Bilgi

E coli için mümkün olan en yüksek yetkinlik nedir?

E coli için mümkün olan en yüksek yetkinlik nedir?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Son derece yetkin bir E coli suşu arıyorum. ~6.6kb'lik bir plazmit kitaplığı yapıyorum ve yeterince yüksek verim alamıyorum. Ultra yüksek verimliliğe (>10) sahip bir tür/protokol önerisi olan var mı?10).


Bu harika bir soru çünkü kendi "homebrew" kimyasal olarak yetkin hücrelerimi yaptım.

çok çeşitli vardır E. koli klonlama için yaygın olarak kullanılan suşlardır. Isı şoku yöntemiyle kimyasal olarak veya elektroporasyonla elektriksel olarak dönüştürülebilirler (burada kısa bir özet bulunabilir). Bunlar laboratuvarda manuel olarak yapılabilir veya saygın satıcılardan ticari olarak satın alınabilir (Invitrogen/Life Tech, NEB, Promega'yı öneririm).

Kimyasal olarak yeterlilik, Hanahan'ın yöntemi veya bunun bir çeşitlemesi kullanılarak elde edilir. Yöntem, bakterilerin çeşitli iki değerli katyon klorür tuzları (CaCl) içeren bir dizi tampon içinde yıkanmasını içerir.2, RbCl2, vesaire). Satışa sunulmuştur E. koli 10 ile "normal" ve "ultra" yetkin olarak satılmaktadır.6 10'a kadar6 düzenli ve gördüğüm en yüksek 1010 cfu/µg DNA. Maksimum verimlilik için, özellikle sizinki gibi küçük bir plazmitin dönüştürülmesi kolay olacağından, elektroporasyon daha verimli bir tekniktir, ancak özel ekipman gerektirir. Elektroporasyon >10 verebilir10 cfu/µg. Standart klonlama uygulamaları için, düzenli veya yüksek verimli kimyasal olarak yetkin E. coli tamamen yeterlidir. Bir kütüphane oluşturduğunuzdan bahsettiğinize göre, kesinlikle ultra yüksek verimli kimyasal dönüşüm veya gerekli donanıma sahipseniz elektroporasyon ile gitmek istiyorsunuz. Elektroporasyon verimliliklerinin > 5x10 olarak bildirildiğini görmedim10.

Dönüşüm verimlilikleri, bazı kontrol plazmitlerinin, tipik olarak pUC19'un µg'si başına koloni oluşturan birimlerin (cfu) sayısı olarak bir oran bildirilerek standartlaştırılır. Dönüşüm verimliliği, ısı şoku süresi, soğuma süreleri, çözülme süresi, plazmid DNA miktarı ve boyutu gibi birçok faktöre karşı çok hassastır. Her şey eşit olduğunda, DNA'nın boyutu ve miktarı sizin amaçlarınız için önemlidir. Dönüşüm verimliliği genellikle DNA miktarı ile artar, ancak bir doyma noktası vardır ve sonuçta çok fazla DNA'ya sahip olmak verimi düşürür. Ayrıca verim, plazmit boyutu ile doğrusal olarak azalır. Örneğin, kontrol vektörü pUC19 ~2.7 kbp'dir ve kütüphane plazmitiniz ~6.6 kbp'dir, bu nedenle aynı DNA kütlesi için plazmit boyutundan dolayı %60 transformasyon kaybedeceğinizi beklemelisiniz. Bu kayıp, fiziksel olarak daha büyük DNA boyutunun bakterilere taşınmasının daha zor olmasından kaynaklanmaktadır.


Epicenter'ın Epi300 elektro-yeterli hücrelerinin (1) çok verimli olduğunu duydum: > 1 x 1010 cfu/µg pUC19. Dan Gibson, makalesinde mitokondriyal genomun sentezi için bunları kullandı (2). Biz de bunları montajlarımızda kullanmayı düşünüyorduk ama oldukça pahalılar.

1. TransforMax™ EPI300™ Elektrokompetan E. coli

2. Fare mitokondriyal genomunun kimyasal sentezi, Gibson et. al.


Videoyu izle: Media H2S Deteksi Coliform E coli (Haziran 2022).