden türetilen değer T Tüm grafikler için testler verilmiştir. *P < 0.05 **P < 0.01 ***P < 0,001 ****P < 0.0001. Çekirdekler: DAPI veya TO-PRO-3. N, çekirdekler. Ölçek çubukları, (A) 20 μm ve 10 μm iç kısımlar için (B ve C) 40 μm.

Perisit kaybının damar bütünlüğü üzerindeki etkisini değerlendirmek için damar sızıntısı analiz edildi. Yaşlanan 55 haftalık farelerin dokularında hiçbir vasküler sızıntı belirtisi gözlenmedi (şekil S6D). Yaşa bağlı damar yoğunluğu kaybının dokuların oksijenlenme durumu üzerindeki etkisini analiz etmek için bu dört organın (böbrek, kas, dalak ve timus) bölümlerinde pimonidazol boyaması yaptık. Yaşlanan kas ve dalak artan hipoksi gösterirken, timus ve böbrek hiçbir değişiklik göstermedi (şekil S6E). Bu nedenle, vasküler kaybın hipoksi üzerindeki bu etkileri organa özgüydü. Vasküler bollukta yaşa bağlı bir kayıp olsa da, LYVE-1 ve PROX-1 ile lenfatik damarların analizi, lenfatik damar yoğunluğunda hiçbir değişiklik göstermedi (şekil S7, A'dan D'ye). LYVE-1 makrofajlar tarafından da eksprese edildiğinden, lenfatik damarlar tübüler şekillerine göre ayırt edildi. CD68 veya F4/80 immüno-lekelemeleri ile makrofaj sayılarının miktarları yaşla birlikte herhangi bir değişiklik göstermedi (şekil S7E).

Fare dokularında gözlemlenen yaşa bağlı değişikliklerin patofizyolojik ilişkisini anlamak için insan doku örneklerini analiz ettik. Genç (<20 yaş) ve yaşlanan (>70 yaş) bireylerin sağlıklı insan dokuları (tablo S4), endotelyal ve perisit belirteçleri için immünohistokimya gerçekleştirilerek vasküler değişiklikleri anlamak için analiz edildi (Şekil 3B). Kemirgen dokularıyla karşılaştırıldığında, yaşlanan insan böbreği, kası ve dalak damar yoğunluğu ve perisit sayılarında önemli bir düşüş sergilerken (Şekil 3B), farelere benzer şekilde yaşlanan insan derisi damarları korudu (Şekil 3C). Bu nedenle, cilt gibi yüksek rejenerasyon potansiyeline sahip yüksek oranda yeniden şekillenen dokular, yaşlanma sırasında kan damarı yoğunluğunu korurken, diğer dokular yaşa bağlı vasküler yıpranma gösterir. Böbrek gibi diğer organlara kıyasla nispeten yüksek rejenerasyon potansiyeline sahip olan karaciğer, farede yaşa bağlı bir vasküler düşüş gösterdi (şekil S2, B ve D), ancak insan karaciğeri yaşlanma üzerine vasküler yoğunluğunu korudu (şekil S7F). Bu nedenle, yukarıdaki veriler, yaşlanan murin ve insan dokularının temel bir özelliği olarak organa özgü vasküler bolluk kaybını göstermiştir.

Vasküler yıpranma, hücresel yaşlanmanın habercisidir

Çok sayıda organda gözlenen yaşa bağlı vasküler değişikliklerin, yaşlanmayla birlikte hücresel bozulmanın sonucu olup olmadığını sorgulamak için, doku düzeyindeki bu vasküler değişikliklerin fare ömründe baskın olmaya başladığı zaman noktasını araştırdık. Bunun için farklı yaş gruplarındaki farelerden alınan organlar analiz edildi. Hem kan damarı yoğunluğundaki hem de PDGFRβ + perisit sayılarındaki düşüş, 30 haftalık farelerde zaten belirgindi (Şekil 4A). Yaşlanan hücrelerin birikmesi, yaşlanan dokuların bir özelliğidir (19) ve hücresel yaşlanma, kademeli telomer kısalması nedeniyle kararlı hücre döngüsü durması ile işaretlenir (20) ve derepresyonu INK4/ARF yer (21). Bu nedenle, CDKN2A lusiferaz raportör fareleri kullanarak yerleşik bir yaşlanma belirteci olan p16/CDKN2A olan INK4 ailesinin bir üyesini analiz ettik (22). Lusiferaz/CDKN2A immün boyama, 30 haftalık farelerden alınan doku kesitlerinde negatifti (şekil S7G), ancak yaşlı dokularda lusiferaz/CDKN2A ekspresyonu saptandı (şekil S7G). Benzer şekilde, CDKN2A için enzime bağlı immünosorbent deneyi (ELISA) analizi, 10 ve 30 haftalık farelere kıyasla 55 haftalık farelerde veya 90 haftalık farelerde CDKN2A seviyelerinin arttığını gösterdi (Şekil 4B) .

(A) Damar yoğunluğu için böbrek, kas, dalak ve timusun çubuk grafikleri (üst, n = 5) ve PDGFRβ + hücreleri (altta, n = 4 veya 5). (B) Çubuk grafikler, dokularda ELISA ile ölçülen CDKN2A konsantrasyonunu gösterir. p16LUC 10, 30, 55 ve 90 haftalık fareler (n = 5). (C) 10 ve 30. haftalarda timusta ve pozitif kontrolde (Luperox ile tedavi edilen) PE-Texas red-A'ya (DHE + hücrelerini temsil eden) karşı yan saçılım alanının (SSC-A) temsili FACS grafikleri. Farklı yaşlardaki dokularda (böbrek ve dalak, n = 5 diğer, n = 4). (NS) 10, 30 ve 55 haftalarda timus MSPC'lerinin temsili FACS grafikleri. Farklı yaşlarda dokularda MSPC'lerin (%) miktarını gösteren çubuk grafikler (n = 5). (E) timusun 3 boyutlu görüntüleri Vegfr2 iΔEC (M) ve yavru kontrol (C) fareleri, belirtildiği gibi immüno-lekelendi. CDKN2A konsantrasyonunun, MSPC'lerin (%) ve fibroblast sayılarının (n = 5). Veriler, ortalama ± SD'yi temsil eder. NS P iki kuyruklu eşleştirilmemiş değerden türetilen değer T testler iki grup için ve ikiden fazla grup için Tukey çoklu karşılaştırma testi ile tek yönlü ANOVA testi verilmektedir. *P < 0.05 **P < 0.01 ***P < 0,001 ****P < 0.0001. Ölçek çubukları, (E) 50 μm.

Çeşitli veriler, yaşlanmada reaktif oksijen türlerinin (ROS) rolünü ortaya koymaktadır ve yaşlı hücreler tipik olarak artan ROS birikimini göstermektedir. Bu artan ROS üretimi, yaşlanmayla birlikte mitokondriyal işlev bozukluğu nedeniyle oluşur ve bu da daha fazla mitokondriyal dejenerasyona ve küresel hücresel hasara yol açar.23). Bu nedenle, farklı yaş gruplarındaki farelerden alınan dokulardaki hücresel ROS'u analiz ettik (Şekil 4C). ROS, canlı hücrelerde süperoksit ve hidrojen peroksit ile reaksiyondan sonra floresan hale gelen floresan probu dihidroetidyum (DHE) kullanılarak tespit edildi.11). DHE'nin akış sitometrik analizi, 10 haftalık farelere kıyasla 30 haftalık farelerin dokularında ROS birikiminde önemli bir artış göstermedi (Şekil 4C). Organik bir peroksit olan Luperox, pozitif kontrol olarak kullanıldı.

Organların rejeneratif kapasitesindeki azalma, yetersiz çoğalmaları nedeniyle çoklu dokulardaki yetişkin kök hücrelerinin fonksiyonel azalmasının neden olduğu memeli yaşlanmasının belirgin bir özelliğidir.24). Farklı yaş gruplarına sahip farelerde kök hücrelerin durumunu analiz etmek için, mezenkimal kök/progenitör hücreleri (MSPC'ler) çok sayıda dokuda bulundukları ve perivasküler bir konuma sahip oldukları için analiz ettik ve nicelleştirdik (25). MSPC'lerin CD45 − /Ter119 − /CD31 − /Sca-1 + /CD140a + ( olarak akış sitometrik analizi26), 10 ve 30 haftalık fareler arasında MSPC sıklığında önemli bir farklılık göstermezken, 55 ve 90 haftalık fareler MSPC'lerde bir düşüş gösterdi (Şekil 4D). Yaşlanmanın diğer bir özelliği, sıklıkla interlökin-6 (IL-6) ve IL-1β düzeylerindeki artışla ilişkili olan kronik düşük dereceli inflamasyonun varlığıdır.27). IL-6 için ELISA analizi, yaşlanan 55 haftalık dokularda IL-6 seviyelerinin arttığını gösterdi, ancak vasküler değişiklikler ortaya çıktığında 30 haftalık dokular kadar erken değil (şekil S7H). Yukarıdaki sonuçlar, vasküler ve perisit kaybının fare yaşam süresinin erken döneminde meydana geldiğini ve yaşlanmanın hücresel özelliklerinden önce geldiğini gösterdi. Yaşlanma ve strese bağlı dokuya özgü vasküler ve diğer hücresel değişiklikler tablo S5'te verilmektedir. Bu nedenle, gözlenen yaşa bağlı vasküler yıpranma, yaşlanmayla ilişkili hücresel bozulmanın bir sonucu değildi.

Daha sonra, vasküler değişikliklerin yaşlanmanın hücresel özelliklerini etkileyip etkilemediğini inceledik. VEGFA-VEGFR2 sinyali, fizyolojik ve patolojik neoanjiyogenezin kritik bir itici gücüdür ve EC'lerde VEGFR2'nin kaybı, anjiyogenezi ve vasküler yeniden şekillenmeyi engeller (28). Bu nedenle, VEGFA-VEGFR2 sinyalleşmesine müdahale etmenin etkisini inceledik. Spesifik olarak, EC'ye özgü işlev kaybı fareleri oluşturduk (Vegfr2 iΔEC ) loxP-yanlı Vegfr2 alellerini birleştirerek (Vegfr2 loxP/loxP ) ve Cdh5(PAC)-CreERT2 transgenikleri. Yetişkin 8 haftalık farelerde tamoksifen uygulamasının ardından, böbrek, kas, dalak ve timus dokularının analizi Vegfr2 iΔEC fareleri, 11 haftalıkken gerçekleştirildi. Silme etkinliği, kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) ile doğrulandı: Vegfr2 (şekil S7I). gelen dokular Vegfr2 iΔEC mutant fareleri, kan damarlarının ve PDGFRβ eksprese eden perisitlerin kaybını gösterdi (Şekil 4E ve şekil S7J). Artan CDKN2A seviyeleri, mutant farelerde, kendi yavruları olan kontrol farelerine kıyasla tespit edildi (Şekil 4E). Bu sonuçlar, yaşlanan hücre birikiminin vasküler kayıp ile ilişkili olduğunu gösterdi. Bununla birlikte, sıralanmış EC'lerde CDKN2A seviyeleri değişmeden kaldı. Vegfr2 iΔEC fareleri, kendi yavru kontrolleriyle karşılaştırıldığında, vasküler kayıp doku mikroçevresindeki hücresel yaşlanma ile ilişkiliyken, EC'lerin kendilerinin bu farelerde yaşlanmaya tetiklenmediğini gösterir (şekil S7K). Ek olarak, Vegfr2 iΔEC mutant fareleri, MSPC sayılarında bir düşüş sergiledi (Şekil 4E), ancak bir fibroblast birikimi oldu (Şekil 4E). Bu nedenle, yukarıdaki sonuçlar, vasküler bozulmanın, yaşlanmanın hücresel özelliklerini etkilediğini ve küresel hücresel bozulmaya yol açtığını gösterdi.

Perisitlerin fibroblastlara yaşa bağlı farklılaşması

Fare organlarındaki vasküler mikro ortamların analizi, yaşlanma üzerine fibroblast belirteçleri için artan immüno-lekeleme gösterdi, yani Podoplanin ve FSP1 (2931) (Şekil 5A ve şekil S8A). ek olarak Vegfr2 iΔEC mutant fareleri, önemli ölçüde artan fibroblast sayıları gösterdi (Şekil 4E). Ayrıca, fibroblastların nicelenmesi, yaşlanan dokulardaki FSP1-pozitif fibroblastlarda önemli bir artış gösterdi (Şekil 5A). Benzer şekilde, FSP1 ekspresyonuna dayalı olarak insan dokularında belirlendiği gibi fibroblast sayılarının analizi ve nicelenmesi, genç donörlere kıyasla yaşlanan donörlerden alınan dokularda artan fibroblastlar gösterdi (Şekil 5B). Ayrıca, FSP1 ve anjiyogenezi inhibe eden bir matris proteoglikan olan Decorin'in örtüşen ekspresyonu, yaşlanan dokularda artmıştır (şekil S8B).

(A) Fare dokularında FSP1 boyama ve fibroblast sayıları (n = 7). (B) İnsan dokularında FSP1 boyama ve fibroblast miktarları (n = 5). (C) FSP1 immün boyama PDGFRβ-P2A-CreERT2 ROSA26-td-Domates fareler. Yıldız işaretleri, tek hücreli çözünürlükte bölgelerin daha yüksek büyütüldüğünü gösterir. Birleşik grafikler domates + /FSP1 + hücre numaralarını gösterir (n = 4 veya 5). (NS) FSP1 boyaması ve domates + /FSP1 + hücre sayılarının kantifikasyonları NG2-CreERTM ROSA26-td-Domates genç ve yaşlı kas (n = 5). (E) Kontrol ve fibrozis böbreğinde FSP1 boyaması ve PDGFRβ kapsamının miktarları ve domates + /FSP1 + hücre sayıları (n = 4). (F) sinovyal eklemlerde FSP1 immün boyama ve kantifikasyonları PDGFRβ-P2A-CreERT2 ROSA26-td-Domates kontrol ve RA fareleri (n = 4). (G) Belirtildiği gibi immüno-lekelenmiş genç ve yaşlı fare eklemlerinin 3D görüntüleri. Birleşik grafikler damar yoğunluğunu gösterir (n = 5) ve PDGFRβ + hücre numaraları (n = 4). Veriler, ortalama ± SD'yi temsil eder. NS P değer, iki kuyruklu eşleştirilmemiş değerden türetilir T testler. *P < 0.05 **P < 0.01 ***P < 0,001 ****P < 0.0001. Sarı kutular, ekleri daha yüksek büyütmede gösterir. Ok uçları domates + /FSP1 + hücrelerini temsil eder. fm, femur tb, tibia sy, synovia. Çekirdek: DAPI. Ölçek çubukları, (A ve B) 40 μm (D) 50 μm (C, E ve F) karo taramaları, 250 μm ek parçalar, 50 μm (G) 50 μm.

Yaşlanan dokular bir fibroblast genişlemesi (Şekil 5, A ve B) ancak perisitlerde bir azalma (Şekil 2B ve 4A) sergiledi, bu nedenle yaşa bağlı perisit kaybının fibroblastlara farklılaşmalarından kaynaklandığını düşündük. Bunu incelemek için, hücre kaderi ve farklılaşmasının araştırılması için güçlü bir yaklaşım olduğu için genç ve yaşlanan farelerde perisitlerin genetik soy takibini gerçekleştirdik (32). Tamoksifen enjeksiyonları genç (6 haftalık) ve yaşlı (55 haftalık) hastalara uygulandı. PDGFRb-CreERT2 x ROSA26 td-Domates çift ​​transgenik (Şekil 5C). Tamoksifen uygulamasından sonra 11. günde farelerin analizi, hem genç hem de yaşlanan farelerde perisitlerde domates ekspresyonuna ve beklendiği gibi yaşlanan farelerde bir düşüşe yol açtı (Şekil 5C ve şekil S8C). FSP1 için immün boyama, genç farelerde domates-pozitif perisitler ve FSP1 ekspresyonu arasında nadiren veya hiç örtüşme göstermedi (Şekil 5C), ancak yaşlanan fareler, domates ve FSP1 ekspresyonu ile bol miktarda çift-pozitif hücre gösterdi (Şekil 5C). Bu nedenle, perisitler, yaşlanan farelerde FSP1 eksprese eden fibroblastların öncüleriydi ve genç farelerde değil. Bu hipotezi başka bir perisite özgü uyarılabilir transgenik kullanarak da test ettik, NG2-CreERTM × ROSA26td-Domates. Yine, tamoksifen uygulamasından sonraki 11. günde, genç farelerde domates pozitif hücrelerde FSP1 ekspresyonu nadiren saptandı (Şekil 5D), ancak yaşlanan farelerde çift pozitif (domates ve FSP1 eksprese eden) hücreler boldu (Şekil 5D). 5D).

Perisit kaynaklı fibroblastlar, yaşlanma ve artritte organ fibrozuna katkıda bulunur

Hematopoetik olmayan, dokuda yerleşik fibroblastlar, çeşitli hastalıkların patogenezine katkıda bulunur.33) ve yaralanmaya bağlı fibrozis (34). Özellikle, FSP1 ekspresyonu fibrozu teşvik eder ve FSP1-pozitif fibroblastların fibrozu yönlendirdiği gösterilmiştir (31). Bu nedenle, fibroz sırasında perisitlerin katılımını araştırmak için, daha sonra böbrekte yaralanmaya bağlı fibroz sırasında genç ve yaşlanan farelerde perisitlerin kaderini analiz ettik. PDGFRb-CreERT2 × ROSA26 td-Domates farelere böbrek fibrozunu indüklemek için sisplatin enjekte edildi ve soy takibi yapıldı (Şekil 5E ve şekil S8D). Sisplatin ile tedavi edilen farelerin sağlıklı durumunu göstermek için H&E boyaması kullanıldı (şekil S8E). Kontrol ve sisplatin ile tedavi edilmiş farelerden alınan böbrek dokularının soy takibi, yavru kontrol farelerinden alınan dokulara kıyasla domates ve FSP1 çift pozitif hücrelerinde önemli bir artış gösterdi (Şekil 5E ve şekil S8D). FSP1 ekspresyonuna ek olarak, bu domates pozitif fibroblastların bir kısmı ayrıca Podoplanin, Vimentin ve PDGFRa'yı da eksprese etti (şekil S8F). Ayrıca, bu domates ve FSP1 çift pozitif hücrelerinin sıklığı, fibrozlu genç farelere kıyasla fibroz gelişen yaşlanan farelerde önemli ölçüde daha yüksekti (şekil S8G). Böylece, yaşlanma sırasında meydana gelen yaralanma kaynaklı fibrozda perisitlerin fibroblastlara farklılaşması artar.

Fibrozise ek olarak, fibroblastlar inflamatuar hastalıkların patogenezine katkıda bulunurlar.35) ve özellikle sinovyal fibroblastlar, invaziv, doku yıkıcı fenotipi alarak romatoid artritte (RA) eklem hasarına ve iltihaplanmaya katkıda bulunur (33, 36). Bu nedenle, daha sonra perisit türevli fibroblastların artritte fibroblast proliferasyonuna ve genişlemesine katkıda bulunup bulunmadığını araştırdık. Böylece, diz eklemlerine enjekte edilen deneysel bir RA zymosan modeli kullandık. PDGFRb-CreERT2 × ROSA26 td-Domates artriti indükleyen fareler (37) sinovyal eklemlerdeki perisitlerin izlenmesi amacıyla. Bu fare hattındaki soy izleme, artritik eklemlerde önemli ölçüde artan domates ve FSP1 çift pozitif hücreleri gösterdi, ancak kontrol eklemlerinde değil (Şekil 5F). Bu nedenle, perisitler deneysel inflamatuar artritte bir fibroblast kaynağıydı. Ayrıca, genç ve yaşlanan sinovyal eklem dokularının karşılaştırılması, genç farelere kıyasla yaşlanan farelerde perisitlerde ve kan damarlarında bir düşüş ile fibroblastlarda bir artış gösterdi (Şekil 5G ve şekil S8H). Birlikte, yukarıdaki veriler, perisit-fibroblast farklılaşmasının, fibroblastların farklı şekillerde katkıda bulunduğu iki enflamatuar hastalık durumunun belirgin bir özelliği olduğunu gösterdi.

Yaşlanan EC'lerde vasküler ve perisit bakım yollarının aşağı regülasyonu

Yaşa bağlı değişiklikleri ve vasküler kaybı yönlendiren moleküler aracıları tanımlamak için, timik dokulardan saflaştırılmış genç ve yaşlanan EC'lerin RNA dizilimi (RNA dizilimi) yapıldı (Şekil 6A). Yaşlanma ile dikkat çekici değişikliklere uğradığı bilindiği için timus dokusu burada analiz edildi. Genç ve yaşlanan fare timisi, tek hücreli süspansiyonlar elde etmek için işlendi. EC'ler, anti-Endomucin antikoru kullanılarak manyetik boncuk bazlı bir ayırma yöntemiyle bu organlardan izole edildi ve RNA-seq analizine tabi tutuldu. Denetimsiz kümeleme analizi, genç ve yaşlanan fareler arasında farklı EC profilleri gösterdi (Şekil 6A). Yaşlanan farelerden alınan EC'lerde farklı olarak düzenlenmiş mRNA'lar, referans numuneler olarak genç farelerden alınan EC ile tanımlandı. Önemli ölçüde diferansiyel olarak eksprese edilen genler, bir kesme yanlış keşif oranı (FDR) ile düzeltilmiş olarak elde edildi P Timustaki <0.01 491 genin değeri yukarı regüle edilirken, 503 genin değeri aşağı regüle edildi (Şekil 6A). KEGG (Kyoto Genler ve Genom Ansiklopedisi) veritabanını kullanarak yol analizi (GAGE) için gen seti zenginleştirme gerçekleştirdik. Önemli yollar bir ile filtrelendi Q <0.1 değeri. Yaşlanan EC'ler, Notch sinyallemesinin aşağı regülasyonunu gösterdi (Şekil 6A). Çentik ve ligandı Dll4, anjiyogenezi dokuya özgü bir şekilde düzenler. Çentik birçok dokuda anjiyogenezin negatif düzenleyicisidir, ancak iskelet sisteminde anjiyogenezin pozitif düzenleyicisidir.38). Bu nedenle, daha sonra indüklenebilir hedeflemeyi gerçekleştirdik. Dll4 gen. Timik dokuların analizi Dll4 iΔEC mutantları (11 haftalık), kan damarlarında kayıp, perisitlerde düşüş ve fibroblastlarda artış gösterdi (Şekil 6A ve şekil S9A). Bunların aksine, EC'ye özgü Notch fonksiyon kazancı Fbxw7 benΔEC fareleri (11 haftalık), kan damarlarında ve perisitlerde bir artış ve fibroblast sayılarında bir düşüş gösterdi (Şekil 6A ve şekil S9A). Bu sonuçlar, yaşa bağlı Notch sinyalleme kaybının küresel vasküler ve perivasküler aberasyonlara yol açtığını gösterdi. Ayrıca, vasküler değişiklikler Dll4 iΔEC mutantları, T hücre progenitörlerinde büyük bir azalmaya yol açtı ve timik epitelyum gelişimini bozdu, böylece timus mikro-ortamını ve fonksiyonunu olumsuz etkiledi (şekil S9, B'den E'ye).Bu bulgular, yaşa bağlı vasküler kaybın, olgun T hücrelerinin azalmış timik çıktısı ile nedensel olarak bağlantılı olduğunu ileri sürdü.39, 40).

(A) Isı haritası (solda), genç (Y 8-10 haftalık) ve yaşlı (50-55 haftalık) timus (FDR ayarlı) arasında farklı şekilde eksprese edilen genlerin RNA-seq ekspresyon seviyelerini gösterir. P değer kesmesi <0.01). Renk yoğunluğu, satır ölçekli normalleştirilmiş günlüğü temsil eder2(CPM) ifadesi, sütun ise kopyaları temsil eder. Kırmızı ve mavi renk yoğunluğu, yukarı regüle edilmiş ve aşağı regüle edilmiş genleri gösterir. Gen seti zenginleştirmesinden elde edilen en önemli aşağı regüle edilmiş biyolojik süreçleri gösteren sol alt. 3D görüntüler, PDGFRβ ve FSP1'in immün boyamasını gösterir. Dll4 iΔEC ve littermate kontrol timusu ve ayrıca Fbxw7 iΔEC ve kontrol timusu (11 haftalık). Birleşik grafikler fibroblast sayılarını gösterir (n = 4). (B) Genç (Y 8-10 haftalık) ve yaşlı (50-55 haftalık) dalak ve böbrek arasındaki diferansiyel olarak eksprese edilen genlerin RNA-seq ekspresyon seviyelerini gösteren ısı haritaları. Alt kısım, aşağı regüle edilmiş yolların en önemli GO terimlerini gösterir. (C) Böbrek, dalak ve timustan yukarı regüle edilmiş yolları temsil eden gen seti zenginleştirme analizinden elde edilen biyolojik süreçlerin Venn diyagramı. (NS) Genç (Y) ve yaşlı (A) cilt ve bağırsak arasındaki farklı şekilde eksprese edilen genlerin RNA-seq ekspresyon seviyelerini gösteren ısı haritaları. Alt kısım, aşağı regüle edilmiş yolların GO terimlerini gösterir. Veriler, ortalama ± SD'yi temsil eder. NS P değer, iki kuyruklu eşleştirilmemiş değerden türetilir T testler. **P < 0.01. Çekirdek: DAPI. Ölçek çubukları, (A) 50 μm. ECM, hücre dışı matris.

Daha sonra, yaşlanma ile endotelyal Notch sinyalinin bu aşağı regülasyonunun çoklu dokularda ortak bir özellik olup olmadığını araştırmak için gençlerden (8-10 haftalık) türetilen dalak ve böbrek dokularından EC'lerin RNA-seq analizini yaptık. ) ve yaşlanan (50-55 haftalık) fareler. Yukarıda timus için tarif edildiği gibi benzer bir analitik yaklaşım izlendi. Böbrekte toplam 1397 gen ve dalakta 537 gen yukarı regüle edilirken, böbrekte 1286 gen ve dalakta 341 gen yaşlanma üzerine aşağı regüle edildi (Şekil 6B ve şekil S10, A ve B). Daha önce olduğu gibi, bu yaşlanan EC'lerde KEGG veritabanını kullanarak GAGE ​​gerçekleştirdik. Önemli yollar bir ile filtrelendi Q <0.1 değeri. Bu organların her ikisinde de yukarıdan aşağı regüle edilmiş yollar, vasküler ve perisit bakımı ve yeniden şekillenmesi için kritik olduğu bilinen yolların aşağı regülasyonunu gösterdi (Şekil 6B). Bununla birlikte, Notch sinyali, bu dokularda yaşlanma üzerine değişmedi (Şekil 6B). Böbrekteki farklı gen ekspresyonu, anjiyogenez ve kan damarı bakımı için gerekli olan Hippo ve Wnt sinyal yollarının aşağı regülasyonunu gösterdi (Şekil 6B) (41, 42). Dalakta, yaşlanan EC'ler, HIF1a sinyali dahil olmak üzere metabolik yolların aşağı regülasyonunu gösterdi (Şekil 6B) (43) ve ayrıca, boşluk kavşağı iletişimi (44) aşağı regüle edildi (Şekil 6B). Bu bulgular, bilinen vasküler bakım yollarındaki yaşa bağlı çoklu değişikliklerin, farklı dokulardaki vaskülatür kaybında birleştiğini ileri sürdü. Analiz edilen bu üç doku arasındaki ortak EC yaşlanma imzasını daha da sorguladık: timus, dalak ve böbrek. Bu dokulardan yaşlanan EC'ler, 84 ortak yukarı regüle edilmiş gen gösterdi ve sitokin-sitokin reseptör etkileşiminin yukarı regülasyonunu ve ksenobiyotiklerin metabolizmasını, GAGE ​​analizi ile sitokrom 450 ile tanımladı ve bu dokular arasında yaşlanan EC'lerin proinflamatuar yapısını gösterdi (Şekil 6C ve Şekil S10, C'den E'ye). Böbrek, dalak ve timusun yukarı regüle ve aşağı regüle yolunun GO (Gen Ontolojisi) terimleri tablo S6'da verilmektedir. Daha sonra genç ve yaşlanan EC'leri bağırsak ve deriden karşılaştırdık, çünkü bu dokular yaşlanma üzerine vasküler yoğunluğu korudu. Genç ve yaşlanan fare bağırsağı ve derisi, tek hücreli süspansiyonlar elde etmek için işlendi ve timus, dalak ve böbrek için gerçekleştirildiği gibi RNA-seq analizine tabi tutuldu. Bağırsak, deri, timus, dalak ve böbrek olmak üzere beş doku arasında ortak yukarı-düzenlenmiş veya aşağı-düzenlenmiş genler ve yollar tanımlanmadı (Şekil 6D ve şekil S10F). Timus, dalak ve böbrekten gelenlerin aksine, bağırsaktan ve deriden yaşlanan EC'ler, sitokin-sitokin reseptörü etkileşim yolunun yukarı regülasyonundan yoksundu, bu EC'lerin proinflamatuar yapısının olmadığını gösterir (tablo S7 ve S8). Bu nedenle, vaskülatür kaybını gösteren dokulara karşı vaskülatür kaybını gösteren dokulardan EC'ler arasındaki ana ayırt edici faktör, vasküler kaybı olan dokulardan türetilen EC'lerde inflamatuar süreçlerin yukarı regülasyonu idi. Bu sonuçlar, damar ve perisit bolluğunu koruyan yüksek oranda yeniden şekillenen dokulardaki EC'lerin, iltihaplanma yaşlanmasından ve yaşlanma sırasında meydana gelen ilişkili enflamatuar hasardan korunmak için koruyucu mekanizmalarla evrimleşmiş olabileceğini göstermektedir.


TARTIŞMA

Bu çalışmada, PSF'yi Fox-3 etkileşimli bir protein olarak tanımladık ve bu etkileşimin, Fox-3'ün NMHC II-B'nin N30 eksonunun nöral hücreye özgü alternatif eklenmesini aktive etmesi için gerekli olduğunu gösterdik. Ayrıca Fox-3'ün ekspresyon modelini, fare merkezi sinir sisteminde hücresel düzeyde Fox-1 ve 2'ninkilerle karşılaştırdık ve Fox-3 ekspresyonu ile N30 ekleme arasında bir korelasyon bulduk.

İki laboratuvar, Fox-1'in memeli sinir sisteminde doku dağılımını ve hücre altı yerleşimini bildirmiştir (24, 29). Fox-1'in nöronal hücrelerde eksprese edildiğini kabul etmelerine rağmen, çekirdeğe mi yoksa sitoplazmaya mı lokalize olduğu konusunda bir tutarsızlık var. Gözlemlerimiz, Fox-1'in ağırlıklı olarak çekirdeklere lokalize olduğu konusunda Black ve meslektaşlarınınkiyle büyük ölçüde aynı fikirde. Ancak omurilikteki motor nöronların çekirdeklerinde ve somalarında da Fox-1 tespit ettik. Histolojik gözlemlerdeki farklılıklar kısmen hayvanların yaş ve türlerindeki farklılıklardan, doku fiksasyonu ve antijen alımı için yöntemlerdeki farklılıklardan ve Abs tarafından tanınan epitoplardaki farklılıklardan kaynaklanabilir. İlgi çekici olan, Fox-1 izoformundaki depolarizasyon kaynaklı değişikliğin Fox-1'in nükleositoplazmik oranında bir değişiklikle sonuçlandığı bildirilmiştir (32). Ayrıca daha önce Fox-1'in farklı izoformlarının, kültürlenmiş hücrelerde eksojen olarak eksprese edildiklerinde farklı hücre altı lokalizasyonları gösterdiğini bildirmiştik (23). Bu nedenle, her belirli sistemde hangi Fox-1 izoformunun baskın olduğunu belirlemek gerekli olabilir.

Ortak immün boyama analizimiz ve FACS'yi takiben immünoblotlama, Fox-1 veya 2'yi eksprese eden bazı nöronal hücrelerin Fox-3'ü eksprese etmediğini gösterdi. Unutulmaması gereken nokta, Fox-3'ün ekspresyon seviyelerinin Fox-1 veya 2'nin değil, beyincik, beyin sapı ve omurilikteki N30 ekleme paternleri ile korele olmasıdır. Beyne özgü alternatif ekleme üzerine yapılan önceki çalışmaların çoğu, tüm beyni veya beynin anatomik olarak parçalanabilen kısımlarını kullanmıştır. Fox-3'ün ekspresyon seviyelerine göre hücreleri ayırmak için FACS'yi kullandık. Hücre sıralama ve biyokimyasal analizin bir kombinasyonu, Fox-3 pozitif ve negatif hücre popülasyonları arasında farklı ekleme modelleri bulmamıza yol açtı. Fox-1 veya 2'nin ekzojen ekspresyonunun kültürlenmiş hücrelerde (23) N30 katılımını arttırdığına dair önceki gözlemimize rağmen, Fox-1 ve/veya Fox-2'yi eksprese eden ancak Fox-3'ü eksprese etmeyen beyin hücreleri N30 eklemesini aktive etmez. Bu kısmen aşağıdakilerle açıklanabilir. Fox-1 veya 2'nin ortalama ekspresyon seviyesi, beyincik, beyin sapı ve omurilikteki Fox-3 pozitif ve negatif hücreler arasında benzer olduğundan, Fox-3'ün ilave ekspresyonu, üç Fox proteininin tümünün toplam miktarını basitçe arttırır. Başka bir neden Fox-1 ve 2 izoformları ile ilgili olabilir. Fox-1 ve 2 genleri, birden fazla alternatif olarak eklenmiş izoform üretir. C-terminal bölgesindeki amino asit dizilerindeki farklılıklar, N30'a doğru ekleme aktivitesinde önemli farklılıklar ile sonuçlanır (23). Şu anda çalışmamız C-terminal amino asitlerindeki farklılıkları ayırt etmemektedir, çünkü anti-Fox-1, Fox-1 izoformlarında ortak olan N-terminal bölgesine karşı oluşturulmuştur ve aynısı anti-Fox-2 için de geçerlidir. Bu nedenle, Fox-3 için negatif olan hücreler, daha düşük ekleme aktiviteleriyle Fox-1 ve/veya Fox-2 izoformlarını ifade edebilir. Üçüncü bir neden, etkileşen protein(ler) için afinitedeki bir farklılık olabilir. Ataksin-1 ve 2, atrofin-1, titreme, Fyn tirozin kinaz ve östrojen reseptörü-α dahil olmak üzere bir dizi proteinin, memelilerde Fox-1 veya Fox-2 ile etkileşime girdiği bildirilmiştir (29, 44-46). Bununla birlikte, bu proteinlerin çoğu, mRNA öncesi ekleme bağlamında işlevsel olarak karakterize edilmemiştir. Bir U1 snRNP bileşeni olan U1C proteininin Fox-1 ve 2 ile maya iki-hibrit taramasında (47) etkileşimini gösteren bir rapor özellikle ilgi çekicidir, ancak bu etkileşimin fonksiyonel sonucu incelenmemiştir. Bu çalışmada, PSF'yi, N30 eklemenin aktivasyonu için Fox-3'ün temel etkileşimli bir proteini olarak tanımladık. Fox-3'e en yüksek dizi benzerliğini ve bilinen izoformlar arasında N30 eklemesi için en yüksek aktiviteyi gösteren Fox-1 ve 2'nin izoformlarını karşılaştırmış olsak da, PSF Fox-1 ve 2'ye kıyasla Fox-3'e daha verimli bağlanır. Bu nedenle bu, Fox-3'ün N30 dahil edilmesinde neden daha aktif olduğunu açıklayabilir. Bu afinite farkı, Fox-3'ün alternatif eklemenin sinirsel özgüllüğünün belirlenmesinde bir rol oynayabileceğini de göstermektedir. Bununla birlikte, Fox proteinleri için PSF'nin afinitesindeki farklılıkların hala biyokimyasal olarak daha ayrıntılı olarak çalışılması ve hücresel bağlamda daha kesin olarak değerlendirilmesi gerekmektedir.

Fox-3 ekspresyonunun seviyesi ile N30 eklemenin kapsamı arasında iyi bir korelasyon bulmamıza rağmen, bu çalışma Fox-1 ve 2'nin N30 eklemeye olası katkısını dışlamaz. Fox-1 ve 2'nin bir maya iki-hibrit sistemi kullanarak birbirleriyle etkileşime girdiği rapor edilmiştir (46). Laboratuarımız ayrıca maya iki-hibrit sistemi kullanılarak Fox-2'nin Fox-3 ile etkileşiminin yanı sıra Fox-3'ün Fox-1 ve Fox-2 ile ortak immünopresipitasyon yoluyla etkileşimini (yayınlanmamış gözlemler) saptadı. Aslında, sadece Fox-3'ü eksprese eden nöronal hücreleri nadiren gözlemledik. Analiz ettiğimiz tüm Fox-1 izoformları hem çekirdekte hem de sitoplazmada yaygın olarak dağıldığından veya kültürlenmiş hücrelerde ekzojen olarak eksprese edildiklerinde ağırlıklı olarak sitoplazmada lokalize olduğundan, Fox-1'in ağırlıklı olarak sağlam beyindeki çekirdeklere lokalize olduğunu bulmak beklenmedik bir durumdu. ( 23 ). Buna karşılık, eksojen olarak eksprese edilen Fox-3 izoformları, neredeyse sadece kültürlenmiş hücrelerdeki çekirdeklere lokalize olur (Ek Şekil S1D). Analiz ettiğimiz Fox-2 izoformları ağırlıklı olarak çekirdeklere yerleşir (23). Bu gözlemler, Fox-1'in Fox-3 veya Fox-2 ile dimerize olabileceği ve çekirdeklere lokalize olabileceği olasılığını artırıyor. canlıda . Fox proteinleri, özellikle pre-mRNA birden fazla UGCAUG elementi içerdiğinde, heterodimerler veya heteromultimerler olarak işlev görebilir. Heterodimerler ve homodimerler arasında ekleme aktivitesinde bir fark olup olmadığının hala belirlenmesi gerekmektedir.

Fox proteinleri, düzenlenmiş ekzonlara göre ön mRNA'lar üzerindeki bağlanma konumlarına bağlı olarak aktivatör veya baskılayıcı olarak işlev görebilir. Model sistemleri kullanan önceki çalışmalarla birlikte son genom çapında çalışmalar, Fox proteinlerinin ekzon seçimini etkilemesi için genel bir kural önerdi (8 , 20 ). Fox proteinleri alternatif eksonun aşağısındaki introna bağlandığında, ekzon inklüzyonu meydana gelir. Öte yandan, Fox proteinleri alternatif eksonun yukarı akışındaki introna bağlandığında, ekson atlama meydana gelir. Son zamanlarda Fox proteinlerinin alternatif ekzonların kullanımını baskıladığı veya aktive ettiği mekanizmayı ele alan birkaç rapor başlamıştır. F1y pre-mRNA kullanılarak, yukarı akıştaki introna alınan Fox-1'in, düzenlenmiş eksonun akış aşağısındaki intron üzerinde erken spliceosome öncesi kompleksin oluşumunu bloke ettiği gösterilmiştir (48). Kalsitonin/CGRP ön mRNA durumunda, yukarı akış intronuna bağlı Fox-2, dal bölgesinde SF1 alımını engeller ve ayrıca alternatif eksona bağlı Fox-2, U2AF'nin alınmasını engeller. 3' ek yeri ( 27 ). Fox proteinlerinin (FOX-1 ve ASD-1), spesifik olarak kasta eksprese edilen başka bir diziye özgü RNA bağlayıcı protein SUP-12 ile etkileşimi, rapor edilmiştir. C. elegans . FOX-1 (veya ASD-1) ve SUP-12 etkileşimi, egl-15 pre-mRNA üzerindeki bitişik hedef RNA elemanlarına bağlanmalarını arttırır ve kasa özel, birbirini dışlayan bir ekzonun dahil edilmesine yol açar. Bu rapor, Fox tarafından düzenlenen alternatif eklemenin katı doku özgüllüğü için bir mekanizma sağlar (49).

Bu çalışmada PSF ve PSF-NonO kompleksini Fox-3 ile etkileşime giren proteinler olarak tanımladık. NonO'nun insan ortolojisine genellikle p54nrb denir. PSF ve NonO, iki RRM içeren ve DNA'nın yanı sıra RNA'ya da bağlanabilen yapısal olarak ilişkili proteinlerdir (40). PSF ve NonO, bir heterodimer oluşturmak için birbirleriyle etkileşime girer ve PSF'nin veya PSF-NonO kompleksinin katılımı, transkripsiyon, transkripsiyonel sonlandırma, mRNA öncesi ekleme, mRNA ve RNA'nın 3 ′ uç işlenmesi dahil olmak üzere nükleer fonksiyonun birçok yönünde rapor edilmiştir. tutma (40, 50, 51). PSF ve NonO, çeşitli dokularda ve hücre tiplerinde eksprese edilir. Fox-3'ün C-terminal bölgesinin doğrudan PSF'nin N-terminal bölgesine bağlandığını ve Fox-3 ve NonO'nun PSF yoluyla dolaylı olarak etkileştiğini gösterdik. PSF, Fox-3'ün hedef UGCAUG öğesine bağlanmasını bir laboratuvar ortamında çapraz bağlama deneyi. Ayrıca PSF'nin varlığı, sağlam hücrelerde UGCAUG elemanlarını içeren NMHC II-B transkriptinin IDDE'sine Fox-3'ün alınmasını arttırır. PSF'nin, bozulmamış hücrelerde hedef RNA elementine Fox-3 bağlanması üzerindeki etkisi, görünüşe göre daha yüksek derecede bir geliştirme (> gt30 kat) gösterir. laboratuvar ortamında (2- ila 3 kat). Bu fark, Fox-3 ve PSF kompleksi oluşumunun farklı verimliliklerinden kaynaklanıyor olabilir. laboratuvar ortamında ve bozulmamış hücreler. Başka bir olasılık, PSF ve Fox-3'ün, mRNA'ların Fox-3 hedef bölgelerine birlikte transkripsiyonel olarak alınabilmesidir. PSF ve NonO'nun, transkripsiyonel uzama faktörlerini içeren büyük bir komplekste fosforile edilmiş RNA polimeraz II ile ilişkili olduğu rapor edilmiştir (52, 53). Fox-3, PSF yoluyla bu komplekse dahil edilmişse, Fox-3, çekirdekteki basit difüzyonla karşılaştırıldığında, transkripsiyonel uzama sırasında ön mRNA'ların hedef bölgelerine daha verimli bir şekilde alınabilir.

Hedef RNA elemanına Fox-3 bağlanmasının PSF tarafından arttırıldığını göstermemize rağmen, alternatif eklemenin Fox-3'e bağlı aktivasyonunda PSF'nin rolü bu etkiyle sınırlı olmayabilir. PSF başlangıçta spliceosome ile ilişkili bir protein olarak bulundu (54). Bir dizi çalışma, spliceosome öncesi ve spliceosome'da farklı aşamalarda ve snRNP'leri içeren komplekslerde PSF'nin varlığını göstermiştir (55). PSF'nin ayrıca, ekleme koşulları altında doğrudan U5 snRNA ve 5' ekleme bölgesi ile etkileşime girdiği bildirilmiştir (42, 53). Bu nedenle PSF, Fox-3'e bağlı ön mRNA ile ekleme makinesi arasında bir aracı olarak işlev görebilir. Bu düşünce, diğer nükleer faktörlerin yokluğunda PSF'nin doğrudan IDDE'ye veya NMHC II-B minigeninden pre-mRNA'ya bağlanmadığı gözlemimizle desteklenir. Ek olarak, hem Fox-3 (veya diğer Fox proteinleri) hem de PSF, N30 eklemenin UGCAUG'a bağlı aktivasyonu için gereklidir. Endojen PSF ve Fox-2'nin varlığında, eksojen Fox-3, eksojen PSF'nin yaptığı gibi N30 eklemesini bir dereceye kadar aktive eder. Eksojen Fox-3 ve PSF'nin bu etkileri görünüşte katkı maddesidir. Bununla birlikte, endojen Fox-2 veya PSF elimine edildiğinde, ne eksojen Fox-3 ne de PSF, N30 eklemesini aktive edemez. PSF'nin N30 eklemesi üzerindeki arttırıcı etkisi, bu elemente bağlanmasa da UGCAUG elementine bağlıdır ve kesinlikle Fox-3'ün (veya diğer Fox proteinlerinin) varlığına bağlıdır. Fox-3'ün N30 ekleme üzerindeki arttırıcı etkisi de kesinlikle PSF'nin varlığına bağlıdır. Bu nedenle, iki proteinin etkileri aslında katkı maddesi değil, daha çok işbirlikçidir. PSF, ekleme işlemi sırasında Fox-3'ün bir ortak etkinleştiricisi veya aracısı olarak işlev görüyor gibi görünüyor. Tüm verileri barındırmak için en basit model, PSF veya PSF içeren karmaşık Fox-3 ve ekleme makinesi arasında köprü oluşturmasıdır. Fox-3 ve PSF etkileşimini takiben N30 ekson tanımanın ayrıntılı moleküler mekanizması açıklanmaya devam etse de, bu etkileşimin, bir aşağı akış intronik yoluyla alternatif ekson dahil edilmesinin Fox proteini tarafından düzenlenen aktivasyonundan sorumlu mekanizmanın ayrılmaz bir parçası olduğu gösterilmiştir. güçlendirici.


Videoyu izle: asiyanotik konjenital kalp hastalıkları 2 ASD, PDA AVSD (Haziran 2022).