Bilgi

Tamponun sonikasyon yoluyla genomik DNA kesme üzerindeki etkileri nelerdir?

Tamponun sonikasyon yoluyla genomik DNA kesme üzerindeki etkileri nelerdir?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Expt: LNCaP hücrelerinden izole edilmiş genomik DNA'm var ve küçük bir molekülü (Chem-seq) DNA'ya çapraz bağlamak istiyorum. Küçük molekül bir alkilatördür, bu nedenle DNA'yı kendi başına çapraz bağlayacaktır. Çapraz bağlama için kullandığım tampon TKMC'dir (10 mM Tris-HCl [pH 7], 10 mM KCl, 10 mM MgCl2, 5 mM CaCl2). Çapraz bağlamadan sonra genomu 100 - 600 bp'ye (ortalama 300-400 bp) parçalamak istiyorum. Bioruptor 300 kullanıyorum.

Soru: TKMC arabelleği sonikasyon için yeterli olmalı mı? Bulduğum çoğu referans TE tamponu (pH 7.5 - 8) kullanıyor ve TKMC kullanarak bir referans bulamıyorum.

Daha fazla bilgi: İki arabellek (TKMC v TE pH8) arasında doğrudan bir karşılaştırma denedim ve TE arabelleği, TKMC arabelleğine kıyasla daha küçük boyutlara bölünüyor gibi görünüyor.

Örneğin: Biorupter 300, Düşük ayar, 1 döngü = 30/30 AÇIK/KAPALI @ 3 C, 300 uL'de 5 ng/uL DNA

30 döngüde ortalama parça boyutu: TE = 350bp, TKMC = 500bp

Herhangi bir öneri? Alkilasyon çapraz bağlamam için TE tamponu kullanmak, EDTA'nın varlığı nedeniyle işe yaramaz. AÇMA/KAPAMA süreleri ile oynamalı mıyım?

Herhangi bir yardım harika olurdu! Teşekkürler.

GÜNCELLEME:

TKMC, TKMC + 1mM EDTA, TKMC + 10 mM EDTA arasında bir karşılaştırma yaptıktan sonra, EDTA ekledikçe parça aralığında hafif bir sıkılaşma oldu. Ek olarak, EDTA eklendiğinde parça aralığı (boyutları) daha küçüktü (aynı sayıda döngüden sonra EDTA'sız TKMC'ye kıyasla). Sonuçlar sert değildi ama gerçekten de parça boyutu ve menzili üzerinde gözle görülür bir etki vardı. Sonikasyondan önce EDTA eklemeye devam edeceğim. Önerileriniz için teşekkür ederiz!


Tamponu değiştirmek için döndürülmüş bir sütun kullanabilir misiniz? Bir çeşit jel filtrasyon kolonu; TE'de denge sütunu; DNA örneğinizi ekleyin, hariç tutulan DNA'yı döndürün. TKMC bileşenleri sütuna dahil edilecek ve böylece korunacaktır.

Güncelleme Bu makaleye ve buradaki referanslara bir göz atın. Görünüşe göre magnezyum iyonları DNA'nın esnekliğini etkiliyor. Açıkça, iki tampondaki DNA'nızın şekli farklıysa, bu, kesme kuvvetlerinin etkilerini etkileyecektir.


Hücre Bozulması: Sonikasyona Karşı Homojenizasyon

Protein ve nükleik asit analizi için numunelerin hazırlanması iki temel adımı gerektirir: tek tek hücreleri serbest bırakmak için dokunun parçalanması ve hücresel içeriklerini serbest bırakmak için bu hücrelerin parçalanması. Mekanik homojenizasyon ve sonikasyon (bazen ultrasonik homojenizasyon olarak anılır) bu işlemler için iki temel tekniktir.

Özel uygulamanız için uygun tekniği seçmek, dikkatli düşünmeyi hak eder. Her birinin avantajları ve dezavantajları vardır ve laboratuvarlar genellikle bu teknikleri birbirleriyle uyum içinde kullanmayı tercih eder. Değerli veya yeri doldurulamaz doku örneklerine zarar vermeyi önleyen bir yöntem seçmenize yardımcı olacak bilgiler için okumaya devam edin.

Mekanik Homojenizasyon

Mekanik homojenizasyon, çözeltideki biyolojik bir numuneyi, tüm fraksiyonların moleküler bileşiminin tutarlı olduğu şekilde düzgün bir dağılım durumuna getirmek için doğrudan fiziksel kuvvet kullanır. Geleneksel olarak, mekanik bozulma, dokuların dondurulması ve ardından bir havan ve havan tokmağı ile öğütülmesiyle sağlandı. Şu anda, diğer iki yaygın yöntem vardır: boncuk tabanlı bozulma ve rotor-stator bozulması. Bu ayırma teknikleri, numuneleri verimli bir şekilde homojenleştirir, ancak genellikle istenen konsantrasyon veya molekül saflığını elde etmek için daha fazla akış aşağı fraksiyonlama gerektirir.

Mikrotüpler içindeki boncuklar, yüksek hızlarda kesme etkisi yaratır. Tohum, doku ve bitki örneklerinin öncesi ve sonrası. (Benchmark Bilimsel)

Boncuk bazlı homojenizasyon, kesme kuvvetleri oluşturmak için yüksek hızlı çalkalama ile birlikte plastik veya metal boncuklar kullanır. Bu teknik, tüm hayvan, böcek (örn. Drosophila melanogaster) veya sağlam hücre duvarlarının bozulmasını gerektiren bitki örnekleri. Boncuk bazlı bozulmanın bir dezavantajı, uygun boncuk malzemesi ve çapı seçimini gerektirmesidir. Örneğin, bazı plastik boncuklar DNA'ya kolayca bağlanacak ve çıkarıldıklarında onu çözeltiden tüketecektir. Benzer şekilde, boncuğun çapı, oluşturulan kuvvet miktarını ve bir numunenin bozulma derecesini etkileyebilir. Çok büyük veya çok küçük bir boncuk boyutunun kullanılması eksik homojenizasyona neden olabilir. Neyse ki, birçok alet üreticisi, çoğu homojenizasyon uygulamasına uyacak çeşitli boncuklar geliştirmiştir.

Rotor-stator bozulması, hızla hareket eden bir rotoru barındıran sabit bir statorun kullanımını içerir. Rotor ve stator arasındaki boşluktaki doku ve hücrelerin hareketi, yüksek derecede bir kesme kuvveti yaratır. Bu cihazlar tipik olarak elle tutulur ve rotor-stator eki değiştirilebilir. Bu cihazlar, sert hayvan ve bitki dokularını (örneğin kas) verimli bir şekilde bozar. Rotor-stator bozulmasının göze çarpan bir yararı, giderek daha küçük rotor-stator mesafe ataşmanları ile sıralı olarak işleyerek homojenizasyon derecesini aşamalı olarak artırma yeteneğidir. Bu işlem, en esnek numuneleri bile etkili bir şekilde homojenleştirebilir. Ek olarak, çok büyük hacimli numuneler, daha büyük bozulma enstrümantasyonu kullanılarak işlenebilir. Rotor-stator bozulmasının dezavantajları arasında artan maliyet ve daha hantal ekipman yönetimi yer alır. Eklentiler genellikle yeniden kullanılmadan önce yıkama ve sterilizasyon gerektirir. Tek kullanımlık ataşmanlar sunulur, ancak daha yüksek işletme maliyeti vardır.

Örnekte sonikasyon probu. (QSonica)

Ultrasonik Homojenizasyon

Ultrasonik homojenizasyon ayrıca dokuları ve hücreleri kesmek için mekanik kuvvetler kullanır, ancak bu kuvvet ultrasonik ses dalgaları şeklini alır. Bu, ultrasonik bir banyo veya bir sonda kullanılarak yapılabilir. Bu teknik numuneleri hızlı bir şekilde homojenize etmek için kullanılabilir, ancak uygun olmayan sonikasyon parametreleri geri döndürülemez numune hasarına neden olabileceğinden, işleme süresi kadar kullanılan güç ve frekansa da özen gösterilmelidir.

Hem banyo hem de prob sonikatörleri, örnekleri bozmak için yüksek enerjili ses dalgalarını kullanır. Prob sonikasyonu, hücrelerin bozulması için en sık kullanılan işlemdir. Banyo sonikasyonu, doku ve hücrelerin büyük toplu hazırlıkları için kullanışlıdır.

Tüm doku ile başlarken, etkili bozulma için tek başına sonikasyonun uygun bir teknik olup olmadığını belirlemek için doku tipini kullanın. Kas gibi daha esnek dokular, harmanlama, ani dondurma veya mekanik homojenizasyon gibi bir yukarı akış, birincil bozulma gerektirir. Bütün hayvanların ve bazı bitki dokularının işlenmesinin tek başına sonikasyon yoluyla gerçekleştirilemeyeceğini de belirtmekte fayda var. Bu nedenle, sonikasyon, çözeltideki hücreleri ve birçok dokuyu etkili ve hızlı bir şekilde bozarken, bazı başlangıç ​​materyalleri için kullanılamaz.

Programlanabilir dijital sonikatör, hız ve sürenin kontrolünü sağlar. (QSonica)

Ultrasonik homojenizasyon, yüksek enerjili bir işlemdir ve operatörler, sonikasyon sırasında çözeltinin moleküler yapısını değiştirme riskini taşır. Kullanıcılar işlemin frekansını ve watt değerini belirtmelidir. Özellikle nükleik asitler, sonikasyonun kesme kuvvetlerine karşı hassastır. Bir numune çok yüksek bir frekansta işlenirse, DNA/RNA omurgası kesilir ve analiz artık mümkün değildir. Nükleik asitlerin kesmeye duyarlılığı da operatörlere fayda sağlayabilir. İstediğiniz son ürün protein ise, kullanıcılar çözeltideki DNA'yı çıkarmak isteyecektir. Sonikasyon, genomik ve hücresel nükleik asitleri etkili bir şekilde bozabilir, böylece artık protein saflaştırmasına müdahale etmezler. Son olarak, sonikasyon yoluyla oluşturulan yüksek enerji numuneleri ısıtabilir ve proteinlerin denatürasyonuna neden olabilir (eğer numune uzun bir süre boyunca işlenirse). Bu nedenle, ultrasonik homojenizasyon için kullanılan süre, watt ve frekansa dikkat edin.

Dokuların ve hücrelerin homojenleştirilmesi, daha fazla aşağı akış analizini kolaylaştırmak için kullanılan yaygın bir tekniktir. Bu işlemler için sayısız teknik ve araç sunulmaktadır. Mekanik homojenizasyon ve ultrasonik homojenizasyon yaygın olarak kullanılan iki tekniktir. Her birinin avantajları ve dezavantajları vardır. Çoğu zaman araştırmacılar, en arzu edilen sonucu elde etmek için iki tekniği birlikte kullanmayı seçtiler. Nasıl karşılaştırdıklarının bir özeti:


DNA hücre lizizinde/protein ekstraksiyonunda "değil" - (Ekim/06/2008 )

Hücre lizatımda bana DNA olduğu söylenen yapışkan, sümüksü bir madde var. SDS'de kaynatıldığında çözülmez, Dönmez ve ondan nasıl kurtulacağımı bilmiyorum.
Bazıları daha fazla ekstraksiyon tamponu (RIPA) kullanmayı önerdi ancak bu, proteini benim kullanımım için çok fazla seyreltiyor. Herhangi bir fikir?
Teşekkürler!

DNA'yı kesmek için yapabileceğiniz her şey viskoziteye yardımcı olacaktır. Sonikasyon iyi çalışır, ancak numuneyi bir şırıngadan & gt22G iğneli bir amperden de geçirebilirsiniz.

Ayrıca, bazı hücre/doku örneklerinin, DNA olmayan, ancak çok sert koşullar (örneğin >6M Üre veya >4M Guanidin) olmadan çözünmesi zor olabilen ECM kollajen/proteoglikanlar üretebileceğini de unutmayın. .

evet bir yol daha fazla RIPA kullanmaktır ancak konsantrasyonunuz düşer. en iyi yol her zaman buzda kalmaktır, bu yüzden tüm protokollerde lizizden önce hücrelerinizi yıkamak için soğuk PBS bile kullanın diyorlar. senin sorunun, bunu buz üzerinde yapmamış olman. hücre peletinizi buz üzerinde tutun. ve soğuk RIPA kullanın ve tüpünüzü hemen buza koyun. bu yapışkan kümeyi ortadan kaldırmalıdır.

bu kümeden kurtulmak için DNase kullanıyoruz. sadece yaklaşık 10ul yapardı. ancak buz üzerinde çalışabilecekken neden DNase kullanasınız? buzu unutma. Buz dostu olmayan birçok insan gördüm. sadece tüplerini buzda tutmaktan hoşlanmazlar ve bu büyük bir hatadır.

DNA'yı kesmek için yapabileceğiniz her şey viskoziteye yardımcı olacaktır. Sonikasyon iyi çalışır, ancak örneği bir şırıngadan & gt22G iğneli bir şırıngadan da geçirebilirsiniz.

Ayrıca, bazı hücre/doku örneklerinin, DNA olmayan, ancak çok sert koşullar (örneğin >6M Üre veya >4M Guanidin) olmadan çözünmesi zor olabilen ECM kollajen/proteoglikanlar üretebileceğini de unutmayın. .

Tavsiyen için teşekkürler. Hem sonikasyonu (bu düşük güçlü, temizleme tipidir) hem de numuneyi 27 numaralı iğneden geçirmeyi denedim ve bu viskoziteyi biraz azalttı ama pipet ucuna yapışan hala yapışkan madde vardı. Daha sonra numuneyi 5um filtre takılı bir iğneden geçirdim ve bu tüm yapışkanlığı yakaladı ama yapışkan maddeye bağlı olabilecek DNA ile etkileşime giren proteinleri kaybetmekten korkuyorum.

Bugün deneyeceğim numuneyi soğuk tutmayı öneren ek tavsiyeler vardı, ardından son çare olarak üre/guanidin.

O kadar konsantre olmam gereken örneklerim vardı ki benzer sorunlar yaşadım. Numuneyi bir veya iki dakika yeniden kaynatın ve hala sıcakken yükleyin. Sıcak bir numune, oda sıcaklığındaki bir numune kadar yapışkan değildir. Bu kadar yoğunlaştırılmış numunelerle ilgili tek önemli sorun, bazı proteinlerin jele düzgün bir şekilde girememesidir. Daha düşük yüzdeli jeller kullanmak isteyebilirsiniz (eğer mümkünse).

DNA'yı numunede bırakmakla ilgili sorun, numuneler arasında değişkenlik yaratma olasılığıdır; bir pipet bir tomar yapışkan madde çeker ve diğeri çıkarmaz. Her şeyi soğuk tutma fikrinin işe yaradığı ve DNA'yı peletlememe izin verdiği ortaya çıktı. Numune protein konsantrasyonum yaklaşık 6,5 mg/ml'dir, bu da jel vb. yüklemek için uygundur. Bu, tüm fikirlerin en basiti olduğu için en iyisi olmalıdır. DNA bağlayıcı proteinleri kaybetme olasılığını ortadan kaldırmak için "DNA" peletini bir jele yüklemeyi deneyebilirim, ancak aksi takdirde bu protokole bağlı kalacağım.
Tavsiyelerini sunan herkese teşekkürler'

Saf soru, muhtemelen, ama biraz DNase I eklememeniz için herhangi bir neden var mı?


Farklı Kromatin Parçalama Yöntemleri Nelerdir?

ChIP tahlillerinde parçalanma aşamasının kritik doğası nedeniyle, kromatini kesmek için iyi kurulmuş birçok yöntem vardır. Sonikasyon, DNA'yı mekanik kuvvetler (kavitasyon olarak da bilinir) yoluyla kesmek için yaygın olarak kullanılır. Sonikasyonun en büyük avantajları, tamamen rastgele kromatin parçaları oluşturması ve parça uzunluğunun sonikasyon koşulları değiştirilerek ayarlanabilmesidir. Diğer popüler yaklaşım, genomu kesmek için tipik olarak mikrokokal nükleaz (MNase) kullanan enzimatik sindirim yoluyla kromatin kesmedir. Başlıca kromatin parçalanma seçenekleri aşağıda daha ayrıntılı olarak tartışılmaktadır.

Tek Örnek Sonikasyon

Prob sonikasyonu, tek tek kromatin numunelerinin kesilmesi için uygun bir seçimdir. Bu yöntemde, ultrason dalgalarını üreten bir prob, doğrudan numuneye daldırılarak doğrudan, odaklanmış kavitasyon ve düzgün kesme sağlanır.

Bu yöntem denenmiş ve doğru olsa da, numuneyi aşırı ısıtabileceği veya köpürmesine neden olabileceği için küçük hacimlerde bazen sorunludur. Ek olarak, prob sonikatörleri bir seferde yalnızca bir örneğe uygulanabileceğinden, yüksek verimli senaryolarda kullanışlılığı ciddi şekilde sınırlıdır ve genellikle örnekler arasında veya kullanıcılar arasında sonikasyon tekrarlanabilirliği ile ilgili sorunlar vardır.

Çoklu Örnek Sonikasyon

Aynı anda birden fazla numuneyi sonikasyona tabi tutmak için piyasada bulunan birkaç sonikatör geliştirilmiştir. Diagenode Bioruptor gibi bazı çok numuneli sonikatörler, tüplerdeki numunelerin daldırıldığı ve su yoluyla dolaylı olarak sonikasyona tabi tutulduğu bir su banyosunda sonikasyon yaparak çalışır. Cihaz, farklı sonikasyon verimliliğine sahip sıcak ve soğuk ultrason noktaları oluşturduğundan, bu sistemler numunelerin su banyosunda döndürülmesini gerektirir. Bu, numune işleme kapasitesinin yanı sıra sonikasyon tekrarlanabilirliğini sınırlayabilir. Üretici ayrıca, en verimli sonikasyonu elde etmek için numunelerin belirli tipteki tüplere aktarılmasını önerir.

Covaris LE220 gibi diğer çok örnekli sonikasyon sistemleri de ses dalgalarını iletmek için nispeten büyük su banyoları kullanır, ancak DNA veya kromatini sonikasyon yapmak için her kuyuya yerleştirilmiş bir fiberle birleştirilmiş odaklanmış ultrasonik dalgalar kullanır. Covaris sonikatörleri 96-kuyulu ve 384-kuyulu plakaları işleyebilir ve böylece üretim engelinin üstesinden gelebilir, ancak tescilli ve maliyetli (400$) cam plakalar kullanırlar, bu da onları çalıştırmayı pahalı kılar. Covaris cihazları, her sütunu sonikasyon için doğru konuma yönlendirmek için dönüştürücüyü fiziksel olarak hareket ettirmek için gereken mekanik bir mekanizma ile, 96 oyuklu plakalardaki kuyuları her seferinde bir sütun işler. Bu nedenle, daha fazla örnek içeren bir sonikasyon çalışmasının tamamlanması, az sayıda örnek içeren bir çalışmaya göre daha uzun sürer. Ayrıca, Covaris cihazlarıyla verimli sonikasyon, su banyosunun uzun süre gazdan arındırılmasını gerektirir ve her sonikasyon çalışmasına ek süre eklenir.

Mevcut çok numuneli sonikatör sistemlerinin hiçbiri, hücrelerin kırpılmadan önce hasat edilmesini ve belirli tüplere veya plakalara aktarılmasını gerektiren doku kültürü plakalarında doğrudan kromatin kesme ile uyumlu değildir.

Enzimatik Kırpma

Kromatin ayrıca enzimatik sindirim ile parçalanabilir. Enzimatik yöntemler basit ve ucuz olmasına rağmen, kullanılan enzimler, belirli DNA dizilerini tercihli olarak sindirdikleri için hangi parçaların üretildiği konusunda bir önyargıya neden olabilir. Ek olarak, enzimlerin bağlanacağı ve kesileceği DNA dizileri, çapraz bağlı proteinler tarafından bloke edilebilir ve bu noktalarda enzim sindirimini verimsiz hale getirebilir. DNA-protein komplekslerinin çapraz bağlanmadığı doğal-ChIP için enzimatik kesme gereklidir, çünkü sonikasyon DNA-protein etkileşimlerini bozar.

CUT&RUN (Hedefler Altında Bölünme ve Nükleaz Kullanarak Serbest Bırakma) adlı daha yeni bir yöntem, ilgilenilen proteine ​​bitişik DNA'yı parçalamak için antikora yönelik bir mikrokokal nükleaz enzimi kullanır. Bu yöntem, çoğu standart ChIP protokolünden daha az hücreyle uyumlu olduğu ve bununla ilişkili daha düşük sıralama maliyetlerine sahip olduğu için araştırmacıların ilgisini çekmektedir, ancak MNase'den gelen önyargılı sindirimin CUT&RUN tahlillerinde sorunlu olup olmadığı açık değildir.


[Cryptosporidium ookistlerinden DNA ekstraksiyonunun analizinde gerçek zamanlı PCR]

Amaç: Farklı yöntemlerle Cryptosporidium ookistlerinden elde edilen DNA'nın nitelik ve niceliklerinin karşılaştırılması.

Yöntemler: Cryptosporidium ookistleri, USA Promega (Promega) ve Shanghai Generay (Generay) ticari DNA ekstraksiyon kitlerinden farklı türlerde lizis tamponları, %2 Triton X-100 ve %5 guanidin tiyosiyanat ile muamele edildi. Ookistler daha sonra dondurarak çözme, proteinaz K ve sonikasyon yoluyla parçalandı. Genomik DNA, ticari kitler veya Chelex-100 kullanılarak saflaştırıldı. Cryptosporidium ookist duvar proteini (COWP) geninin kopyalarını belirlemek için real-time PCR tekniği kullanıldı. Promega ticari DNA ekstraksiyon kiti kontrol olarak kullanıldı.

Sonuçlar: Promega kiti, Generay ticari DNA kitinden [(2.38-3.69) x 10(6)], %5 guanidin tiyosiyanat [( sırasıyla 1.27-21.29) x 10(5)] veya %2 Triton X-100 [(2.06-866.70) x 10(3)]. Dondurma-çözme artı proteinaz K artı sonikasyon yöntemi, COWP geninin en yüksek kopya sayısını sağladı.

Çözüm: Dondurma-çözme + proteinaz K + sonikasyon yöntemi en etkilidir. Generay kiti ve %5 guanidin tiyosiyanat ile DNA ekstraksiyonunun etkisi Promega kitine benzer.


DNA Parçalanması

Bozulmamış yüksek moleküler ağırlıklı DNA'nın hazırlanması ve çoğu iş akışı adımında kesilmenin önlenmesi önemli olsa da, DNA fragmantasyonu çoğu dizileme platformu için numune hazırlamada gerekli bir adımdır. Örneğin, kısa okuma dizileme platformları genellikle

300-600 bp), uzun okuma dizileme platformları ise birçok kb uzunluğunda fragmanlarla uyumludur.

Parçaların kesim bölgelerine veya baz bileşimine ilişkin önyargı oluşturmadan, uygun boyutta parçaları güvenilir bir şekilde üreten bir parçalama yönteminin seçilmesi esastır. DNA fragmantasyonu adımı için her biri kendine özgü fayda ve dezavantaj profiline sahip çeşitli seçenekler vardır ve bir fragmantasyon yönteminin seçimi dikkatli bir şekilde değerlendirilmelidir. Kullanılan yöntemler şunları içerir:

& middot Enzim bazlı tedaviler: Bu, her iki zinciri aynı anda parçalayarak veya dsDNA kopmaları oluşturmak için dsDNA'nın her bir dizisinde çentikler oluşturarak DNA'yı fragmanlar. Bu yöntem oldukça esnektir ve uzunluğu düşük bp'den birçok kb'ye kadar olan parçaların üretilmesi için kullanılabilir.

& middot Akustik kesme: Kısa dalga boylu, yüksek frekanslı akustik enerji, DNA örneğine odaklanarak, DNA molekülünü sıcaklık değişikliği gerektirmeden fiziksel olarak bozar. Bu yöntem, düşük yüzlerce bp'den birçok kb uzunluğa kadar olan parçaların üretilmesi için kullanılır.

& middot Sonication: DNA'yı odaklanmamış, daha uzun dalga boylu akustik enerji sonikatörlerine tabi tutan özel sonikatörler, sonikasyon patlamaları arasında bir soğuma periyodu gerektirir. Bu yöntem, birçok kb uzunluğunda parçaların üretilmesi için kullanılır.

& orta nokta Santrifüj kesme: DNA, DNA'yı belirli bir boyuttaki bir delikten hareket ettirmek için merkezkaç kuvveti kullanılarak kesilebilir, santrifüjleme hızı DNA parçalanma derecesini belirler. Bu yöntem, birçok kb uzunluğunda parçaların üretilmesi için kullanılır.

& Middot Point-sink kesme: Bir şırınga pompası, bir tüp içinde daralma boyutunda hidrodinamik kesme kuvvetleri üretir ve sıvının akış hızı, DNA fragman boyutunu belirler. Bu yöntem, birçok kb uzunluğunda parçaların üretilmesi için kullanılır.

· İğne kesme: En düşük teknoloji seçeneği, DNA'nın küçük bir iğneden geçirilmesiyle oluşturulan kesme kuvvetlerine dayanır. Bu yöntem, onlarca kb uzunluğunda parçaların üretilmesi için kullanılır.

Türü Seçin:

Özellik Makaleleri

DNA fragmantasyonu için mevcut seçenekler arasında, enzimatik fragmantasyon, numune üzerinde gözle görülür şekilde daha naziktir ve herhangi bir ölçekte daha az hasar verir. Illumina® için yeni NEBNext® Ultra™ II FS DNA Kitaplığı Hazırlık Kiti, enzimatik parçalanma, uç onarım ve dA kuyruğu için tek bir adım içerir.

Sorun Giderme Kılavuzları

Posterler

Bu ürün, New England Biolabs, Inc (NEB) tarafından sahip olunan veya kontrol edilen bir veya daha fazla patent, ticari marka ve/veya telif hakkı kapsamındadır.

NEB, ürünlerini çeşitli uygulamalar için geliştirip doğrularken, bu ürünün kullanımı, alıcının belirli uygulamalar için ek üçüncü taraf fikri mülkiyet hakları edinmesini gerektirebilir.

Ticari haklar hakkında daha fazla bilgi için lütfen [email protected] adresinden NEB'in Küresel İş Geliştirme ekibiyle iletişime geçin.

Bu ürün yalnızca araştırma amaçlıdır. Bu ürün, insanlarda veya hayvanlarda terapötik veya teşhis amaçlı kullanılmak üzere tasarlanmamıştır.

Videolar

Hızlı İpuçları - DNA parçalanmam için hangi boyut aralığını seçerim?

Bu video, DNA parçalanmanız için bir boyut aralığına karar verirken göz önünde bulundurulması gereken bazı şeyleri açıklamaktadır.


MACGYVER PROJESİ: GÜNLÜK MALZEMELERİ KULLANARAK GENOMİK DNA EKSİKLİĞİ VE JEL ELEKTROFOREZ DENEYLERİ


Soyut:
Agaroz jel elektroforezi ile DNA ekstraksiyonu ve ayrılması, herkesin yapabileceği basit ve heyecan verici bir işlemdir. Bununla birlikte, özel ekipman ve kimyasalların yüksek maliyeti, genellikle böyle bir deneyin lise topluluğu üyeleri tarafından gerçekleştirilmesini engeller. Burada, önceden belirlenmiş bir MacGyver sınırlaması altında DNA'yı çıkarmanın ve elektroforezlemenin uygun maliyetli bir yolunu açıklıyoruz - bu, yalnızca bir bakkaldan veya alışveriş merkezinden temin edilebilen malzemeleri kullanmaktır.

Bu projeyi gerçekleştirmek için önce prosedürü her biri ayrı ayrı ele alınacak üç spesifik bölüme ayırmaya karar verdik. Bunu yaptığınızda, aşağıdaki zorlukların mevcut olduğunu görürsünüz. Bunlar: (i) DNA'nın ekstraksiyonu, (ii) DNA'nın jel elektroforezi ve (iii) DNA'nın görselleştirilmesidir.

Bir Araştırma Ortamında DNA Ekstraksiyonu:
Geleneksel bir araştırma ortamında, DNA'yı çıkarmanın ilk adımı, fiziksel veya kimyasal araçlar kullanarak hücre zarının açılmasını içerir. Örnekler, sonikasyon (sonik dalgalar), homojenleştirme ekipmanı (blender, french press, harç ve havaneli) veya seçici deterjan kullanımını içerir. Bize göre deterjanların (veya sabunların) veya fiziksel adımların (harç ve havaneli) araştırılması en bariz seçimlerdi.

Hücre/doku parçalandıktan sonra, genellikle sonraki adımlar DNA'nız için numuneyi saflaştırma veya zenginleştirme girişimini içerir (yani diğer şeylerden kurtulma). Bu, birçoğu MacGyver değerlendirme başlığımız altında teknik olarak mümkün olmayan çeşitli şekillerde yapılabilir. Bununla birlikte, bir hücre lizatı, DNA'yı seçici olarak çökeltmek için alkol kullanılarak DNA için kolayca zenginleştirilebilir ve onu bir "sümük" benzeri varlık halinde kümelenecek şekilde oluşturur. Sonuç olarak, bu tip numune alkol çökeltme protokolü altında en iyi şekilde çalıştığı ve hem ekstraksiyon hem de jel adımlarında görselleştirme kolaylığı açısından en bol DNA türü olduğu için genomik DNA ekstraksiyonuna odaklanmaya karar verdik.

Genomik bir hazırlık, eğitim açısından da ilginçtir. Bir öğretmen, 'insanlar neden genomik DNA elde etmek ister?' - yeni genlerin klonlanmasıyla ilgili sayısız tartışmalara yol açabilecek bir soru, parmak izi amacıyla DNA kaynağına sahip organizmalar (Koyun Dolly) ortaya koyabilir (CSI, adli tıp) ), hatta organizmanın tüm genomunun dizilenmesi için bir numunenin hazırlanması (İnsan Genom Projesi). Genomik DNA'ya odaklanmak, bir öğrencinin, genom boyutundaki farklılıkların fark edilmesi için makul bir olasılığın olduğu farklı kaynaklardan örnekleri keşfetmesine de olanak tanır. Bonus olarak, DNA'nın 'sümük' benzeri bir forma çökeltilmesi, aktiviteye ek bir 'vay' faktörü ekler.

DNA'nın MacGyver Ekstraksiyonu:
Deneyin bu kısmı için reaktifler ve malzemeler oldukça basittir. Burada bir doku kaynağı, bir tür fiziksel parçalama, temiz su/tampon solüsyonu, sabun ve alkol bulunması gerekir. Ek olarak, bunu yapmak için bir tür kap, tercihen doğası gereği şeffaf olan bir kap gerekli olacaktır.

Doku Kaynağı:
İzole edilen DNA'nın kimyasal özellikleri organizmadan organizmaya pratik olarak aynı olmasına rağmen, içinde barındırıldığı hücre büyük ölçüde değişebilir. Sonuç olarak, doku seçimi en büyük değişkendir, ancak tartışmasız bir öğrencinin oynaması için en iyi unsurdur. Soğan, bezelye, mısır, maya, fasulye filizi, buğday tohumu, kivi, muz ve hatta insan yanak hücrelerinden DNA çıkarmayı denedik ve bunların hepsinde farklı derecelerde başarı elde ettik. Deneyci optimal koşulları bulmak için oynamaya istekli olduğu sürece, herhangi bir taze ürün veya tahıl materyali ile genel olarak iyi DNA'nın elde edilebileceğini bulduk. Ancak genel olarak, düşük bakım gerektiren DNA ekstraksiyonunun en iyi kaynakları olarak soğan veya muz dokusunu öneriyoruz. Ayrıca, çok iyi çalışan “hızlı” bir prosedür olduğu için buğday tohumu öneriyoruz. Son olarak, bir öğrencinin kendi yanak hücrelerinden izole edilen DNA, etkinliğe kişisel bir unsur kattığı için ilginç bir alternatiftir. Ancak yanak hücrelerinden izolasyonun daha az güvenilir olduğu unutulmamalıdır.

Fiziksel Adım:
Kullandığınız dokuya bağlı olarak, fiziksel bir adım garanti edilebilir. Bu, dokuyu kesmek ve ardından bir havan ve havan tokmağı kullanmak kadar ya da tahta bir çubukla vurmak kadar küçük olabilir. Genel olarak, bitki materyali ve et kesimleri böyle bir adımdan fayda sağlayacaktır, çünkü bitkiler mücadele etmek için sert bir hücre duvarına sahiptir ve et genellikle sert kas çizgileri içerir.

Tampon Çözümü:
Bu, numunenin daldırılması gereken sıvıdır ve bu nedenle DNA'nızı güvende tutma rolüne sahiptir. Çıkarma prosedürü için kullanılabilecek, hepsi temelde çalışan birçok olası MacGyver tipi tampon vardır (bkz. Tablo 1). Bununla birlikte, damıtılmış veya şişelenmiş su kullanılması gerektiğini unutmamalıyız. Musluk suyunun ekstraksiyon prosedürü üzerinde küçük bir etkisi olduğu görülmektedir ve aslında daha sonra açıklanan sonraki jel adımlarında çok zararlıdır.

A: “Tuzlu Tampon”
%0.9 tuzlu su (kontakt lens solüsyonu)

B: “Normal Tampon”
1.5 gr sofra tuzu (NaCl)
5.0 gr kabartma tozu (sodyum bikarbonat)
su ile 120 ml nihai hacme

C: “Asidik Tampon”
1.5 gr sofra tuzu (NaCl)
5.0 gr kabartma tozu (sodyum bikarbonat)
5 mL sirke
su ile 120 ml nihai hacme

D: “Proteinaz Tamponu”
1.5 gr sofra tuzu
5.0 gr kabartma tozu
2.5 mL Komple göz solüsyonu veya 2 protein tableti (Komple marka)
su ile 120 ml nihai hacme

E: “Et Tenderizer Buffer”
100 mL sıcak su
3 gr et yumuşatıcı

* Tek başına suyun da etkili bir şekilde kullanılabileceğini unutmayın.

Sabun/Deterjan:
Genellikle sıvı bulaşık deterjanı kullanılmıştır. Spesifik olarak, sabun renksiz olduğunda daha iyi sonuçlar bulduk ve genel olarak kokusuz versiyonların en iyi sonucu verdiğini gördük. Esasen, marketlerde bulunan sabunların çoğunda koruma, koku, renk, leke çıkarma vb. konularda rol oynayan katkı maddeleri bulunur. Bunlar genellikle teknikle ilgili bir sorun olmasa da, en basit sabunu seçmek sorun giderme için iyi bir şeydir. çıkarma işleminizde başarılı olmuyorsunuz. Genel olarak, 120 ml çözelti başına yaklaşık 5 ml (veya daha az) deterjan kullanmanın iyi sonuç verdiğini gördük.

Filtreleme:
Doku seçiminize ve ayrıca kullanmaya karar verdiğiniz doku miktarına bağlı olarak, kalıntıları çıkarmak için bir filtreleme adımı eklemek uygun olabilir. Bu, sonunda DNA sümük etkisinin daha iyi görselleştirilmesini sağlar. Filtreleme, kahve filtreleri veya tülbent kullanılarak kolayca gerçekleştirilebilir. Tülbent kullanırken 3-4 kat tülbent kullanmanız gerekeceğini unutmayın. Kahve filtreleri genellikle daha kolaydır çünkü daha ucuz, daha erişilebilir ve temizlenmesi daha kolaydır.

Alkol ile Yağış:
DNA'nın çökeltilmesi alkol ile temas yoluyla yapılır. Bu alkol, eczanelerde %99 izo-propanol çeşidinin sürtünme alkolü olarak mevcuttur. Alternatif olarak, çoğu okulun %95 etanol stoklarına erişimi olacaktır. Alkol, numuneniz ile alkol arasındaki arayüzde oluşan DNA'nın görülebilmesi için katmanlar halinde eklenmelidir. Orijinal numunenizin hacminin en az iki katını eklemelisiniz. “Sümük” oluşumunu görmüyorsanız, her şeyi birlikte karıştırmak istenen etkiyi elde etmelidir. Karıştırmaya başvurmayı düşünüyorsanız, görselleştirme kolaylığı için filtreleme adımının özellikle gerekli olabileceğini unutmayın.

DNA, doğal olarak hidrofobik olduğundan ve çözücü optimal değilse (yani su) bir araya toplanma eğiliminde olduğundan, alkol muamelesi altında çökelir. Sonuç olarak, müstahzarınıza bir alkol eklemek, DNA'nın optimal ortamında (su) tamamen çözünmediği ve bu nedenle toplanacağı ve çözeltiden çökeceği anlamına gelir. Topaklanma derecesinin ve kolaylığının, mevcut DNA miktarına ve ayrıca mevcut olduğu konsantrasyona bağlı olacağı vurgulanmalıdır. Bu nedenle, minimum miktarda DNA görürseniz, (i) daha fazla dokudan izole etmeye çalışarak ve (ii) materyali daha küçük bir sıvı hacminde yeniden süspanse ederek bunu düzeltebilmelisiniz.

TABLO 2: ÖNERİLEN MACGYVER GENOMİK DNA EKSİKLİĞİ PROTOKOLLERİ:

GENEL PROTOKOL
1. Gerekirse, seçtiğiniz DNA kaynağını dilimleyin. Çilek büyüklüğünde bir miktar kullanın.
2. Bir havan ve havan tokmağı kullanarak numuneyi öğütün ve deterjan zaten eklenmiş olarak 10 mL hazırlanmış tampon çözeltisini yavaş yavaş ilave edin. En az 5 dakika tüm ağırlığınız ve kuvvetinizle ezerek hücre zarını açarak kremamsı bir çorba kıvamına gelmesini sağlayın. Öğütmeden sonra numune çok kalınsa, daha büyük hücresel malzeme filtrenin arkasında kalırken numunenin sıvı kısmının filtreden geçebilmesi için optimum kalınlığa ulaşmak için daha fazla salin solüsyonu ekleyin. Not: DNA örneği donmuşsa öğütülmesi oldukça kolaydır.
3. Numunenizin suyunu küçük bir behere süzün. Tüm sıvı filtreden geçene kadar çözeltinin behere damlamasına izin verin. Bu çok uzun sürerse, numunedeki tüm suyu filtreden sıkın.
4. Bir pipet veya pastör pipetiyle beherin yan tarafına 2 hacim (bu, mevcut numunenin hacminin yaklaşık iki katı anlamına gelir) buz gibi soğuk alkol ekleyin. Alkolün meyve suyu tabakasının üzerinde bir tabaka oluşturmasını sağlamak için bu adımı yavaşça yapın. Beherin oturmasına izin verdiğinizde, DNA çökelmelidir. Ne kadar uzun süre beklerseniz, o kadar fazla DNA görmeniz gerekir. Yağış görmüyorsanız, her şeyi yavaşça karıştırın.
5. DNA çökeltileri, meyve suyu ve alkol arasındaki arayüzde yarı saydam beyaz sümük ipliğine benzemelidir. Önemli bir süre sonra, DNA sonunda alkol tabakasının üstüne yüzebilir.
6. DNA'yı tahta bir dondurma çubuğu veya cam çubukla çıkarabilirsiniz. DNA ahşaba iyi yapışır.

HIZLI PROTOKOL
1. Fincanınıza bir çay kaşığı veya daha az buğday tohumu koyun.
2. Yaklaşık 10 ml damıtılmış su ekleyin ve bir dondurma çubuğu/çubuk ile 1 dakika boyunca hafifçe ezin.
3. Ardından bir miktar bulaşık deterjanı ekleyin ve buzlu şeker çubuğuyla 2 dakika boyunca hafifçe ezin.
4. Alkolü suyun üzerine koyarak karıştırma çubuğunun uzunluğu boyunca yavaşça alkol dökün.
5. Kabı bir masanın üzerine koyun ve alkol ile su arasındaki arayüzde DNA'yı arayın.

YANAK HÜCRESİ PROTOKOLÜ
1. 10 ml “normal tampon” ölçün (Tablo 1'den), tamponu ağzınıza dökün ve yaklaşık 1 dakika yanaklarda döndürün.
2. Suyu, tercihen test tüpü gibi nispeten dar bir kaba geri tükürün.
3. Numuneye biraz sıvı sabun püskürtün ve dondurma çubuğuyla iyice karıştırın. Ters çevirerek karıştırabiliyorsanız, bunu yaklaşık 20 kez nazikçe yapın.
4. Numuneye yavaş yavaş 10 ml soğuk alkol ekleyin ve iki tabaka oluşturacak şekilde test tüpünün kenarından aşağı doğru açılı olarak döktüğünüzden emin olun. Bunu pipet vb. ile çok nazikçe yapın. İki katmanın bozulmaması önemlidir.
5. Yaklaşık 10 dakika bekleyin, DNA alkol tabakası üzerinde yüzer halde görünecektir.

Bir Araştırma Ortamında DNA'nın Jel Elektroforezi:
Elektroforez, molekülleri yük ve boyuta göre ayırmanın bir yoludur. Bizim durumumuzda meyve, sebze ve mayadan elde edilen farklı boyutlardaki genomik DNA moleküllerini ayırmak istiyoruz. Genel olarak, elektroforez jellerini oluşturmak için agaroz veya akrilamid gibi polisakarit polimerleri kullanılır. DNA negatif yüklü olduğu için, sisteme bir elektrik alanı uygulayarak onu jelden geçmeye zorlayabilir. Normalde bu, "jel"in üretimini veya dökümünü kolaylaştırmak ve bir platformun jeli bir elektrik alanı oluşturmak için bir iyon içeren tampona batırmasına izin vermek için tasarlanmış özel jel aparatı kullanılarak elde edilir. Böyle bir cihaz, minimum yaklaşık 500 $ çalıştıracak ve normalde teslimat için kullanılan güç paketleri

80V voltaj benzer bir fiyat aralığında çalışabilir. Sonuç olarak, MacGyver projesinin bu yönü tartışmalı bir şekilde maliyet tasarrufuna odaklanmıştır ve öncelikle agaroz için bir ikame bulmaya ve bir jel aparatı üretme talimatlarına odaklanmıştır.

DNA'nın MacGyver Jel Elektroforezi:
Jel Malzemesi:
Agaroz, deniz yosununun bir bileşenidir ve bu nedenle "Agar Agar" olarak bilinen yaygın bir gıda koyulaştırıcıdan elde edilen rafine saflaştırılmış bir moleküldür. tesadüfen çoğu doğu tarzı yiyecek mağazasında kolayca bulunabilir. "Agar Agar" pul, erişte veya toz halinde satın alınabilir. Bu bileşenler jel matrisinin oluşumunu engelleyebileceğinden, herhangi bir ek bileşen (glikoz gibi) içermediğinden emin olmaya çalışın. Jel yapmak için, pul veya erişte formundan ziyade toz formunda “Agar Agar” kullanılması tavsiye edilir. Diğer daha büyük formlar, sorunlu ve çok dağınık olan kesme ve ek filtreleme gerektirme eğilimindedir.

Çalışan Tampon:
Jeli yapmak için gerekli olan ve aynı zamanda elektrik alanının iletilmesine izin vermek için katılaşmış jelinizi nihai olarak batıracak sıvı olarak gerekli olan bir çalışan tampon hazırlamanız gerekecektir. Macgyver çalışan arabellek tarifi aşağıdaki gibidir:

– 0.05g NaCl (bu temel iyondur)
– 2g Karbonat (Sodyum Bikarbonat)
– damıtılmış şişe suyuyla 1 L'ye getirin

pH', evcil hayvan mağazası akvaryum pH kiti kullanılarak yaklaşık pH7.5'e getirildi. (Seqchem tarafından yapılan alkalin tamponu kullandık).

Jel Aparatı:
Araştırma sınıfı bir jel kutusu maliyetli olmasına rağmen, aslında nispeten basit bir ekipman parçasıdır. Özünde, sıvı tutabilen büyük bir kaptır (buna bir tampon odası diyelim), bu sayede zıt uçlar bir pozitif/negatif elektrot senaryosu oluşturan bir güç kaynağına bağlanır. Tampon haznesinin, jeli yapmak ve tutmak için kullanılan daha küçük bir kabı (buna jel döküm haznesi diyelim) uygun şekilde tutabilmesi gerekir. Ayrıca, daha küçük jel döküm haznesinin, tampon haznesinin iki elektrotu arasında ortada olacak şekilde oturması gerekir.

Bu elektroforez kutusunun montajı, "bir şeyler yapmayı" sevenler için oldukça basit ve hatta eğlenceli olmalıdır. Bu iki hazneyi ortak plastik malzemelerden (tupperware, sabunluk, vb.) Elektrot bağlantıları için, sorunsuz çalışan paslanmaz çelik vidalar (5cm) ve paslanmaz çelik tel (20 gauge) ile sınırlıydık. Bununla birlikte, uygun bir hırdavatçıyı ziyaret ederek daha ayrıntılı bir elektrot sistemi yapmak kolay olacaktır.

Tupperware kullanmaya bir alternatif olarak, jel döküm odanıza uyacak özel bir tampon oda yapımında da Lego'nun son derece yararlı olduğunu gördük. Lego odalarının su geçirmez bir malzemeyle kaplanması gerektiğini unutmayın, ancak son zamanlarda Glad, mükemmel çalışan ve kullanımı kolay yeni bir "Glad Press'N Seal" malzemesi geliştirdi.

Son olarak, bir “tarak: yapılması gerekecek. Bu, jelinizde küçük kuyucukların oluşmasını sağlayan bir mekanizmadır. Burada lego'nun özellikle yararlı olduğunu gördük, ancak bir bağlamada plastik parçalarını keserek veya gerçek bir saç tarağının dişlerini bantlayarak da taraklar yaptık.

ŞEKİL 1: MACGYVER JEL KUTUSU YAPI NOTLARI.

Jel Hazırlama:
Toz haline getirilmiş “Agar Agar”ı kullanarak %1.2 ila %1.5 arasında bir jel yapmak isteyeceksiniz (a/h veya 1.2g ila 1.5g her 100 ml çalışma tamponu için). Ayrı bir kapta (örneğin bir şişe) gerekli miktarda "Agar Agar" tartın ve gerekli miktarda çalıştırma tamponu ekleyin (belirli miktarlar jel döküm kurulumunuzun boyutuna göre belirlenir). Balon, “Agar Agar” solüsyonunun tabanda 2 cm'lik bir tabaka oluşturması için yeterince büyük olmalıdır. Bu, etkin eritme için ocak ile temas halinde geniş bir yüzey alanı sağlamak için gereklidir. Agar çözeltisini eşit şekilde ısıtmak için bir sıcak plaka kullanılması ve karıştırmaya devam edilmesi önerilir. Bir alternatif mikrodalga kullanmaktır, ancak bu yöntemle karışımı sık sık karıştırırken kısa aralıklarla düşük bir ısı seviyesi kullanılmalıdır. Bu prosedür dikkatli bir şekilde yapılmazsa, çözelti büyük olasılıkla aşırı kaynar ve büyük bir karmaşa yaratır. "Agar Agar" solüsyonu tamamen çözülmezse, bunun DNA'nın jelden geçerken hareketliliğini büyük ölçüde etkileyeceğini unutmayın. Ayrıca, boyama prosedürü sırasında çözünmemiş agar bitleri boyanacak ve bu da DNA bantlarının görülmesini zorlaştıracaktır.

Not: Bazı okulların bakteri plakaları yapmak için kullanılan “Agar”a erişimi vardır. Bu malzeme jellerin dökülmesinde çok iyi çalışır ("Agar Agar"dan çok daha iyi) Genomik görselleştirme amacıyla %1 w/v jel yapmanızı öneririz.

Döküm jel odanızın açık uçlarını maskeleme bandı veya benzeri bir malzeme ile kapattığınızdan emin olun. Eritilmiş karışımı döküm jeli haznenize dökün. Kuyu oluşumunun gerçekleşmesi için “tarak”ı da yerleştirmeyi unutmayın.Jelin katılaşması oda sıcaklığında yaklaşık 20 ila 30 dakika sürecektir. Bu süre zarfında jeli rahatsız etmeyin. Jel oldukça hassastır, bu nedenle numunenizi yüklemeden önce tarağı çıkarırken çok dikkatli olun.

Jel, yaklaşık 0,5 cm ila 1,0 cm kalınlığa kadar dökülmelidir. Daha kalın jeller, daha derin kuyular yapma fırsatı verir, böylece daha büyük bir numunenin yüklenmesine izin verir. Daha ince jeller daha hızlı çalışmalıdır. Jel çok inceyse, daldırıldığında yüzebileceğini unutmayın. Jeli mümkün olan en kısa sürede kullanmaya çalışın. Plastik sargıya sarabilir ve gece boyunca buzdolabında saklayabilirsiniz, ancak taze kullanıldığında daha iyi çalışırlar.

DNA Örneği Hazırlama:
Tahta bir karıştırma çubuğu kullanılarak ekstraksiyon prosedürünün sonunda genomik sümük DNA'nız çıkarılabilir. DNA daha sonra fazla tuzların uzaklaştırılmasını kolaylaştıran %70'lik bir alkol solüsyonuna daldırılmalıdır. Bu, etkili çözünmenin yanı sıra etkili jel çalışması için çok önemlidir. DNA daha sonra kalan alkolü buharlaştırmak için yaklaşık 10 dakika havayla kurutulabilir ve daha sonra küçük bir hacimde çalışan tampona aktarılabilir (ne kadar küçük olursa o kadar iyi, yani <0.5mls). Genomik DNA'nın düzgün bir şekilde çözünmesinin genellikle günler alabileceğini unutmamak gerekir. DNA'nın gece boyunca oda sıcaklığında çözülmesine izin vermenizi öneririz (50C'ye kadar sıcaklığa erişiminiz varsa, o zaman bu en iyisidir). Büyük genomik DNA kesilmeye çok meyilli olduğundan numunenize karşı nazik olun. Bir gecede çözülme aşaması bittiğinde, tamamlanana kadar çözülüp çözülmediğinden bağımsız olarak bunu DNA örneğiniz olarak kabul edin.

Numunenizin daha sonra bir yükleme arabelleği ile işlenmesi gerekecektir. Bu, esasen numunenizin viskoz olmasına neden olacak ve böylece yükleme sırasında kuyularınıza gerçekten "batabilecek" bir şeydir. Çoğu zaman, bir yükleme tamponunda DNA ile aynı yönde hareket edecek ve ayrıca jel yüklemesinin görülmesini kolaylaştıran bir boya da bulunur.

Tarifimiz şu şekilde:
– 0,5ml gliserol/gliserin (eczane bölümünde mevcuttur)
– 0.1 ml damıtılmış su
Birkaç damla Kulüp Evi Kırmızı Gıda Boyası (boya seçiminin sonucu büyük ölçüde etkileyebileceğini unutmayın - burada iyi bir şey bulma konusunda pek başarılı olamadık, bu nedenle son çare boya kullanmadan kullanmak olacaktır).

Bu yükleme tamponu 5X ila 10X olarak kullanılabilir, yani 0,5 ml numune için 0,05 ila 0,1 ml yükleme tamponu eklemeniz gerekir. Dikkatlice karıştırın. Numuneniz artık jel için hazırdır.

Jel Koşusu.
Katılaşmış jelinizi (jel döküm haznesine) daha büyük tampon haznesine yerleştirin. Jelin üzerinde en az 3 mm sıvı kalacak şekilde jel daldırılana kadar çalıştırma tamponu ekleyin. Ne kadar sıvı eklerseniz jelin o kadar yavaş çalışacağını unutmayın.
Kuyularınıza mümkün olduğu kadar çok numune (yükleme tamponu ile) yükleyin. Bu muhtemelen en iyi, bir tür kauçuk ampule bağlı plastik bir karıştırma çubuğu ile yapılır. Esasen, sıvıyı küçük bir tüpten geçirebilecek bir şey monte etmek istersiniz. Tüm numuneler yüklendikten sonra elektrotları bir dizi 9V pile bağlamak isteyeceksiniz. DNA'nız negatif yüklüdür, bu nedenle pozitif elektrotu kuyulardan "uzak" olarak konumlandırmak istersiniz. Temel olarak, bir pil yeterli olacaktır ancak çok çok yavaş olacaktır (gece çalışma senaryosu). 5'ten 7'ye veya seri bir devrede dizilmiş olmaları iyi miktarda voltaj vermelidir. Jel çalışırken, parmağınızı sıvıya SOKMAYIN. Kullandığınız pil sayısına bağlı olarak 100mAmp kadar akım verilir (size küçük bir şok verecek kadar).

Devre çalışırken, tel elektrotlardan kabarcıkların oluştuğunu ve genellikle en çok pozitif uçta görülebildiğini görmek iyi bir görsel kontroldür.

Jeli çalıştırmak için en uygun süre, açıkçası, jelinizin boyutuna, jelinizin kalınlığına, sistemdeki çalışan tampon miktarına, uygulanan voltaj miktarına bağlı olduğundan tahmin edilmesi zor bir şeydir. , ve hatta kullanılan kablolama kurulumu. Sonuç olarak, kesinlikle oynamanız gereken tek şey budur. Ancak, 5 ila 7 pil kurulumunda en az 1 saate ve muhtemelen daha fazlasına ihtiyacınız olacaktır. Ek olarak, farklılaşan genomik hazırlıklar uygunsa (yani farklı genom boyutu), bu potansiyel farkı görmek için çalışma süresiyle daha fazla deneme yapmanız gerekebilir.

Bir Araştırma Ortamında DNA'yı Görselleştirmek:
Elektroforez tamamlandıktan sonra bantların yerinin görselleştirilmesi gerekir. Bantları tespit etmenin yaygın bir yolu, jeli, DNA'yı görüntülemek için ultraviyole ışık altında floresan olan etidyum bromür ile lekelemektir. Ne yazık ki, hem etidyum bromür hem de ultraviyole ışık tehlikelidir (Ethidyum son derece kanserojendir ve UV ışığı uygun güvenlik önlemleri alınmadan bir kişinin gözlerini yakabilir) ve bu nedenle lise öğrencileri arasında kullanım için ideal değildir.

DNA'yı Görselleştirmenin MacGyver Yolu:
DNA bantlarını görselleştirmek için jel, bir Metilen Mavisi solüsyonunda lekelendi. Metilen Mavisi, tuz metilen mavisi klorürden oluşur. Suda tuz, mavi renkli pozitif yüklü metilen mavisi iyonuna ve renksiz negatif yüklü klorür iyonuna ayrışır. Bu mavi kromofor daha sonra jeldeki pozitif yüklü DNA'ya bağlanabilir. Metilen mavisi, kimyasal olarak güvenli, tekrar kullanılabilir ve 20ng'den fazla DNA/bant varlığını tespit ettiği için laboratuvarda kullanıma uygun bir lekedir.

Daha da önemlisi, metilen mavisi çoğu evcil hayvan mağazasında rahatlıkla bulunabilir. Genellikle %5 konsantrasyonda bir akvaryum dezenfektanı olarak satılır. En iyi jel boyama sonuçları, bitmiş jelin gece boyunca oda sıcaklığında %0.02 metilen mavisi (damıtılmış su içinde) solüsyonuna daldırılmasıyla elde edildi. Bu protokolü kullanarak, fazla rengin damıtılmış su inkübasyonu ile lekelenmesi gerekli değildi. Daha yüksek konsantrasyonlu çözeltilerin jeli çok koyu lekeleme eğiliminde olduğunu ve bu da arka planı DNA bantlarından ayırt etmeyi zorlaştırdığını bulduk. Bu, damıtılmış su ile leke çıkarıldıktan sonra bile gözlendi. Ayrıca, "Agar Agar" tozu jel içinde tamamen çözünmemişse, çözünmeyen pullar koyu mavi boyanarak belirgin, görünür bantların oluşmasını engelledi.

ŞEKİL 2: MISIR GENOMİK DNA HAZIRLIK MACGYVER TARZI.

Sonuçlar:
Genel olarak, MacGyver sınırlaması altında bazı temel moleküler biyoloji tekniklerini gerçekleştirmek için etkili bir yöntem taslağı tanımladık (Şekil 2). Bununla birlikte, bunu kendi sınıfınızda yapmanın kaçınılmaz olarak biraz kendi çalışmanızı gerektireceğini vurgulamalıyız. Bu, “Yeterli DNA'm var mı?” gibi çok sayıda düşünceden kaynaklanmaktadır. "jel kurulumum nedir" "işleri daha da verimli hale getirmek için elimde ne tür özel reaktifler var?" vb. Ancak burada sunulan bilgilerin sorun gidermenizi olabildiğince sorunsuz hale getirmesi umulmaktadır. İyi şanlar!


Malzemeler ve yöntemler

Örnek Açıklama ve İşleme

Deniz tabanında nispeten yüksek biyokütleye sahip derin deniz ortamlarının temsilcileri olarak üç örnek toplandı: (1) Guaymas Havzasından (burada GB) toplanan mikrobiyal mat kaplı, organik zengin yağa batırılmış hidrotermal tortu. alvin 2008'de 4460 AT-15-25 dalışı sırasında itme çekirdeği ile (2) Doğu Pasifik Yükselişi'nden (burada EPR) bir bazaltik sülfür hidrotermal baca, tarafından toplanmıştır. Jason 2014 yılında Cruise AT-26 dalış 10 sırasında robotik kol ile (3) Güney Çin Denizi'nden (burada SCS) kalsiyum karbonat ve kil bakımından zengin deniz tabanı tortusu, 2013 yılında Cruise HYIV20130429 sırasında yerçekimi çekirdeği tarafından toplanmıştır. Ayrıntılı bilgi şurada verilmiştir: Tablo ​ Tablo1 1 . Örnekler kullanılana kadar �ଌ'de saklandı. Her bir yuvarlak numune için, çekirdek bölümü ve baca, laminer bir akış başlığında steril bir spatula ile alt örneklendi ve çalkalanarak daha da homojenleştirildi. Bu çalışmada, önceki örnek tedavi prosedürlerinin çoğuna uygun olması için, DNA ekstraksiyonu sırasında hücre dışı DNA ve hücre içi DNA ayrılmamıştır (Alawi ve diğerleri, 2014).

Tablo 1

Üç DNA ekstraksiyon yöntemi kullanılarak numunelerin ve kurtarılan DNA'nın özeti.

Örnek konumÖrnek tipSıcaklık (ଌ)Derinlik (mbsf)Su derinliği (m)Hücre bolluğu (hücre/g numune)DNA ekstraksiyon yöntemiDNA geri kazanımı (μg DNA/g örneği) 1 DNA geri kazanımı (μg DNA/g numunesi) 2 Archaeal 16S rRNA gen kopyaları/g örneğiBakteriyel 16S rRNA gen kopyaları/g örneğiArchaeal - Bakteriyel 16S rRNA gen oranıParçalanmamış hücre (hücre/g numune)Lizis verimliliği (%)
Guaymas Havzası (GB)Yağa batırılmış hidrotermal tortu310.061,96 ± 0,22 × 10 10 M-SDS75,1 ± 6,9512.95 ± 0.167,2 ± 0,2 × 10 9 10.0 ± 0.1 × 10 8 7.203,6 ± 0,6 × 10 8 98.2
HA25.1 ± 3.4 3 3.17 ± 0.141.5 ± 0.0 × 10 9 3.5 ± 0.1 × 10 8 4.262,7 ± 0,2 × 10 8 98.6
KITI14.5 ± 3.50,25 ± 0,031,7 ± 0,2 × 10 6 9,8 ± 0,7 × 10 5 1.691,5 ± 0,3 × 10 9 92.5
Doğu Pasifik Yükselişi (EPR)Bazaltik sülfür, hidrotermal baca40CS20001,69 ± 0,25 × 10 9 M-SDS30.0 ± 1.411.21 ± 0.0042,2 ± 0,3 × 10 7 7,9 ± 0,1 × 10 7 0.284,4 ± 0,02 × 10 7 97.4
HA12,8 ± 0,3 3 0.11 ± 0.033.4 ± 1.0 × 10 6 4,7 ± 0,1 × 10 7 0.072,9 ± 0,4 × 10 8 82.9
KITI6.0 ± 0.770,06 ± 0,0043,9 ± 0,2 × 10 4 1,6 ± 0,1 × 10 6 0.032,1 ± 0,5 × 10 7 98.8
Güney Çin Denizi (SCS)Kalsiyum karbonat, kil tortusu𢏄0.1116001,17 ± 0,03 × 10 9 M-SDS43.2 ± 1.10,60 ± 0,013.1 ± 0.1 × 10 7 1,6 ± 0,0 × 10 8 0.191,1 ± 0,02 × 10 7 99.0
HA23,3 ± 0,7 3 0.12 ± 0.048,3 ± 0,3 × 10 6 6,6 ± 0,2 × 10 7 0.134,3 ± 0,8 × 10 7 96.3
KITI8.2 ± 1.0deniz mili8.3 ± 2.1 × 10 4 3.1 ± 0.1 × 10 5 0.265,9 ± 0,6 × 10 7 94.9

DNA Ekstraksiyon Yöntemleri

Deniz tabanı örneklerinden DNA çıkarmak için üç yöntemi test ettik: (1) Zhou ve diğerleri tarafından modifiye edilmiş bir SDS tabanlı yöntem. (1996, yani, M-SDS Şekil ​ Şekil1 1 ) (2) Morono et al. (2014, yani HA) (3) ticari bir kit (burada KIT). Genel olarak, her bir paralel ekstraksiyon için 0,3 g iyice karıştırılmış numune kullanılmıştır. M-SDS ile DNA ekstraksiyonu için, 0,3 g tortu veya baca numunesi, eşit ağırlıkta 0,1 mm çapında cam boncuk ve 670 μL ekstraksiyon tamponu (100 mM Tris-HCl, 100 mM sodyum EDTA, 100 mM sodyum fosfat, 1.5 M NaCl ve %10 setiltrimetilamonyum bromür, pH 8.0). Örnek, 5 dakika boyunca düşük hızlı vorteks kullanılarak ekstraksiyon tamponu ile karıştırıldı ve daha sonra bir doku lyzer (Tissuelyser-48, Shanghai Jingxin, Çin) ile 30 Hz'de 30 saniye ve 120 saniyelik aralıklarla iki döngü ile homojenleştirildi. 50 μL lizozim (20 mg/mL) ve 10 μL proteinaz K (20 mg/mL) eklendi ve 37ଌ su banyosunda 30 dakika inkübe edildi. İnkübasyondan sonra 70 μL %20 SDS eklenmiş ve her 10 dakikada bir hafifçe karıştırılarak 65'x000b0C'de 2 saat inkübe edilmiştir. Süpernatan, 10.000 × sonra toplandı. G oda sıcaklığında 10 dakika santrifüjlendi ve 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarıldı. Kalıntı topaklar, 500 μx003bcL ekstraksiyon tamponu eklenerek bir kez daha ekstrakte edildi ve yukarıda tarif edildiği gibi iki kez homojenleştirildi, ardından 70 μx003bcL %20 SDS eklenip 1 saat boyunca 65'x000b0C'de inkübe edildi ve ardından santrifüjlendi. İki ekstraksiyon adımından elde edilen süpernatan birleştirildi ve eşit hacimde fenol:kloroform:izoamil alkol (25:24:1 [hacim/hacim]) ile karıştırıldı. Sulu faz, santrifüjleme ile tutuldu ve daha sonra çözünmüş DNA, gece boyunca 4°C'de 70.6 hacim izopropil alkol ve 0.3 M sodyum asetat (pH 5.2) ile çökeltildi. Tüp 16.000 ×'de santrifüjlendi G 20 dakika oda sıcaklığında tutuldu ve DNA kaybını önlemek için süpernatant dikkatlice çıkarıldı. Son olarak, DNA peleti önceden soğutulmuş %70 etanol ile yıkandı ve 50 μx003bcL Milli-Q su içinde yeniden süspanse edildi.

Modifiye edilmiş SDS tabanlı DNA ekstraksiyon yöntemini (M-SDS) gösteren akış şeması. Sağ kısım, bu çalışmada kullanılan M-SDS yöntemidir. Sol kısım Zhou ve ark. (1996) yöntemi.

HA ile DNA ekstraksiyonu, 0.3 g tortu, önceden ısıtılmış alkalin lizis solüsyonu (1 M NaOH, 5 mM EDTA pH 8.0 ve %1 SDS) ile karıştırıldı ve 70'sx000b0C'de 20 dakika inkübe edildi. İnkübe edilen tortu örnekleri 1000 ×'de santrifüj edildi. G 1 dakika boyunca oda sıcaklığında ve süpernatant geri kazanıldı ve 1 M HC1 ve 0.3 M Tris-HCl (pH 8.0) ile nötralize edildi. Daha sonra tortu topakları, önceden ısıtılmış çift damıtılmış su ile yıkandı ve santrifüjleme yoluyla çözelti geri kazanıldı, ardından önceki süpernatan ile birleştirildi. Kombine süpernatan solüsyonları eşit hacimde fenol:kloroform:izoamil alkol ve kloroform:izoamil alkol (25:1[hacim/hacim]) ile işlendi, ardından sulu faz santrifüjleme ile toplandı. Nükleik asit, 0.1 hacim sodyum asetat 3 M, etachinamat ve 2.5 kat daha fazla hacimde buz gibi soğuk etanol eklenerek çökeltildi. Numune daha sonra 15000 ×'de santrifüjlendi. G 4 °C'de 30 dakika boyunca peletleri %70 etanol ile yıkandı ve 1X TAE pH 8.0 ile yeniden süspanse edildi. Tortudan ekstrakte edilen DNA, PCR inhibitörlerini çıkarmak için polivenilpolipirolidon (PVPP) ile doldurulmuş bir döndürme kolonu kullanılarak daha da saflaştırıldı. PVPP hazırlama, saflaştırma ve DNA, Morono ve arkadaşlarına göre geri kazanıldı. (2014).

Bu çalışmada, üreticinin protokolüne göre toprak DNA ekstraksiyonu için tasarlanmış ticari bir kit (PowerSoil DNA Isolation Kit, MO BIO Laboratories, Carlsbad, CA, ABD) kullanıldı. Kısaca, 0.3 g numuneler, farklı boyutta cam boncuklar içeren bir boncuk dövme tüpüne, hızlı ve boncuk döverek homojenleştirme için lizis tamponu eklenir. Hücre lizizi mekanik ve kimyasal yöntemle gerçekleşir ve toplam genomik DNA, bir döndürme kolonunda (kolon filtrasyonu) bir silika membran üzerinde yakalanır. DNA yıkandı ve membrandan ayrıştırıldı. DNA konsantrasyonu Nanodrop 2000 (UV/Vis. Spektrofotometre, Thermo Fisher Scientific, ABD) ile ölçüldü ve parça boyutu, %1 agaroz jel üzerinde elektroforez ile analiz edildi. HA yöntemi kullanılarak ekstrakte edilen DNA, tek sarmallı DNA olarak kabul edildiğinden, konsantrasyon, 260 nm'de bir spektrofotometre absorbansı ile hesaplanmıştır (Farrell, 2009 Morono ve diğerleri, 2014). Çift zincirli DNA (dsDNA) konsantrasyonu Qubit 3.0 florometre (Life Technologies, Invitrogen) ile Qubit dsDNA HS Assay kiti kullanılarak ölçülmüştür. Ayrıca DNA konsantrasyonu, standart eğri olarak Lambda DNA/HindIII Marker 2 (Thermo Fisher Scientific, ABD) kullanılarak agaroz jel üzerindeki DNA bantlarının yoğunluğuna dayalı olarak CLIQS 1D Pro yazılımı (TotalLab, UK) ile karşılaştırıldı. Farklı cam boncuk çapları (0,1, 0,5 mm, 1:1 oranında karışık 0,1 ve 0,5 mm), cam boncukların numuneye oranı (0,5:1, 1:1, 1:2, 2:1) ve doku lyzer (20, 30, 40, 50, 70 Hz) yoğunluğu test edildi. Üç yöntem boyunca her bir DNA ekstraksiyonu partisi sırasında paralel bir boş ekstraksiyon yapıldı. PCR ile amplifiye edilmiş 16S rRNA genleri için agaroz jel üzerinde herhangi bir görsel bant görülmediyse, DNA ekstraksiyonunun kontaminasyon içermediği kabul edildi.

Hücre Numaralandırma

Kısaca, DNA ekstraksiyonundan önce ve sonra deniz tabanı numuneleri %3 NaCl solüsyonunda yeniden süspanse edildi (%2 paraformaldehit fiksatif olarak eklendi). Her bir ekstraksiyon yöntemi için mikrobiyal hücre sayıları ve hücre liziz verimliliği Morono ve arkadaşlarına göre hesaplandı. (2009, 2014).

Arkeal ve Bakteriyel 16S rRNA Genlerinin Kantifikasyonu

Archaeal ve bakteriyel 16S rRNA genlerinin kopya sayıları, Applied Biosystems 7500 Real Time sisteminde (Life Technologies, ABD) kantitatif PCR (qPCR) ile ölçülmüştür. qPCR, SYBR ön karışımı Ex Taq II (TaKaRa, Japonya), her bir ileri ve geri primerden 0,8 μM ve 1 μL şablon DNA ile gerçekleştirildi. Standart seriler ve negatif kontrol ile birlikte her numune için 25 μx003bcl reaksiyon hacmi ile niceleme, üç kopya halinde gerçekleştirildi. Archaeal 16S rRNA gen kopyaları Uni519F (5′-CAGCMGCCGCGGTAA-3′ Ovreas ve diğerleri, 1997) ve Arch908R (5′-CCCGCCAATTCCTTTAAGTT-3′ Jorgensen ve diğerleri, 2012) primerleri ile termal 95×000b0C'de 15 dk ve 30 sn için 95′x000b0C, 30 sn için 60′x000b0C ve 45 sn için 72′x000b0C'de 40 çevrim bisiklet programı. Escherichia koli Negatif kontrol olarak DH5α genomik DNA kullanıldı. Standart eğri, 101 ile 107 arasında archaeal 16S rRNA gen fragmanları içeren PMD 18 T-Vector (TaKaRa, Japonya) dilüsyonları kullanılarak hazırlandı. Amplifikasyon verimliliği %96 idi ve r Standart eğrinin 2'si 0,99 idi. Bakteriyel 16S rRNA gen kopyaları, bac341F (5′-CCTACGGGWGGCWGCA-3′ Jorgensen ve diğerleri, 2012) ve 519r (5′-TTACCGCGGCKGCTG-3′ Ovreas ve diğerleri, 1997) primerleri ile ölçüldü. 95ଌ'de 15 dakikalık bisiklet programı ve 30 sn için 95'x000b0C ve 30 sn için 72'x000b0C'de 35 döngü. Standart eğri, 102 ve 107 arasında bakteriyel 16S rRNA gen fragmanları içeren seyreltilmiş bir PMD 18 T-Vektöründen oluşuyordu. genomik DNA'sı Pyrococcus yayanosii CH1 negatif kontrol olarak kullanıldı. Amplifikasyon verimliliği %100 idi ve r Standart eğrinin 2'si 0,99 idi.

PCR Amplifikasyonu ve Sıralama

16S rRNA geninin arkeal V4 bölgesi, çoklu etiket primer setleri U519F (5'x02032-XXXXXXXXXXX YMGCC RCGGKAAHACC-3'x02032) ve Arch806R (5'x02032-GGACTACNSGG GTMTCTAAT-3'x02032 Song et al., 2013 ile amplifiye edildi. ), burada X bölgesi her örnek için çeşitli anahtar etiketleri temsil eder. PCR programı 95'x000b0C'de 3 dk, ardından 35 döngü 94'x000b0C 40 sn, 56'x000b0C 1 dk ve 72'x000b0C 1 dk. Son uzatma adımı 10 dakika boyunca 72ଌ idi. Bakteriyel V4 bölgesi, 16S rRNA geni, her numune için sekiz nükleotid anahtar etiketi ve 802R (5'x02032-TACNVGGGTATCTAATCC-3'x02032 Song ve ark., 2013). 50 μL amplifikasyon karışımı, her bir ileri ve geri primerden 1 μL, 1 μL şablon DNA, 5 μL 10× Ex Taq tampon, 0.25 μL Ex Taq polimeraz (TaKaRa, Japonya), 4 μL 2.5 mM dNTP karışımı ve 5 μL BSA (25 mg/mL). PCR programı 95×000b0C'de 3 dk, ardından 35 döngü 94'x000b0C 40 s, 56'x000b0C 40 s ve 72'x000b0C 2 dak. Son uzatma adımı 10 dakika boyunca 72ଌ idi. PCR ürünleri E.Z.N.A. Jel Ekstraksiyon Kiti (Omega Bio-Tek, ABD) ve üreticinin talimatlarına göre MiSeq platformunda (Illumina, ABD) sıralanmıştır.

Mikrobiyal Topluluk Bileşimi ve İstatistiksel Analiz

Başka bir yerde açıklandığı gibi ham dizi okumalarına bir kalite kontrol adımı uygulandı (Zhang ve diğerleri, 2016). Kısaca, ortalama kalite puanı 30'dan az olan ve/veya herhangi bir belirsizliğe sahip 50 bp'lik bir sürekli parça içeriyorsa ham okumalar kaldırılmıştır. Filtrelenen okumalar FLASH kullanılarak birleştirildi (Magoč ve Salzberg, 2011 Sürüm 1.2.6). Birleştirilmiş diziler, sürekli olarak meydana gelen altıdan fazla aynı baz içeriyorsa ve/veya herhangi bir belirsizlik içeriyorsa veya dizi uzunluğu 𼈀 bp ise çıkarıldı. Temiz diziler, QIIME yazılım boru hattı (Caporaso ve diğerleri, 2010 Sürüm 1.9.0) kullanılarak numune kimliği, barkod ve primer dizisini içeren bir eşleme dosyası kullanılarak demultiplekslendi. Dizi okumaları, %97 dizi benzerliği sınırında operasyonel taksonomik birimler (OTU'lar) halinde kümelendi ve OTU'lar, QIIME yazılım boru hattı (Caporaso ve diğerleri, 2010 Sürüm 1.9) kullanılarak Greengenes veritabanına atandı (DeSantis ve diğerleri, 2006 Sürüm gg_13_5) .0). Kimeralar UCHIME programı ile tespit edildi (Edgar ve diğerleri, 2011 Sürüm 4.2) ve daha fazla analizden çıkarıldı. Üçlü arsa, seyreklik analizi ve çeşitlilik indeksleri, PAST yazılım paketi kullanılarak gerçekleştirilmiştir (Hammer ve diğerleri, 2001). Venn diyagramı için, diziler eşit derinliğe kadar seyrekleştirildi (Tablo ​ Tablo2 2 , her grup içindeki en az dizi sayısı SCS örneğiydi) QIIME kullanılarak rastgele örnekleme yoluyla. Venn şeması, Venn Şeması Plotter yazılımı 1 kullanılarak oluşturulmuştur.

Tablo 2

Üç DNA ekstraksiyon yöntemi kullanılarak arke ve bakteri 16S rRNA gen dizilerinin özeti.

Arkeal zenginlik ve çeşitlilik Bakteriyel zenginlik ve çeşitlilik
ÖrneklemDNA ekstraksiyon yöntemidizi sayısıOTU sayısı (%97)Zenginlik (ACE)Shannon'ın endeksi (Chao ve Shen)Simpson endeksi (MLE)dizi sayısıOTU sayısı (%97)Zenginlik (ACE)Shannon'ın endeksi (Chao ve Shen)Simpson endeksi (MLE)
Guaymas Havzası (GB)M-SDS42,8721,5630.711.690.0923,5053980.6920.04
HA39,7986820.631.350.0723,4713980.681.750.04
KITI9,5875720.711.520.0919,7303380.531.440.03
Doğu Pasifik Yükselişi (EPR)M-SDS46,7736390.832.260.1529,7661,1710.974.180.22
HA44,9584390.812.230.1625,7221,0300.943.60.14
KITI37,7005130.762.070.1622,1268940.943.540.13
Güney Çin Denizi (SCS)M-SDS56,4109530.812.160.1925,1162,0720.913.470.10
HA33,6686800.792.020.1518,5691,7110.892.960.13
KITI30,8746760.721.950.1214,1051,6840.842.530.11

Metagenom Dizileme ve Topluluk Kompozisyon Analizi

GB örneğinden M-SDS ile ekstrakte edilen yaklaşık 5 μg DNA, BGI-Shenzhen tarafından metagenom dizilimi için kullanıldı. DNA parçalandı ve jel-elektrofotometriye tabi tutuldu. Parçalanmış DNA'ya bir son onarım karışımı eklendi ve karışım 20'C'de 30 dakika inkübe edildi ve ardından QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen, Almanya) ile saflaştırıldı. Daha sonra A-tailing karışımı ilave edildi ve karışım 37°C'de 30 dakika inkübe edildi. Adaptör ve ligasyon karışımı ile birlikte saflaştırılan 3'x02032 uçlu adenilat DNA karışımı ligasyon reaksiyonu için 20'x000b0C'de 15 dakika inkübe edildi. Adaptörle bağlanmış DNA, %2 agaroz jelden geri kazanıldı. Seçilen jel, QIAquick Gel Extraction kiti (Qiagen, Almanya) ile saflaştırıldı ve adaptörle bağlanmış DNA parçalarını zenginleştirmek için birkaç tur PCR amplifikasyonu yapıldı. Hedef parçaları geri kazanmak için bir başka %2 agaroz jel turu gerçekleştirildi. 350 bp-insert boyutuna sahip kitaplıklar, akış hücresinde bir küme oluşturmak için büyütüldü (TruSeq PE Cluster Kit V3KcBot𠄻otCIllumina). Amplifiye edilmiş akış hücresinin çift uçlu dizilimi, HiSeq 2000 Sistemi (TruSeq SBS KIT-HS V3, Illumina, BGI-Shenzhen'de) kullanılarak yapıldı. Illumina çift uç dizilimi ile elde edilen ham metagenomik okumalar replike edildi (%100 uzunluklarda %100 özdeşlik) ve orak 2 kullanılarak budandı. 16S rRNA dizileri, Sortmerna (Kopylova ve diğerleri, 2012) kullanılarak özümlendi ve referans 16S dizilerinin kümelenmesine dayalı olarak (Quast ve diğerleri, 2013) %97 dizi benzerliği kesiminde OTU'lara eşlendi.

Erişim numarası

Tüm dizi verileri, Ulusal Biyoteknoloji Bilgi Merkezi (NCBI) Dizi Okuma Arşivinde SRP072161 erişim numarası altında saklanmıştır.


Bulaşma

PCR testleri bağlamında, önemli kontaminasyon biçimleri, numunede uygun olmayan şekilde bulunan ve ayrıca spesifik hedefle birlikte tespit edilebilen ve yanlış pozitif ile sonuçlanan nükleik asit şablonu veya aşağı akış reaksiyonlarını engelleyerek, şablon konsantrasyonunun yanlış negatifleri veya daha düşük tahminleri.

Şablon Kirliliği

PCR süreci, amplikonun kopyalarını katlanarak oluşturduğundan, PCR deneyleri, ilgilenilen spesifik hedef diziyle amplikon kontaminasyonuna karşı özellikle hassastır. Sonuç olarak, bir PCR tahlili gerçekleştirme süreci, gelecekteki PCR tahlilleri için mükemmel kirleticiyi üretir. Bir moleküler biyoloji laboratuvarında, reaksiyonun kurulduğu ve yürütüldüğü alanı, PCR ürününün analiz edileceği ve daha fazla manipüle edileceği PCR sonrası analiz alanından ayırmak esastır. Mümkün olduğunda, PCR sonrası analiz alanından hiçbir şeyin temiz, (PCR öncesi) alanla temas etmeyeceği şekilde özel ekipman ve laboratuvar önlükleri bulunan ayrı odaların kullanılması tercih edilir. Birçok laboratuvar, reaksiyonun bulaşmasını önlemek için bu alanlara personel erişimi için daha fazla kontrol sağlar. Kantitatif PCR deneyleri, tek bir şablon molekülü tespit edebildikleri ve kontamine edici şablon, miktar ölçümlerini karıştıracağından, amplikon kontaminasyonuna karşı özellikle hassastır.

Spesifik amplikonun PCR üretimine ek olarak, orijinal şablon materyalin bir numuneden diğerine aktarılmadığından (çapraz kontaminasyon) veya insan numunelerinin analizi durumunda, bu materyalin laboratuvar kurulumunda dikkatli olunması gerekir. analizi yapan personelden tanıtılmamıştır.

Potansiyel kontaminasyon kaynaklarını belirlemek için uygun kontrollerle standart bir deneysel prosedürün benimsenmesi şiddetle tavsiye edilir.

RNA'nın gDNA ile kontaminasyonu

RNA'yı analiz ederken, gDNA kontaminasyonu olmadığından emin olmak önemlidir. Numunelerin çözelti içinde DNase I ile enzimatik muamelesi, kontamine edici gDNA'nın çıkarılması için tavsiye edilir ve özellikle intronsuz genlerin araştırılması için veya test tasarımının gDNA ve cDNA dizileri arasında ayrım yapmadığı durumlarda önemlidir. Mümkün olan her yerde, yalnızca işlenmiş mRNA dizilerinin amplifiye edilebileceği ve/veya saptanabileceği şekilde intron/ekson sınırı üzerinde analizlerin tasarlanması tavsiye edilir. Etkili bir şekilde genomik cDNA dizileri olan işlenmiş psödo genler olarak var olan diziler olduğundan, bu her zaman gDNA'dan amplifikasyonu engellemez (bkz. PCR/qPCR/dPCR Test Tasarımı). Ayrıca reaktiflerde DNA bulunduğunu ve potansiyel olarak kontaminasyon sorunlarına neden olabileceğini de dikkate almaya değerdir 12 .


Arka plan

Ökaryotik hücrelerde meydana gelen tüm DNA şablonlu işlemler, bunu kromatin bağlamında yapar. Kromatin, bir oktamer histon proteini etrafına sarılmış 147 baz çift sarmallı DNA çiftinden oluşan bir dizi nükleozomdan oluşur (Kornberg ve Lorch 1999). Kromatin, her biri kromatin etkileşimli faktörler tarafından düzenlenen bireysel nükleozomlar, DNA erişilebilirliği ve daha yüksek dereceli yapılar seviyelerinde DNA şablonlu işlemlerin uygun işlevini kolaylaştırmak için yüksek düzeyde düzenlenir. Bu kromatin etkileşimli faktörler, yerel kromatin mimarisinin hem nedeni hem de sonucu olarak genom bölgelerine yönlendirilir ve ayrı faktör lokalizasyonu kalıpları yaratır. Ortaya çıkan, kromatin düzenleyici faktörlerin nükleozom mimarisini etkilediği ve bunun da yeni düzenleyici faktörlerin bağlanmasını etkilediği karmaşık bir karşılıklılık sistemidir. Bu süreçler arasındaki dinamik etkileşim ile, nükleozom mimarisini ve düzenleyici faktör bağlanmasını incelemek için çeşitli yöntemler gereklidir.

Bir hücre içindeki düzenleyici elemanlar, öncelikle genomun açık veya erişilebilir bölgelerinde bulunur. Bu nedenle, hücreye özgü düzenleyici öğelerin belirlenmesi, öncelikle erişilebilirlik deneyleri yoluyla gerçekleştirilir. Açık kromatinin saptanması, kromatinle etkileşime giren proteinler için bağlanma bölgelerini de belirleyebilir. Bu derlemede, ilk olarak, DNase I ile sindirim ve derin dizileme (DNase-seq) dahil olmak üzere kromatin erişilebilirliğini incelemek için kromatin biyolojisi alanındaki teknikleri tartışacağız (Crawford ve diğerleri 2006a, b Sabo ve diğerleri. 2006 Song ve Crawford 2010 ), düzenleyici elemanların formaldehit destekli izolasyonu (FAIRE-seq) (Giresi ve diğerleri. 2007 Simon ve diğerleri. 2012), mikrokokal nükleaz (MNase) sindirimi ve ardından derin sıralama (MNase-seq (Cui ve Zhao 2012a Henikoff ve diğerleri). 2011 Mieczkowski ve diğerleri 2016 Ramani ve diğerleri 2019) ve transpozaz erişilebilirliği için bir test (ATAC-seq (Buenrostro ve diğerleri 2013, 2015 Chen ve diğerleri 2016 Corces ve diğerleri 2017) Şekil 1). özellikle nükleozom doluluk ve konumlandırma ile ilgili olarak, gen düzenlemesi için önemli bir bağlam.

Genom erişilebilirliğini haritalama yöntemleri. A DNase-seq, kromatinin açık bölgelerini tanımlar. DNase-seq, bağlı proteinler tarafından korunmayan kromatin bölgelerinin tercihli sindirimine dayanır ve DNase I aşırı duyarlı bölgeleri (DHS'ler) olarak bilinen erişilebilir bölgeleri geride bırakır. B FAIRE-seq, formaldehit kullanarak kromatin etkileşimli proteinlerin DNA'ya çapraz bağlanmasına bağlıdır. Daha sonra kromatin kesilir ve proteinler (örneğin histonlar) tarafından bağlanmayan bölgeler fenol-kloroform ekstraksiyonunun sulu katmanında kalırken çapraz bağlı DNA organik katmanda kalır. C MNase-seq profilleri nükleozom doluluk ve konumlandırma. Formaldehit çapraz bağlanmasından sonra, eklenen MNase, bağlı proteinler tarafından korunmayan DNA'yı sindirerek, dizileme kitaplığında azalan mevcudiyet ile erişilebilirliğin artmasını sağlar. NS. ATAC-seq, dizileme adaptörlerini genomun erişilebilir bölgelerine yerleştirmek için hiperaktif Tn5 transpozaza dayanır. Transpozisyonun ardından genomik DNA, PCR ile izole edilebilir ve amplifiye edilebilir, ardından derin dizilemeye tabi tutulabilir. Biorender.com ile oluşturulan şekil

Önemli olarak, faktörlerin veya histon proteinlerinin genomik konumu, hücre tiplerinde tek başına DNA dizisi veya erişilebilirlik ile tahmin edilemez. Bireysel protein profilleme teknolojileri bu nedenle fonksiyonel bağlanmanın hücreye özgü özelliklerini tanımlamak için kullanılır. Kromatin immünopresipitasyon (ChIP) (Albert ve ark. 2007 Furey 2012 Gilmour ve Lis 1984 Gilmour ve ark. 1991 O'Neill 2003 Solomon ve Varshavsky 1985), DNA adenin metiltransferaz dahil olmak üzere kromatine faktör bağlanmasını ve kromatinde lokalizasyonu belirleme teknikleri tartışacağız. tanımlama (DamID (Greil ve ark. 2006 van Steensel ve Henikoff 2000) ve kromatin immün parçalamadan türetilen teknikler (ChIC/CUT&RUN (Schmid ve ark. 2004 Skene ve Henikoff 2017) Şekil 2).

Kromatin üzerinde protein lokalizasyonunun profilini çıkarma yöntemleri. A DamID, E. koli DNA adenin metiltransferazı (Baraj), onu ilgili bir faktöre kaynaştırarak ve bu plazmidi bir hücreye transfekte ederek. Bu yapı, faktör bağlama bölgelerinin yakınında bulunan adeninleri metiller. Genomik DNA daha sonra izole edilebilir ve dpnÖzellikle G m ATC dizisinde ayrılan I. Sindirilen DNA'nın bir kısmı daha sonra ile sindirilir. dpnBaraj aralığı dışındaki potansiyel metillenmiş bölgeleri belirlemek için metillenmemiş GATC'yi ayıran II. Yan yana kitaplıklar oluşturulur ve derin sıralamaya tabi tutulur. B ChIP-seq, faktörlerin DNA'ya çapraz bağlanmasıyla başlayan, ardından manyetik veya agaroz boncuklar üzerinde ilgilenilen faktör için kromatin kesme ve antikor düşüşleri ile başlayan antikor tabanlı bir teknolojidir. Çapraz bağlar daha sonra tersine çevrilir ve derin dizileme için DNA izole edilir. C CUT&RUN, ilgilenilen faktörü tanıyan ve spesifik olarak DNA'yı faktör bağlama bölgelerinde parçalayan bir birincil antikora bağlanmak için bir rekombinant Protein A-MNase (pA-MNase) füzyon yapısını kullanır, böylece çekirdeklerden izole edilebilen ve olarak kullanılabilen küçük parçalar oluşturur. kitaplık oluşturma ve derin sıralama için bir şablon. CUT&RUN, baz çiftine yakın çözünürlük sunar ve yüksek sıralama sinyal-gürültü oranı nedeniyle doğal (yani çapraz bağlanmayan) koşullar altında gerçekleştirilebilir. Biorender.com ile oluşturulan şekil

Erişilebilirliği veya yerelleştirmeyi değerlendiren kromatin profilleme teknolojileri birlikte, arka plan üzerinde hedef sinyali iyileştirmek ve gerekli hücre girişini azaltmak için artan hassasiyetle rafine edildi ve genellikle tekniklerin tek hücreli uyarlamalarının geliştirilmesiyle zirveye ulaştı. Burada, düşük hücre uygulamaları için teknoloji geliştirme, yöntemler, avantajlar ve dezavantajlar ile optimizasyonu gözden geçiriyoruz.

Bölüm 1: DNA erişilebilirliğini ve kromatin durumunu inceleme yöntemleri

Ökaryotik DNA, kromatin oluşturmak için DNA ve histon proteinleri arasındaki etkileşimler yoluyla çekirdeğe sıkıştırılır (Lammerding 2011). Genel olarak, kromatinin temel tekrarlayan birimi olan nükleozom, faktörler DNA üzerinde histon proteinleri tarafından kapatılan bölgeleri işgal edemediğinden, DNA şablonlu işlemlere önemli bir engel teşkil eder (Beato ve Eisfeld 1997 Felsenfeld 1992 Wallrath ve diğerleri 1994). . Bununla birlikte, açık kromatin bölgelerine DNA bağlayıcı proteinler tarafından erişilebilir ve genellikle genomun düzenleyici bölgelerinde bulunur (Song ve Crawford 2010 Thurman ve ark. 2012). Histon olmayan proteinler tarafından erişilebilen genom bölgelerinin belirlenmesi, bu nedenle, geliştiriciler, promotörler ve yalıtkanlar gibi varsayılan genomik düzenleyici bölgeler için önemli bilgiler sağlar ve ayrıca genomun bilinen düzenleyici bölgelerinin nükleozom yapısını tanımlar (Thurman ve ark. 2012).

Kromatin erişilebilirliğini incelemek için kullanılan genomik yöntemler geleneksel olarak tercihli enzimatik sindirime veya erişilebilir DNA'nın bağlı histon proteinleri veya transkripsiyon faktörleri tarafından korunan DNA'ya modifikasyonuna dayanmaktadır (Şekil 1). Birçok genomik erişilebilirlik tekniği (örneğin, DNase-seq ve MNase-seq), uzun süredir kullanılan nükleaz ayak izi deneylerinden evrimleşmiştir (Cappabianca ve diğerleri, 1999 Dingwall ve diğerleri, 1981 Galas ve Schmitz 1978), yeni nesil sıralama geliştirmelerinden yararlanarak, lokusa özgü ayak izi yerine genom çapında nükleozom mimarisini değerlendirin (Crawford ve diğerleri 2006b Schones ve diğerleri 2008). Ortaya çıkan teknikler sayısız, güçlü ve kromatin erişilebilirliğini açıklayan yüksek çözünürlüklü veriler sağlama yeteneğine sahiptir. Bu veri kümelerinin nasıl değerlendirileceğine dair genel bir biyoinformatik boru hattı için, Şekil 3'e bakınız. Erişilebilirliğin profilini çıkarmak için kullanılan enzimlerin çoğu hafif önyargılara sahip olsa da, ortaya çıkan genom mimarisi portreleri birbirleriyle karşılaştırıldığında genellikle tutarlıdır.

Genom çapında erişilebilirliği analiz etmek veya veri kümelerini profillemek için genel bir biyoinformatik işlem hattı. Önyargıları en aza indirmek için analizler kullanılan tekniğe bağlı olarak değişse de, NGS tarafından oluşturulan veri kümelerini analiz etmek için genel bir boru hattı sunduk. İlgili kalite kontrol bilgilerinin ardından (Andrews 2010), tüm dizileme deneyleri, ilgilenilen genomla eşlemeyi, diziyi, hizalama bilgilerini ve .sam dosyaları olarak bilinen kalite bilgilerini (veya sıkıştırıldığında .bam dosyaları) içeren dosyaların oluşturulmasını içerir. diğerleri 2009 Langmead ve Saltzburg 2012 Li ve Durbin 2009). Bu hizalanmış dosyalar filtrelenir ve nükleozom ve faktör işgali ve konumlandırmasını incelemek için aşağı akış analizlerinde kullanılır, erişilemeyen bölgeleri kullanılabilirliklerini engelleyen faktörlere göre bölmek için boyut sınıfları oluşturulur (Li, Handsaker ve diğerleri 2009 Schep ve diğerleri. 2015). Boyuta bölünmüş erişilebilirlik .bam dosyalarından ve kalite filtreli yerelleştirme .bam dosyalarından, tepe noktaları yerel arka plan puanlamasının üzerinde çağrılabilir ve/veya bir girdi dosyasıyla karşılaştırılabilir (Heinz ve diğerleri. 2010 Meers, Tenenbaum ve Henikoff, 2019 Zhang ve diğerleri 2008). Faktör zirvelerinden, bu konumları en olası hangi faktörlerin bağladığını belirlemek için motifler çağrılabilir. Genomik veriler tipik olarak ısı haritaları veya metaplotlar şeklinde görüntülenir (Heinz ve diğerleri 2010 Ramírez ve diğerleri 2016). Biorender.com ile oluşturulan şekil

DNaz-seq

DNase-seq, tercihen bağlı proteinler tarafından korunmayan DNA'yı bozan spesifik olmayan DNA endonükleaz DNase I ile kromatin erişilebilirliğini incelemek için kullanılan bir yöntemdir (örneğin, histon proteinleri Şekil 1A). DNase-seq'den önce, DNase I, DNase işleminden sonra bir jelin, ilgilenilen proteinin varlığında ve yokluğunda çalıştırılacağı ayak izi için kullanılmıştı, jel üzerindeki boş bölgelerin korunduğu ve/veya erişilemediği sonucuna varıldı. bölgeler, oysa daha fazla nükleozom-tükenmiş -veya erişilebilir- bölgeler, bir jel üzerinde daha büyük bölünme bölgesi mevcudiyeti ile işaretlenecektir (Cappabianca ve diğerleri, 1999 Dingwall ve diğerleri, 1981 Galas ve Schmitz 1978). Francis Collins'in grubu, mikrodizi çipleri (DNase-çipi) ve büyük ölçüde paralel Sanger dizilimi kullanarak, genom çapında DNase I ayak izini ilk kez uyguladı (Crawford ve diğerleri 2006a, b Sabo ve diğerleri. 2006). 2008'de Gregory Crawford'un grubu, mikrodizi teknolojisi üzerinden sunulan artan çözünürlük ve kalite nedeniyle önceki DNase-chip ve DNase-seq deneylerinden daha büyük bir başarı elde etmek için yeni nesil dizileme ile kombinasyon yoluyla bu teknolojiyi daha da geliştirdi (Boyle ve ark. 2008). DNase-seq, bitkiler, maya, nematodlar, sinekler ve memeli hücrelerinin ortak laboratuvar sistemleri dahil olmak üzere tüm ökaryotik kromatine uygulanabilir.

DNase-seq, çekirdeklerin hücrelerden izole edilmesi, çekirdeklerin DNase I tarafından genel DNA sindirimine tabi tutulması, sırasıyla RNazlar ve Proteinaz K kullanılarak RNA ve proteinlerin parçalanması, bir fenol-kloroform ekstraksiyonu ve etanol çökeltmesi kullanılarak DNA'nın saflaştırılması ve jel ekstraksiyonu ile gerçekleştirilir. istenen faktör sınıfına karşılık gelen büyüklükte fragmanlar (tipik olarak transkripsiyon faktörleri için 50-100 bp ve nükleozomlar için 130-160 bp (He ve ark. 2014).Ardından saflaştırılmış ve boyut seçilmiş DNA, kütüphane yapımı için bir şablon olarak kullanılır. DNase-seq kitaplıklarının sekanslanmasında en az sıklıkla tanımlanan bu bölgeler, DNase I tarafından en sık olarak bozulmuştur ve en erişilebilir oldukları sonucuna varılır.

DNase I'in DNA'yı diziye bağlı olarak farklı şekilde parçalamasına yönelik içsel bir önyargı vardır ve bu etkinin minör oluğun genişliği ile ilgili olduğu öne sürülmüştür (Lazarovici ve ark. 2013). Bu sınırlama, bir DNase-seq deneyi hazırlanırken dikkate alınmalıdır (He ve ark. 2014). DNase-seq tarafından profillenmesi zor olan faktörler için, yakın zamanda yapılan bir değişiklik, tanımlamaya yardımcı olmak için XL-DNase-seq olarak adlandırılan %0.1 formaldehit çapraz bağlama kullanımını dahil etmiştir (Oh ve diğerleri 2019). Başka bir DNase-seq modifikasyonu, tek hücreli DNase-seq (scDNase-seq), DNase-seq'i tek tek hücrelere ve düşük girdili birincil doku örneklerine uygulamıştır (Jin ve diğerleri, 2015). Geleneksel DNase-seq'e benzer olmakla birlikte, scDNase-seq, aşağıdaki değişiklikler uygulanarak daha da optimize edilmiştir: bakteriyel taşıyıcı DNA'nın dahil edilmesi, nükleer izolasyon eksikliği, optimize edilmiş DNase I sindirimi, agaroz jel ayırma eksikliği ve değiştirilmiş PCR koşulları. Bu optimizasyonlar, numune kaybını en aza indirmek ve küçük DNA parçalarının amplifikasyonunu kolaylaştırmak için tasarlanmıştır (Cooper ve ark. 2017).

DNase-seq, genomun varsayılan düzenleyici bölgelerinin belirlenmesinde oldukça etkili olmuştur. DNase I aşırı duyarlı siteleri (DHS'ler) olarak bilinen DNase-seq kitaplıklarında nadiren görünen bölgeler, genellikle geliştiriciler ve destekleyiciler gibi aktif düzenleyici bölgeler için bir proxy olarak kullanılır.Bu DHS'leri belirleme girişimleri, 2,9 milyondan fazla DHS (Thurman ve diğerleri 2012) ve 45 milyondan fazla transkripsiyon faktörü doluluk olayı (Neph ve diğerleri 2012) dahil olmak üzere neredeyse tüm bilinen cis düzenleyici bölgeleri kapsayan oldukça etkili makalelerle sonuçlandı. Ek olarak, DNase-seq, büyük ölçüde ENCODE projesi ve Roadmap Epigenomic Consortium'un çabalarıyla epigenetik dokuya ve hücre tipine özgü farklılıkları araştırmak için değerli bir araç haline geldi (Consortium 2012 Maurano ve diğerleri 2015 Roadmap Epigenomics ve diğerleri 2015) .

FAIRE-seq

Genom boyunca erişilebilir bölgeleri belirlemek için DNase-seq'e bir alternatif olarak, formaldehit destekli düzenleyici elementlerin izolasyonu (FAIRE) 2007'de geliştirildi. Korunmasız DNA'yı sindirmek yerine FAIRE, histonların DNA'ya çapraz bağlanmasına dayanırken, bağlanmamış DNA çıkarsanır erişilebilir olması (Şekil 1B). FAIRE ilk olarak DNA mikrodizileri ile kullanılmak üzere geliştirildi (Giresi ve diğerleri 2007), ancak kısa süre sonra yeni nesil dizileme teknolojileriyle birleştirildi (Gaulton ve diğerleri 2010). DNase-seq'e benzer şekilde, FAIRE-seq, DHS'ler olarak da adlandırılan düzenleyici bölgeleri (TSS'ler, promotörler ve geliştiriciler dahil) incelemek için kullanılabilir. FAIRE-seq bitki, maya, nematod, sinek, fare ve insan hücrelerinde doğrulanmıştır.

Tipik bir FAIRE-seq deneyi, en bol çapraz bağlama hedeflerinin histon proteinleri olduğu formaldehit çapraz bağlamayı içerir (Rodríguez-Gil ve diğerleri, 2018 Simon ve diğerleri. 2012). Çapraz bağlı kromatin daha sonra sonikasyon yoluyla yaklaşık 200-300 bp boyutunda kesilir ve bir fenol-kloroform ekstraksiyonu yoluyla izole edilen DNA, burada yüksek düzeyde çapraz bağlı DNA organik fazda kalır ve çapraz bağlı olmayan DNA sulu faza çekilir. Sulu fazdan çapraz bağlanmamış DNA daha sonra amplifiye edilebilir ve dizilenebilir. Sıralama havuzunda zenginleştirilmiş okumalar, daha düşük nükleozom ve faktör bağlanmasına sahip olma eğilimindedir ve bu nedenle erişilebilir bölgelerden geldiği sonucuna varılır.

FAIRE-seq deneylerinin önemli bir dezavantajı, histon bazlı kromatin mimarisi için bilgilendirici olsa da, transkripsiyon faktörleri tarafından bağlanan veya aktif olarak kopyalanan düzenleyici bölgelerin de çapraz bağlanabilmesidir. Bu nedenle teknik, doğru erişilebilirlik profili için karışık bir popülasyonun varlığına dayanır ve sonuç olarak bu incelemede açıklanan diğer tekniklerden daha düşük çözünürlüktedir. Sonuç olarak, daha az araştırma grubu bu teknolojiyi kullanmıştır, ancak FAIRE-seq, tümör gelişimini yönlendiren düzenleyici bölgeleri belirlemek için kullanılmıştır (Davie ve ark. 2015), temel durum ve hazır pluripotent hücreler arasında ayrım yapmak için (Murtha ve ark. 2015) ve benzer şekilde ENCODE ve Roadmap Epigenomic Consortium'un DNase-seq kromatinin erişilebilir düzenleyici bölgelerini küresel olarak haritalandırma çabalarına benzer şekilde (Bianco ve diğerleri 2015).

MNase-seq

MNase-seq, genom boyunca nükleozom konumlandırmasını ve doluluğunu test etmek için bir yöntemdir (Şekil 1C). Mikrokokal nükleaz (MNase), izole edilen bir enzimdir. stafilokok aureus serbest DNA'yı sindirmek için hem endo- hem de eksonükleaz aktivitesi gösterir (Axel 1975 Dingwall ve diğerleri 1981). DNase I'e benzer şekilde, MNase, yeni nesil dizileme teknolojilerinin icadından önce DNA erişilebilirliğini incelemek için DNA ayak izi deneylerinde kullanıldı (Cappabianca et al. 1999 Dingwall et al. 1981). MNase döşeme dizileri (MNase-chip), diğerleri arasında, Ollie Rando, Corey Nislow ve Frank Pugh'un grupları tarafından, derin dizilemenin ortaya çıkmasından önce yüksek çözünürlükte nükleozom konumlandırmasını belirlemek için kullanıldı (Lee ve diğerleri, 2007 Mavrich ve diğerleri. 2008 Yuan ve diğerleri 2005). Diğer tekniklerde olduğu gibi, MNase profilleme kısa süre sonra yeni nesil dizileme teknolojileriyle eşleştirildi (Schones ve ark. 2008). MNase-seq, bitkilerden mayalara ve insanlara kadar ökaryotlar boyunca nükleozom mimarisini haritalamak için kullanılmıştır.

Bir MNase-seq deneyi, proteinler ve DNA arasındaki etkileşimi yakalamak için tasarlanmış bir in vivo formaldehit çapraz bağlama adımıyla başlar. Bu çapraz bağlanma, bağlı proteinlerin ilişkili DNA'larını MNase tarafından sindirilmekten korumasına izin verir. Çapraz bağlanmanın ardından hücreler, liziz tamponuna Ca2+ ilavesiyle spesifik olarak aktive edilen MNase ile parçalanır ve sindirilir. Bu sindirim, reaksiyonun şelatlanmasıyla durdurulur, bu noktada numuneler RNaz ile işleme tabi tutulur, çapraz bağlar tersine çevrilir ve proteinler kromatinden uzaklaştırılır. DNA daha sonra bir fenol-kloroform ekstraksiyonu yoluyla izole edilir ve bozulma olmadan DNA'nın uygun şekilde sindirilmesini sağlamak için bir agaroz jeli üzerinde incelenir. DNA ile en çok temas eden proteinler histonlar olduğundan, bu jel tipik olarak mono-, di- ve trinükleozomları temsil eden her 147 baz çiftinde bir periyodik merdivenlenme gösterecektir.

Geleneksel MNase-seq protokolleri, bu korunan DNA fragmanlarını zenginleştirmek için mono-nükleozom bandının çıkarılmasını önerir (Cui ve Zhao 2012b Rando 2010 Zhang ve Pugh 2011), ancak MNase ile sindirilmiş bir bütünün tamamı üzerinde derin sıralama yapmak da mümkündür. örnek (Henikoff ve ark. 2011). MNase bölünmesinden sonra kalan parçalar sindirimden korunmuştur ve bu nedenle proteine ​​bağlı oldukları sonucuna varılmıştır. Tüm çapraz bağlı proteinler tarafından korunan DNA dizilimi, hem küçük proteinlere (<80 bp, sindirimden korunan, örneğin transkripsiyon faktörleri) hem de geleneksel nükleozom dizilerine karşılık gelen ek ayak izi sağlayabilir (Hainer ve Fazzio 2015 Henikoff ve diğerleri, 2011).

Önemli olarak, MNase, bir hücre popülasyonunu sindirmek için kullanılan enzim miktarına bağlı olarak farklı sindirim kinetikleri gösterir (Mieczkowski ve diğerleri 2016), ayrıca bazı genomik lokuslar (kırılgan nükleozomlar gibi) durumunda, yüksek ve düşük sindirim profilleri olabilir. büyük ölçüde farklı bilgiler sağlar (Chereji ve diğerleri 2017 Mieczkowski ve diğerleri 2016 Weiner ve diğerleri 2010). Bu nedenle, MNase içermeyen, düşük MNase ve yüksek MNase kopyaları olan tek tip bir popülasyon üzerinde MNase-seq deneyleri yapmak çok önemlidir. MNase-seq geleneksel olarak mevcut hücresel girdi ile sınırlıyken, tek hücreli MNase-seq yakın zamanda yayınlanmıştır (Lai ve ark. 2018).

MNase, AT açısından zengin çıplak DNA'nın bölünmesi için iyi belgelenmiş bir tercihe sahiptir (Chung ve diğerleri 2010), ancak bu dizi tercihi, kromatin erişilebilirliği nedeniyle tercihe kıyasla çok küçüktür (Allan ve diğerleri, 2012). Bununla birlikte, MNase tercihinden dolayı yanlılığı en aza indirebilecek teknikler mevcuttur. Jay Shendure'nin laboratuvarı, MNase-seq için, MNase-SSP olarak bilinen ve geleneksel MNase-seq'den daha kısa parçalar için zenginleştiren ve transkripsiyon faktörlerinin sağlam bir şekilde profillenmesini sağlayan, MNase-SSP olarak bilinen alternatif, tek zincirli bir kütüphane oluşturma protokolü yayınladı (Ramani et al. 2019). Ek olarak, enzimatik sindirim yerine DNA'nın kimyasal bölünmesini kullanan, birbiriyle yakından ilişkili birkaç alternatif geliştirilmiştir. Bing Ren'in grubu tarafından geliştirilen MPE-seq, tercihen bağlayıcı DNA'yı histonlar arasında bölmek için metidyumpropil-EDTA-Fe(II) (MPE) kullanır (Ishii ve ark. 2015). Steve Henikoff'un grubu ayrıca, peroksit (Chereji) mevcudiyetinde DNA'yı dyad ekseninde lokal olarak parçalayan fenantrolin aracılı bakır şelasyonu ile bölgeye özgü bir nükleaz oluşturmak için H4'te (S47C) bir mutasyon kullanarak kimyasal bir DNA parçalama tekniği geliştirdi. ve diğerleri 2018).

MNase-seq, hücresel farklılaşmanın bir sonucu olarak düzenleyici bölgelerdeki nükleozom doluluk ve konumlandırma değişikliklerinin profilini çıkarmak için kullanılmış ve embriyonik kök hücre geliştiricilerindeki önemli değişiklikleri vurgulamıştır (West ve ark. 2014). Ayrıca, MNase-seq, paralel Pol II ChIP-seq tarafından onaylanan bir trend olan duraklatılmış Pol II konumlandırmasının profilini çıkarmak için bile kullanılabilir (Teves ve Henikoff 2011). İlginç bir şekilde, MNase-seq profilleme, 3B genom etkileşimlerini ve yüksek dereceli kromatin yapılarını güvenilir bir şekilde tahmin etmek için kullanılabilir (Schwartz ve diğerleri. 2019 Zhang ve diğerleri. 2017). Çapraz bağlama yoluyla geçici etkileşimleri yakalama yeteneği nedeniyle MNase-seq, en çok yönlü kromatin erişilebilirlik profilleme tekniklerinden biridir.

ATAC-seq

Transpozaz erişilebilirliği ve derin dizileme (ATAC-seq) testi, erişilebilir kromatini değerlendirmek için ek bir teknolojidir. ATAC-seq, dizileme adaptörlerini kromatinin açık bölgelerine yerleştirmek için hiperaktif bir Tn5 transpozazının kullanımını içerir ve daha sonra bu bölgeleri yeni nesil dizileme yoluyla diziler (Buenrostro ve diğerleri 2013) Şekil 1D). Diğer erişilebilirlik profilleme tekniklerinden farklı olarak, ATAC-seq, tek bir lokusta kullanım için uyarlanmış olmasına rağmen, yakın zamanda geliştirildi (Buenrostro ve diğerleri, 2013). Nispeten yeni bir teknik olan, kullanılan enzim olan Tn5 transpozaz, tanımlanan ilk transpozazlardan biriydi ve 20 yılı aşkın bir süredir in vitro transpozisyon deneyleri için kullanılıyordu (Goryshin ve Reznikoff 1998 Naumann ve Reznikoff 2002 Reznikoff 2003 Reznikoff 2008). DNA aracılı bir "kes ve yapıştır" mekanizması ile, burada transpozaz bir DNA segmentini keser, bir hedef DNA bölgesine bağlanır, bir çift zincir kırılmasına neden olur ve transpozonu yeni lokusa sokar (Ivics et al. 2009). ATAC-seq'de, Tn5, fonksiyonel bir transposom oluşturan, ekleme noktasında sekanslama adaptörleri eklemek için tasarlanmış bir transpozon ile yüklenmiştir.ATAC-seq, maya, bitkiler, nematodlar, sinekler, memeliler, ve hatta donmuş dokular (Corces ve ark. 2017).

ATAC-seq, hücresel lizis ve DNA transpozisyon adımlarından ve DNA ekstraksiyonu ve amplifikasyonundan oluşan iki ila üç temel adımda gerçekleştirilir (Buenrostro ve ark. 2013). Orijinal ATAC-seq (Buenrostro ve diğerleri 2013), kan hücreleri için tasarlanmış FAST-ATAC-seq (Corces ve diğerleri 2016) ve Omni-ATAC-seq (Corces) dahil olmak üzere çeşitli ATAC-seq protokolleri geliştirilmiştir. ve ark. 2017), hücresel lizizde kullanılan deterjanlarda büyük ölçüde farklılık gösterir. ATAC-seq, korunan DNA'nın sindirilmesinden ziyade erişilebilir DNA'ya yerleştirmeye dayandığından, teknik, mitokondriyal DNA tarafından kontaminasyonu sıralamaya eğilimlidir. Bu yaygınlık nedeniyle ATAC-seq'de mitokondriyal okumaları azaltmak için yöntemler geliştirilmiştir (Corces ve ark. 2017 Montefiori ve ark. 2017 Rickner ve ark. 2019).

ATAC-seq, tek hücrelerde (Buenrostro ve ark. 2015 Mulqueen ve ark. 2019) ve donmuş dokudan (Corces ve ark. 2017) kromatin erişilebilirliğini değerlendirmek için başarıyla kullanılmıştır ve bu nedenle teknik, çekirdekle yüzleşmek için değerli bir araç olabilir. hücre heterojenliği ve düşük numune mevcudiyetinin genomik sorunları. Gerçekten de Jay Shendure'ün grubu, çeşitli fare dokularında tek hücre indeksli ATAC-seq'e dayalı 85 farklı kromatin erişilebilirlik modeli (büyük ölçüde hücre tipine özgü) yayınlamıştır (Cusanovich ve diğerleri 2018). Ek olarak, Howard Chang ve William Greenleaf'in grupları, ATAC-seq kullanan bir dizi birincil insan kanserinde erişilebilirlik çalışmaları yayınladı (Corces ve diğerleri 2018). ATAC ayrıca genom erişilebilirliğinin bir sonucu olarak doğrudan görüntüleme, miktar tayini ve hücre sınıflandırmasına izin vermek için görselleştirme ve akış sitometrisi (ATAC-see) ile eşleştirilmiştir (Chen ve ark. 2016).

Özet

Kromatin erişilebilirliğini ölçmek için kullanılan teknikler iki temel ilkeye dayanır: birincisi, proteinlerin DNA'yı sindirimden koruyabilmesi ve ikincisi, histon proteinlerinin DNA ile etkileşime giren en belirgin proteinler olmasıdır. DNase-seq, MNase-seq ve ATAC-seq temelde birinci ilkeye dayanırken, FAIRE-seq ve MNase-seq daha çok ikinci ilkeye dayanır, ancak her iki ilke de her teknik tarafından ortaya çıkarılan ayrı erişilebilirlik kalıpları için önemlidir. Yukarıda bahsedilen teknikler, nükleozom konumlandırma ve kromatin erişilebilirliğinin farklı - ancak tutarlı - anlık görüntülerini sağlar ve her tekniğin belirli avantajları ve dezavantajları vardır (Tablo 1). Bu teknolojiler, genomun erişilebilir durumunu ortogonal yaklaşımlarla aydınlatmış ve doğrulamış ve insan genomunun yaklaşık 3 milyon varsayılan düzenleyici bölgesinin tanımlanmasına yol açmıştır (Thurman ve ark. 2012).

Genomun genel olarak erişilebilir bölgelerinin haritalanmasına paralel olarak, kromatin ile etkileşime giren ve bu erişilebilir bölgeleri faktöre özgü protein lokalizasyon profili yoluyla düzenleyen faktörlerin araştırılması, genom mimarisinin temel ilkelerini anlamak için eşit derecede önemlidir.

Bölüm 2: Kromatin üzerinde protein lokalizasyon profili oluşturma yöntemleri

Çekirdek içindeki özel rollerine bağlı olarak, kromatin etkileşimli proteinler, genomik lokalizasyonun karakteristik modellerini gösterir. Proteinlerin bulunduğu genomik bölgeleri tanımlayarak, fonksiyonel rolleri, bağlanma için önemli motifleri ve in vivo DNA şablonlu süreçlerin düzenleyici ağlarını belirlemek mümkündür. DNA erişilebilirliğini ölçme yöntemleri gibi, kromatin etkileşimli proteinlerin genomik bağlanma yerlerini belirlemeye yönelik, son yıllarda popülerlik kazanan (Şekil 2), her birinin avantajları ve dezavantajları olan çok sayıda yaklaşım vardır (Tablo 1). Genel olarak, profil oluşturma yöntemleri, deneyi gerçekleştirmek için gerekli olan numune ile bağlanma yeri tanımlamasının çözünürlüğünü dengelemelidir. ChIP-exo (Rhee ve Pugh 2012) gibi bazı yöntemler, artan gerekli örnek girişi pahasına baz çifti çözünürlüğüne öncelik verir, DamID (van Steensel ve Henikoff 2000) gibi diğerleri, daha yüksek giriş sınırlamaları olmadan sağlam etkileşim verileri sağlar. -çözünürlük teknikleri. Daha yakın zamanlarda, kromatin immüno-klevaj (ChIC) yönteminden (Schmid ve diğerleri 2004) türetilen teknikler ortaya çıkmıştır ve ultra düşük girdi numuneleriyle bile bağlanma bölgelerinin yüksek çözünürlüklü tanımlanmasını sağlama yeteneğine sahiptir. Bu genomik bağlanma bölgelerinin nasıl tanımlanacağına dair genel bir biyoinformatik boru hattı için Şekil 3'e bakın.

ChIP-seq

Kromatin bağlayıcı proteinlerin lokalizasyonunu değerlendirmek için en yaygın kullanılan teknik olan kromatin immünopresipitasyon (ChIP) (Şekil 2A), Gilmour ve Lis (1984) tarafından radyoaktif DNA etiketlemesi ve formaldehit çapraz bağlama ve jel kullanılarak tek bir lokusta kullanım için geliştirilmiştir. Solomon ve Varshavsky (1985) tarafından tabanlı görüntüleme. Bu teknik, kromatin ile etkileşime giren bir proteinin bağlanma bölgesinin genomik tanımlamasını incelemek için kütüphane inşasından sonra derin dizileme için uyarlanmadan önce uzun yıllardır kullanılıyordu (Albert ve ark. 2007). İlk radyo-etiketleme deneylerine dayanarak, ChIP DNA'nın çeşitli genomik lokuslara karşı DNA mikrodizilerine hibridize edildiği bir teknik olan ChIP-chip, 2000 yılında ChIP'nin ilk geniş genomik uygulaması olarak geliştirildi (Ren ve diğerleri 2000). ChIP, ChIP çipinden daha fazla hedeflenen, ancak tek lokus radyoetiketli ChIP'den daha az kısıtlayıcı olan kantitatif bir şekilde birden fazla lokasyondaki protein doluluğunu incelemenin bir yolu olarak kantitatif PCR (ChIP-qPCR) ile birleştirildi (Irvine ve ark. 2002) . ChIP-seq, ökaryotik türler boyunca protein-DNA etkileşimlerini sağlam bir şekilde profiller.

Bir ChIP deneyi tipik olarak, yerel DNA ile etkileşen proteinlerin lizinlerini çapraz bağlamak için tasarlanmış bir formaldehit inkübasyonu ile başlar. Hücreler daha sonra çapraz bağlı kromatini serbest bırakmak için parçalanır ve kromatini kısa bölümlere (tipik olarak 100 ila 400 baz çifti arasında) kesmek için yansız sonikasyona tabi tutulur. Kesilen kromatin daha sonra ilgili proteini hedefleyen bir antikorla inkübe edilir, ardından tipik olarak sefaroz veya manyetik boncuklara bağlanan ikincil bir IgG tanıyan antikor eklenir. Epitopun tanınması üzerine, DNA'nın etkileşen bölgesi çapraz bağlı olduğu protein ile aşağı çekilir, böylece proteinin çapraz bağlandığı (ve proteinin mutlaka yakın olduğu - yaklaşık 2 Å) DNA bölgeleri spesifik olarak izole edilir ( Perez-Romero ve Imperiale 2007) Daha sonra çapraz bağlar tersine çevrilir, protein sindirilir ve DNA, lokusa özgü qPCR için bir şablon olarak kullanılmak veya bir jel üzerinde çalıştırılmak üzere izole edilir.

ChIP-seq, lambda ekzonükleaz sindirimi (ChIP-exo ve ChIP-nexus (He ve diğerleri 2015 Rhee ve Pugh 2012), UV çapraz bağlama (UV-ChIP (Gilmour ve diğerleri) dahil) dahil olmak üzere yüksek çözünürlük sağlamak için çeşitli tekniklerle birleştirilmiştir. 1991) ve MNase sindirimi (Native ChIP (O'Neill 2003). ChIP-exo ve ChIP-nexus, ChIP-seq çözünürlüğünü baz çiftine yakın bir düzeye yükseltmek için nükleaz sindirimini kullanan iki tekniktir. ChIP-exo lambda kullanır. eksonükleaz, nükleazın ilerleyemediği bir protein-DNA çapraz bağına ulaşana kadar bağlanmamış dsDNA 5′-3′ sindirmek için (Rhee ve Pugh 2012). ChIP-exo'ya benzer şekilde, ChIP-nexus, lambda eksonükleaz kullanılarak çapraz bağlı DNA'nın sindirilmesine dayanır, ancak, ChIP-nexus ayrıca değiştirilmiş bir kitaplık oluşturma protokolü ve aşırı amplifikasyon için barkod tabanlı bir monitör içerir (He ve ark. 2015).Ayrıca, ChIP-nexus yalnızca bir 3′ dizileme adaptörü gerektirir, bu da geleneksel ChIP-seq'e göre giriş gereksinimlerini azaltır ( He ve diğerleri 2015). UV-ChIP, UV ışığını sıfır len olarak kullanır. Doğrudan protein etkileşimini test eden in vivo çapraz bağlama maddesi gth, ancak UV çapraz bağlama düşük verim sağlar, bu da onu düşük girdili numuneler veya seyrek etkileşimler için uygun hale getirmez (Toth ve Biggin 2000). Native ChIP, MNase sindirimini, çapraz bağlanmamış kromatin üzerindeki protein bağlanmasının tanımlanmasına izin veren sonikasyona daha nazik bir alternatif olarak ve artık sonikasyon verimliliği ile sınırlı olmadığı için geleneksel ChIP-seq'den önemli ölçüde daha yüksek çözünürlükte kullanır (O'Neill 2003).

ChIP-seq deneyi için en acil sınırlama, yüksek bir sinyal-gürültü oranı üretmek için girdidir, ChIP-seq, özellikle transkripsiyon faktörü bağlanmasını incelemek için tipik olarak milyonlarca girdi hücresi gerektirir. Histonlar, diğer DNA bağlayıcı proteinlerden çok daha fazla olduğu için, ChIP-seq teknolojilerini düşük girdi için optimize etmek, histonları kullanarak faktörlerden çok daha verimli olmuştur. Geleneksel, çapraz bağlama tabanlı ChIP-seq teknikleri için, ChIP mikroakışkan teknolojisi ile eşleştirilmiş olmasına rağmen, μChIP-seq 400 hücrede histon modifikasyonlarının profilini çıkarmak için yeterli olmuştur (Dahl ve diğerleri 2016). 2015) histon modifikasyonlarının profilini çıkarmak için gerekli girdiyi 100 hücreye düşürmek. Yerel ChIP-seq teknikleri, daha yumuşak kromatin kesme nedeniyle hücresel girdiyi azaltmada daha başarılı olmuştur. 2006'da, Carrier ChIP, 50 hücrede histon modifikasyonlarının profilini çıkarmak için başarıyla kullanıldı (her ne kadar numune kaybını azaltmak için milyonlarca "taşıyıcı" hücreye sahip olsa da (O'Neill ve ark. 2006), daha yakın tarihli girişimler histon modifikasyon profillemesi için hücresel girdiyi azalttı) 500 hücreye (MINT-ChIP ve ULI-NChIP) ve 200 hücreye (STAR-ChIP (Liu ve ark. 2016 van Galen ve ark. 2016 Zhang ve ark. 2016). Transkripsiyon faktörlerinin bolluğu ve geçici bağlanması onları zorlaştırırken Düşük girdili numunelerde profil, iki ChIP tabanlı teknik, hücre girdisini başarıyla düşürdü: ChIPmentation ve Carrier-destekli ChIP-seq İlki, ChIPmentation, Christoph Bock'un grubu tarafından geliştirildi ve dizileme adaptörlerini doğrudan kromatin üzerine bağlamak için Tn5 transpozazı kullanıyor boncuklar üzerinde (Schmidl ve diğerleri 2015) 100.000 hücrede transkripsiyon faktörlerinin profilini çıkarmak için ChIPmentation kullanıldı.Ayrıca, Jason Carroll'un grubu, transkripsiyon faktörü lokalizasyonunu 10,0 kadar az bir sürede profillemek için taşıyıcı destekli ChIP-seq kullandı 00 hücre (Zwart ve ark. 2013).

İlk ve en belirgin genomik tekniklerden biri olan ChIP ve türevleri, kromatin etkileşimlerinin ve transkripsiyonun düzenlenmesinin anlaşılmasında olağanüstü derecede etkili olmuştur.Bugüne kadar, "kromatin immünopresipitasyon" terimi ENCODE veritabanında neredeyse 23.000 PubMed isabetine ve 9000'den fazla kamuya açık veri setine sahiptir ve çok daha fazlası NCBI Sequence Read Archive'de (Konsorsiyum 2012) depolanmıştır. ChIP-seq faktör yerelleştirme profilinin altın standardı olmaya devam etse de, son 30 yılda faktör yerelleştirmesini farklı yaklaşımlarla incelemek için başka teknikler geliştirilmiştir.

Baraj kimliği

DamID, proteinleri kromatin üzerine yerleştirmek için ChIP olmayan bir alternatif sunar (Şekil 2B) (van Steensel ve Henikoff 2000). DamID, rekombinant bir protein kullanır (Escherichia koli DNA Adenin Metiltransferaz veya Dam), proteinin etkileşime girdiği genomik bölgeleri belirlemek için ilgilenilen kromatin etkileşimli proteine ​​kaynaşmıştır. Dam, adenini GATC dizisi içinde metiller (Barras ve Marinus 1989 Boivin ve Dura 1998 Wines ve diğerleri, 1996). Adenin metilasyonu çoğu ökaryotta meydana gelmediğinden, DamID faktör lokalizasyonu için doğal ve spesifik bir okuma sağlar (Barras ve Marinus 1989). Dam metilasyonu, protein bağlama bölgesinden 5 kb'ye kadar yayılabilir (van Steensel ve Henikoff 2000), DamID deneylerinde dengelenen çözünürlük ve özgüllük arasındaki dengeyi vurgular. Ek olarak, genomun daha erişilebilir bölgelerinin, kaynaşmamış Barajın transfeksiyonu ile profil oluşturma yoluyla kontrol edilen bir değişken olan Dam tarafından metillenmesi daha olasıdır (Greil ve diğerleri 2006). Her ne kadar DamID, Southern blot ve kantitatif PCR (qPCR) ile metilasyon miktar tayini ile öncülük etmiş olsa da, o zamandan beri yeni nesil dizileme teknolojileri ile yer değiştirmiştir (Aughey ve diğerleri, 2019 Greil ve diğerleri. 2006). DamID en yaygın olarak Meyve sineği ancak mayada kullanılmıştır, C. elegans, Arabidopsis, fareler ve insan hücreleri, daha çok yönlü bir profil oluşturma aralığını gösterir.

Tipik bir DamID deneyi, ilgili proteinin N- veya C-terminaline birleştirilmiş Dam ile bir plazmitin inşasını içerir. Plazmit daha sonra, yalnızca Dam içeren bir kontrol plazmiti ve boş bir vektör gibi incelenecek hücrelere transfekte edilir. Genomik DNA daha sonra transfekte edilmiş hücrelerden izole edilir ve DNA ile sindirilir. dpnkısıtlama enzimi. Olarak dpnBen sadece ve spesifik olarak G m ATC'yi sindiririm, bu sindirimden üretilen fragmanların, ilgilenilen kromatin ile etkileşime giren proteine ​​çok yakın olduğu sonucuna varılır. Adaptörler bağlanır dpnI-sindirilmiş fragmanlar ve daha sonra DNA ile tedavi edilir dpnII, genomda G m ATC'yi iki kez seçmek için yalnızca metillenmemiş GATC'yi parçalayan bir kısıtlama enzimi. DNA kütüphaneleri daha sonra amplifiye edilir ve derin dizileme için gönderilebilir.

DamID, ChIP-seq ile aynı popülerliğe ulaşmadı, ancak bazı önemli güçlü yönler sunuyor. İlk olarak, DamID, profil faktörü bağlanmasına yönelik antikorlara bağımlı değildir; bu, az çalışılmış proteinlerin profilini çıkarmak için önemli bir avantajdır. Ek olarak, DamID, ChIP verilerinin alternatif bir yaklaşımla onaylanabileceği ilk yöntemdi. Bununla birlikte, DamID, profilli proteinin konakçı hücreler için endojen olmaması gerçeğiyle dezavantajlıdır. Bir Dam füzyon yapısının bağlanma bölgeleri genellikle bir endojen protein ile karşılaştırılabilir olacaktır, ancak Baraj yapısının kendisinin yanı sıra plazmit bazlı ekspresyonunun mevcudiyeti nedeniyle muhtemelen aynı olmayacaktır. Ek olarak, DamID, Dam füzyon plazmidi ile transfekte edilebilen genetik olarak izlenebilir bir sistem gerektirir. Ayrıca, DamID, düşük çözünürlüğü ile sınırlıdır, çünkü Dam, füzyon proteininin bağlanma bölgesinden 5 kb'ye kadar kalıntıları metilleyebilir ve kapsamlı yanlış pozitifler bulunabilir (van Steensel ve Henikoff 2000). Bu metilasyon aralığından dolayı, DamID'nin ChIP tabanlı teknikler tarafından sunulan çözünürlüğe ulaşması olası değildir. .2018) ve hatta tek hücreler (Lai ve diğerleri 2019). ChIP-seq (ve daha yakın zamanda, CUT&RUN) faktör lokalizasyonu için büyük ölçüde DamID'nin yerini almış olsa da, DamID daha geniş kromatin özelliklerinin incelenmesinde daha popüler hale geliyor, örneğin, açık kromatini değerlendirmek için Chromatin Erişilebilirlik Hedefli DamID (CATaDA) geliştirilmiştir (Aughey ve ark. .2018). CATaDa, açık kromatinin bölgelerini metillemek için bağlanmamış bir Dam proteini kullanır ve nükleozoma bağlı DNA'yı metillenmemiş halde bırakır (Aughey ve diğerleri 2018). Split DamID, aynı zamanda, bir maya iki-hibrit elek (Hass ve diğerleri, 2015) ve katalitik olarak aktif olmayan dpnI-GFP füzyon yapısı, Baraj kaynaklı GATC metilasyonunu mikroskopi kullanarak gerçek zamanlı olarak incelemek için kullanılmıştır (Kind ve diğerleri 2015).

KES&ÇALIŞTIR

Hedefler altında bölünme ve nükleaz kullanılarak salıverme (CUT&RUN), Skene ve Henikoff tarafından, Ulrich Laemmli'nin grubunun 2004 ChIC tekniğinin genom çapında bir modifikasyonu olarak geliştirilmiştir; burada mikrokokal nükleaza kaynaşmış bir rekombinant Protein A (pA-MNase) birleştirilebilmektedir. MNase'yi spesifik olarak hedef alan ve ilgili proteinin bağlandığı DNA çevreleyen bölgeleri parçalayan bir birincil antikor ile (Şekil 2C (Schmid ve diğerleri 2004).Benzer teknikler arasında kromatin endojen bölünme (ChEC (Schmid ve diğerleri 2004), bu da aşağıdakileri içerir) içerir. MNase'in ilgili bir proteine ​​ve ChEC-seq'e bir C-terminal füzyonu, ChEC ve yeni nesil dizilemenin genom çapında bir eşleşmesi (Zentner ve diğerleri 2015). (Baptista ve ark. 2017 Grunberg ve ark. 2016 Grunberg ve Zentner 2017 Warfield ve ark. 2017 Zentner ve ark. 2015), teknik, ilgilenilen proteini spesifik olarak etiketleme ihtiyacı ile sınırlıdır. uyumlu IgG omurgalarına sahip herhangi bir birincil antikoru tanımak için bir rekombinant pA-MNase proteinini tanımlar. CUT&RUN son zamanlarda geliştirilmiş bir teknik olmasına rağmen, protein-DNA etkileşimlerini profillemek için kullanılmıştır. Arabidopsis, maya, sinekler, fareler ve insan hücreleri, çok yönlü bir uygulama yelpazesi sergiliyor.

Bir CUT&RUN deneyi, hücreleri parçalamak için hipotonik bir tampon ile nükleer izolasyon (Hainer ve Fazzio 2019 Skene ve Henikoff 2017) veya digitonin ile hücre geçirgenliği (Skene ve diğerleri 2018) ve çekirdekleri izole etmek için lektin kaplı konkanavalin A manyetik boncuklar içerir. . Sonraki adımlar, korunan DNA fragmanları kitaplık hazırlamadan önce serbest bırakılıncaya kadar boncuk bağlı çekirdeklerde gerçekleştirilir. İlgilenilen proteini hedefleyen birincil antikor eklenir ve çekirdeklere serbestçe yayılmasına izin verilir, ardından birincil antikorun IgG omurgasını tanıyan ve bu nedenle spesifik olarak ilgilenilen proteinin kromatin üzerindeki bağlanma bölgelerine yönlendirilen rekombinant pA-MNase eklenir. . MNase daha sonra Ca2+ ilavesiyle aktive edilir ve DNA'yı parçalamak ve proteine ​​bağlı parçaları süpernatanta salmak için bir buzlu su banyosunda (en uygun olmayan MNase sindirim kinetiği için) sindirilir. Serbest bırakılan fragmanlar daha sonra RNaz ile muamele edilir, Proteinaz K ile sindirilir, saflaştırılır ve kütüphane yapımı için girdi olarak kullanılır. CUT&RUN deneyleri, birincil antikorun numunenin dışında bırakıldığı veya bir IgG kontrolü ile değiştirildiği, serbest pA-MNase yapısı tarafından arka plan kesmenin ölçüldüğü ve daha erişilebilir bölgelere doğru doğal bir önyargının düzeltildiği bir kopya ile birlikte gerçekleştirilir. genetik şifre. Ek olarak, heterolog DNA, MNase sindirimini şelatlama (Skene ve Henikoff 2017) veya kontamine etme üzerine reaksiyona eklenebilir. E. koli pA-MNase saflaştırmasından elde edilen DNA, bir artış olarak kullanılabilir (Meers ve diğerleri 2019). CUT&RUN, yüksek bir sinyal-gürültü oranı sağlar ve azaltılmış arka plan, yaklaşık 10 milyon okuma ile kapsamlı dizilemeye izin verirken, bir ChIP-seq deneyi, protein bağlanmasını doğru bir şekilde değerlendirmek için 20-40 milyon okuma gerektirir.

CUT&RUN, çoğu Steve Henikoff'un grubu tarafından geliştirilen deneysel bağlamlara uyacak çok sayıda değişikliğe uyarlanabilir olduğunu kanıtlamıştır. Böyle bir uyarlama, yüksek verimli profil oluşturma için protokolün robotik otomasyonudur (AutoCUT&RUN (Janssens ve ark. 2018). Ek olarak, Henikoff'un grubu, çözünürlüğe dayalı kromatin fraksiyonasyonuna izin veren ve özellikle profil oluşturma için yararlı olan bir yöntem olan CUT&RUN.Salt'ı yayınladı. tipik koşullar altında sentromerik veya başka şekilde çözünmeyen kromatin (Thakur ve Henikoff 2018). pA-MNase-antikor bağlanmasının verimliliğini artırmak için Henikoff'un grubu, tavşan olmayan antikorların profilinin çıkarılmasına izin veren bir rekombinant Protein A-Protein G-MNase füzyon yapısı tasarladı ikincil antikor adımı olmadan (Meers ve diğerleri 2019).Son olarak, CUT&RUN, serbest bırakılan CUT&RUN fragmanlarında bulunan protein kompleksleri için ChIP'ye izin veren geleneksel ChIP (CUT&RUN.ChIP) ile birleştirilmiştir (Brahma ve Henikoff 2019).Genel CUT&RUN bu nedenle teknik, çeşitli deneysel tasarımlar ve istenen sonuçlar için protein lokalizasyonunu profillemek için esnek görünmektedir.

2019'da, murin embriyonik kök hücrelerinde pluripotens faktörlerini incelemek için kromatin bağlı proteinlerin CUT&RUN kullanılarak ilk tek hücreli genom çapında profili yayınlandı (Hainer ve diğerleri 2019). Tek hücrelerde profil oluşturmaya ek olarak, bireysel erken blastokistlerde (her biri 30-50 hücreden oluşan) faktör bağlama profili çıkarıldı, bu daha önce ChIP tabanlı teknikler kullanılarak mümkün olmayan bir uygulama. Daha yakın zamanlarda, Hedefler ve Etiketleme Altında Bölünme veya CUT&Tag, bir rekombinant pA-MNase füzyon proteini yerine bir rekombinant Protein A-Tn5 transpozaz füzyonunu kullanan CUT&RUN üzerinde bir modifikasyon olarak geliştirildi (Kaya-Okur ve diğerleri. 2019). CUT&Tag, tek hücrelerde transkripsiyon faktörü bağlanmasının profilini çıkarmak için henüz kullanılmamış olmasına rağmen, tek hücrelerde histon modifikasyonlarının profilini çıkarmak için kullanılmıştır (Kaya-Okur ve ark. 2019). CUT&Tag'e ek olarak, MNase'in spesifik bir antikora bağlanmasını ve MNase'i yönlendirmek için antikor kullanılarak hedef bölgelerin bölünmesini ve ardından PCR ile bölünmüş fragmanların seçici olarak amplifiye edilmesini içeren benzer bir ChIC, scChIC-seq tek hücre modifikasyonu geliştirildi ( Ku ve diğerleri 2019). CUT&RUN, uliCUT&RUN, CUT&Tag, ChEC-seq ve ChIC-seq arasında, ChIC- ve ChEC türevli teknikler, kromatin etkileşimli faktör profili oluşturmanın bir sonraki dönemini kolaylaştırmaya hazır görünüyor.

Özet

Genomik teknik iyileştirme, araştırmacıların kromatin ve DNA erişilebilirliği üzerindeki faktör bağlama bölgelerini yüksek çözünürlükle belirlemesine izin verdiğinden, standart tekniklerin sınırlamaları giderek daha belirgin hale geldi. Hücresel heterojenite, tutarsız enzim sindirim kinetiği ve hedeflenmemiş numune izolasyonundan kaynaklanan farklılıklar nedeniyle, genomik tekniklerdeki son gelişmeler, gerekli numune girişini ve arka plan sinyalini azaltmaya odaklanmıştır. Bu teknik gelişmeler, bireysel hücrelerde genom mimarisini ve faktör bağlama profillerini, hasta biyopsileri gibi düşük girdili örnekleri ve heterojen hücresel popülasyonların alt kümelerini incelemeyi mümkün kılmıştır. Erişilebilirlik ve faktör bağlama konusundaki genomik çalışmalardan ortaya çıkan şey, kromatin mimarisi tarafından düzenlenen DNA şablonlu aktivitelerin karmaşık bir resmidir.

Genom erişilebilirliğinin ve faktör bağlanmasının profilinin çıkarılması, genomik düzenleyici mekanizmaların tanımlanması için bir aşama oluşturmuştur, ancak bu teknikler, gen düzenlemesini mekanik düzeyde anlamak için yalnızca bir başlangıçtır. Bu veriler, transkripsiyonel ve hücresel ağların işlevsel genomu şekillendirmek için işbirliği içinde ve antagonist olarak nasıl çalıştığını anlamak için entegre edilmelidir. Ek olarak, hücre türleri arasındaki karşılaştırmalar, ortak bir faktör paketinin hücre tipine özgü işlevleri nasıl yönlendirdiği hakkında bilgi sağlamak için önemli olacaktır.