Bilgi

Neden birçok DNA solüsyonu ek bileşikler içerir?

Neden birçok DNA solüsyonu ek bileşikler içerir?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Sadece sudaki DNA çözünürlük verileri azdır.

Önceki bir soru, sudaki DNA çözünürlüğünün nicelleştirilmesini istedi. Kolayca cevaplanabilir gibi görünüyordu, ancak o kadar basit değil çünkü DNA çözünürlüğü için hiçbir veri yok gibi görünüyor. sadece su.

Suyla ilgili küçük miktardaki veri bile organik bileşiklerin çözeltiden yıkanması bağlamındaydı. Bu beni düşündürdü. DNA, biyolojik durumlarda sulu bir çözelti içindedir ve genellikle laboratuvarlarda sulu çözeltilerde işlenir. Öyleyse çözünürlük verileri neden bu kadar kıt? saf Su? DNA çözeltileri için organik bileşikler hakkında önemli olan nedir?

Laboratuvar DNA çözümleri için diğer katkı maddeleri neden önemlidir?

yani benim sorum Niye DNA içinde çözülür mü sadece su laboratuvarlarda görünüşte "nadir"? Saf su hakkında DNA depolaması için kötü olan bir şey var mı? İşlevsel olarak DNA'nın, proteinler tarafından erişilemediği için asla suda olması gerekmiyor mu? Yoksa çözünürlük verilerinin eksikliğini yanlış mı yorumladım; su sıradan bir yer ve ihtiyaç olmadığı için veri yok mu?

PCR'nin DNA çözümleriyle ilgili verilerin çoğunun bulunduğu yer olduğunu hayal ediyorum. Peki ya polar organik çözücüler/bileşikler onları DNA çözeltileri için önemli kılar?


Saf suda DNA.

Nükleik asitlerin saf su ile karşılaşacağı tek zaman laboratuvar ortamında olacaktır - örneğin, bir oligonükleotit in vitro sentezlendikten sonra, bitmiş dizideki reaktif atomlardan koruyucu gruplar çıkarılır ve nihai ürün destekleyiciden ayrılır. matris. Bu noktada amonyum hidroksit çözeltisini liyofilize edebilir (dondurarak kurutabilir) ve tek iplikli oligoyu saf suda yeniden süspanse edebilirsiniz.

Ek bileşikler, ağır oligomer çözünürlüğünü arttırır.

Bununla birlikte, yorumlarda belirtildiği gibi, nükleik asit çözünürlüğü, özellikle genomik DNA gibi yüksek moleküler ağırlıklı DNA, seyreltik monovalent katyonlar içeren çözeltilerde arttırılır. 10 mM TrisHCl, pH 8.0, 1 mM EDTA hemen hemen her uygulama için yeterlidir. EDTA, hatalı DNA'ları inhibe eder ve ayrıca mikrobiyal büyümeyi hafifçe inhibe eder.

Bileşikler pH tamponu görevi görür.

Tris en iyi biyolojik tampon değildir ancak yüksek çözünürlüğe sahiptir ve nispeten ucuz ve stabildir. Çözelti çok bazik hale gelirse DNA iplikleri erir ve çözelti çok asidik hale gelirse pürinler deaminasyona başlar.

DNA, biyolojide asla saf su ile karşılaşmaz.

DNA'nın bir hücrede sentezlendiği andan o hücre ölene ve DNA'sı bozulana kadar saf su ortamıyla karşılaşmaz.


Organik çözücüler olmadan fizyolojik deneyler yapılabilirken, DNA veya analoglarının kimyasal sentezleri, DNA'nın kimyasal modifikasyonu ve kimyasal reaksiyon sonrası saflaştırma organik çözücülerin varlığında gerçekleştirilebilir. Bu tür deneyler doğrudan fizyoloji ile ilgili değildir, ancak kimyasal olarak sentezlenmiş DNA ve DNA analoglarını kullanıyoruz. Ek olarak, organik çözücülerin varlığında DNA'nın kimyasal özellikleri, DNA'nın fizyolojik koşullarda nasıl davrandığını söyleyebilir. PCR ve/veya moleküler biyoloji yapan kişiler DNA'nın çözünürlüğü ile ilgilenmeyebilirler çünkü kullandıkları koşullar altında konsantrasyonlar doymuş durumdan çok daha düşüktür.


Neden birçok DNA solüsyonu ek bileşikler içerir? - Biyoloji

1870'de Fredrick Miescher tarafından nükleik asitlerin keşfinden itibaren, monomer birimlerinin yapıları, nükleotidler 1909'da kurulana ve RNA'nınki 1935'te Levene ve Tipson tarafından önerilene kadar uzun süredir bir merak konusu olarak kabul edildiler. Nükleik asitler temel olarak iki tiptir - nükleotid zincirlerinin polimerleri olan DNA ve RNA. Her nükleotit, ilk olarak, ikinci kısım fosfat gruplarına birleştirilmiş bir pentoz (beş üyeli halka) olan bir şeker parçası olmak üzere üç kısımdan oluşur. Her şekerin anomerik karbonu, bir ß-glikosidik bağlantıda üçüncü kısım olan heterosiklik bileşiğin nitrojen atomuna bağlanır. C-1 ve C-4'teki sübstitüentler furanoz halkasının aynı tarafında olduğu için bağlantı bu şekilde adlandırılır.

Nükleik asitlerin bir bölümünü oluşturan heterosiklik bileşikler, amin grupları içerdiğinden ve genel olarak aminler baz olarak hareket ettiğinden, bu heterosiklik bileşiklere keyfi olarak bazlar da deniyordu. Ayrıca halkadaki hetero atom Azot olduğu için bu bileşikler Azot Bazları olarak adlandırılmıştır. Azot bazları, çoğunlukla pürin veya pirimidin türevleri olan düzlemsel, aromatik, heterosiklik moleküllerdir. DNA'da sadece dört baz vardır - ikisi ikameli pürinlerdir (adenin ve guanin), ikisi ikameli pirimidinlerdir (sitozin ve timin). RNA ayrıca sadece dört baz içerir. Üçü (adenin, guanin ve sitozin) DNA'dakilerle aynıdır, ancak RNA'daki dördüncü baz timin yerine urasildir. Timin ve urasil, yalnızca bir metil grubuyla farklılık gösterir; timin, 5-metilurasildir.

Nükleik asitler neden sadece Riboz veya Deoksi-Riboz şekerleri içerir?
RNA'da beş üyeli halka şeker D-ribozdur. DNA'da 2'-deoksi-D-ribozdur (2 konumunda bir OH grubu olmayan D-riboz). Beş üyeli halka seçimi, varsayılan olarak, bu halkalar, rezonans ile stabilize edilen altı üyeli bir halka olan benzen durumu dışında, aromatik bileşikler arasında en kararlı olanlardır. Pentozlar arasında Riboz, evrim sırasında nükleik asitlerin özel şeker bileşeni olarak seçilir. Seçim, moleküler modeller kullanılarak ve kimyasal yapılarına bakılarak ve bir nükleik asit modeline nasıl sığacakları tasavvur edilerek diğer yaygın şekerlerin çoğu elimine edilerek açıklanır. Şeker büzücü konformasyonlarının ve pentozların konfigürasyonlarının karşılaştırılması, ribozun rastgele seçilmediğini, ancak tek seçenek olduğunu göstermektedir, çünkü ß-D-riboz, nükleik asitlerin fizyolojik formlarının yapısına en iyi şekilde uymaktadır. Arabinoz, ksiloz veya liksoz içeren diğer nükleotidlerde, C2'-OH ve/veya C3'-OH, furanoz halkasının üzerindedir ve hacimli baz ve C5'-OH grubu ile sterik etkileşime neden olur.

Nükleik asitler neden negatif yüklüdür?
Fosforik asit, hem RNA hem de DNA'daki şekerleri birbirine bağlar. Asit, pKa değerleri 1.9, 6.7 ve 12.4 olan üç ayrışabilir OH grubuna sahiptir. Fosforik asidin –OH gruplarının her biri, bir alkol (asit + alkol -> ester) ile bir fosfomonoester, bir fosfodiester veya bir fosfotriester verecek şekilde eşit derecede reaksiyona girebilir. Nükleik asitlerde fosfat grubu sadece bir fosfodiester oluşturur. Fosforik asit üç ester bağı oluşturabilmesine rağmen, yalnızca iki bağ oluşturarak üçüncü -OH grubunu serbest bırakır, bu da ayrışma üzerine negatif yük verir. RNA durumunda, ek 2'-OH grubu da negatif yüke eklenir. Bu nedenle RNA daha fazla yüke sahiptir ve bu nedenle daha az kararlıdır ve elektroforez üzerine DNA'dan daha fazla hareketlilik sergiler.


Fosforik asit moleküllerinin ısıtılması, bir fosfoanhidrit olan pirofosforik asit oluşumuna neden olur. bir su molekülünün kaybıyla oluşur. Pirofosfat adı, "ateş" anlamına gelen Yunanca - pyr kelimesinden türetilmiştir. Böylece pirofosforik asit “ateşle” yani ısıtılarak hazırlanır. Yukarıda bahsedilen şekilde, fosforik asidin bir anhidrit oluşturma yeteneğinden dolayı trifosforik asit ve daha yüksek polifosforik asitler de oluşturulabilir.

Nükleotitler monofosfatlar, difosfatlar ve trifosfatlar olarak bulunabilir ve nükleosit adına monofosfat veya difosfat veya trifosfat eklenerek adlandırılır. Bu fosfoanhidrit bağları, yüksek enerjili bağlardır; bu, bu bağlar kırıldığında, hücrede diğer kimyasal reaksiyonları yürütmek için aynı anda kullanılabilen çok fazla enerji saldıkları anlamına gelir.

Purinler ve pirimidinler, furanoz halkasının anomerik karbonuna (purinler N-9'da ve pirimidinler N-1'de) -glikosidik bir bağlantıyla bağlanır. D-riboz veya 2'-deoksi-D-riboza bağlı bir baz içeren bir bileşiğe Nükleozit denir. Bir nükleositte şekerin halka konumları, onları bazın halka konumlarından ayırt etmek için asal sayılarla gösterilir. Bu nedenle DNA'nın şeker bileşenine 2'-deoksi-D-riboz denir. Örneğin, adenin baz, adenosin ise nükleosittir. Benzer şekilde, sitozin bazdır, sitidin ise nükleosittir, vb. Urasil sadece RNA'da bulunur ve bu nedenle D-riboz'a bağlıdır, ancak 2-deoksi-D-riboz'a bağlanmaz. Benzer şekilde, timin sadece DNA'da bulunduğu için 2-deoksi-D-riboz'a bağlıdır, ancak D-riboz'a bağlanmaz.

Bir nükleotit, fosforik aside bir ester bağıyla bağlı 5' veya 3' -OH grubuna sahip bir nükleosittir. Şekerin D-riboz olduğu RNA nükleotidlerine daha kesin olarak ribonükleotidler denirken, şekerin 2-deoksi-D-riboz olduğu DNA nükleotidlerine deoksiribonükleotidler denir.

Nükleotidlerin biyolojik işlevleri:
Nükleotidler, DNA ve RNA'nın ayrılmaz birimleri olarak hareket etmelerinin yanı sıra, kimyasal enerji donörleri, hücre sinyallemesinde ikincil haberciler, enzimler için kofaktörler, vasidialtorlar, hücre duvarı sentezi ve lipid biyosentezinde gerekli olan alt birimlerin taşıyıcıları gibi çeşitli hücresel aktiviteleri gerçekleştirirler.

ATP- Hücrenin para birimi:
Tüm canlı sistemler, hayatta kalmalarını ve üremelerini sağlamak için enerjiye ihtiyaç duyarlar ve besinleri kimyasal olarak faydalı bir enerji formuna dönüştürerek enerji elde ederler. Kimyasal enerjinin en önemli formu adenozin-trifosfattır (ATP). ATP'nin biyolojik reaksiyonlardaki önemi, insanlardaki devir hızıyla gösterilir - her gün bir kişi kendi vücut ağırlığına eşdeğer miktarda ATP kullanır. ATP, prokaryotlardan ökaryotlara kadar tüm canlı sistemlerde yaygın olarak kullanıldığı için kimyasal enerjinin evrensel taşıyıcısı olarak bilinir. "ATP'nin hidroliz enerjisi, endergonik reaksiyonları ekzergonik reaksiyonlara dönüştürdüğü" için ATP, termodinamik olarak elverişsiz reaksiyonları olumlu olanlara dönüştürme yeteneğine sahiptir.

ATP'nin istikrarının ardındaki sır:
ATP'nin yapısından da anlaşılacağı gibi, herhangi bir nükleotid trifosfatın dört birim negatif yüke sahip olması ve yüksek oranda reaktif olması ve dolayısıyla onu daha az kararlı hale getirmesi gerektiğinden, ATP'nin oldukça negatif yüklü olduğu görülür. Yukarıdaki gerçek göz önüne alındığında, ATP enzim katalizli reaksiyonlarda kolayca reaksiyona girse de, şaşırtıcı bir şekilde, bir enzimin yokluğunda reaksiyon hızı oldukça yavaştır. Birkaç dakika içinde hidrolize olan karboksilik asit anhidritleri ile karşılaştırdığımızda, ATP'nin hidrolize olması birkaç hafta sürer. Düşük ATP hidroliz hızı, hücrede daha uzun süre tutulabildiğinden ve enzim katalizli bir reaksiyon için gerektiğinde kullanılabilir olduğundan hücre için olumlu bir sonuçtur. Enzimlerin yokluğunda ATP'nin yavaş reaktivitesinin arkasındaki nedenin, nükleofillerin yaklaşımını iten negatif yükü olduğunu bilmek çok ilginçtir. ATP, bir enzimin aktif bölgesine bağlandığında, ATP üzerindeki toplam negatif yükü azaltan magnezyum ile kompleks yapar. Bu nedenle ATP gerektiren enzimler de metal iyonlarına ihtiyaç duyar Diğer iki negatif yük, aktif bölgedeki arginin veya lizin kalıntıları gibi pozitif yüklü gruplar tarafından stabilize edilebilir. Bu formda, ATP'ye nükleofiller tarafından kolayca yaklaşılır, bu nedenle ATP, enzim katalizli bir reaksiyonda hızla reaksiyona girer, ancak enzimin yokluğunda çok yavaş reaksiyona girer.

  • ATP biyolojik olarak önemli tek nükleotit değildir. Bazı fosforil transfer reaksiyonlarında ATP yerine Guanozin-trifosfat (GTP) da kullanılır. GTP, çeviri sırasında peptit bağı oluşumunu yönlendirir. GTP ve GDP ayrıca G-proteinine bağlı Reseptör (GPCR) aracılı sinyalleşmede yer alır.
  • UDP, bakterilerde hücre duvarı sentezi için gerekli olan UDP-Glikoz formunda Glikoz parçasının taşıyıcısı olarak hizmet eder.
  • CDP-Kolin, membran fosfolipid-Fosfotidil Kolin sentezi için Kolin grubunun taşıyıcısı olarak görev yapar.
  • Oksitleyici ajan olarak FAD, FMN gibi dinükleotidler ve indirgeyici ajan olarak NADH, NADPH kullanılmaktadır.
  • Diğer bir önemli nükleotid, yaygın olarak siklik AMP olarak bilinen adenosin - monofosfattır. Döngüsel AMP, birkaç hormon (ilk haberciler) ve hücresel işlevi düzenleyen belirli enzimler arasında bir bağlantı görevi gördüğü için “ikinci haberci” olarak adlandırılır. Adrenalin gibi belirli hormonların salgılanması, ATP'den siklik AMP'nin sentezinden sorumlu enzim olan adenilat siklazı aktive eder. Siklik AMP daha sonra bir enzimi, genellikle onu fosforile ederek aktive eder.
  • Adenozin, Uyku indükleyicisi olarak işlev görür ve ticari olarak “Adenocarp” olarak temin edilebilir.

İndirgeyici ajan NADPH'dir ve hücrede üretilen her NADPH, üç ATP üretebilir. Bu gerçeğe dayanarak, dihidrofolatı azaltmak için NADPH kullanımı ATP pahasına gelir. Timinin sentez süreci enerji açısından pahalı olsa da, hücre yine de DNA'da Urasil yerine Timin almayı tercih eder.
DNA'da urasil varlığı mutajeniktir ve timinin varlığı potansiyel olarak ölümcül mutasyonları önler. Bunun arkasındaki kimyasal fenomen, daha sonra urasil'e hidrolize olan bir imin oluşturmak üzere totomerize olabilen Sitozinin kimyasal kararsızlığıdır. Bir amino grubunu çıkardığı için genel reaksiyona deaminasyon denir.
DNA'daki bir sitozin bir urasile deamine edilirse, urasil, replikasyon sırasında sitozin tarafından belirtilecek olan guanin yerine bir adeninin yavru zincire dahil edilmesini belirleyecektir. Bunun, nükleotid dizisinde değişikliklere yol açtığı ve GC baz çiftlerinin AT baz çifti mutasyonlarına neden olabileceği için olumsuz etkileri olacaktır. Bu tür komplikasyonlardan kaçınmak için, DNA'da bir U'nun varlığı, yan zincire yanlış bir baz yerleştirilmeden önce hücresel enzimler tarafından bir "hata" olarak kabul edilir. Urasil-N-glikolsilaz ve dUTPase, U'nun DNA'dan elimine edilmesini sağlayan iki enzimdir. dUTPase, çekirdekte bulunan UTP moleküllerini parçalar ve DNA polimerazın aktif bölgesine girmelerini engeller. DNA'ya herhangi bir U eklenmesi durumunda, Urasil-N-glikolsilaz, glikozidik bağı parçalar ve DNA'dan nükleotidi çıkarır. Bu, bir lezyon olarak tanınan ve onarım enzimleri tarafından daha da onarılan bir apirimidinik bölge oluşturur.
U'lar normalde DNA'da bulunursa, enzimler normal bir U ile sitozinin deaminasyonuyla oluşan bir U arasında ayrım yapamazlardı. DNA'da U'ların yerine T'lerin olması, DNA'da bulunan U'ların hata olarak tanınmasını sağlar. Kendini kopyalayan DNA'nın aksine, RNA'daki herhangi bir hata uzun süre hayatta kalmaz çünkü RNA sürekli olarak bozulur ve ardından DNA şablonundan yeniden sentezlenir. Bu nedenle, T'leri RNA'ya dahil etmek için fazladan enerji harcamaya değmez.

Nükleik asitlerin özellikleri:
sıcaklığın etkisi
Dubleks nükleik asit yapıları yüksek sıcaklıkta tek sarmallı moleküller halinde bozulur veya denatüre olur ve süreç 'erime' olarak adlandırılır, çift sarmalların erime süreci kolayca izlenebilir çünkü baz istifleme ve baz eşleştirme etkileşimleri UV absorpsiyonunu önemli ölçüde azaltır. Bir polinükleotid dupleksini içeren bir çözeltinin sıcaklığı yükseltildiğinde, UV ışığının absorpsiyonu, iki ipliğin tek iplikli polinükleotidlere ayrıldığı sıcaklık civarında büyük ölçüde artacaktır. Bunun nedeni, tek zincirli moleküllerin, 260 nm dalga boyunda çift sarmallı moleküllerden daha yüksek UV absorpsiyonu sergilemesidir. UV absorpsiyonundaki geçiş tipik olarak 48°C ila 88°C aralığında gerçekleşir. X ekseninde Absorbans ve Y ekseninde Sıcaklık ile bir grafik çizildiğinde, Erime eğrisi olarak adlandırılır. Polinükleotid türlerinin yarısının dupleks ve yarısının tek sarmallı olduğu geçiş veya erime eğrisinin orta noktası, Erime sıcaklığı (Tm) olarak tanımlanır. Genel olarak DNA dupleksleri, termal denatürasyona karşı RNA duplekslerine veya RNA-DNA duplekslerine göre nispeten daha az kararlıdır.

Hiperkromik kayma: Çift sarmallı DNA'nın denatürasyonu üzerine 260 nm'de absorpsiyonun artması ve bunun sonucunda tek sarmallı DNA oluşumuna Hiperkromik kayma denir.

Hipokromik kayma: Tek sarmallı DNA moleküllerinin çift sarmallı DNA verecek şekilde renatürasyonu üzerine 260 nm'de emilimdeki azalma Hipokromik kayma olarak adlandırılır. Renatürasyon bt yavaş soğutma, Tavlama olarak adlandırılır.

Belirli bir dupleks için Tm, aksi takdirde bir dizi faktörden etkilenir. Başlıca belirleyiciler, dizi uzunluğu, G-C içeriği ve tuz konsantrasyonunu içerir. Daha uzun dupleksler veya daha yüksek oranda G-C çiftine sahip olanlar daha kararlıdır ve bu nedenle daha yüksek Tm'ye sahip olacaktır. Sodyum (Na+) ve potasyum (K+) gibi tek değerli katyonlar, fosfodiester omurgası boyunca negatif yükü kısmen nötralize ederek çift sarmalları stabilize eder. Sonuç olarak, daha yüksek tuz konsantrasyonu, belirli bir polinükleotid dupleksinin Tm'sini de artıracaktır. Ek olarak, bir dublekste uyumsuz bazların mevcudiyeti, genellikle bir kararsızlaştırıcı etkiye sahip olacak ve Tm'yi azaltacaktır.

  1. Absorbans 260 nm'de azalan sırada.
    Serbest nükleotitlerin absorbansı, polimerik formlarından daha fazladır ve tek sarmallı moleküller, çift sarmallı formlardan daha fazlasını emer. Benzer şekilde, 2'-OH grubunun varlığından dolayı RNA'nın emilimi DNA'dan daha fazladır. Purin, çift halka yapısının varlığı nedeniyle pirimidinlerden daha fazlasını emer. Pürinler arasında Adenin, daha fazla serbest elektronun varlığından dolayı Guanin'den daha fazlasını emer. Sonuç olarak, uzunlukları eşit ancak GC içeriği farklı olan iki DNA molekülü, daha fazla AT içeriğine sahip DNA ile daha fazla GC içeriğine sahip DNA'dan daha fazla emer.
    A260: Nükleotidler > ss DNA > ds DNA
    A260: RNA > DNA
    A260: Pürinler > Pirimidinler
    A260: Adenin > Guanin > Timin = Sitozin
  2. Ozmotik basınç denatürasyon ile artar. Organik çözücüler ve deterjanlar hidrofobik etkileşimleri engeller ve DNA denatürasyonuna neden olur.
  3. viskozite denatürasyon ile azalır. DNA çözeltileri oldukça viskozdur ve yüksek viskozite, moleküllerin uzun uzunluğu ve sertliğinden kaynaklanır. Denatürasyon üzerine, çift sarmallı DNA, tek sarmallı DNA'ya kıyasla daha sert ve dolayısıyla viskoz olduğundan viskozite azalır.
  4. Optik Döndürme düzlem polarize ışık hafifçe sola doğru kayarken (daha negatif) denatürasyon üzerine daha negatif olur.
  5. Yoğunluk Verilen hacim başına daha fazla kütle kapladığı için çift sarmallı DNA tek sarmallı DNA'ya kıyasla daha az yoğun olduğundan denatürasyon üzerine nükleik asitlerin miktarı artar.

pH'ın nükleik asitler üzerindeki etkisi:
Nükleik asitler 5-9 pH aralığında stabildir. Bu aralığın ötesinde, karşıt zincirlerin nükleotidleri arasındaki H-bağını değiştiren Azot bazlarının tautomerik kayması nedeniyle kendiliğinden denatürasyona uğrarlar.

Asidin nükleik asitler üzerindeki etkisi:
Hem DNA hem de RNA asit hidrolize uğrar.Purin nükleozidlerinin glikozidik bağları, guanozin veya adenosinin N7'sinde protonasyon yoluyla asit hidrolizine karşı hassastır. Hafif asidik koşullar altında DNA, Apurinik DNA olur. Her iki durumda da polinükleotitte bir abazik sitenin oluşumu sonuçlanmasına rağmen, DNA'nın depurinasyonu RNA'nınkinden daha uygundur. DNA'daki bir abazik bölge tarafından temsil edilen dizi bilgisinin tamamen kaybı da aynı şekilde kalıcı bir mutasyona neden olabilir.

Alkali'nin nükleik asitler üzerindeki etkisi:
RNA, 2'-OH grubunun varlığından dolayı alkali hidrolize uğrar, ancak DNA alkali hidrolize uğramaz.
Hem RNA hem de DNA, fosfodiester omurgasının bölünmesi yoluyla parçalanabilse de, kimyasal kararlılıkları büyük ölçüde farklıdır. RNA, belirgin bir şekilde, C2' oksijeninin bitişik fosfora saldırı için bir nükleofil görevi gördüğü bir transesterifikasyon reaksiyonuna tabi tutulur. Bu özel reaksiyon, C2' oksijeni ile fosfor merkezi arasında oluşturulan bağın, fosfor merkezi ile C5' oksijeni arasında kırılacak bağla aynı doğrultuda olduğu bir pentakoordinat fosfat ara ürünü ile ilerler. Sonuç olarak, reaksiyon ürünleri bir C5' hidroksil ve C2', C3'-siklik fosfat ile sonlanır. RNA transesterifikasyonunun bu döngüsel mekanizması kolayca meydana gelir çünkü nükleofil doğal olarak fosfodiester omurgasındaki fosfor merkezine yakın olarak konumlandırılmıştır. Ayrıca, reaksiyon ya C2' hidroksilinin deprotonasyonu ya da C5' oksijeninin protonasyonu ile desteklenir. Bu nedenle, RNA'lar alkali veya asidik çözeltilerde kolayca bozunur. Hem RNA hem de DNA polimerlerine uygulanabilen benzer bir mekanizma, ikinci bir molekülün saldıran nükleofil olarak hizmet ettiği fosfodiesterin bölünmesi için çalışır. Reaksiyon, benzer şekilde saldıran grubun deprotonasyonu ve ayrılan grubun protonasyonu ile desteklenir. Ancak ürünler bir C5' fosfat ve C3' hidroksil ile sonlanır. Su, RNA veya DNA polimerlerinin kendiliğinden hidrolitik bozunmasında bir nükleofil görevi görebilir, ancak reaksiyonun meydana gelme olasılığı RNA transesterifikasyonundan yaklaşık 100.000 kat daha azdır. Yukarıdaki prensibe ve her şekerin bir C2' hidroksil grubuna sahip olmaması gerçeğine dayanarak, DNA'nın fosfat ve şeker omurgası nispeten büyük bir kimyasal stabilite sergiler. Aslında DNA, genetik materyal olarak hareket etmek için bir ön koşul olan genetik bilginin bütünlüğünü korumasını sağlayan biyolojik polimerlerin en kararlısıdır.

Bisülfit ve nitröz asidin etkisi:
Bisülfit ve nitröz asit, sitozinden bir amino grubunun deaminasyonunu veya çıkarılmasını teşvik ederek sitozinin urasile dönüştürülmesine neden olur. DNA'da sitozin deaminasyonu, eğer düzeltilmezse, nihayetinde bir G-C baz çiftinin bir A-T baz çiftine dönüşmesine yol açacaktır.

İyonize Radyasyonların ve Oksitleyici Maddelerin Etkisi:
İyonlaştırıcı radyasyon tarafından üretilen hidroksil radikalleri veya oksijen üreten süperoksit iyonlarının eksik metabolik indirgenmesi, hidrojen peroksit veya hidroksil radikalleri gibi güçlü oksitleyici ajanlar, DNA ile aşırı derecede reaksiyona girer. Hidroksil radikalleri, fosfodiester omurgasını kırarak DNA'ya spesifik olmayan bir şekilde zarar verebilir. İplik kesilmesi, her biri farklı 5' ve 3' terminal ürünlerine sahip polinükleotit fragmanları üreten bir dizi mekanizma ile gerçekleşir. Ek olarak, hidroksil radikalleri, 8-hidroksiguanin ve timin glikol gibi bileşikler oluşturan nükleik asitlerdeki bazların kimyasal bileşimine doğrudan saldırabilir ve bunları değiştirebilir. Bu modifikasyonlar, DNA dizisinde lezyonların oluşmasına neden olarak onları mutasyonlara duyarlı hale getirir ve sonuçta kansere yol açabilir. Bu nedenle, DNA hasarına neden olan iyonlaştırıcı radyasyon ve diğer bileşikler tipik olarak kanserojen veya kansere neden olur.


Hareket mekanizması

DTT, disülfid değişim reaksiyonlarında yer alır. DTT, protein SS indirgemesi için 1-10 mM'de kullanılır ve biyolojik zarları geçebilir.

Özellikleri azaltmak

Ditiyotreitol, pH 7'de -0.33 V redoks potansiyeline sahip güçlü bir indirgeyici ajandır. Bir disülfid bağının indirgenmesini iki ardışık tiyol-disülfid değişim reaksiyonu takip eder (bakınız aşağıdaki Şekil 2). İndirgeme, DTT'deki ikinci tiyolün halkayı kapatma eğiliminin artması nedeniyle genellikle karışık disülfid türlerini geçerek devam eder. Bu, oksitlenmiş bir DTT oluşumuna neden olur ve geride indirgenmiş bir disülfid bağı bırakır. DTT'nin indirgeme gücü, yalnızca negatif yüklü tiyolat formu reaktif olduğundan, 7'den büyük pH değerleriyle sınırlıdır. Tiyol grupları, 9.2 ve 10.1'lik pKa değerlerine sahiptir.

İncir. 2: İki ardışık tiyol-disülfid değişim reaksiyonu yoluyla tipik bir disülfid bağının DTT ile indirgenmesi


LABORATUVAR PROSEDÜRLERİ

DNA ekstraksiyonu

Başarılı DNA ekstraksiyonlarına yol açan temel adımlar, dokuyu yeterince öğütmek ve eldeki amaç için en iyi ekstraksiyon protokolünü/protokollerini belirlemektir. Laboratuvar ekipmanı ve altyapısının mevcudiyeti de dikkate alınması gereken bir husustur: Minimum laboratuvar ekipmanı seti ve temel moleküler biyoloji protokolleri için öneriler Ek 1'de verilmiştir.

Bitki dokularının verimli bir şekilde öğütülmesi, yüksek DNA verimine doğru ilk adımdır. Çoklu doku numunelerinin verimli ve eşzamanlı homojenizasyonu için, ticari olarak mevcut boncuk çırpıcılara ucuz bir alternatif olarak pistonlu testereye dayalı bir öğütücünün değiştirilmiş bir versiyonunu kullandık (Alexander ve diğerleri, 2007 Ek 1). Elle öğütmeye yardımcı olmak için moleküler biyoloji dereceli gümüş kum ilaveli havan tokmakları ve harçlar alternatif olarak kullanılabilir. Minimum numune boyutu gerekliyse ve dokular yumuşaksa, mikro havaneli mikrofüj tüplerinde öğütülebilirler (örn., Geneaid katalog no. MP050 Geneaid Biotech Ltd., New Taipei City, Tayvan).

DNA ekstraksiyon protokolünün dikkatlice düşünülmesi gerekir. Bitkiler, özellikle tropik bitkiler, DNA ile birlikte saflaştırılabilen ve verimi azaltabilen ve/veya sonraki PCR reaksiyonlarını engelleyebilen polisakaritler ve polifenoller (Coley ve Barone, 1996) gibi çok çeşitli bileşikleri sentezler. Bazı durumlarda, ekstraksiyon protokolünün dokunun belirli zorluklarını karşılayacak şekilde uyarlanması gerekebilir ve tüm numuneler için iyi çalışan tek bir yöntem bulmak zor olabilir.

En yaygın olarak kullanılan DNA ekstraksiyon yöntemleri iki gruptan birine yerleştirilebilir: DNA'yı saflaştırmak için DNA bağlama kolonları kullananlar ve çözeltideki hücresel içerikten DNA'yı ayırmak için kimyasal yöntemler kullananlar. DNA bağlayıcı kolonlar güvenilirdir ve tutarlı sonuçlar üretir, etkili bir şekilde kullanmak için daha az teknik uzmanlık gerektirir ve çok az tehlikeli atık üretir veya hiç üretmez. En büyük dezavantajı, daha ucuz versiyonları mevcut olmasına rağmen pahalı olabilmeleridir ve kitlerle elde edilen zaman ve emek tasarrufunun dikkate alınması gerekmektedir.

Bölünmeye dayalı bir yöntem seçilirse, yakından ilişkili taksonlardan veya benzer ekstraksiyon zorluklarına sahip taksonlardan (örneğin fazla polisakkaritler) DNA çıkarmak için o belirli yöntemi kullanarak başarıları için literatürü araştırmanızı öneririz. Kaju ve mısır (Sika ve diğerleri, 2015), patates (Hosaka, 2004), Rosaceae (Antanaviciute ve diğerleri, 2015) ve pirinç (Sika ve diğerleri, 2015) dahil olmak üzere çeşitli örneklerde başarıyla kullanılan çok sayıda basit DNA ekstraksiyon yöntemi vardır. Sajib ve diğerleri, 2017 ) test edilebilir ve başarılı olabilir. Aksi takdirde, belirli ikincil metabolitleri uzaklaştırmak için ajanlar eklenerek modifiye edilmiş bir CTAB yöntemi iyi bir başlangıç ​​noktasıdır, bkz. Allen ve ark. (2006) ve Neubig ve ark. (2014). Bu yöntemlerin çoğu, fenol ve kloroform gibi bir çeker ocakta işlenmesi ve yerleşik protokoller kullanılarak yerel düzenlemelere uygun olarak güvenli bir şekilde atılması gereken toksik kimyasallar gerektirir. Satın alınan tüm kimyasallara eşlik eden ve çevrimiçi olarak (örn. www.sigmaaldrich.com adresinde) bulunan Güvenlik Veri Sayfaları (SDS) iyi bir güvenlik bilgisi kaynağıdır.

İhtiyaçlarımız için en iyi ekstraksiyon protokolünü bulmak için, mikrofüj tüplerinde gerçekleştirilmek üzere modifiye edilmiş, nispeten ucuz ve makul derecede basit CTAB tabanlı iki yöntemi değerlendirdik. Bu protokollerin her ikisi de taksona özel projeler için LIPI Moleküler Sistematik Laboratuvarı tarafından başarıyla kullanılmıştır. İlk olarak, Tel-Zur ve ark.'nın ekstraksiyon yöntemini kullanarak 75 örneğin dokularından DNA çıkardık. ( 1999 ), Wendel tarafından değiştirilmiştir (Ek 1). PCR'den sonra, 63 örnek, her ikisini de sıralamak için yeterli PCR ürünü vermedi. rbcL ve matK (aşağıda ayrıntılı olarak tartışılmıştır). Bu nedenle, Porebski ve arkadaşlarının ekstraksiyon yöntemini kullanarak bunlardan ve 331 örnekten daha DNA çıkardık. (1997), daha küçük hacimli tehlikeli kimyasal atık üreten, ancak Wendel ekstraksiyon yöntemine kıyasla fazladan bir gecelik adım içeren (Ek 1). Toplamda 406 örneğin dokularından DNA çıkardık. Ek bir karşılaştırma için, daha önce CTAB ekstraksiyonlarına tabi tutulan 48 numuneden oluşan bir alt kümenin dokularından DNA'ları çıkarmak için kolon bazlı DNeasy Plant Mini Kit'i (QIAGEN, Venlo, Hollanda Ek 1) kullandık. Kullandığımız moleküler biyoloji iş akışı Şekil 1'de gösterilmektedir, DNA ekstraksiyon yöntemleri Ek 1'de detaylandırılmıştır ve DNA ekstraksiyon verileri Ek S1'de gösterilmektedir.

DNA ekstraktlarının miktarını ve kalitesini belirlemek için yaygın olarak iki genel yaklaşım kullanılmaktadır. DNA numunelerinin jel elektroforezi ve kantifikasyon için bir merdiven, DNA konsantrasyonlarının tahmin edilmesine ve numunenin bozulup bozulmadığının veya çoğunlukla yüksek moleküler ağırlıklı parçalar içerip içermediğinin belirlenmesine olanak tanır. Spektrofotometri, proteinler ve fenol gibi bazı yaygın kirleticilerin tanımlanmasının yanı sıra miktarın tahmin edilmesini sağlar. Uygun bir spektrofotometreye erişimimiz olmadığı için jel elektroforezi kullandık. Jelden elde ettiğimiz DNA bozulması veya düşük verim kanıtına bakılmaksızın tüm numuneler için PCR girişiminde bulunduk, ancak yüksek oranda bozulmuş DNA'lardan lokusları çoğaltma girişimlerinden daha düşük PCR başarısı bekleniyor.

PCR primerleri ve amplifikasyonu

İlgilenilen grup için yayınlanmış, taksona özgü primerler, dal odaklı çalışmalar için iyi bir başlangıç ​​noktasıdır. Bu tür primerler mevcut değilse veya çalışmamızda olduğu gibi çok çeşitli taksonlar üzerinde çalışılıyorsa, filogenetik olarak çeşitli taksonlarda çalışmak üzere tasarlanmış evrensel primerler iyi bir seçenektir (örneğin, CBOL Plant Working Group 2009 tarafından önerilenler). ). CBOL tarafından önerilen primerler için kriterler, evrenselliğe (birden çok taksonda başarılı amplifikasyon), dizi kalitesine ve kapsamına (yüksek kaliteli dizi verileri döndüren bölgelerin amplifikasyonu) ve ayrımcılığa (en çok türün ayırt edilmesini sağlar) dayanır. Proje kapsamı genişse, ancak kötü PCR sonuçları belirli taksonlarla ilişkiliyse, ilgili taksona özgü primer dizileri sorun giderme için yine de yararlı olabilir. Bu yaklaşımlar başarılı olmazsa, halka açık dizi verilerine dayalı olarak primerler tasarlanabilir. İdeal olarak, uygun, korunmuş bölgelerin primer siteler olarak tanımlanabilmesi için hedef taksonla ilgili birden fazla taksondan dizi hizalamaları oluşturulmalıdır. Primerler daha sonra PrimerDesign (Brodin ve diğerleri, 2013) veya Primaclade (Gadberry ve diğerleri, 2005) gibi yazılımlar kullanılarak ilgili bölgeyi büyütmek için tasarlanabilir. Lorenz (2012), PCR primer tasarımı için genel yönergeler sunar.

PCR zor olabilir ve tekrarlanabilir amplifikasyon elde etmek için mümkün olduğunda yüksek kaliteli DNA'lar kullanmak ve her zaman iyi tasarlanmış primerler ve uygun şekilde hazırlanmış ve depolanmış reaktifler kullanmak çok önemlidir. DNA'yı depolamak zordur (Anchordoquy ve Molina, 2007 ) ve DNA ve diğer reaktifleri depolamak için buzlanmayan dondurucuların kullanımına ilişkin ayrıntılarla birlikte Ek 1'de ayrıntılı olarak tartışılmaktadır. Su kalitesi genellikle bir sorundur ve eğer güvenilirse Milli-Q (MilliporeSigma, Burlington, Massachusetts, ABD) veya eşdeğeri su mevcut değilse, güvenilir bir reaktif şirketinden moleküler biyoloji dereceli su satın alınması önerilir.

Bitki DNA barkodları için PCR primerlerini seçtik rbcL ve matK CBOL Tesis Çalışma Grubunun (2009) tavsiyelerine dayanmaktadır. Ek 1, primer dizilerini ve PCR koşullarını detaylandırır. CTAB tabanlı bir protokol kullanılarak ekstrakte edilen her DNA örneği için iki adet 12,5 μL PCR reaksiyonu gerçekleştirdik (Şekil 1). Pahalı PCR reaktiflerini korurken amplifikasyonda iki bağımsız girişimde bulunmak için bir büyük hacimli reaksiyon yerine iki küçük hacimli reaksiyon kullanıldı. PCR ürünleri, yukarıda tarif edildiği gibi jel elektroforezi kullanılarak incelendi. İki denemeden sonra hiçbir PCR ürünü oluşturulmadıysa, başka PCR gerçekleştirilmedi. Bununla birlikte, bir miktar ürün mevcutsa, dizileme için yeterli DNA olana kadar ek PCR'ler gerçekleştirildi. Yeterli ürün elde etmek için ek PCR gerçekleştirmekle, marjinal verimler üreten şablon ve primer kombinasyonları için PCR protokolünü optimize etmeye çalışmakla ilgili ödünleşimler vardır. Bir proje, bu durumda olduğu gibi, bir bölgeden veya topluluktan bireyleri örneklediğinde, optimizasyon pratik olmayabilir. Bununla birlikte, yakından ilişkili taksonları örneklerken, optimizasyon sonuçta zaman ve kaynak tasarrufu sağlayabilir. Optimizasyon ve sorun giderme önerileri Ek 1'de bulunabilir.

Elde etmek üzere rbcL barkodlar, Wendel protokolü kullanılarak ekstrakte edilen 75 DNA numunesi üzerinde dört adede kadar PCR reaksiyonu ve Porebski protokolü kullanılarak ekstrakte edilen 386 DNA numunesi üzerinde altı adede kadar PCR reaksiyonu gerçekleştirdik (55 numune, daha önce Wendel protokolü ile ekstrakte edilen numunelerden ekstraksiyonları temsil eder Şekil 1) . Toplamda, üretmeye çalıştık rbcL 406 numuneden alınan barkodlar (Ek S1). Sekanslama için yeterli DNA biriktirmek için hangi DNA örneklerinin ek PCR reaksiyonlarının hedefi olması gerektiğini belirlemek amacıyla nitel kategorilere verim atadığımız PCR verimini belirlemek için jel elektroforezi kullandık. Kullandığımız kategoriler, görünür bir ürün grubu olmadığında “ürün yok”, beklenen boyutta zayıf bir bant göründüğünde “bazı ürün” ve beklenen boyutta parlak bir bant göründüğünde “yeterli ürün” idi. Bu kategoriler, soluk ve parlak bantların dizilenmesinden elde edilen ampirik sonuçlara dayanıyordu. Sıralama için numuneler göndermek amacıyla birden fazla PCR reaksiyonundan havuzlanmış DNA'yı kategorize etmek için yukarıda tarif edilenle aynı kategorileri kullandık (Şekil 1). Kullanılan DNA ekstraksiyon yönteminden bağımsız olarak, dizileme için yeterli PCR ürünü elde etmek için en yaygın olarak üç veya dört 12,5 μL PCR reaksiyonu gerçekleştirmemiz gerekiyordu. Wendel protokolü ile ekstrakte edilen 75 numuneden 19'u sekanslandı ve Porebski protokolü ile ekstrakte edilen 386 numuneden 76'sı sekanslandı. Bu verilerin bir özeti Şekil 2'de gösterilmiştir. Hem Wendel hem de Porebski ekstraksiyonlarından elde edilen PCR ürünleri bir araya getirilerek, 406 numuneden (%24) üretilen toplam 97 barkod verilerek iki numune daha dizildi.

Elde etmek üzere matK barkodlar, Wendel protokolü kullanılarak ekstrakte edilen 73 numune üzerinde altı adede kadar PCR reaksiyonu ve Porebski protokolü kullanılarak ekstrakte edilen 386 numune üzerinde yedi adede kadar PCR reaksiyonu gerçekleştirdik (56 numune, daha önce Wendel protokolü Şekil 1 ile ekstrakte edilmiş numunelerden ekstraksiyonları temsil eder). Toplamda, üretmeye çalıştık matK 405 numuneden alınan barkodlar (Ek S1). Yukarıda açıklandığı gibi, her bir ekstraksiyon yöntemi için PCR ürünleri, jel elektroforezi ile tahmin edilen verime dayalı olarak üç kategoriye (ürün yok, biraz ürün ve yeterli ürün) ayrıldı. PCR sonuçları Şekil 2'de özetlenmiştir. Sıralama için yeterli ürün elde etmek için en yaygın olarak numune başına iki (Wendel) veya dört (Porebski) 12.5-μL PCR reaksiyonu gerçekleştirmemiz gerekiyordu. Wendel protokolü ile ekstrakte edilen 73 numuneden 18'i sekanslandı ve Porebski protokolü ile ekstrakte edilen 386 numuneden 116'sı sekanslandı. Hem Wendel hem de Porebski ekstraksiyonlarından elde edilen havuzlanmış ürünlerden 10 numune daha dizildi ve 405 numuneden (%35) toplam 144 barkod verdi. Genel olarak, Wendel ve Porebski DNA ekstraksiyon yöntemleri benzer şekilde gerçekleştirilmiştir (Şekil 2).

QIAGEN DNeasy Plant Mini Kit protokolü (Ek 1) kullanılarak ekstrakte edilen DNA'ların her biri tek bir PCR reaksiyonuna tabi tutuldu (Şekil 1). Karşılık gelen CTAB ile ekstrakte edilmiş DNA'dan tek bir PCR reaksiyonu aynı zamanda gerçekleştirildi. Daha önce olduğu gibi, PCR ürünleri jel elektroforezi ile tahmin edilen verime göre üç kategoriye (ürün yok, biraz ürün, yeterli ürün) ayrıldı. Bu tek PCR reaksiyonlarının başarısı matK ve rbcL Şekil 3'te gösterilmiştir ve tüm detaylar Ek S1'de verilmiştir. PCR ürünü oluşturmak için kullanılabilecek DNA'lar açısından, QIAGEN ile ekstrakte edilen DNA, CTAB ile ekstrakte edilen DNA'ya benzer şekilde performans gösterdi. QIAGEN kiti kullanılarak ekstrakte edilen DNA'ları kullanarak ek 18 rbcL toplam 115/406 örnek (%28) ve 10 matK toplam 154/405 örnek (%38) verecek şekilde diziler. GenBank erişimleri Ek S1'de verilmiştir.

PCR başarısızlık oranları yüksek görünse de, en azından bir miktar PCR ürünü (Şekil 2, Ek S1) olan numuneler, verimi artırmak için PCR optimizasyonundan sonra muhtemelen sıralanabilir. Toplam 51 numunede bazı PCR ürünleri vardı. rbcL (üç DNA ekstraksiyon yönteminden birleştirilmiştir). PCR optimizasyonu ve bunların başarılı bir şekilde sıralanması, genel başarı oranını %41'e çıkaracaktır. Benzer şekilde, 75 örnek vardı. matKbaşarılı bir şekilde sıralanırsa, genel başarı oranını %57'ye çıkaracaktır.

Yukarıda tartışıldığı gibi, bitki taksonomik grupları, DNA ekstraksiyonu ve amplifikasyonunu engelleyen bileşiklerin varlığına göre farklılık gösterir ve evrensel primerler tüm familyalar için çalışmayabilir. Bu nedenle, genel başarımızın bitki aileleri arasında farklılık göstermesini bekliyorduk. Her ikisi için de DNA barkodları üretmenin genel başarısı ile taksonomik aile arasında önemli bir ilişki bulduk. matK ve rbcL (sırasıyla, χ 2 = 57.6, df = 11, P = 2.57 × 10 −8 χ 2 = 25.5, df = 11, P = 0.00768 Tablo 1, Ek S1). Her iki belirteç için Clusiaceae ve Phyllanthaceae'den alınan örneklerin neredeyse tamamen başarısız olduğunu ve bunlar arasındaki başarı farklılıklarını not etmek önemlidir. matK ve rbcL Annonaceae ve Myristicaceae için.

aile a Aileler başarı oranında önemli ölçüde farklılık gösterdi (matK: χ 2 = 57.6, df = 11, P = 2.57 × 10 -8 rbcL: χ 2 = 25.5, df = 11, P = 0.00768). Aileye göre başarının tam listesi için Ek S1'e bakın.
matK rbcL
Barkod oluşturuldu Barkod oluşturulmadı Barkod oluşturuldu Barkod oluşturulmadı
Annonaceae 18 9 1 26
Apocynaceae 7 7 3 11
Clusiaceae 0 11 1 10
dipterocarpaceae 12 8 8 12
Lauraceae 6 5 1 10
Meliaceae 7 8 6 9
Moraceae 7 14 7 14
Myristicaceae 12 2 0 14
Phyllanthaceae 1 30 7 24
Primulaceae 4 9 5 8
Rubiaceae 7 28 9 26
Başka 73 120 67 127
TOPLAM 154 251 115 291
  • a Aileler başarı oranında önemli ölçüde farklılık gösterdi (matK: χ 2 = 57.6, df = 11, P = 2.57 × 10 -8 rbcL: χ 2 = 25.5, df = 11, P = 0.00768). Aileye göre başarının tam listesi için Ek S1'e bakın.

Genel olarak, verilerimiz çoklu ekstraksiyon yöntemlerinin başarıyla kullanılabileceğini, kit maliyetleri, uygun kimyasallara ve altyapıya erişim ve benzer örneklerle önceki başarılı deneyimler gibi diğer faktörlerin bir yöntem seçerken dikkate alınması gerektiğini göstermektedir.

Kirlenmeyi azaltmak

Kontaminasyon, herhangi bir moleküler biyoloji laboratuvarında büyük bir problem olabilir.Önceden amplifiye edilmiş PCR ürünleri, genomik DNA'nın uzun bir parçasında yer alabilen orijinal hedef lokustan çok daha kolay bir şekilde amplifiye olabildikleri için özellikle endişe vericidir. Laboratuvar, kontaminasyon riskini en aza indirecek şekilde düzenlenmelidir. İdeal olarak, DNA ekstraksiyonuna karşı PCR ve tüm PCR sonrası işlemler için ayrı ekipman ve mikropipetlere sahip ayrı odalar olmalıdır. Bu mümkün değilse, DNA ekstraksiyonu ve PCR için laboratuvarın ayrı mikropipetleri olan ayrı alanları kullanılmalıdır. Filtre uçları, pipetleme sırasında aerosollerle çapraz kontaminasyon miktarını etkili bir şekilde azaltır ve mümkünse kullanılmalıdır. Filtre uçlarının ek maliyeti, kullanılamayan verilerin oluşumunu azaltarak dengelenir. Pipetler düzenli olarak temizlenmeli, her zaman yeni eldiven giyilmeli ve sık sık değiştirilmelidir. Sıvıların veya sıvılardan aerosollerin cilde veya eldivenlere yapışması ve bir sonraki işlem adımına aktarılması çok kolaydır. Numuneler işlenirken, çalışma alanı etrafına yaprak parçaları yaymamak veya numuneleri çapraz kontamine etmemek için dikkatli olunmalıdır. Numune manipülasyonları için forseps alevle sterilize edilebilir veya alkolde temizlenebilir. Negatif kontroller (DNA şablonu olmayan tam reaksiyon karışımları), pahalı dizileme yapılmadan önce kontaminasyonun hızlı bir şekilde tespit edilmesini sağlamak için her PCR reaksiyonu setine dahil edilmelidir. Tüm PCR deneylerinde ayrıntılı kayıtların kayıt defterlerinde tutulması, kontaminasyon kaynağını bulma görevi için vazgeçilmezdir. Numunelerin otomatik olarak işlenmesine erişim mevcutsa, bu, kontaminasyonun azaltılması ve tekrarlanabilirliğin arttırılması için başka olanaklar sunar.

DNA dizilimi

DNA dizileme maliyeti düşmeye devam ediyor ve daha fazla dizileme hizmeti ve platformu mevcut hale geliyor. Barkodların yüksek verimli dizilimi (örneğin, Liu ve diğerleri, 2017 ) ve metabarkodlama (Deiner ve diğerleri, 2017 ), çok sayıda numuneyi ve/veya ekolojik ağları hedefleyen barkodlama projeleri için iyi seçeneklerdir. Dizileme okumalarından organel ve yüksek kopya nükleer lokusları "gözden kaçırmak" için düşük kapsama alanında tüm genom pompalı tüfek dizilimi bile maliyet etkin hale geliyor (Twyford ve Ness, 2017). Yüzlerce ila birkaç bine kadar numaralandırılmış örneklerden az sayıda barkodu hedefleyen projeler için, Sanger sıralama makul bir seçenek olmaya devam ediyor. Ana karar, PCR tarafından oluşturulan barkodların sıralanmasının dış kaynak kullanımına mı yoksa kurum içinde mi tamamlanacağına ilişkindir. Reaktifleri ithal etmekten, tekrar reaksiyonları gerçekleştirmekten ve sorun gidermeden ve enstrümanların bakımını yapmaktan genellikle daha ucuz olduğu için, yüksek kaliteli, uygun fiyatlı bir sıralama hizmetine dış kaynak sağlamanızı öneririz. Dizileme hizmetleri, DNA dizileme yaklaşımlarındaki teknolojik değişimin hızlı hızına ayak uydurmak için bireysel laboratuvarlardan çok daha iyi bir konumdadır. Çeşitli şirketler, numune başına 3 ABD Doları gibi düşük bir fiyattan tek geçişli sıralama sunar. Plaka formatında daha fazla sayıda numune göndermek için genellikle daha da büyük indirimler vardır ve daha büyük ancak yine de mütevazı sayıda numune göndermek için ücretsiz gönderim mevcuttur. PCR ürün saflaştırma gibi ek hizmetler de birçok şirket tarafından sunulmaktadır ve bu da reaktifleri ithal etmekten daha uygun maliyetli olabilir. Numunelerin veya genomik DNA'nın aksine, DNA dizilimi için PCR ürünleri genellikle menşe ülke dışına gönderilebilir çünkü numuneler genomun sadece küçük bir parçası olup, başka amaçlar için kullanılamaz ve dizileme reaksiyonu tüm numuneyi tüketir. . Macrogen Korea'da Sanger dizileme hizmetini kullandık, burada numune gönderimi için gereksinimler 100 ng/μL'de 25 μL ürün ve ayrıca 10 pmol/μL'de 2 μL dizileme primeriydi. Macrogen ayrıca makul fiyatlı bir primer sentez seçeneği sunar. 20'den fazla reaksiyon için nakliye ücretsizdir ve başarısız numuneler için bir ücretsiz tekrar reaksiyonu sağlanır, bu da bunu küçük ölçekli bir laboratuvar için dizi verileri oluşturmak için çok uygun maliyetli bir yol haline getirir.

Belirli dizi özellikleri (örneğin, yüksek GC içeriği ve basit dizi tekrarlarının varlığı) müdahale edebilmesine rağmen, yüksek kaliteli dizileme verileri genellikle uygun miktar ve kalite standartları karşılandığında elde edilebilir. Miktar ve kalite yönergeleri tipik olarak dizileme hizmetlerinden temin edilebilir ve DNA dizi izlerinin giderilmesi için mükemmel bir kaynak, Nucleic Acid PCR Research Core Facility (NAPCore Facility, Philadelphia, Pennsylvania, ABD https://napcore.research) tarafından sağlanmıştır. chop.edu/problems.php).


Uygulamalar

Transmisyon elektron mikroskobu DNA dizilimi henüz ticari olarak mevcut değildir, ancak bu teknolojinin bir gün sağlayabileceği uzun okuma uzunlukları, onu çeşitli bağlamlarda faydalı hale getirecektir.

De novo genom montajı

Bir genom dizilenirken, tek bir okumada dizilenebilecek kadar kısa parçalara bölünmelidir. Bu okumalar daha sonra okumalar arasında örtüşen bölgeleri hizalayarak bir yapboz gibi tekrar bir araya getirilmelidir, bu işleme denir. yenigenom montajı. Bir dizileme platformunun sağladığı okuma uzunluğu ne kadar uzun olursa, örtüşen bölgeler o kadar uzun olur ve genomu birleştirmek o kadar kolay olur. Hesaplamalı bir bakış açısından, mikroakışkan Sanger dizilimi, referans genom dizisinin bulunmadığı genomları dizilemenin ve birleştirmenin hala en etkili yoludur. Nispeten uzun okuma uzunlukları, montajda daha fazla istatistiksel güven sağlayan bireysel sıralama okumaları arasında önemli ölçüde örtüşme sağlar. Buna ek olarak, uzun Sanger okumaları, aksi takdirde yanlış hizalamalara neden olarak dizi derlemesini karıştıran tekrarlayan DNA dizisinin çoğu bölgesini kapsayabilir. Yine de, yeni Sanger dizilimi ile genom montajı son derece pahalı ve zaman alıcıdır. İkinci nesil dizileme teknolojileri [19] daha ucuz olmakla birlikte, genellikle yeni Kısa okuma uzunlukları nedeniyle genom montajı. Genel olarak, transmisyon elektron mikroskobu DNA dizilimini içeren üçüncü nesil dizileme teknolojileri [11], düşük dizileme maliyetini korurken okuma uzunluğunu iyileştirmeyi amaçlar. Böylece, üçüncü nesil dizileme teknolojileri geliştikçe, hızlı ve ucuz yeni genom montajı gerçek olacak.

Tam haplotipler

Bir haplotip, tek bir kromozom üzerinde birlikte kalıtılan bir dizi bağlantılı aleldir. DNA dizilimi, bir haplotip oluşturan tek nükleotid polimorfizmlerinin (SNP'ler) tümünün genotipi için kullanılabilir. Bununla birlikte, kısa DNA dizileme okumaları genellikle aşamalı olamaz, yani heterozigot varyantlar doğru haplotipe güvenle atanamaz. Aslında, kısa okunan DNA dizileme verileriyle haplotipleme, Mendel iletiminin haplotipleri tahmin etmek için kullanılabilmesi için SNP'leri doğru bir şekilde tanımlamak için çok yüksek kapsama alanı (her DNA bazının ortalama >50x kapsamı) ve ayrıca ebeveynlerden ek dizi verileri gerektirir. [20] Transmisyon elektron mikroskobu DNA dizilimi de dahil olmak üzere uzun okumalar üreten dizileme teknolojileri, tek bir okumada tüm haploblokları yakalayabilir. Yani haplotipler çoklu okumalar arasında parçalanmaz ve genetik olarak bağlantılı aleller sıralama verilerinde bir arada kalır. Bu nedenle, uzun okumalar haplotiplemeyi daha kolay ve daha doğru hale getirir, bu da popülasyon genetiği alanı için faydalıdır.

Kopya numarası çeşitleri

Diploid insan genomunda normal olarak iki kopya halinde bulunan genler, bu standart kopya sayısından sapan genlere kopya numarası varyantları (CNV'ler) olarak atıfta bulunulur. Kopya sayısı varyasyonu iyi huylu (bunlar genellikle kopya numarası polimorfizmleri olarak adlandırılan yaygın varyantlardır) veya patojenik olabilir. [21] CNV'ler, floresan in situ hibridizasyon (FISH) veya karşılaştırmalı genomik hibridizasyon (CGH) ile tespit edilir. Bir silmenin meydana geldiği belirli kesme noktalarını tespit etmek veya bir çoğaltma veya amplifikasyon olayı tarafından ortaya çıkan genomik lezyonları tespit etmek için, bir döşeme dizisi (dizi CGH) kullanılarak CGH gerçekleştirilebilir veya değişken bölge sıralanabilir. Uzun sekans okumaları, tek bir sekans okumasında yakalanırlarsa, amplifiye edilmiş segmentlerin oryantasyonunu analiz etmek mümkün olduğundan, özellikle duplikasyonları veya amplifikasyonları analiz etmek için kullanışlıdır.

Yengeç Burcu

Kanser genomiği veya onkogenomik, tüm kanser genomlarını dizilemek için yüksek verimli, ikinci nesil DNA dizileme teknolojisinin uygulandığı gelişmekte olan bir alandır. Bu kısa okuma sıralama verilerini analiz etmek, ilgili tüm sorunları kapsar. yeni Kısa okuma verilerini kullanarak genom montajı. [22] Ayrıca, kanser genomları sıklıkla anöploiddir. [23] Esasen büyük ölçekli kopya sayısı varyantları olan bu sapmalar, kopya sayısını tahmin etmek için okuma frekansı kullanan ikinci nesil sıralama teknolojileri ile analiz edilebilir. [22] Bununla birlikte, daha uzun okumalar, kopya sayısı, amplifiye bölgelerin oryantasyonu ve kanser genomlarında bulunan SNP'lerin daha doğru bir resmini sağlayacaktır.

Mikrobiyom dizilimi

Mikrobiyom, bir mikroçevrede bulunan mikropların toplam koleksiyonunu ve ilgili genomlarını ifade eder. Örneğin, tahminen 100 trilyon mikrobiyal hücre, herhangi bir zamanda insan vücudunu kolonize eder. [24] Bu ortak bakteriler insan sağlığı ve bağışıklığı için önemli olduğundan, insan mikrobiyomu özellikle ilgi çekicidir. Dünya'nın bakteriyel genomlarının çoğu henüz dizilenmedi, kapsamlı bir mikrobiyom dizileme projesi üstlenildi. yeni genom montajı, kısa okuma DNA dizileme teknolojileriyle göz korkutucu bir olasılık. [25] Daha uzun okumalar, yeni mikrobiyal genomların birleştirilmesini büyük ölçüde kolaylaştıracaktır.


Hayvan Biyoteknolojisinde Son Eğilimler

Hayvan biyoteknolojisi çeşitli şekillerde tanımlanmıştır. Hayvan biyoteknolojisinin en son alıntılanan tanımlarından biri şudur: “Mal ve hizmet sağlamak için hayvanlar veya suda yaşayan türler tarafından malzemelerin işlenmesine veya üretilmesine bilimsel ve mühendislik ilkelerinin uygulanması”.

Hayvan Biyoteknolojisi, ilk transgenik farelerin ve ilk in vitro üretilen sığır embriyolarının yaratıldığı 1980'lerin başından beri hızla gelişmiştir.

Bu makalede, hayvan biyoteknolojisi alanında mevcut olan bilgi kaynakları ve süreçleri tarif etmek için bir girişimde bulunulmuştur.

Hayvan biyoteknolojisinin örnekleri arasında, belirli bir genin inaktive edildiği hayvanları üretmek için gen nakavt teknolojisi kullanılarak transgenik hayvanların veya transgenik balıkların üretilmesi, somatik hücre nükleer transferi ile neredeyse aynı hayvanların üretilmesi veya infertil su türlerinin üretimi yer alır.

Hızla büyüyen nüfusumuzun ihtiyacını karşılamak için hayvanlardan veya bitkilerden ucuz protein kaynakları aramak bizim için en göz korkutucu görev oldu. Hayvansal protein, insan beslenmesi için gerekli olan mükemmel bir diyet amino asit kaynağıdır. Ayrıca canlı hayvanlardan et, süt ve lif hasadı yapabiliyor ve bunları farklı refah programları için kullanabiliyoruz. Hayvanlardan gıda üretimi, bitkilerden daha pahalı ve daha az verimlidir. Bu dezavantajlara rağmen ticari olarak gıda, lif ve yan ürünler için hayvan yetiştirmeye devam ediyoruz.

Atalarımız, binlerce yıl önce hayvanları evcilleştirdi ve o zamandan beri sürekli yoldaşlarımız oldular. O andan itibaren, hayvanların kendileri değişmeye başladı. Zamanın geçmesi ve vahşi akrabalarından sürekli izolasyon ile evcil hayvanlar farklı özellikler sergilemeye başladı. Bazıları diğerlerinden daha fazla veya daha iyi süt üretecek, bazıları daha hızlı büyüyecek veya daha verimli olacak, bazıları daha kuvvetli olacaktı.

Atalarımız bu varyasyonları fark etmiş ve benzer arzu edilen özelliklere sahip hayvanları çiftleştirmiş olabilirler, ancak bunu kalıtımın temelini anlamadan yaptılar. Kısıtlayıcı üreme ve seçici çiftleşme, günümüzde sahip olduğumuz çok çeşitli hayvan türlerine yol açtı, ancak baskın evcil sığırların çoğu türü Bos taurus son birkaç yüzyılda ortaya çıktı. Bos primigenius atalarının sürüleri 18. yüzyılda Avrupa'da yaşıyordu.

Böylece hayvanların iyileştirilmesi artık bir ilgi meselesi değil, bir zorunluluk meselesidir. Biyoteknoloji, dünya çapında hayvansal üretimi artırmak için bu araçların temellerini öğrenmemizi sağlayan güçlü araçlar sağlar. Bu yazıda bu araçların ne olduğunu ve uygulamalarını tartışacağım.

A. Hayvanlarda Üreme/Üreme Teknolojisi:

Üreme, üretim sisteminde bazı önemli rollere sahiptir. Stokun yenilenmesinin kullanımından daha fazla olmasını ve stokun genetik kalitesini iyileştirmesini sağlayan bir oranda gerçekleşmelidir. Üreme teknolojilerinin amacı, genel olarak stokların ve özellikle süt sığırları ve evcil domuzlar gibi en yoğun şekilde yönetilen hayvanların genetik kalitesini geliştirirken döl sayısını artırmaktır. Bu, suni tohumlama, embriyo transferi, in vitro fertilizasyon ve embriyo klonlama gibi çeşitli prosedürlerle yapılmıştır.

A. 1. Suni Tohumlama (AI):

İlk hayvan biyoteknolojisi olan suni tohumlama, erkeğin fazla gamet (sperm) üretim kapasitesinden yararlanır. Bu, verimliliği artıran tek ve en önemli faktör olmuştur. Göz önünde bulundurulması gereken birçok suni tohumlama varyasyonu vardır. Hayvan-hayvan suni tohumlama, taze uzamış (soğutulmuş) semen tohumlama ve donmuş semen tohumlama vardır.

Döllenmeden önce, atılan sperm toplanır, seyreltilir ve sperm sayısını ve ölüm oranını belirlemek için mikroskop altında incelenir. AI teknikleri arasında vajinal biriktirme, cerrahi implant ve transservikal tohumlama yer alır. Taze, taze uzatılmış veya dondurulmuş her semen preparasyonunun, özellikle trans-servikal teknikle semen uterusa biriktiğinde daha büyük yavrular üreteceğine dair ikna edici kanıtlarla çalışmalar yayınlanmıştır. Taze ve taze uzatılmış meni, vajinal birikim ile iyi sonuçlar verir.

Sığırlar için AI, ayakta duran hayvanlarda anestezi kullanılmadan, “rektal palpasyon” olarak bilinen bir prosedür kullanılarak yapılır. Farklı semen hazırlama türleri arasında, taze hayvan-hayvan toplama ve tohumlamanın en iyi semen hazırlığını vereceği yine açıktır. Taze uzatılmış veya “soğutulmuş” meni uzun yıllar çok iyi performans gösterdi, ancak taze meni kadar iyi değil.

Dondurma için hangi işlem kullanılırsa kullanılsın en kötü sonuçlar donmuş spermadadır. Dişiler, sadece birkaç saat süren ve en sık olarak geceleri meydana gelen yumurtlamadan sonra döllenir. Birçok çiftlik hayvanı türünde yumurtlamayı (östrus) tespit etmek çok zordur.

Alternatif, dişileri senkronize bir şekilde yumurtlamaya teşvik etmektir. Pratikte, yumurtlamanın tam senkronizasyonunu sağlamak oldukça imkansızdır, ancak kadınların yaklaşık %80'i indükleyiciye cevap verecektir. Ruminantlarda, dişilerde yumurtlama, progesteron veya prostaglandin gibi hormonların uygulanmasıyla indüklenebilir.

Tek cinsiyet tüm hayvancılık endüstrileri tarafından tercih edilmektedir. Süt ve besi sığırlarında dişiler üremede verimli olmadıkları ve istenilen üretim özelliklerine sahip olmadıkları için erkeklere göre dişiler daha fazla kabul görmektedir. Aynı şey domuz endüstrisinde de olur. Embriyonun cinsiyeti yalnızca X kromozomu veya Y kromozomu içeren sperm tarafından belirlenir.

Bir ejakülattaki spermin yarısı X'i ve kalan yarısı Y'yi içerdiğinden, dölün cinsiyet oranı 1:1'e yakındır. AI. İki popülasyonun ayrılması, bir floresanla aktive edilmiş hücre sıralayıcısı (FACS) kullanılarak yapılmıştır. Yöntem çok pahalı ve çok yavaş. Spesifik olarak Y taşıyan sperm hücrelerine bağlanan monoklonal antikor, gelecekte Y taşıyan ve X taşıyan spermleri ayırmak için kullanılabilir. X'i Y taşıyan hücrelerden ayırmak için sperm hücrelerinin akış sıralaması, test edilen çoğu durumda başarılı olmuştur ve sığır ve domuzlarda istenen cinsiyetin yavruları ile sonuçlanmıştır.

A. 2. Embriyo Transferi:

Genetik olarak değerli hayvanların üremesi, embriyo transfer edilerek arttırılır. Bunu yapmak için, seçilmiş bir dişi tarafından üretilen olgun yumurtaların sayısını arttırmanız gerekir. Döllenmenin ardından, bu döllenmiş yumurtalar, her yumurta için bir tane olmak üzere koruyucu anneye implante edilir. Donör kadınlara, tedaviye başlamadan önce senkronize bir östrus oluşturmak için prostaglandin F2a (PGF2a) enjekte edilir. Östrus döneminden on gün sonra, dört günlük bir süre boyunca FSH enjekte edilir, ardından östrusu indüklemek için PGF2a verilir.

Süper yumurtlanan donörler daha sonra suni tohumlama ile çiftleştirilir. Tohumlamadan altı ila sekiz gün sonra, döllenmiş yumurtalar sığırlardan ve altı gün koyun ve keçilerden toplanır. Hemen senkronize alıcılara aktarılırlar. Alternatif olarak, süresiz depolama için dondurulabilirler. İyi uygulama ile transfer edilen embriyodan sığırlarda %50-60 gebelik oranlarına ulaşılabilir.

Tek yumurta ikizleri üreten bir yöntemle embriyo bölme işlemi yapılarak gebelik çıktı oranları artırılabilir. Son zamanlarda bu, mikromanipülasyon ekipmanı ve minimum eğitim gerektiren rutin bir üretim aracı haline geldi. Embriyolar, donörden blastosist aşamasında elde edildi (Şekil 21.1) ve hipertonik sakaroz ve sığır serum albümini içeren standart bir hücre kültürü ortamına aktarıldı.

Embriyo daha sonra, dibe battığı ve ona yapıştığı standart kültür ortamını içeren plastik bir Petrish'e aktarılır. Dış zar üzerindeki BSA kaynaklı negatif yük ile plastik diskin pozitif yükü arasındaki elektrostatik etkileşimler nedeniyle oluşur.

Embriyo daha sonra ters mikroskop altında ince bir bıçakla donatılmış bir mikromanipülatör kullanılarak ikiye bölünür. Embriyo bölme sırasında, iç hücre kütlesinin eşit yarılara bölünmesini sağlamak için özen gösterilmelidir. Bölündükten sonra, normal transfer ile aynı prosedür izlenerek alıcı dişinin yumurta kanalına transfer edilirler. Bir üretim özelliği olan dölün cinsiyetini belirlemek için rutin biyopsi yapılmıştır. Bir embriyo biyopsisinin hücrelerinde Y kromozomal DNA'sının varlığı, embriyonun bir erkek olduğunu gösterir: Y kromozomal DNA'sı yoksa, dişidir. Bu, Y kromozomuna özgü DNA'yı yükseltmek için PCR kullanılarak yapılıyor.

A. 3 Tüp Bebek (IVF):

Embriyo transferi, yüksek maliyetler, teknik zorluklar ve sınırlı bulunabilirlik gibi birçok faktör nedeniyle yaygın olarak kullanılmamaktadır. Donör dişiden alınan oositlerin in vitro döllenmesi ile bu problemlerin üstesinden gelebiliriz. Daha az meni kullanarak daha fazla yumurtanın döllenmesini sağlar. Bu nedenle IVF, AI'dan daha verimli bir yöntemdir. Östrus döngüsü sırasında bir dizi Graaf folikülü büyümeye başlar.

Sonunda foliküllerden biri olgunlaşır ve yırtılır ve yumurtaları döllenme için serbest bırakır. Süper yumurtlanmış donörlerden laparoskopik cerrahi ile bu foliküllerden oositler toplanır. Yumurtalar daha sonra olgunlaşmak ve in vitro döllenmek üzere inkübe edilir. Bu yöntem yüksek teknik beceri gerektirir ve bu nedenle her zaman uygun maliyetli değildir.

IVF'nin başarısı, çok sayıda oositin toplanmasına ve orada in vitro olgunlaşmaya bağlıdır. Bu, seçilen bir dişiden bir yumurtalık çıkarılarak yapılabilir ve in vitro olgunlaşmaya teşvik edilir. Dünya çapında çok sayıda bilim insanı, in vitro oosit olgunlaşması üzerine araştırmalar yürütmektedir. Ancak burada Graaf foliküllerinin çoğunun hiçbir zaman olgunluğa erişmediğini belirtmekte fayda var. Embriyo transferi ile en yüksek başarı oranları, blastokistler alıcılara implante edildiğinde rapor edilir.

Bu, embriyolar kültürde tutulursa yapılabilir. Birçok laboratuvar IVF sığır embriyolarının %60'ının blastosist aşamasına kadar kültürlenebileceğini göstermiştir. Gebeliğin ilk iki ayında kültür embriyolarından yüksek oranda düşük kaydedilmektedir. Bu, oositteki genetik kusurdan ve/veya spermi döllemekten ve yumurta, sperm veya embriyonun çevresel mutajenezinden (esas olarak serbest oksijen radikallerinin neden olduğu) kaynaklanabilir.

B. Klonlama:

Hayvan biyoteknolojisinin bir başka uygulaması, diğer hayvanların yalnızca aynı kopyaları olan hayvanların birden fazla kopyasını üretmek için somatik nükleer transferin kullanılmasıdır. Bu işleme ‘klonlama’ denir. Yani klonlama, başka bir bitki veya hayvanla genetik olarak özdeş olan bir veya daha fazla özdeş bitki veya hayvanın üretilmesidir.

İstenen özelliklere sahip belirli bir embriyonun sayısının artmasını kolaylaştıracaktır. Doğanın kendisi en büyük klonlama ajanıdır. Her 75 gebelikten birinde, döllenmiş embriyo bölünür ve monozigotik ikizler üretir.

B. 1. DNA Klonlama:

Bireysel rekombinant DNA moleküllerinin (örneğin, insülin geni içeren DNA) daha fazla manipülasyonu ve analizini yapmak için, moleküllerin genellikle saflaştırılmış bir biçimde birçok kopyasına sahip olmamız gerekir. DNA klonlama, büyük miktarlarda spesifik DNA segmenti üretmek için bir tekniktir. Klonlanacak DNA parçası, eklenmiş DNA'yı bakteri E. coli gibi uygun bir konak hücreye taşımak için bir araç olan bir vektöre eklenir.

Vektör, konak hücre içinde kopyalanmasına izin veren diziler içerir ve genellikle klonlama vektörü olarak adlandırılır. Mevcut kullanımda çok sayıda klonlama vektörü vardır ve bunlar arasında seçim, klonlanması gereken DNA parçasının boyutuna veya klonun kullanılacağı kullanıma bağlıdır.

Bakteriyel plazmitler, ana bakteri kromozomundan farklı olan küçük dairesel DNA molekülleridir. DNA'larını bakteri kromozomundan bağımsız olarak çoğaltırlar. Vektör olarak rutin olarak kullanılan plazmitler, ilaç direnci için genleri taşıyanlardır. İlaca dirençli genler yararlıdır çünkü ilaca dirençli fenotip, rekombinant plazmidi içeren hücreleri seçmek için kullanılabilir.

Bakteri hücrelerinin ortamdan DNA aldığı sürece transformasyon denir. Bu, bakteri hücrelerinde plazmit klonlamanın temelini oluşturur (Şekil 21.2). En yaygın olarak kullanılan yöntemlerde, Kalsiyum iyonları ile ön işleme tabi tutulmuş bir bakteri kültürüne rekombinant plazmitler eklenir. Bakteri hücreleri daha sonra ortamdan DNA almak için (ısı şokuyla) aktive edilir.

Normalde az sayıda hücre rekombinant plazmit moleküllerinden birini alıp tutabilir. Bir bakteri hücresi ortamdan bir rekombinant plazmit aldığında, hücre, rekombinant DNA molekülünü içeren bir hücre kolonisine yol açar. Rekombinant bir plazmit içeren bu bakteriler, plazmitlerin ilaca dirençli genine özgü antibiyotik varlığında hücrelerin büyütülmesiyle diğerlerinden seçilir.

1b. Bakteriyofaj Vektörleri:

Bakteriyofaj içindeki kromozomal DNA'nın tek iplikli mi yoksa çift iplikli mi olduğuna ve donör DNA eklentisinin boyutuna bağlı olarak bakteriyofaj vektörlerinin farklı sınıfları vardır.

B.1c. Bakteriyofaj (Lambda):

Yaklaşık 25 kb'ye kadar çift sarmallı DNA ekleri için bir klonlama vektörü olarak kullanılır. Lambda faj kafaları, yaklaşık 50 kb uzunluğunda doğrusal bir DNA (genom) barındırır. Genomun merkezi kısmı, replikasyon veya paketleme için gerekli değildir ve bu nedenle, kısıtlama enzimi kullanılarak bir merkezi kısım kesilebilir ve atılabilir.

Genomun her iki ucunda kalan iki ‘arm’, kısıtlama ile sindirilmiş donör DNA'ya bağlanır (Şekil 21.3). Rekombinant moleküller, transformasyon yoluyla E. coli'ye dahil edilebilir. Bakteriye girdikten sonra, donör DNA eklentisi lambda/faj DNA'sı ile birlikte amplifiye edilir ve hücre parçalandığında salınan yeni nesil virüs partikülleri halinde paketlenir. Serbest kalan parçacıklar yeni hücreleri enfekte eder. Bu, enfeksiyon bölgesinde bakteri plakasında açık bir nokta (veya plak) oluşmasına neden olur. Her plak, her biri aynı donör DNA ekinin tek bir kopyasını taşıyan milyonlarca büyük parçacığı barındırır.

B.1d. Daha Büyük DNA Ekleri için Vektörler:

Standart bir plazmide veya vektöre yerleştirilebilecek donör DNA'nın maksimum boyutu, yaklaşık 30 kb uzunluğundadır. Bu talebi karşılamak için birkaç vektör tasarlanmıştır. En büyük prokaryotik ekler BAC (bakteriyel yapay kromozom) vektör sistemini kullanır. 7 kb F plazmitine dayanır ve daha büyük DNA eklerini (yaklaşık 300 kb'ye kadar) kabul etme kabiliyetine sahiptir.

300 kb'den daha büyük ekler için, YAC (maya yapay kromozomu) - dönüşüm yoluyla maya hücrelerine eklenen maya kromozomlarına dayanan bir ökaryotik vektör sistemi, 1.000 kb uzunluğundaki rekombinant molekülleri klonlamak için kullanılıyor.

B. 1e. DNA Kütüphanesinin Oluşumu:

DNA klonlama, klonlanmış DNA parçalarının koleksiyonları olan DNA kitaplıklarını üretmek için sıklıkla kullanılır. İki temel DNA kütüphanesi türü vardır: genomik kütüphaneler ve cDNA kütüphaneleri. Genomik kütüphaneler, çekirdeklerden elde edilen toplam DNA'dan üretilir ve türlerin tüm DNA dizilerini içerir.

Bir türün genomik kütüphanesi oluşturulduktan sonra, bilim adamları kütüphaneyi belirli DNA parçalarını izole etmek için kullanabilirler. cDNA kitaplıkları, mRNA popülasyonunun DNA kopyalarından türetilir. cDNA kütüphaneleri, belirli bir hücre tipinde bulunan mRNA'dan üretilir ve bu, o hücre tipinde aktif olan genlere karşılık gelir.

B.1f. İlgilenilen DNA Moleküllerinin Tanımlanması:

Klonlamadan hemen sonra, bir sonraki görev, istenen geni içeren o belirli klonu bulmaktır. Bu, ya spesifik bir prob kullanılarak (DNA veya protein bulmak için) veya spesifik bir nükleik asidin problanmasıyla yapılmıştır.

B. 1g. Genetik Mühendisliği için Rekombinant DNA Teknolojisinin Kullanımı:

Bir organizmanın genotipini ve fenotipini değiştirmek için karmaşık rekombinant DNA tekniklerinin kullanılmasına genetik mühendisliği denir. Bu, genlerin kopyalandıkları ve çevrildikleri ökaryotik hücrelere sokulmasıyla yapılıyor. Bunu başarmak için bir takım stratejiler vardır. En sık kullanılan teknik, transdüksiyon olarak adlandırılan viral aracılı gen transferidir.

Burada tasarlanmış DNA, replike olmayan bir virüsün genomuna dahil edilir ve virüsün hücreyi enfekte etmesine izin verir. İlgilenilen genin geçici olarak eksprese edilip edilemeyeceğini veya konakçı hücrelerin genomuna entegre edilip edilemeyeceğini belirleyen virüs türüdür. Retrovirüsler, gen terapisinde, normal bir geni, kusurlu bir gene sahip bir hastanın hücrelerine aktarmak için kullanılmıştır. Transfeksiyon, çıplak DNA'nın kültürlenmiş hücrelere dahil edilebildiği bir işlemdir.

İşlem sırasında hücreler, her ikisi de eklenen DNA ile hücreye yapışmasını destekleyen bir kompleks oluşturan kalsiyum fosfat veya DEAE-dekstran ile muamele edilir. Sadece birkaç hücrenin DNA'yı aldığı ve transgenik bir ökaryot yapmak için onu stabil bir şekilde kromozomlara dahil ettiği gözlenir (Şekil 21.4). Elektroporasyon ve lipofeksiyon - diğer iki yöntem de hücreleri transfekte etmek için kullanılmıştır.

Lipofeksiyonda, yabancı DNA, hücre zarının lipid çift tabakası ile kaynaşabilen ve DNA'yı sitoplazmaya tedarik edebilen pozitif yüklü lipidlere (lipozomlar) bağlanır. Elektroporasyonda, yabancı DNA, elektrik akımı tarafından indüklenen değiştirilmiş plazma zarından çekirdeğe girer ve genomla bütünleşir. Yabancı DNA, doğrudan hücre çekirdeğine mikroenjekte edilerek bir hücreye dahil edilebilir.

Uzun süredir Xenopus oositleri, yabancı genlerin ekspresyonunu incelemek için kullanılmıştır. mRNA sentezi için tüm bileşenleri içerir. Yabancı DNA çekirdeğe verildiğinde, transkripsiyonu başlatır ve sonunda m-RNA, immünolojik olarak tespit edilebilen proteinlere çevrildikleri sitoplazmaya taşınır.

Enjekte edilen DNA için bir diğer önemli hedef, bir fare embriyosunun çekirdeğidir. Burada yabancı DNA, embriyonun tüm hücrelerine ve sonunda yetişkine geçecek olan yumurtanın kromozomuna entegre olur. Genetiği değiştirilmiş hayvanlara transgenik hayvanlar denir.

İlk transgenik hayvan, 1981 yılında Pennsylvania Üniversitesi'nden Ralph Brinster ve Washington Üniversitesi'nden Richar Palmiter tarafından yaratıldı. Farelerin döllenmiş yumurtalarına sıçan büyüme hormonu (GH) için bir gen yerleştirmeyi başardılar. Enjekte edilen DNA, sıçan GH geninin (kodlayıcı protein) fare metallotiyonein geninin promotör bölgesinden aşağı akışta yer alacak şekilde yapılandırıldı.

Normal bir sıçanda, kadmiyum, çinko veya glukokortikoid hormonları gibi metallerin tedavisini takiben metallotiyonein geninin sentezi hızlanır. Transgenik farelerde, GH geninin sentezinin, metaller ve glukokortikoidler ile muameleyi takiben arttığı görülmüştür. Fareler, memeli genetiği için en önemli modellerdir. Farelerde geliştirilen teknoloji insana da uygulanabilir.

Farelerde transgenez için iki strateji vardır: ektopik yerleştirme ve gen hedefleme. Ektopik yerleştirmede yer alan prosedür, daha önce tartışılan erken evre embriyoların çekirdeğine bakteriyel olarak klonlanmış DNA çözeltilerini enjekte etmektir. Gen hedeflemesi biraz nadir bir olaydır ve embriyonik kök hücrelerin kullanımını içeren çok adımlı bir sürece ihtiyaç vardır. Embriyonik kök hücreler (ES), bir farenin herhangi bir parçasını oluşturma yeteneğine sahiptir, bu nedenle bunlara totipotent hücreler denir.

Gen hedefleme süreci, çıktılarından biri olan normal gen için işlevsel olmayan bir genin ikamesi ile tanınabilir. Bu tür hedeflenen inaktivasyona gen nakavt denir. Burada embriyonik kök hücreler bir fare suşundan (albino) izole edilir ve embriyolar, nakavt edilecek genin aktif olmayan, mutant bir alelini içeren bir DNA eki ile transfekte edilir.

ES hücreleri daha sonra bir albino suşundan toplanan alıcı genç fare embriyosuna (blastocoel) enjekte edilir. Bir sonraki adımda, ES hücrelerini içeren embriyo, taşıyıcı anneye dönüşmek üzere büyür. Ortaya çıkan soy, hem donörden (nakledilen ES) hem de alıcı suşlardan türetilen dokuya sahip olan kimeriktir. Kimerik fareler daha sonra, genin her bir kopyasında nakavt ile homozigot fareler üretmek için kardeşleriyle çiftleştirilir (Şekil 21.5). Bunlar, genin işlevsel bir kopyasından yoksun olan nakavt farelerdir.

‘klonlama’ terimi genellikle üç farklı prosedüre atıfta bulunur. Üç tür klonlama vardır: embriyo klonlama, yetişkin DNA klonlama ve terapötik klonlama.

B. 2. Embriyo Klonlama:

İkizlerin doğal olarak geliştiği mekanizmayı uyardığı için buna daha doğru bir şekilde ‘yapay ikizleme’ denebilir. Bir embriyodan bir veya daha fazla hücrenin çıkarılmasını ve bir hücrenin orijinaliyle aynı DNA'ya sahip ayrı bir embriyoya dönüşmesini teşvik etmeyi içerir.

Sığır, koyun, domuz, keçi, at, köstebek, kedi, sıçan ve fare gibi birçok hayvan türü üzerinde yıllardır başarıyla uygulanmaktadır. Embriyo klonlama teknolojisi iki şekilde yapılmıştır: nükleer transfer ve embriyonik kök hücre. Embriyoların klonlanması 1970'lerin sonlarından beri farelerde ve 1980'lerden beri hayvan ıslahında kullanılmaktadır.

B.2a. Nükleer Transfer:

Teknik, klonlanacak hayvanlardan uygun bir dokudan (tercihen fibroblast) somatik hücrelerin kültürlenmesini içerir. Kültürlenmiş somatik hücrelerden alınan çekirdekler daha sonra aynı veya yakından ilişkili türlerdeki başka bir bireyden elde edilen çekirdeksiz bir oosit içine mikro enjekte edilir.

Henüz anlaşılmayan bir süreçle, somatik hücrelerden gelen çekirdek, embriyonun normal gelişimini yönlendirmeye uygun bir gen ekspresyonu modeline yeniden programlanır. Daha fazla kültür ve in vitro geliştirmeden sonra, embriyolar alıcı bir dişiye aktarılır ve nihayetinde canlı yavruların doğumuyla sonuçlanır.

Nükleer transferle hayvan üretme başarı oranı %10'dan azdır ve içerdiği türler, alıcı yumurtanın kaynağı, donör çekirdeğin hücre tipi, donör hücrelerin çekirdek transferi öncesi tedavisi ve nükleer transfer için kullanılan teknikler gibi birçok faktöre bağlıdır.

Kamuya duyurulan ilk insan klonlaması, Robert J. Stillman ve ekibi tarafından Washington DC'deki George Washington Tıp Merkezi'nde yapıldı. Genetik olarak kusurlu 17 insan embriyosu aldılar. Bu embriyolar, iki sperm tarafından döllenmiş yumurtadan elde edildi. Bu, yumurtanın kaderini mahveden fazladan bir kromozom seti ile sonuçlandı. Hiçbiri bir fetüse dönüşemezdi. Bu yumurtalar 1994'te başarılı bir şekilde bölündü ve her biri bir veya daha fazla klon üretti.

B. 3. Erişkin DNA Klonlama (Üreme Klonlama):

Bu teknik, mevcut bir hayvanın bir kopyasını üretmek için kullanılır. Bir koyunu ve diğer memelileri klonlamak için kullanılmıştır. Üreme klonlamasının, 1996 yılında İskoçya'nın Roslin kentindeki Roslin Enstitüsü'nden Dr. Ian Wialmut adlı bir bilim adamı tarafından etkinleştirilinceye kadar tüm memelilerde imkansız olduğu düşünülüyordu. 23 Şubat 1997'de medyaya. O, başka bir yetişkinden DNA kullanan ilk büyük klonlanmış hayvandır.

Altı yaşındaki olgun bir koyunun meme dokusundan DNA'sı uykudayken bir hücre alındı. Çekirdeği çıkarılmış koyun yumurtası ile kaynaştırıldı. ‘döllenmiş’ hücre daha sonra bir elektrik darbesi ile uyarıldı. 277 hücre füzyonu denemesinden sadece 29'u bölünmeye başladı. Bunların hepsi koyunlara yerleştirildi, 13 tanesi hamile kaldı ama sadece bir kuzu, Dolly doğdu. 4 Mart 1997'de Başkan Clinton, ABD'de insan klonlamaya yönelik Federal fonların yaygın olarak yasaklanmasını emretti. İnsan klonlama ile ilgili araştırmalar diğer ülkelerde de devam etmektedir.

Son 25 yılda ökaryotik genomların analizinde muazzam ilerlemeler kaydedilmiştir. Bu ilerleme, moleküler biyologların birden fazla kaynaktan türetilen DNA dizilerini içeren moleküller olan rekombinant DNA molekülleri oluşturmayı öğrenmesiyle başladı.

Belirli bir polipeptidi kodlayan belirli bir DNA segmentinin genomundan izolasyonu, DNA'yı kesin olarak tanımlanmış konumlarda kesecek enzimlerin (kısıtlama endonükleazları) ve DNA fragmanlarına (ligazlar) kovalent olarak katılacak enzimlerin izolasyonunu içerir.

DNA Klonlamanın Ana Adımları (Şekil 21.6)'da verilmiştir ve Aşağıdaki Prosedürleri İçerir:

1. Klonlanacak DNA'nın izolasyonu.

2. İzole edilmiş DNA'nın, yabancı DNA'yı bakteri E. coli gibi uygun konakçı hücreye taşımak için bir araç olan vektör adı verilen başka bir DNA parçasına yerleştirilmesi. Her ne kadar (Şekil 21.2). bir plazmit vektörünün kullanımını gösterir, diğer vektör türleri de Bakteriyofaj lambda gibi kullanılabilir.

3. Rekombinant vektörlerin bakteri hücrelerinde ya virüsler kullanılarak enfeksiyon yoluyla transformasyonlar yoluyla transferi.

4. İstenen rekombinant vektörleri içeren hücrelerin seçimi.

5. Gerektiği kadar klonlanmış DNA vermek için bakterilerin büyümesi.

B.3a. Klonlanacak DNA'nın İzolasyonu:

Analiz için DNA bağışlamak için kullanılacak olan incelenen organizmaya donör organizma denir. Üç DNA segmenti kaynağı düşünülebilir: genomik DNA, tamamlayıcı DNA ve kimyasal olarak sentezlenmiş DNA.

Bu DNA dizileri, incelenen organizmanın kromozomlarında bulunur ve bu nedenle en kolay DNA kaynağıdır.

Tamamlayıcı DNA (cDNA):

Tamamlayıcı DNA veya cDNA, esasen bir mRNA molekülünün çift sarmallı bir DNA versiyonudur. cDNA, orijinal olarak retrovirüslerden izole edilen ters transkriptaz adı verilen özel bir enzim kullanılarak mRNA'dan yapılır. Bir mRNA molekülünün kalıp olarak kullanılmasıyla ters transkriptaz, çift sarmallı DNA sentezi için kalıp olarak kullanılabilen tek sarmallı bir DNA molekülünü sentezler. Gen yapısı ve gen ekspresyonunun analizinde cDNA sentezi çok önemlidir (Şekil 21.6).

Kimyasal Olarak Sentezlenmiş DNA:

Oligonükleotitlerin kimyasal sentezine yönelik teknikler, rekombinant DNA amacıyla DNA dizisi üretmek için geliştirilmiştir.

B.3b. Rekombinant DNA'nın Yapısı:

İzole edilmiş DNA molekülleri, belirli bölgelerde parçalanan endonükleazlar (kısıtlama enzimleri) ile enzimatik olarak sindirilerek küçük parçalara ayrılır. Kısıtlama enzimleri, spesifik DNA hedef dizilerinde (4 ila 8 nükleotid içeren) kesilir ve bu özellik, onları DNA manipülasyonu için uygun kılan temel özelliklerden biridir.

Herhangi bir DNA molekülü, virüslerden, bakterilerden, bitki ve hayvandan türetilmiş olsun, tamamen tesadüfen, kısıtlama enzimi hedef bölgeleri içerir. Bu nedenle, uygun kısıtlama enziminin varlığında, DNA, kısıtlama bölgelerinin konumuna göre bir dizi küçük parçaya kesilecektir.

Kısıtlama Enzim EcoR1 (E. coli'den) Herhangi Bir Organizmanın DNA'sında aşağıdaki 6-Nükleotid Çifti Dizisini tanır:

Bu tip segmente DNA palindromu denir; bu, her iki zincirin de aynı nükleotid sekansına sahip olduğu ancak antiparalel yönelimde olduğu anlamına gelir. EcoR1, yalnızca GAATTC palindrom dizisini tanır ve keser.

Kesikler, Palindromun Her Bir Dizisindeki G ve A Nükleotidleri Arasındadır:

Bu kademeli kesimler, bir çift özdeş beş tabanlı uzun tek telli ‘yapışkan uçlar’ bırakır. Uçlara yapışkan denir, çünkü tek sarmallı olduklarından, tamamlayıcı bir kopyaya baz çifti hidrojen bağı yoluyla hibridize edilebilirler. Bu yapışkan uçların üretimi, onları rekombinant DNA teknolojisi için uygun araçlar yapan birçok kısıtlama enziminin bir başka özelliğidir.

İki DNA molekülü aynı yapışkan uç üreten kısıtlama enzimi ile kesilirse, her birinin fragmanları aynı tamamlayıcı yapışkan uçlara sahip olacak ve bir test tüpünde uygun koşullar altında birbirleriyle hibridize olmalarını sağlayacaktır. (Şek. 21.7). bir plazmit (vektör) gibi dairesel DNA molekülünde tek bir kesim yapan kısıtlama enzimini gösterir, kesim daireyi açar ve elde edilen bir astar molekülünün iki yapışkan ucu vardır.

Böyle bir molekül farklı bir DNA molekülü ile karıştırılırsa (insülin içeren donör DNA fragmanı—EcoR1 ile kesilmiş gen (Şekil 21.7), daha sonra ikisi tamamlayıcı yapışkan uçlar yoluyla bir rekombinant molekül oluşturmak üzere birbirine hibritleşebilir. İnsülin geni içeren donör DNA'nın yararlı rekombinant moleküller oluşturmak için plazmit DNA segmentlerine bağlanmasının iki nedeni vardır.

İlk olarak, parçalanmış bir donör DNA parçası, bir test tüpünde veya bir konakçı organizma içinde kopyalanmasını sağlamak için kendi başına gerekli DNA dizilerine sahip değildir. Verici DNA, bir test tüpünde veya bir konak hücre içinde replikasyonu destekleyebilen diğer DNA segmentlerine fiziksel olarak bağlanmalıdır. İkincisi, bir deney, fonksiyonel bir birim (örneğin, transkripsiyonel olarak aktif bir gen) oluşturmak için birden fazla parçanın birbirine yapıştırılmasını gerektirebilir.

En yaygın olarak, hem donör hem de plazmit DNA, DNA ligaz varlığında birlikte sindirilir. Kuluçka sırasında, iki tip DNA, yapışkan uçlarıyla birbirine hidrojen bağlı hale gelir ve daha sonra dairesel DNA rekombinantları oluşturmak üzere bağlanır.

B. 4. Terapötik Klonlama:

Bu, başlangıç ​​aşamaları yetişkin DNA klonlaması ile aynı olan bir prosedürdür. Bununla birlikte, kök hücreler, DNA'yı sağlayan kişiye geri nakledilmek üzere doku veya bütün bir organ üretmek amacıyla pre-embriyodan çıkarılır. Ön embriyo bu süreçte ölür. Terapötik klonlamanın amacı, hasta bir kişinin doku veya organının nakil için sağlıklı bir kopyasını üretmektir.

Doku veya organ, hasta kişinin orijinal DNA'sına sahip olacaktır ve bu nedenle hastanın hayatının geri kalanında immünosupresif ilaçlar almasına gerek yoktur. Bilim adamları, insan genlerine sahip transgenik domuzlar yaratmaya çalışıyorlar. Kalpleri, karaciğerleri veya böbrekleri insanlarda organ nakli olarak kullanılabilir. Bu birçok hayat kurtaracak çünkü her yıl binlerce insan insan organlarını beklerken ölüyor.

Bir kez elde edildiğinde, transgenik hayvanlar gerektiği kadar çok organ üretmek için klonlanabilir. Araştırmacılar, tipik olarak sütünde insan hormonları veya proteinleri üretmek için transgenik hayvanlar ürettiler. Bu maddeler sütten ayrılabilir ve insan rahatsızlıklarının tedavisinde kullanılabilir.

Gen tedavisi, hastalık gelişiminden sorumlu genleri düzeltmek için kullanılan bir tekniktir. Gen tedavisinin vaatleri 1989'da başlatılan ilk denemelerden belliydi. Ele alınan hastalık, vücudun bir temizlik enzimi eksikliğinin bağışıklık sisteminde zararlı olduğu, nadir görülen otozomal resesif bir hastalık olan adenozin deaminaz (ADA) eksikliğiydi.

Orada, ADA'nın yokluğu, T lenfositlerinin erken ölümüyle sonuçlanır ve bu da bir immün yetmezlik durumuna (SCID – ciddi kombine immün yetmezlik) yol açar. Ulusal Sağlık Enstitüsü'nde, ABD'li araştırmacılar, bozuklukla doğan çocukların lenfositlerine normal bir ADA genini aktardı.

Daha sonraki denemelerde gen, kemik iliği hücrelerine yerleştirildi. Her iki stratejide de manipülasyon ex vivo idi. Hastaya vahşi tipte bir ADA geni ile transfekte edilmiş kendi kan hücreleri enjekte edildi. Paralel olarak sığır kanından elde edilen adenosin deaminaz verildi. Uzun vadeli klinik faydalar henüz takdir edilmemiş olsa da, bu erken çabalar, bir terapötik strateji olarak gen aktarımı potansiyelini oluşturmaya hizmet etti (Şekil 21.8).

Araştırmacılar, Arızalı Genleri Düzeltmek İçin Çeşitli Yaklaşımlardan Birini Kullanıyor:

a. Normal bir gen, işlevsel olmayan bir genin yerini almak için genom içinde spesifik olmayan bir konuma yerleştirilebilir. Bu yaklaşım en yaygın olarak uygulanmaktadır.

B. Anormal bir gen, homolog rekombinasyon yoluyla normal bir gen için değiştirilebilir.

C. Anormal gen, geni normal işlevine döndüren seçici ters mutasyon yoluyla onarılabilir.

NS. Belirli bir genin düzenlenmesi (bir genin açılıp kapatılma derecesi) değiştirilebilir.

Çoğu gen terapisi çalışmasında, hastalığa neden olan bir "anormal" genin yerini almak üzere genoma bir "normal" gen yerleştirilir. Tedavi edici geni hastanın hedef hücrelerine ulaştırmak için bir vektör kullanılmalıdır. Şu anda en yaygın vektör, normal insan DNA'sını taşımak için genetiği değiştirilmiş bir virüstür. Virüsler, genlerini patojenik bir şekilde insan hücrelerine kapsüllemek ve iletmek için bir yol geliştirdiler. Bilim adamları, bu yetenekten yararlanmaya ve hastalığa neden olan genleri ortadan kaldırmak ve terapötik genleri eklemek için virüs genomunu manipüle etmeye çalıştılar.

Hastanın karaciğer veya akciğer hücreleri gibi hedef hücreler viral vektör ile enfekte olur. Vektör daha sonra terapötik insan genini içeren genetik materyalini
hedef hücre. Terapötik genden fonksiyonel bir protein ürününün üretilmesi, hedef hücreyi normal bir duruma geri getirir.

Gen Terapi Vektörlerinin Sayısı vardır. Vektörlerden bazıları şunlardır:

RNA genomlarının çift sarmallı DNA kopyalarını oluşturabilen bir virüs sınıfı. Genomunun bu kopyaları, konakçı hücrelerin kromozomlarına entegre edilebilir. İnsan immün yetmezlik virüsü (HIV) bir retrovirüstür.

İnsanlarda solunum, bağırsak ve göz enfeksiyonlarına neden olan çift sarmallı DNA genomuna sahip bir virüs sınıfı. Soğuk algınlığına neden olan virüs bir adenovirüstür.

Adeno İlişkili Virüsler:

Genetik materyallerini kromozom 19 üzerindeki belirli bir bölgeye yerleştirebilen küçük, tek sarmallı DNA virüsleri sınıfı.

Herpes Simpleks Virüsleri:

Belirli bir hücre tipini, nöronları enfekte eden çift sarmallı DNA virüslerinin bir sınıfı olan Herpes simpleks virüs tipi, uçuklara neden olan yaygın bir insan patojenidir.

Bir gene, bazı durumlarda az ya da çok yapay bir taşıyıcı verilir, diğerlerinde hücre zarından geçişi kolaylaştırmak için bir lipit kapsülleme, diğerlerinde genin kaplandığı küçük bir altın boncuk, yine de diğerlerinde deriye vurulabilir. , genin bağlı olduğu bir protein.

Gen Tedavisinin Gereksinimleri:

Gen (örneğin ADA geni) tanımlanır ve klonlanır. Daha sonra hastanın kendi hücrelerine (ex vivo) yerleştirilir, doku kültüründe tedavi edilir ve hastaya geri verilir. Değerli miktarda enzimin üretilmesi için yeterli verimlilikle DNA'ya yerleştirilmeli, kopyalanmalı ve çevrilmelidir.

Retrovirüsler gen vektörü olarak kullanılır. Retrovirüslerin insan hücrelerine genleri sokmak için çeşitli avantajları vardır; zarf proteinleri, virüsün insan hücrelerini enfekte etmesini sağlar. İnsan ADA geninin RNA kopyaları, bir paketleme hücresi kullanılarak retroviral genoma dahil edilebilir.

Paketleme hücreleri, (i) insan ADA geninin bir RNA kopyası ile birlikte taze virüs partiküllerinin bir araya getirilmesi için gerekli olan bir paketleme sinyali (P) ve DNA kopyalarının vücudun DNA'sına yerleştirilmesine yardımcı olmak için her uçta ters çevrilmiş tekrarlar (R) eksprese eder. hedef hücreler,

(ii) retroviral gag, pol ve env genlerinin bir RNA kopyası, ancak paketleme sinyali olmadan, böylece genler taze viral partiküllere dahil edilemez.

Bu İki Genomla Tedavi Edilen Paketleme Hücresi, aşağıdakileri içeren bir Retrovirüs Mahsulünü Üretir:

(i) İnsan hedef hücresini enfekte etmek için gereken zarf proteini,

(ii) İnsan ADA geninin, her iki ucunda R dizileri ile tamamlanmış bir RNA kopyası

(iii) Hedef hücrenin DNA'sına yerleştirilebilecek ADA geninin bir kopyasını yapmak için gereken ters transkriptaz,

(iv) Virüsün yeni konakçısında replike olmasını sağlayacak genlerin (gag, pol, env) hiçbiri. Virüs hedef hücrelere bulaştıktan sonra, bu RNA DNA'ya ters kopyalanır ve konağın kromozomal DNA'sına eklenir.

Ayrıca, gen aktarımı için başka seçenekler de var. En basit yöntem, terapötik DNA'nın hedef hücrelere doğrudan eklenmesidir. Bu yaklaşım, yalnızca belirli dokularla kullanılabildiği ve büyük miktarda DNA gerektirdiği için uygulamasında sınırlıdır.

Gen Tedavisi Araştırmasının Mevcut Durumu:

Gıda ve İLAÇ İdaresi (FDA), henüz satılık herhangi bir insan gen tedavisini onaylamamıştır. Mevcut gen tedavisi deneyseldir ve klinik deneylerde çok başarılı olduğu kanıtlanmamıştır. İlk gen tedavisi klinik denemesinin 1990'da başlamasından bu yana çok az ilerleme kaydedildi.

1999'da 18 yaşındaki Jesse Gelsinger'in ölümüyle gen terapisi büyük bir gerileme yaşadı. Jesse, ornitin transkarboksilaz eksikliği (OTCD) için bir gen terapisi çalışmasına katılıyordu. Tedaviye başladıktan 4 gün sonra çoklu organ yetmezliğinden öldü. Ölümünün, adenovirüse karşı şiddetli bir bağışıklık tepkisi tarafından tetiklendiğine inanılıyor.

Bir başka büyük darbe Ocak 2003'te FDA'nın kan kök hücrelerinde retroviral vektörler kullanan tüm gen tedavisi denemelerini geçici olarak durdurmasıyla geldi. FDA, bir Fransız gen terapisi denemesinde tedavi edilen ikinci bir çocuğun lösemi benzeri bir durum geliştirdiğini öğrendikten sonra bu eylemi gerçekleştirdi. Hem çocuk hem de Ağustos 2002'de benzer bir durum geliştiren bir başkası, “baloncuk bebek sendromu” olarak da bilinen X'e bağlı şiddetli kombine immün yetmezlik hastalığı (X-SCID) için gen tedavisiyle başarılı bir şekilde tedavi edilmişti.

FDA'nın Biyolojik Müdahale Değiştiricileri Danışma Komitesi (BRMAC), yaşamı tehdit eden hastalıkların tedavisine yönelik bir dizi retroviral gen tedavisi denemesinin uygun güvencelerle devam etmesine izin verebilecek olası önlemleri tartışmak üzere Şubat 2003'ün sonunda toplandı. FDA, BRMAC toplantısının tartışmalarına ve tavsiyelerine dayanarak henüz bir karar vermedi.

B.4b. Gen Terapisi ile İlgili Sorunlar:

Gen terapisinin kısa ömürlü doğası—gen terapisinin herhangi bir durum için kalıcı bir tedavi olabilmesi için, hedef hücrelere verilen terapötik DNA'nın işlevsel kalması ve terapötik DNA'yı içeren hücrelerin uzun ömürlü ve kararlı olması gerekir. Terapötik DNA'nın genoma entegre edilmesindeki sorunlar ve birçok hücrenin hızla bölünen doğası, gen terapisinin uzun vadeli faydalar elde etmesini engeller. Hastalar çok sayıda gen terapisinden geçmek zorunda kalacaklar.

İnsan dokularına herhangi bir yabancı cisim girdiğinde, bağışıklık sistemi istilacıya saldırmak üzere tasarlanmıştır. Bağışıklık sistemini gen tedavisinin etkinliğini azaltacak şekilde uyarma riski her zaman potansiyel bir risktir. Ayrıca istilacılara karşı geliştirilmiş bağışıklık tepkisi, hastalarda gen tedavisinin tekrarlanmasını zorlaştırır.

Viral Vektörlerle İlgili Sorunlar:

Çoğu gen terapisi çalışmasında tercih edilen taşıyıcı olan virüsler, hastaya toksisite, immün ve inflamatuar yanıtlar gibi çeşitli potansiyel problemler sunar. Ek olarak, viral vektörün bir kez hastanın içine girdikten sonra hastalığa neden olma yeteneğini geri kazanabileceği korkusu her zaman vardır.

Tek bir gendeki mutasyonlardan kaynaklanan durumlar veya bozukluklar, gen tedavisi için en iyi adaylardır. Ne yazık ki, kalp hastalığı, yüksek tansiyon, Alzheimer hastalığı, artrit ve diyabet gibi en sık görülen rahatsızlıklardan bazıları, birçok gendeki varyasyonların birleşik etkilerinden kaynaklanır. Bunlar gibi çok genli veya çok faktörlü bozuklukların gen terapisi kullanılarak etkili bir şekilde tedavi edilmesi özellikle zor olacaktır.

C. Hayvan Biyoteknolojisi ile İlgili Belirsizlikler:

Yeni teknolojilerde olduğu gibi, hayvan biyoteknolojisi de çeşitli belirsizlikler, güvenlik sorunları ve potansiyel risklerle karşı karşıyadır. Örneğin, transgenik hayvanlar oluşturmak için kullanılan yapılarda gereksiz genlerin kullanılması, aktarılma potansiyeli olan vektörlerin kullanılması veya diğer organizmalara dizilere başka bir şekilde katkıda bulunmak için kullanılması, genetiği değiştirilmiş hayvanların canlılar üzerindeki potansiyel etkileri ile ilgili endişeler dile getirilmiştir. çevre, biyoteknolojinin hayvan refahı üzerindeki etkileri ve hayvan biyoteknolojisinden elde edilen et veya hayvansal ürünler için potansiyel insan sağlığı ve gıda güvenliği endişeleri. Hayvan biyoteknolojisi, hayvansal tarım üretim sistemleri tarafından yaygın olarak kullanılmadan önce, hayvan biyoteknolojisinin faydalarının bu potansiyel risklerden daha ağır basıp basmadığını belirlemek için ek araştırmalara ihtiyaç duyulacaktır.


PCR Tekniği: Adım Adım

7. DNA Merdiveni İki Ayrı İpliğe "Açılır"

DNA polimeraz ve dört nükleotidin tamamının bir karışımı, ekstrakte edilmiş DNA örneğini içeren bir test tüpüne eklenir. Çift sarmallı ebeveyn (kalıp) DNA 95 santigrat dereceye ısıtıldığında, tek tek sarmallar gevşer ve birbirinden ayrılır. Amaç, DNA polimeraz enzimini kullanarak hedef geni içeren her bir zincirin bölümünü kopyalamaktır. DNA'nın her bir ebeveyn zinciri, nükleotidler 5 asal (5') ila 3 asal (3') yönünde bağlanırken, eksik tamamlayıcı zinciri yeniden oluşturma konusunda dikkate değer bir özelliğe sahiptir. Her yeni oluşan tamamlayıcı iplikçik (her bir ebeveyn iplikçik için bir tane) bir "kız iplik" olarak adlandırılır.

Çift sarmallı ebeveyn DNA molekülü (DNA merdiveni) 95 o C'ye ısıtıldığında, iki ayrı sarmal birbirinden ayrılır. DNA polimeraz, tamamlayıcı nükleotitlerin her bir ipliği yeniden oluşturmak için bağlanmasını kolaylaştırır, bu da iki çift sarmallı molekül ile sonuçlanır. P = fosfat, D = deoksiriboz, A = adenin, T = timin, G = guanin ve C = sitozin. Uzatılmış fosfat "kuyruğu", her bir ipliğin 5' pozisyonunu temsil eder.

Çift sarmallı ebeveyn DNA molekülü (DNA merdiveni) 95 o C'ye ısıtıldığında, iki ayrı sarmal birbirinden ayrılır. DNA polimeraz, tamamlayıcı nükleotitlerin her bir ipliği yeniden oluşturmak için bağlanmasını kolaylaştırır, bu da iki çift sarmallı molekül ile sonuçlanır. Pembe bölüm, kopyalanacak gerçek hedef geni temsil eder.

8. Primer DNA Zincirinin Bir Ucuna Bağlanır

DNA polimerazın, DNA'nın her bölümünde belirli bir hedef genin başlangıcını bulması için, primer olarak adlandırılan kısa bir DNA parçası, her bir "ana" DNA zincirine yukarıdan (3' uca doğru) eklenmelidir (tavlanır). her gen. Primer, hedef gen ile örtüşmez, çünkü DNA'nın ana zincirindeki genden hemen önce görünen baz dizisine tamamlayıcıdır. Tamamlayıcı "kız" iplik 5' ila 3' yönünde üretilir. Primerler yaklaşık 20 baz içerir ve PCR tekniği kullanılarak yaygın olarak amplifiye edilen birçok gen için sentezlenmiştir. Biyoteknoloji tedarik şirketlerinden satın alınabilirler. Tek iplikli DNA karışımına, 52-54 o C'ye (126-129 o F) soğutulduktan sonra spesifik bir gen için primer eklenir.

Primerler olarak adlandırılan kısa bölümler (oligonükleotitler) her bir genden yukarı doğru (ana "ana" ipliğin 3' ucuna doğru) bağlanır. Artık DNA polimeraz, genin başlangıcını tanıyabilir ve tamamlayıcı ipliği 5' ila 3' yönünde yeniden oluşturabilir.

Çift sarmallı ebeveyn (şablon) DNA merdiveni fermuarını açtığında ve nükleotidler iki tek ebeveyn zincirinin her birine bağlandığında, çok ilginç bir şey olur. "Öncü iplik" olarak adlandırılan bir kız iplik, nükleotidler 5' ila 3' yönünde bağlanırken sürekli olarak oluşur. Ancak "gecikmeli iplik" olarak adlandırılan diğer yavru iplikte, nükleotidler süreksiz bölümlerde bağlanır. Bu bölümlere, onları keşfeden Japon bilim adamı Reiji Okazaki'nin adını taşıyan Okazaki parçaları denir. Gecikmeli iplik öndeki ipliği tamamlayıcı olduğundan, bunun 3' ucu öndeki ipliğin 5' ucunun karşısındadır ve bunun tersi de geçerlidir. Ana DNA molekülü açılırken bu ipliğin 5' ila 3' yönünde uzayabilmesinin tek yolu, onun bölümler veya parçalar halinde büyümesidir. Bu olağanüstü keşif aşağıdaki resimde gösterilmiştir.

Ebeveyn (kalıp) DNA zincirleri replike olduğunda, yavru zincirler iki farklı şekilde sentezlenir. Önde gelen iplik, tek nükleotidler 5' ila 3' yönünde birer birer bağlandıkça sürekli olarak oluşturulur. Gecikmeli iplik, önceden oluşturulmuş nükleotit bölümleri (Okazaki fragmanları olarak adlandırılır) 5' ila 3' yönünde birleşirken süreksiz olarak oluşturulur.

9. Telomerler: Çoğaltma Sorununu Sona Erdiren Büyük Bir Moleküler Düzeltme

DNA'nın yapısı ve işlevi kesinlikle biyoloji biliminde devrim yaratan en önemli keşiflerden ikisidir. DNA, genetik bilgi için mükemmel bir depo molekülü gibi görünse de ciddi bir replikasyon sorunu vardır. Ökaryotik hücrelerin kromozomları doğrusal DNA'dan oluşur. Hücre bölünmesinin gerçekleşmesi için DNA molekülünün eşlenmesi gerekir. Başka bir deyişle, tek kromozom, iki kromatitten oluşan çift kromozom haline gelmelidir. Sorun şu ki, DNA her kopyalandığında yeni moleküller biraz daha kısalıyor. Bir dizi ardışık bölünmeden sonra, bu bozulma, kromozomların uçlarında ciddi gen kaybıyla sonuçlanabilir. Hem Alexey Olovnikov hem de James Watson, 1970'lerin başında "son çoğaltma sorunu" olarak adlandırılan bu fenomeni bağımsız olarak tanımladılar. Aslında, Olovnikov'un "A Theory of Marginotomy"si, uç replikasyon probleminden kaynaklanan terminal dizilerin kaybının yaşlanmaya yol açacağını öngörmüştür (Olovnikov, 1973). [James Watson ve Francis Crick 1953'te DNA'nın yapısını keşfettiler ve 1962'de Nobel Tıp Ödülü'nü aldılar.]

Yıkıcı son problem replikasyonu problemiyle başa çıkmak için ökaryotik hücreler, telomer adı verilen kromozomların uçlarında koruyucu "başlıklar" geliştirmiştir. Elizabeth Blackburn, Jack Szostak ve Carol Greider, kromozomların telomerler ve telomeraz enzimi tarafından nasıl korunduğunu keşfettikleri için 2009 yılında Nobel Tıp Ödülü'ne layık görüldüler. Ustaca yaptıkları genetik araştırmaları ve titiz biyokimyasal çalışmalarıyla, yalnızca temel bir sorunu çözmekle kalmadılar. biyolojide değil, aynı zamanda yeni bir araştırma alanı açtı ve yaşlanma sürecine ve kansere karşı potansiyel tedavilerin geliştirilmesini başlattı. Burada 60 yıldan daha uzun bir süre önce Barbara McClintock'un mısırdaki telomerleri incelediği belirtilmelidir. 1940'ların başlarında dikkatini, insanlarda önemli tıbbi etkileri olan bir başka dikkate değer genetik fenomen olan mısırdaki yer değiştirebilir elementlerin (transpozonlar) çalışmasına çevirdi. Transpozonlar üzerine yaptığı ömür boyu araştırmaları için 1983'te Nobel Tıp Ödülü'nü aldı.

T elomerler, lineer kromozomların terminal uçlarındaki tekrarlayan DNA zincirleridir (tekrarlayan baz dizileri). Kromozomu bozulmadan ve diğer kromozomlarla uçtan uca füzyondan koruyarak bütünlüğünü korumada önemli bir rol oynarlar. Telomerler, kromozomların uç uçlarındaki kodlamayan DNA'nın esasen koruyucu "uç kapaklarıdır". Telomerler, bağcıkların çözülmesini engelleyen ayakkabı bağlarının uçlarıyla mecazi olarak karşılaştırılmıştır. Bir hücre her bölündüğünde, telomerler az miktarda DNA kaybeder. Sonunda, tüm telomer DNA'sı gittiğinde, hücre artık bölünemez ve ölür. Prokaryotik hücrelerde uç replikasyon sorunu, uçsuz dairesel DNA moleküllerine sahip oldukları için bir sorun değildir.

Bir normal hücre popülasyonunun bölünebildiği sayı, adını keşfeden Leonard Hayflick'ten alan Hayflick limiti olarak adlandırılır. 1961'de Hayflick, bir kültürdeki normal insan fetal hücrelerinin 40 ila 60 kez bölündüğünü gösterdi. Telomerler kritik bir uzunluğa ulaşana kadar hücre bölünmesinin gerçekleştiği artık açıktır. İnsan telomerlerinin tahmini uzunluğu, doğumda 8.000 baz çiftinden, yaşlandıkça 3.000'e ve yaşlı insanlarda 1.500'e kadar düşmektedir. 8.000 baz çiftinden başlayarak, her bir bölünmede 100 ila 200'lük bir kayıp, 40 ila 80 bölümdeki telomerleri tamamen aşındırır.

1. DNA Açıldığında, DNA Polimeraz Ana İpin 3' Ucuna Eklenmelidir.
2. 5' ila 3' Yönünde Nükleotidler (Sentezleme Kızı İpliği) Eklemelidir.
3.DNA Polimerazına Başlamak İçin Bir Yer Vermek İçin Önce Bir RNA Primeri Eklenmelidir.

Kromozom duplikasyonu, çift sarmallı DNA'nın iki sarmal halinde açılmasıyla başlar (ana sarmal #1 ve ana sarmal #2). Bu tamamlayıcı ana iplikler, iki DNA molekülü oluşturmak için şablon görevi görür. Bir RNA primeri, ana iplik #1'in 3' ucuna bağlanır, böylece DNA polimeraza başlamak için bir yer verir. Primer, DNA polimerazın ilk bağlanmasından hemen önce bağlanır. DNA polimeraz, ana iplik #1 boyunca 3' ila 5' yönünde hareket eder ve ana iplik #1 şablonunun tüm uzunluğu boyunca kesintisiz tamamlayıcı bir DNA'nın kızı ipliğini oluşturmak için nükleotidler ekler. Bu tamamlayıcı zincir "öncü zincir" olarak adlandırılır ve 5' ila 3' yönünde sentezlenir. [5' ve 3', nükleotidler adı verilen DNA yapı taşlarındaki deoksiriboz şekerinin spesifik karbon atomlarını ifade eder.] 5' ve 3' yönlerinden bahsedildiğinde, ana iplikten mi yoksa tamamlayıcı yavru iplikten mi bahsettiğinizi belirtmek önemlidir. .

Orijinal ana DNA açılırken, DNA polimeraz 2 numaralı ana ipliğin tepesine 5' konumunda (aşağıdaki şemada sağ üstte) bağlanamaz. 5' konumunda 2. ana ipliğin tepesine bağlanabilse bile, ana iplikten aşağı hareket edemez ve 3' ila 5' yönünde bir yavru iplik sentezleyemez. Bu nedenle, DNA polimeraz ana iplik 2'ye daha da bağlanır ve 5' ila 3' yönünde bir dizi DNA bölümü üretir. Bu bölümler, onları keşfeden Japon bilim adamı Reiji Okazaki'den sonra "Okazaki parçaları" olarak adlandırılmıştır. Bölümler topluca, 2 numaralı ana ipliğin tepesine "gecikmeli iplik" adı verilen bir kız iplik oluşturur. Bu, R. Ohki, T. Tsurimoto ve F. Ishikawa tarafından güzel bir şekilde açıklanmıştır (Molecular and Cellular Biology Cilt 21, 2001). Kısa RNA primerleri, DNA polimeraz için bir başlangıç ​​noktası oluşturmak üzere her DNA bölümünün önüne bağlanmalıdır.

Burada 2 numaralı ana ipliğin 3' ucunda bir problem var. Son RNA primeri bu uca ulaştığında, DNA polimerazın önünde tutabileceği başka bir DNA şablonu kalmaz. Son primer 3' ucuna bağlanır, ancak DNA polimeraz, gecikmeli ipliğin son bölümünü ekleyemez ve primerin eklendiği yerde bir boşluk bırakır. Bu nedenle, her yeni sentezlenmiş gecikmeli ipliğin 5' ucu kısa kesilir. Her replikasyon turunda yaklaşık 100 baz çifti tıraşlanır, böylece telomer kısalır. Aşağıdaki şemada, ana iplik #2 yeni oluşan gecikmeli ipliğin 5' ucunda bir boşluğa sahiptir.

Aşağıdaki animasyonlu gifler, DNA'nın art arda altı bölümde herhangi bir kısaltma olmaksızın replikasyonunu gösterirken, geride kalan iplikteki son replikasyon sorunu ve DNA'nın kademeli olarak kısalmasıyla karşılaştırıldığında.

T elomerler, telomeraz enzimi tarafından restore edilebilir. Bu enzim, germ hücrelerindeki (yumurta ve sperm üreten hücreler) telomerleri uzatır, böylece telomerleri zigotta maksimum uzunluklarına geri getirir. Aynı zamanda, yaşamı sürdürmek için gerekli olan çok sayıda nesil kırmızı kan hücresi üreten kemik iliği kök hücreleri, cilt epiteli ve bağırsağı kaplayan hücreler de dahil olmak üzere, sürekli olarak bölünmesi gereken diğer hücrelerde de bulunur. Telomeraz genellikle normal somatik hücrelerde aktif değildir. Bu enzim, ökaryotik kromozomların telomer bölgesindeki DNA zincirlerinin 3' ucuna omurgalılarda TTAGGG tekrarlayan DNA dizisi tekrarları ekler. Kanser hücrelerinde aktif telomeraz varlığı, telomeraz inhibitörleri ile bazı kanserlerin teşhis ve tedavisinde faydalı olabilir.

Aşağıdaki paragraf Science and Technology'den geliyor (9 Kasım 2007): Köpekbalıklarının tüm hücrelerinde telomeraz var. Telomerleri kısalmıyor ve köpekbalıklarının insanlar gibi genetik olarak programlanmış bir ömrü yok. Aslında, köpekbalıkları yaşamları boyunca büyümeye devam eder. Ömürlerinin sınırı, oksijen alımı için solungaçlarında hava sirkülasyonu sağlamak için hareket etmeye devam etmeleri gerektiği gerçeğidir. Yüz milyonlarca yılda çok az değişmiş olan köpekbalıkları, genetik olarak son derece kararlıdır. Ayrıca köpekbalıkları nadiren kansere yakalanır.

T elomerler ve telomeraz da bitki hücrelerinde bulunur. Bitki telomer biyolojisi T.D. McKnight ve D.E. Bitki Hücresi Vol. 16: 794-803 (2004). Çoğu çiçekli bitkide telomerler, TTTAGGG tekrarlayan DNA bazlarından oluşur. Hayvanların somatik hücreleri gibi, bitkisel dokuda çok az aktif telomeraz vardır veya hiç yoktur, ancak muhtemelen gametlerin ve embriyoların maksimum uzunluklarına geri yüklenen telomerleri devralmasını sağlamak için çiçeklenme sırasında yeniden etkinleştirilir. Hayvanlardaki kanser hücreleri gibi, sınırsız çoğalma kapasitesine sahip hücreler için beklenebileceği gibi, bitki doku kültürlerinin hücrelerinde telomeraz tamamen işlevseldir. Yaklaşık 27.000 tür (tüm anjiyospermlerin yaklaşık yüzde 10'u) içeren monokot düzen Asparagales, memeli telomerlerinde bulunan aynı dizilim olan TTAGGG'nin 6-baz tekrarına sahiptir. Bu düzen, orkide, süsen, nergis zambağı, agav, soğan ve kuşkonmaz gibi birçok tanıdık bitki ailesini içerir. Bitkiler ve memeliler tamamen ayrı yollar boyunca çok hücreli organizmalara evrimleştiklerinden, bu paralel evrimin (homoplazi) bir başka örneği gibi görünmektedir.

T elomerler DNA'nın kısalmasını engellemezler, sadece aşınma sürecini ertelerler. Telomer kısaltma mekanizması normalde hücreleri sabit sayıda bölünmeyle sınırlar. Sonunda, tüm telomer bittiğinde, hücre artık bölünemez ve böylece hücre döngüsü sona erer. Çoğu kanser, telomerlerin aşınması nedeniyle programlanmış hücresel ölümden kaçan "ölümsüz" hücrelerin sonucudur. Malign hücrelerin kromozomları genellikle telomerlerini kaybetmezler, bu da kontrolsüz hücre bölünmesine neden olur. Hayvan çalışmaları, telomer uzunluğunun hücresel düzeyde yaşlanma süreci ve hayvanların yaşam süresi ile ilişkili olabileceğini düşündürmektedir. Düzenli egzersiz ve stres azaltmanın telomer erozyonunu en aza indirmeye yardımcı olabileceğini öne süren çalışmalar bile var. Aslında, American Heart Association dergisi Circulation'ın 3 Mayıs 2005 sayısında yayınlanan bir araştırma, kilo alımının ve artan insülin direncinin zamanla daha fazla telomer kısalması ile ilişkili olduğunu buldu.

Telomerlerin kökeni hakkında spekülasyon yapmak ilginç. Ana iplik #2'nin 5' ucuna bağlanan ve 3' ila 5' yönünde nükleotidler ekleyen başka bir DNA polimeraz versiyonu mevcut olsaydı, teorik olarak, ana iplik şablonunun sonuna kadar uçsuz bir şekilde sürekli bir iplik sentezlenebilirdi. replikasyon sorunu Bu teorik versiyon hiçbir zaman bulunamadı ve bu nedenle telomerler, DNA'nın kademeli olarak kısalmasını ve genlerin aşınmasını önlemek için gereklidir. Neden 5' ila 3' yönünde yavru iplikleri sentezleyen tek bir DNA polimeraz formu vardır? Bu, canlı sistemlerin neden sadece L-formu (solak) amino asitlere ve D-formu (sağ-elli) şekerlere sahip olduğunu sormak gibidir. Telomerlerin evrimi, orijinal DNA'da bulunan bir replikasyon problemini mi çözdü, yoksa ilk ökaryotik hücrelerin orijinal DNA'sında telomerler mi mevcuttu?

Son Problem Çoğaltma ve Telomerlerin Evrimsel Önemi

Son replikasyon sorunuyla ilgili bu bölümü ilk yazdığımda, bölünme sayısını sınırlayarak hücrenin ömrünü tam anlamıyla kısaltan DNA'daki bir kusur olduğu sonucuna vardım. Telomerler, belirli sayıda ardışık erozyonla yaşamı uzatan mitotik zaman saatleri olarak hizmet eder. Ancak, bu hikayenin, organizmaların yaşam süresini sınırlamanın gerçekten faydalı olabileceği başka bir yanı daha var. Hızla değişen bir ortamda bir türün hayatta kalması, DNA mutasyonları yoluyla genetik değişkenliğe ve bu genleri gelecek nesillere aktarma yeteneğine bağlıdır. Aşırı uzun nesil süreleri olan bir tür, adaptif mutasyonlar çevresel değişikliklere ayak uyduramadığı için rekabet edemeyebilir, ancak daha uzun nesiller, doğurganlık (dişi başına yavru sayısı) sabit kaldığı sürece popülasyon büyümesini yavaşlatabilir. Bir bireye ölümsüzlük iyi görünebilir, ancak bu tür için iyi olmayabilir. Bu mantık, Uzay Yolu 2: "Khan'ın Gazabı"nda Spock'ın "Çoğunluğun iyiliği, azınlığın ya da bir kişinin iyiliğinden daha ağır basar" dediğinde bahsedilmiştir. Aslında bu mantıktan iki bin yıl önce Yuhanna 11:49-50'de bahsedilmektedir. Elbette, son replikasyon kaybının yararına bir uyarı, tüm hücrelerinde aktif telomeraz ve yaşla birlikte önemli ölçüde azalmayan telomer uzunluklarına sahip olan köpekbalığıdır. Köpekbalıkları (Chondrichthyes sınıfı) çok başarılı bir gruptur ve 200 milyon yıldan fazla bir süredir buralardalar. Aslında, bazı türlerin yaş tahminleri 100 yıl veya daha fazladır. Kuşkusuz, okyanustaki çevresel değişiklikler karadaki kadar yaygın olmamıştır.

10. Tek DNA Dizileri, Çift Dizilere Çoğalır

DNA karışımı 72 o C'ye (162 o F) ısıtılır ve DNA polimeraz her bir zincire tavlanan primeri tanır ve genin sonuna kadar tamamlayıcı zinciri sentezlemeye devam eder. Nükleotitler, zaten karışımda bulunan tüm adeninlerden, timinlerden, sitozinlerden ve guaninlerden gen boyunca bağlanır. Şimdi karışım, genin iki özdeş kopyasını içerir (iki tam DNA merdiveni). Thermus aquaticus bakterisinden elde edilen DNA polimeraz (TAQ polimeraz olarak adlandırılır), yüksek sıcaklıklara karşı bağışık olduğu için reaksiyon için kullanılır. 40 o C'nin (104 o F) üzerindeki sıcaklıklarda yok edilen çoğu protein enziminin aksine, Thermus aquaticus'tan gelen DNA polimeraz, reaksiyonun 72 o C'sinde hayatta kalabilir. Aslında bu bakteri normalde kaplıcalarda yaşar ve suyun kaynama noktasına yaklaşan sıcaklıklarda hayatta kalabilir.

Yellowstone Milli Parkı'ndaki Kaynar Kaplıcaların Bakterileri

Yellowstone Milli Parkı'ndaki petrol kaplı kaplıcalar, termofilik siyanobakteri, öbakteri ve arkebakteri kolonileri tarafından renklendirilir. Turuncu renkli siyanobakteriler genellikle 73 o C'nin (163 o F) altına soğuyan suda bulunur. Bu fotosentetik bakterilerdeki yeşil klorofiller, turuncu karotenoid pigmentler tarafından maskelenmiştir. Tuz göllerinin parlak kırmızı halobakterileri gibi karotenoidler de hassas hücreleri özellikle yaz aylarında yoğun güneş ışınlarından korur. Havuzların daha sıcak, beyazımsı alanları, fotosentetik olmayan öbakterilerin lifli kütlelerini içerir. Thermus aquaticus, 80 o C'ye (176 o F) kadar fotosentetik bakteriler için çok yüksek sıcaklıklarda hayatta kalır. Thermus aquaticus heterotrofiktir ve suda çok az miktarda organik madde ile hayatta kalır. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) kullanılarak DNA'nın amplifikasyonunda kullanılan TAQ polimeraz, orijinal olarak Yellowstone Ulusal Parkı'ndaki bir kaplıcada toplanan bir T. aquaticus kolonisinden izole edilmiştir.

Yellowstone Milli Parkı'nda kaynayan bir kaplıca. Turuncu-kırmızı renk, yoğun fotosentetik siyanobakteri kolonilerinden kaynaklanır.

Bir rkebakteri, Yellowstone Ulusal Parkı'ndaki kaynayan suda 92 o C (198 o F) sıcaklıkta gelişir. Bu bakteriler ayrıca, 115 o C'yi (239 o F) aşan sıcaklıklarda okyanusun dibindeki buhar deliklerinin yakınında gelişirler. Dünyanın dört bir yanından bilim adamları, Yellowstone Ulusal Parkı'ndaki şaşırtıcı bakteri florasını inceliyorlar. Burası, bu organizmaları doğal korunan habitatlarında incelemek için dünyadaki en iyi yerlerden biridir. Dünyanın diğer bölgelerinde, jeotermal enerji üretimi için benzer kaplıcalar tahrip edildi.

Yellowstone Milli Parkı'nda kaynayan kaplıcalar. Turuncu-kırmızı renk, gelişen fotosentetik siyanobakteri kolonilerinden kaynaklanır. Daha sıcak suyun beyazımsı bölgelerinde, fotosentetik olmayan öbakterilerin lifli kütleleri meydana gelir.

Yellowstone Milli Parkı'ndaki pH'ı 4.0'ın altında olan bir cid kaplıcası, ökaryotik alg Cyanidium caldarum'u destekler. Bu olağanüstü fotosentetik alg, sıfır pH'da bile hayatta kalabilir! Bazı asidofilik kaplıca bakterileri, ATP sentezi için kükürt ve demirin oksidasyonunu kullanır. Alkali kaplıcalar, enerji kaynağı olarak hidrojen sülfür kullanan bakteri kolonilerini destekler.

Bildiğimiz gibi, ilk olarak üç milyar yıldan daha uzun bir süre önce yüksek sıcaklıkta kaynayan su ortamında ortaya çıkmış olabilir. Yellowstone Milli Parkı'nın kaplıcalarındaki termofilik bakteriler, dünyadaki ilk yaşamın kalıntı popülasyonları olabilir. Aslında bu termofilik bakteriler, insanlar dahil tüm diğer yaşam formlarının ataları olabilir!

11. İki DNA Merdiveni Dört Ayrı İpliğe "Çözünür"

Şimdi karışım tekrar 95 o C'ye ısıtılır ve hedef genleri içeren çift sarmallı DNA molekülleri tek sarmallara ayrılır. Ama şimdi iki çift sarmallı genden dört tek sarmal var. Karışım bir kez daha 52-54 o C'ye soğutulur ve primerler, her genden önceki başlangıç ​​konumlarında ipliklere tavlanır. DNA polimeraz bir kez daha her bir tek ipliğin dört tam çift zincirli gen halinde yeniden oluşturulmasını katalize eder. PCR, polimeraz zincir reaksiyonu olarak adlandırılır, çünkü reaksiyon, genlerin kopya kopyaları katlanarak üretildiğinden, döngüler halinde tekrar tekrar meydana gelir. Sadece 40 döngüden sonra orijinal genin 1.0995116 X 10 12 veya bir trilyondan fazla kopyası olacaktır!

İki çift sarmallı DNA molekülü (DNA merdivenleri) dört zincire ayrılır. DNA polimeraz, her bir merdiven için tamamlayıcı zinciri yeniden oluşturacak ve dört çift sarmallı DNA molekülü ile sonuçlanacaktır. Not: Bu çizim, tekrarlayan bölünmeler sırasında DNA'nın kısaldığı son replikasyon problemini göstermez.

12. İnsanlar Tarafından Giyilen İlk Giysiyi Tarihlendirmek İçin Bit DNA'sının Kullanılması

DNA dizilimi için en yeni kullanımlardan biri, insanların ilk kez ne zaman giysi giymeye başladığının belirlenmesidir. Almanya, Leipzig'deki Max Planck Evrimsel Antropoloji Enstitüsü'ndeki Mark Stoneking ve meslektaşlarına göre, yaklaşık 70.000 yıl önce kıyafet giymeye başladık. Bu tarih, insan emen bitlerin genlerine dayanmaktadır. Vücut bitinin insan baş bitinden evrimleştiği yaklaşık zamanla ilişkilidir ve vücut bitinin habitatının (giysisinin) yaygınlaştığı zamana tekabül eder. Bu aynı zamanda Homo sapiens sapiens'in Afrika'dan Avrupa'nın daha serin bölgelerine taşınmaya başladığı zamandır.


insan kafası biti
Emici bitler kanatsız, parazitik böcek takımı Anoplura'ya aittir. İnsan emici bitleri arasında vücut biti, yengeç biti ve baş biti (Pediculus humanus) bulunur. Anopluranlar, cildi delmek ve kanı çekmek için bir dizi uzun hipodermik benzeri stile kullanır. Kan yuttuktan sonra vücutları şişer ve karınlarında koyu renkli bir kan pıhtısı görülür. İnsan emici bitlerinin iki türü vardır, baş biti (P. humanus capitis) ve vücut biti (P. humanus humanus). Baş biti kafa derisinin saçını istila eder ve vücut biti vücut yüzeyine yakın giysilerde yaşar. İnsan bitleri "cooties" olarak da bilinir ve tüylere yapışan yumurtalarına "sirke" adı verilir. İnsan biti lokal kaşıntıya neden olur, ancak rahatsızlık, Rickettsia prowazeki adı verilen bulaştırabilecekleri bakterinin sefaleti ile karşılaştırıldığında önemsizdir. Bu küçük bakteri, ortaçağ Avrupa'sında popülasyonları harap eden ciddi bir hastalık olan "Salgın Tifüs"e neden olur.

S toneking ve meslektaşları Ralf Kittler ve Manfred Kayser, baş ve vücut bitlerinden mitokondriyal DNA dizilerini karşılaştırdılar. İki bit formu arasındaki dizi farkı ne kadar büyük olursa, evrimsel bölünmeleri de o kadar eski olur. Afrika'dan gelen insan bitleri, dünyanın diğer bölgelerindeki bitlerden genetik olarak daha çeşitlidir ve bu, türlerin Afrika'dan geldiğini gösterir. Baş bitleri vücut bitlerinden daha çeşitlidir ve bu da onların daha yaşlı grup olduklarını gösterir. Stoneking'in ekibi, vücut bitlerinin mitokondriyal DNA'sını şempanze bitleriyle karşılaştırarak, vücut bitlerinin kökenini yaklaşık 70.000 yıl öncesine kadar tahmin edebildi. Bu tarih, modern insanların Afrika'da evrimleştiğine ve yaklaşık 100.000 yıl önce kuzeye göç ettiğine dair artan kanıtlarla iyi bir şekilde ilişkilidir.

S tonlama ayrıca tipik olarak kasık kıllarında yaşayan insan yengeç bitlerini (Pthirus pubus) inceliyor. İnsan kasık biti, goril biti ile kafa bitinden daha yakından ilişkilidir. Bu emici bit vücutta sadece kıllı yerlerde yaşadığından, insanların ağır vücut kıllarını ne zaman kaybettiğine biraz ışık tutabilir. Yengeç bitleri genellikle insandan insana cinsel ilişki yoluyla bulaşır, ancak istila edilmiş çamaşırlardan, giysilerden ve diğer kaynaklardan da bulaşabilirler.


GİRİŞ

Polisiklik aromatik moleküllerin çift sarmallı DNA'ya (1, 2) girdiği bilinmektedir. Bu tür konak-misafir etkileşimlerinin teorik tedavisinin yanı sıra, ekzojen moleküller tarafından DNA interkalasyonunun sonuçları, tıbbi kimyada büyük ilgi çekmiştir, çünkü böyle bir kompleks oluşum DNA yapısında önemli bir modifikasyona yol açar ve engellenmiş veya baskılanmış bir sonuçla sonuçlanabilir. nükleik asidin fizyolojik süreçlerdeki işlevi (3-10). Biyolojik sistem üzerinde böyle bir etki, DNA hedefleyen ilaçlar için temel bir gereklilik olduğundan, küçük moleküllerin DNA'ya eklenmesi, DNA replikasyonunun baskılanmasının ve gen transkripsiyonunun tümör hücrelerini veya enfekte dokuyu yok etmek için kullanıldığı terapötik yaklaşımlarda uygulanabilir. . Sonuç olarak, oldukça seçici ve verimli interkalatörler elde etmek için büyük ve küçük moleküllerin DNA ile birleşme sürecinin farklı yönleri hakkında daha fazla bilgi edinmek için birçok çalışma yapılmıştır (11 ).

Katyonik organik boyalar genellikle klasik interkalatörler olarak kabul edilir. Temsili örnekler, proflavin (1) veya akridin portakalı (12) gibi akridin türevleri, metilen mavisi (13) gibi azin boyaları, etidyum bromür (14) gibi fenantridinyum tuzları veya tiyazol portakalı gibi siyanin boyalarıdır (topakları aynı zamanda küçük oluğa bağlayın) (15-17). Bu bileşiklerin DNA ile birleşmesi genellikle onların absorpsiyon ve emisyon özelliklerini etkiler, böylece DNA ile etkileşimleri spektrofotometrik ve spektroflorometrik titrasyonlarla kalitatif ve kantitatif olarak değerlendirilebilir (18). Bu basit ve basit spektroskopik yöntemler özellikle avantajlıdır çünkü organik boyalar, DNA bazlarının (λ) absorpsiyonuna müdahale etmeyen dalga boylarında absorbe eder ve yayar.maksimum= 260 nm). Bu nedenle, spektrofotometrik ve spektroflorometrik titrasyonlar genellikle bir boyanın DNA ile ilişkisini gösterir. Ayrıca, elde edilen bağlanma izotermleri, bağlanma sabitlerini ve bağlanma yeri boyutunu tahmin etmek için kullanılabilir. yani işgal edilen bağlama sitelerinin sayısı. Ayrıca, dairesel veya doğrusal polarize ışığın absorpsiyonu, boya molekülünün DNA'ya göre oryantasyonu hakkında daha fazla bilgi edinmek ve bağlanma modunu belirlemek için dairesel dikroizm (CD) ve doğrusal dikroizm (LD) spektroskopisinde kullanılabilir (19). .Kararlı durum floresan polarizasyon ölçümleri ve DNA bazlarından bağlı boyaya floresan enerji transferi, bağlanma modunu aydınlatmak için ek güvenilir kriterler olarak kullanılmıştır (20). Spektroskopik yöntemlere ek olarak, bağlanma modunu değerlendirmek için viskozite, sedimantasyon katsayısı veya DNA erime sıcaklığı gibi hidrodinamik ve termodinamik kriterler kullanılabilir (20).

Katyon ve fosfat omurgası arasındaki çekici iyonik etkileşimler nedeniyle bir pozitif yükün bir molekülün DNA'ya bağlanma eğilimini arttırdığı yaygın olarak tespit edilmiştir (21). Çoğu katyonik boyada, bu pozitif yük, bir ekzosiklik amonyum işlevselliği veya bir endosiklik piridinyum parçası tarafından oluşturulur. Bu işlevsellikler genellikle alkilasyon veya protonasyon ile kuaternize edilir. Ancak ikinci durumda bu, pH'ın DNA bağlama özellikleri üzerinde önemli bir etkisine yol açar. Buna karşılık, endosiklik kuaterner içeren katyonik boyalar köprübaşı nitrojen atomu oldukça nadirdir ve bu bileşik sınıfı için az sayıda sistematik çalışma mevcuttur. Bu makalede, kuaterner köprü başlı nitrojen atomuna sahip boyalar için temsili örnekler olarak kinolizinyum (Şema 1) türevlerinin (22) DNA bağlama özelliklerine ilişkin çalışmaları özetleyeceğiz ve tavlanmış kinolizinyum türevlerinin yararlı bir platform olarak hizmet edebileceğini göstereceğiz. ara boyaların tasarımı için.


MALZEMELER VE YÖNTEMLER

Malzemeler

Nükleaz P1 (dan Penicillium sitrinum ) Calbiochem, EMB Biosciences, Inc.'den (San Diego, CA) satın alındı. Dana timusu (ct)-DNA, yılan zehiri fosfodiesterazı ve buzağı dalak fosfodiesterazı Sigma Chemical Co.'dan (St Louis, MO) elde edildi. Alkalin fosfataz, Roche Diagnostics Corporation'dan (Indianapolis, IN) satın alındı. 2'-Deoksiadenozin-5'-trifosfat-1,3,7,9- 15 N 4 -(4-amino-15N) (dATP-15N 5 ) ve 2'-deoksiguanozin-5'-trifosfat-1,3,7,9-15 N 4 -(2-amino-15N) (dGTP-15N 5 ) Medical Isotopes, Inc.'den (Pelham, NH) alındı. (5′ S )-cdA, Berry & Associates, Inc.'den (Ann Arbor, MI) elde edildi. Asetonitril (HPLC derecesi) Burdick ve Jackson'dandı (Muskegon, MI). Biomax5 ultra filtrasyon membranları (5 kDa moleküler kütle kesmesi) Millipore'dan (Bedford, MA) satın alındı. LC/MS analizleri için su (HPLC dereceli), J.T. Fırıncı (Phillipsburg, NJ). Diğer tüm uygulamalar için Milli-Q sistemi (Millipore) ile saflaştırılmış su kullanıldı. 2′-Deoksiadenilil(3′→5′)-(5′ S )-8,5'-siklo-2'-deoksiadenozin 3'-monofosfat [d(AcA)-3'-p], 2'-deoksisitidilil(3'→5')-(5' S )-8,5'-siklo-2'-deoksiadenozin 3'-monofosfat [d(CcA)-3'-p], 2'-deoksiguanilil(3'→5')-(5' S )-8,5'-siklo-2'-deoksiadenozin 3'-monofosfat [d(GcA)-3'-p] ve 2'-deoksitimidilil(3'→5')-(5' S )-8,5'-siklo-2'-deoksiadenozin 3'-monofosfat [d(TcA)-3'-p] ve (5' içeren oligodeoksinükleotidler) S )-cdA ve uçsuz fosfat grupları başka bir yerde tarif edildiği gibi sentezlendi (10, 20).

DNA ışınlaması

Sulu tamponlu bir DNA solüsyonu (10 mM fosfat tamponu, pH 7.4, 0.3 mg/ml) N ile doyuruldu. 2 O ve 60 Co gama kaynağında 2 Gy dozunda (doz hızı 24 Gy/dk) gama ışınları ile ışınlanmıştır. Daha sonra, ışınlanmış ve ışınlanmamış DNA çözeltileri, 18 saat boyunca suya karşı diyaliz edildi. Diyaliz sırasında diyaliz tüplerinin dışındaki su üç kez değiştirildi. 50 ug DNA'nın alikuotları, vakum altında bir SpeedVac içinde kurutuldu.

Domuz karaciğerinden DNA izolasyonu

Dondurulmuş domuz karaciğeri, Pel-Freeze, Inc.'den (Rogers, AK) elde edildi. İki DNA izolasyon yöntemi kullanıldı. İlk yöntem (fenol-kloroform yöntemi) esasen daha önce tarif edildiği gibiydi (21). Kısaca, dokular 10 hacim homojenleştirme tamponu (%1 SDS + 1 mM EDTA) içinde homojenleştirildi, ardından 500 ug/ml Proteinaz K eklendi ve 30 dakika 37°C'de inkübe edildi. Homojenatlar daha sonra fenol, fenol-Sevag (24:1 oranında kloroform/izoamil alkol) ve ardından Sevag ile özümlendi. DNA, 1 hacim ile çöktürüldü. soğuk etanol ile karıştırıldı ve 0.01 x SSC (1.5 mM NaCl, 0.15 mM sodyum sitrat, pH 8.0) içinde çözüldü. DNA, 37°C'de 30 dakika boyunca RNase T1 (50 U/ml) ve RNases A (50 ug/ml) ile işlendi, ardından eşit hacimlerde Sevag ile özü çıkarıldı. DNA, soğuk etanol kullanılarak sulu katmandan çökeltildi ve %70 etanol ile yıkandı. DNA daha sonra 0.01 x SSC içinde -1 mg/ml'de çözüldü. Homojenleştirmeden önce homojenleştirme tamponuna 1.25 mM desferoksimin (Sigma) eklenmesinin etkisini de test ettik.

İkinci yöntem, daha önce açıklandığı gibi yüksek tuzlu bir özütleme yöntemiydi (22, 23). Dondurulmuş doku (1 g), 8 ml Lysis solüsyonu (0.5 M Tris, pH 8.0, 20 mM EDTA, pH 8.0, 10 mM NaCl, %1 SDS) içinde homojenleştirildi. Karışıma proteinaz K (0.5 mg/ml) ilave edildikten sonra gece boyunca 37°C'de inkübe edildi. Ertesi gün karışıma 4 ml doymuş NaCl çözeltisi ilave edildi ve 1 dk vorteksle karıştırıldıktan sonra 56°C'de 15 dk inkübe edildi. Karışım, 16 000 ile 30 dakika santrifüj edildi. G ve süpernatant toplandı. Başka bir santrifüjlemeden sonra, süpernatandaki DNA, 1 hacim kullanılarak çökeltildi. soğuk etanol ile yıkandı, %70 etanol ile yıkandı ve 0.01 x SSC içinde çözüldü. DNA daha sonra RNazlarla işlendi, Sevag ile özütlendi, çöktürüldü ve yukarıda tarif edildiği gibi çözündürüldü.

Dinükleotitlerin, oligodeoksinükleotitlerin ve DNA'nın enzimik hidrolizi

Enzimik hidroliz için, 2 pmol (5′ S )-cdA- 15 N 5 100 pmol dinükleotit ve oligodeoksinükleotitlere dahili bir standart olarak eklenmiştir. miktarları (5′ S )-cdA- 15 N 5 50 μg ışınlanmamış ve ışınlanmamış ct-DNA örneklerine eklenen sırasıyla 0.2 ve 1 pmol idi. Dahili standardın eklenmesinden sonra, dinükleotitler, oligodeoksinükleotitler ve DNA örnekleri bir SpeedVac içinde vakum altında kurutuldu ve daha sonra 45 mM içeren 2.5 ul 1 M sodyum asetat ile takviye edilmiş 50 ul 10 mM Tris-HCl çözeltisi (pH 7.5) içinde çözüldü. çinko 2 (nihai pH 6.0). Nükleaz P1 (5 U), yılan zehiri fosfodiesteraz (0.004 U) ve alkalin fosfataz (32 U) alikotları eklendi ve numuneler 6, 24 veya 48 saat 37°C'de inkübe edildi. Bazı durumlarda dalak fosfodiesterazı (0,004 U) da kullanılmıştır. Dinükleotitlerin 3′-fosfat grupları, dinükleozid monofosfatlar d(AcA), d(CcA), d(GcA) ve d(TcA) elde etmek için alkalin fosfataz ile 6 saat boyunca hidroliz yoluyla çıkarıldı. Hidrolizden sonra numuneler, 6000'de santrifüjleme ile moleküler kütle kesmesi 5 kDa olan ultrafiltrasyon membranları kullanılarak süzüldü. G 30 dk.

Daha önce bildirilen 32 P-son etiketleme çalışmasında kullanılan enzimik hidroliz koşullarının (20 ) aynı zamanda salınıp bırakmayacağını belirlemek için (5′ S )-cdA, 100 pmol dinükleotit veya oligodeoksidinükleotit, 30 mM sodyum süksinat (pH 6), 10 mM CaCl içeren 10 ul'lik bir çözelti içinde inkübe edildi. 2 , 500 mU mikrokokal nükleaz ve 10 mU dalak fosfodiesteraz (Worthington Biochemicals, Vineland, NJ). Sindirim 37°C'de 3.5 saat devam etti. Daha sonra 225 mM sodyum asetat (pH 5.0), 0.55 mM ZnCl içeren 4 µl solüsyon 2 ve 5.6 µg nükleaz P1 eklenmiş ve 37°C'de 45 dakika inkübasyona devam edilmiştir. Reaksiyon, 2.6 ul 0.75 M CHES [2-(sikloheksilamino)etansülfonik asit] tamponu (pH 9.7) eklenerek nötralize edildi ve numuneler kuru buz üzerinde donduruldu. Numuneler daha sonra eritildi ve yukarıda tarif edildiği gibi alkalin fosfataz ile işlendi.

LC/MS ile analiz

İzotop seyreltme tekniği ve seçilen iyon izleme (SIM) kullanılarak API-ES işlemi ile LC/MS ile analiz, daha önce tarif edildiği gibi yapıldı (17). Bir Zorbax Eclipse XDB C18-ters faz kolonu (15 cm x 2.1 mm i.d., 5 um partikül boyutu) (Agilent Technologies, Rockville, MD) kullanıldı. Kolon başlığına aynı sabit faz (1 cm x 2.1 mm i.d.) ile paketlenmiş bir koruma kolonu takıldı. A solventi, su ve asetonitrilin (98:2, v/v) bir karışımıydı ve solvent B, %100 asetonitril idi. Dakikada çözücü B'nin %0.5'lik bir gradyanı kullanıldı. Akış hızı 0.2 ml/dakika idi. Kolon sıcaklığı 30°C'de tutuldu. İzotopik olarak etiketlenmiş dahili standart (5′ S )-8,5'-siklo-2'-deoksiadenozin-1,3,7,9- 15 N 4 -(4-amino- 15 N) [(5′S)-cdA- 15 N 5 ] dATP-15 N kullanılarak hazırlandı 5 daha önce açıklandığı gibi (18). Filtrelenmiş enzimik hidrolizatların alikuotları (20 ul) başka bir işleme tabi tutulmadan LC sütununa enjekte edildi. Gerektiğinde, atıklar (5′ absorbansının izlenmesi için bir UV spektrofotometresinden geçirildi. S )-cdA ve dinükleosit monofosfatlar, kütle spektrometresinin iyon odasına yerleştirilmeden önce. 8-hidroksi-2'-deoksiguanozin (8-OH-dG) ve 8-hidroksi-2'-deoksiadenozin (8-OH-dA) tanımlanması ve miktar tayini başka bir yerde tarif edildiği gibi yapıldı (24 , 25). İzotopik olarak etiketlenmiş dahili standartlar 8-OH-dG-15 N 5 ve 8-OH-dA-15 N 5 dGTP-15 N'nin gama ışınlı çözeltilerinden izole edildi 5 ve dATP-15 N 5 , sırasıyla, yarı-preparatif LC kullanarak ve (5′ izolasyonu için daha önce tarif edilenle aynı prosedür) S )-cdG- 15 N 5 ve (5′ S )-cdA- 15 N 5 ( 18 ).


Bağlantılar

Kirlilik Kontrolü ve Kaynak Yeniden Kullanımı Devlet Anahtar Laboratuvarı, Çevre Bilimi ve Mühendisliği Koleji, Tongji Üniversitesi, Şanghay, 200092, Halkla İlişkiler, Çin

Xian Zhang, Ling Chen ve Hong-Wen Gao

Yangtze Nehri Su Çevresi Ana Laboratuvarı, Eğitim Bakanlığı, Çevre Bilimi ve Mühendisliği Yüksekokulu Tongji Üniversitesi, Şanghay, Halkla İlişkiler, Çin, 200092

Çevre Mühendisliği Koleji, NanJing Ormancılık Üniversitesi, Nanjing, 210037, Halkla İlişkiler, Çin


Videoyu izle: Dünyanın ilk TASARLANMIŞ BEBEKLERİ doğdu! (Mayıs Ayı 2022).