Bilgi

Fajdaki DNA'nın boyutu

Fajdaki DNA'nın boyutu



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

DNA'nın (rekombinasyondan sonra) bakteriyofaj lambda içinde yalnızca 40000 ila 53000 bp uzunluğundaysa paketlendiğini okudum. Bu kısıtlama, rekombinant DNA'nın paketlenmesini sağlamak için kullanılabilir.

Daha kısa DNA'nın neden paketlenemediğini anlamıyorum.

Kaynak : Lehninger Biyokimya Prensipleri


lambda için:

İkisi arasındaki mesafe ise çünkü siteler ~37 kb'den azsa, ortaya çıkan faj partikülü kararsız olacaktır. DNA kapsidin içindeyken kapside baskı uygular. Aynı şekilde kapsid de DNA'ya içe doğru bir kuvvet uygular. Kapsidin içinde yeterli DNA yoksa, kapsidin içe doğru kuvvetinden patlayacaktır. İki cos alanı arasındaki mesafe çok uzaksa (~52 kb), ikinci cos'a ulaşılmadan önce kapsid doldurulacaktır. Kuyruk eklenemez çünkü kapsidden sarkan DNA yoldadır ve bulaşıcı faj partikülü üretilmez.

http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/03-Bacteriophage.pdf

Buna karşılık M13 gibi ipliksi fajların üst boyut sınırı yoktur, ancak daha fazla DNA ile uzadıkları için fiziksel olarak kırılgan hale gelirler.


Sentetik biyoloji ve genom mühendisliği yoluyla faj tedavisini geliştirmek

Sentetik biyoloji, verimli faj genom mühendisliği sağlar.

Ayarlanabilir konak aralığına ve antimikrobiyal yük dağıtımına sahip fajlar, etkinliği artırır.

Faj tasarım ilkeleri, gelecekte hesaplama yaklaşımları tarafından yönlendirilebilir.

Bakteriyofajların antimikrobiyal ve terapötik etkinliği, çoğunlukla faj direncinin hızla ortaya çıkması ve çoğu faj izolatının çok çeşitli klinik suşları bağlayıp enfekte edememesi nedeniyle şu anda sınırlıdır. Burada, genetik mühendisliğindeki son gelişmelerle faj tedavisinin nasıl geliştirilebileceğini tartışıyoruz. İlk olarak, reseptör bağlayıcı proteinlerin ve bunların ilgili yapısal alanlarının, faj özgüllüğünü yeniden yönlendirmek ve direnci önlemek için nasıl tasarlandığını özetliyoruz. Ardından, karmaşık mikrobiyomlar içinde tanımlanmış hücreleri hedeflemek için diziye özgü nükleazlar gibi antimikrobiyal "yük" proteinleri sağlayan prokaryotik gen terapisi vektörleri olarak fajların nasıl yeniden programlandığını özetleyeceğiz. Son olarak, gelecekte geliştirilmiş sentetik faj tasarımına rehberlik edebilecek büyük veri ve yeni yapay zeka odaklı yaklaşımları tanımlıyoruz.


Fajdaki DNA'nın Boyutu - Biyoloji

Bakteriyofajlar (bakterileri enfekte eden virüsler), bakteri genetiği ve moleküler biyolojide önemli bir rol oynamış ve oynamaya devam eden büyüleyici organizmalardır. Faj, örneğin patojenik olmayan bir suşu bir patojene dönüştürmek gibi ana fenotipleri konakçılarına verebilir ve her türlü ortamda bakteri popülasyonlarının düzenlenmesinde önemli bir rol oynarlar. Faj-bakteri ilişkisi büyük ölçüde değişir: basit yırtıcı-av modelinden, her ikisinin de hayatta kalmasını ve evrimsel başarısını destekleyen karmaşık, neredeyse simbiyotik bir ilişkiye. Fermantasyon endüstrisinde kullanılan bakterilerin enfeksiyonu çok sorunlu olabilir ve mali kayıplara neden olabilirken, diğer senariolarda bakterilerin faj enfeksiyonu endüstriyel ve/veya tıbbi uygulamalar için kullanılabilir. Aslında potansiyel terapötik ajanlar olarak faj ve faj gen ürünlerine olan ilgi hızla artıyor ve önümüzdeki yıllarda farmasötik endüstrisi ve genel olarak biyoteknoloji üzerinde büyük bir etkisi olması muhtemel. Potansiyel bir uygulama, artan antibiyotiğe dirençli enfeksiyonlar tehdidiyle mücadele etmek için faj kullanımıdır.

Bakteriyofaj araştırmalarının farklı alanlarında aktif olarak yer alan seçkin uluslararası araştırmacılar tarafından yazılan bu kitap, bu heyecan verici alandaki güncel hızlı gelişmelere odaklanmaktadır. Kitap, konulara geniş bir genel bakış sağlayan ve ayrıca bakteriyofaj araştırmasının çok yönlü yapısını vurgulayan mükemmel bir bölümle açılıyor. Bunu biyoinformatik ve genomik, çevredeki faj, tıpta bakteriyofaj, faj DNA'sının konakçıya transferi, konak fenotipine katkı ve çok daha fazlasını içeren en güncel konulara odaklanan bir dizi inceleme izler.

Akademi, biyoteknoloji ve ilaç şirketlerinde ve gıda ve diğer endüstrilerde bakteriler üzerinde çalışan moleküler biyologlar ve mikrobiyologların ilgisini çeken tüm faj araştırmacıları için temel bir okumadır.

"Bu güzel hazırlanmış, ciltli kitap aynı zamanda boyut olarak da yönetilebilir ve ileri görüşlü herhangi bir üniversite veya hastane kütüphanesi için açıkça önemli bir yatırımdır. Tıp ve tıp da dahil olmak üzere çeşitli alanlardaki öğrenciler ve araştırmacılar için bir ilham kaynağı ve bilimsel heyecan kaynağı olacaktır. sanayi." SGM Microbiology Today'den (2007)

Doodys'ten (2007) ". yetkili ve yararlı . "

(EAN: 9781904455141 9781913652333 Konular: [viroloji] [bakteriyoloji] [mikrobiyoloji] [moleküler mikrobiyoloji] [genomik] )


Mu Fajının Yaşam Döngüsü

Yaşam döngüsü aşağıdaki adımlarda özetlenebilir:

Ek

İlk olarak, kuyruk lifleri, konakçı hücre yüzeyinin reseptör bölgesine bağlanır. Kuyruk lifinin bağlanmasıyla Mu fajının taban plakasında konformasyonel değişiklik olur. Taban plakasındaki konformasyonel değişiklik nedeniyle, kuyruk kılıfı büzülür.

Nüfuz

Kuyruk kılıfının büzülmesiyle, sert iç malzeme hücre zarfı yoluyla konakçı hücre yüzeyine girer. N proteini (kopyalayıcı olmayan protein) de viral genomla birlikte enjekte edilir.

Sirkülerizasyon

N-proteini, viral genoma bağlandıktan sonra daireselleşmeye uğrar.

Entegrasyon

Daireselleştirmeden sonra, Repc ve Ner baskılayıcılarına ve DDE rekombinaz A'ya (Mu A) yol açan erken transkripsiyon meydana gelir. Bu genler, viral genomun konakçı genomu ile entegrasyonuna yardımcı olur. Bu adım sırasında, değişken uçlar viral genomdan kesilir.

Erken aşama

Replikatif olmayan transpozisyondan sonra, Repc ve Ner baskılayıcıların oranı, fajın lizojenik faja mı yoksa litik faja mı gireceğine karar verir.

  • Repc: Gecikme veya lizojeni oluşturarak erken promotörü bastırır.
  • Ner: Mu fajının replikasyonu için erken genlerin ifadesini teşvik ederek Repc ifadesini bastırır.

Orta faz

Repc inaktivasyonundan sonra MuA ve MuB genlerinin ifadesi olur. MuA, DDE rekombinaz-A enzimidir ve MuB, hedef DNA aktivatörü B'dir. MuA, viral genom uçlarının ve konakçı DNA'nın transpozisyonunu gerçekleştirir. Hedef DNA aktivatörü B, viral konakçı DNA'nın replikasyonuna yardımcı olarak iki kopyanın oluşumuna yol açar. Bu tip kopyalamaya replikatif transpozisyon denir. Bu replikasyon, ardışık turlardan sonra 100 viral genoma yol açabilir.

Geç transkripsiyon

Bu faz, viral DNA'daki adeninleri modifiye ederek viral DNA'yı konak kısıtlama enzimlerine karşı dirençli kılan adenin modifikasyon enziminin ekspresyonunu gerçekleştirir.

Biyosentez ve Montaj

Geç gen, virüs partiküllerinin biyosentezine yol açan Mu fajının yapısal genlerini sentezler. Daha sonra boş kapsid, kuyruk lifleri vb. gibi virüs parçacıkları bir araya gelir.

Virion'un ambalajlanması

İlk olarak, bakteri DNA'sı, yaklaşık 50-150bp için entegre Mu genomunun solunda ilk önce kesilir. Ardından faj kafasının doldurulmasından sonra ikinci bir kesim meydana gelir. Viral DNA'nın paketlenmesi de Mu genomunun sağ tarafında meydana gelir. Bu nedenle, bakteri genomunun farklı bölgelerinde Mu genomunun paketlenmesi meydana gelecektir.

Hücre lizizi ve virion salınımı

Paketlemeden sonra, yeni sentezlenen viryonlar, litik enzimleri kodlayan (hücre lizizinden sorumlu) lye geninin yardımıyla konakçı hücreden salınır.


Bakteriyofajın Yapısı

Bakteriyofajın morfolojisi aşağıdaki bileşenleri içerir:

  • Uzatılmış ve altıgen şeklindedir.
  • Bakteriyofajın başı prizmoid bir yapıya sahiptir.
  • adı verilen bir zarfla çevrilidir. kapsit.
  • adı verilen özdeş protein alt birimleri tarafından üretilir. kapsomerler.
  • Yaklaşık 2000 kapsomer içerir.

Genetik materyal:

  • 50 nm uzunluğundadır ve şunlardan biri olabilir: DNA veya RNA.
  • Genetik materyalin yapısı doğrusal veya dairesel olabilir.
  • Kafanın içinde sıkıca paketlenmiştir.
  • Ayrıca bir denir yaka, baş ve kuyruğu birbirine bağlayan.
  • Dairesel plaka benzeri bir yapıya sahiptir.
  • Bir şeye benziyor içi boş tüp.
  • Bir kuyruk bir protein ile çevrilidir kılıf.
  • Yaklaşık 144 protein alt biriminden oluşur.
  • Bakteriyofajın kılıfı oldukça kasılma.
  • 24 yüzük içerir.

Kuyruk lifleri:

  • Bunlar taban plakasına bağlıdır.
  • Uzun görünüyor ve ipliğe benzer filamentler.
  • Kuyruk lifleri konak özgüllüğünü indükler veya bunlar ana bilgisayara özgü.
  • Genelde 6 adet bulunurlar.
  • Boyut: 130x2nm
  • Ayrıca bir denir kuyruk pimi.
  • Spikes, konak hücrenin alıcı bölgelerini tanır.

Bakteriyofajın Yaşam Döngüsü

Litik ve lizojenik döngüler, bakteriyofaj yaşam döngüsünün ortak aşamalarıdır.


Litik döngü

Ayrıca denir öldürücü veya bulaşıcı Çevrim. Litik fajları içerir. Bir litik döngünün fajları, döngünün virülent faz olarak bilinmesinden dolayı konak hücreyi enfekte edebilir veya öldürebilir. Aşağıdaki adımları içerir:

  1. Ek
  2. adsorpsiyon
  3. nüfuz
  4. çoğaltma
  5. toplantı
  6. hücre parçalanması

Ek: Bu adımda, bir kuyruk pimi veya başak konak bakteri hücresindeki reseptör bölgelerini tanır ve ona bağlanır. Bundan sonra, kuyruk lifleri bakteriyofaj bakteri yüzeyine yapışır.

adsorpsiyon: Bu adımda, konak hücrenin amino grupları, bakteri hücresinin karboksil grubu ile reaksiyona girer ve bunun tersi de geçerlidir. Reaksiyondan sonra kuyruk lifleri bir litik enzim. Bu enzim, konak hücrede bir viral genomun konak hücre sitoplazmasına hareket ettiği bir delik oluşturur.

nüfuz: Bu adım aynı zamanda “EnjeksiyonFaj genetik materyalinin konağın genetik materyaline nüfuz ettiği ”.

çoğaltma veya biyosentez: Penetrasyondan sonra, mRNA çekirdekten sitoplazmaya hareket eder ve viral genom, konakçı genetik materyali bozar. Daha sonra mRNA, diğer bileşenlerin biyosentezine yol açan protein kapsidini oluşturmak üzere kopyalar ve çevirir.


toplantı: Aynı zamanda “Olgunlaşma” olarak da ifade edilir. Bu aşamada, bakteriyofajın tüm bileşenleri yeni yavru veya yavru üretmek için bir araya gelir. soy viryonları.

lizis: Bu aşamada virüs bakteri hücresini öldürerek hücre parçalanması ve yaklaşık 100-200 döl virionu serbest bırakır.

Lizojenik Döngü

Aynı zamanda bir olarak adlandırılır Ilıman veya Bulaşıcı olmayan Çevrim. Bu döngüye katılan fajlar "Lizojenik faj" olarak bilinir. Bu fajlar, lizojenik bir fazın bulaşıcı olmayan bir faz olarak kabul edilmesinden dolayı bakteri hücresini öldürmez veya enfekte etmez. Aşağıdaki adımları içerir:

  1. Ek
  2. nüfuz
  3. Genetik materyalin dahil edilmesi
  4. çoğaltma
  5. Hücre bölünmesi
  6. indüksiyon

Ek: Bu adımda, lizojenik faj ilk önce konağın alıcı bölgesini sivri uçları aracılığıyla tanır. Tanımadan sonra, kuyruk lifleri konak hücre yüzeyine yapışır.

nüfuz: Aynı zamanda, kuyruk liflerinin bir serbest bıraktığı litik faz ile aynıdır. lizojenik enzim bir viral genomun konak hücrenin sitoplazmasına girdiği bir gözenek oluşturmak için.

Genetik materyalin dahil edilmesi: Aynı zamanda “olarak da adlandırılır.Genetik materyalin entegrasyonu”. Bu aşamada, faj DNA, bir kompleks oluşturan (Profaj) konakçı genetik materyalin genetik materyaline dahil olur. Profaj, aktif olmayan, yani yeni nesiller üretemeyen ılıman bir fajdır.

Bu adım basitçe rekombinasyon faj ve konağın transkripsiyon ve translasyon işlemlerini içermeyen genetik materyali.

çoğaltma: Uygun koşullar sırasında, bakteri genomu çoğaldığında ve yavru hücrelere geçtiğinde profaj çoğalır.

Hücre bölünmesi: Bu aşamada, bir hücre iki özdeş yavru hücreye bölünür.

indüksiyon: İki şartı vardır:

  • Profaj, konak hücrenin içinde uyku durumunda kalabilir.
  • İkincisi, profaj, UV ışınlarının indüklenmesi veya ısıl işlemle litik döngüye devam edebilir.

Önemi

  • tanımlanmasına, sınıflandırılmasına ve tespit edilmesine yardımcı olur. patojenik bakteri.
  • Toprak ve su kirliliğine karışan bakterileri öldürerek biyokontrol ajanı görevi görür.
  • Evrim kavramını incelemek için, aynı zamanda mod organizmalar.
  • Bakteriyofajlar, genetik mühendisliğinde önemli bir kullanıma sahiptir.
  • Uzay mikrobiyolojisinde, radyasyon dedektörü.
  • Bakterilerin neden olduğu birçok hastalığın tedavisinde önemli ölçüde kullanılmaktadır. faj tedavisi.
  • Bakteriyofajlar, bakteriyel plankton büyümesini kontrol etmede merkezi bir rol oynar.
  • Bahçecilikte bunlar bitki ve sebzeleri korumak için sprey şeklinde kullanılır.
  • Ayrıca, gibi davranır biyositler çevresel yüzeyleri temizlemek için dezenfektan gibi. Örneğin. Hastanelerde.

Bu nedenle, bir bakteriyofaj çok çeşitli ekolojik, moleküler ve biyomedikal öneme sahiptir.


II. Çokyüzlü veya kübik fajlar

- sınıflandırılmış mikrovirüsler, kortikoviridae, Tektiviridae, Leviviridae, ve Cystoviridae.

mikrovirüsler faj- ikosahedral kafa, viryon boyutu 27 nm, 12 kapsomerli, tek iplikli DNA (ssDNA)

Örnek: faj φX174

kortikoviridae fajlar- zarfsız, 63 nm boyutunda, kompleks kapsid, lipidler, dsDNA

Örnek: faj PM2

Tectiviridae fajlar- zarfsız, 60 nm, esnek lipid vezikül, yalancı kuyruk, dsDNA

Örnek: faj PRD1

Leviviridae fajlar- zarfsız, 23 nm, poliovirüs benzeri, ssRNA

Örnek: faj MS2

sistoviridae fajlar-zarflı, ikosahedral başlı, 70-80 nm, lipidler, dsRNA

Örnek: Pseudomonas ɸ6


Teşekkür

Bu çalışma Polonya Bilim ve Yüksek Öğrenim Bakanlığı araştırma hibesi No. N N401 3550 33 ve Avrupa Birliği Projesi Operasyonel Program Yenilikçi Ekonomi 2007–2013 (OP IE) No POIG.01.03.01-02-003/08 kapsamında desteklenmiştir: "Tedavi edici bakteriyofajların özelliklerinin ve üretiminin optimizasyonu". Bu fon sağlayan kuruluşların, deneylerin tasarımında, makalenin yazılması sırasında verilerin toplanması, analizi ve yorumlanmasında veya makaleyi yayın için gönderme kararında herhangi bir rolü yoktu.


Bakteriyofaj T4 genomu

Faj T4, genetik ve biyokimya paradigmalarına sayısız katkı sağlamıştır. 168.903 bp'lik tam genom dizisi, yaklaşık 300 gen ürününü kodlar. T4 biyolojisi ve onun genomik dizisi, modern fonksiyonel genomik ve proteomik için en iyi anlaşılan modeli sağlar. Örtüşen genler, dahili translasyon başlatma, eklenmiş genler, translasyonel bypass ve RNA işleme dahil olmak üzere gen ekspresyonundaki varyasyonlar, bizi tamamen hesaplama yöntemlerinin uyarıları konusunda uyarır. T4 transkripsiyonel modeli, konakçı RNA polimerazına olan bağımlılığını ve RNA polimeraz transkripsiyonel aktivatör proteinlerini, bir faj sigma faktörünü, anti-sigma ve sigma tuzak proteinlerini sırayla değiştiren faj kodlu proteinlerin kullanımını yansıtır, ayrıca erken, orta, ve geç destekleyici tanıma. T4 tarafından yapılan transkripsiyon sonrası kontroller, özellikle yapısal düzeyde RNA'ya bağlı süreçlerin incelenmesi için mükemmel sistemler sağlar. T4'ün DNA replikasyonu ve rekombinasyon sistemlerinin fazlalığı, faj ve diğer genomların farklı ortamlarda nasıl kararlı bir şekilde kopyalandığını ve onarıldığını ortaya koyarak genom evrimi ve yeni konakçılara ve büyüme ortamlarına adaptasyonlar hakkında bilgi sağlar. Ayrıca, genomik dizi analizi, proteinlerin kuyruk lifi varyasyonu, parçalanması, gen kopyaları ve zar lokalizasyonu hakkında yeni bilgiler sağlarken, "hücre delme cihazının" yüksek çözünürlüklü yapısal tespiti, üç boyutlu görüntü rekonstrüksiyonu ile birleştirilmiştir. taban plakası, enfeksiyon sırasında penetrasyon mekanizmasını ortaya çıkarmıştır. Bu gelişmelere rağmen, yaklaşık 130 potansiyel T4 geni tanımlanmamıştır. Mevcut faj dizileme girişimleri, Escherichia coli dışındaki bakterileri enfekte edenler de dahil olmak üzere, T4 ailesinin üyeleri arasındaki benzerlikleri ve farklılıkları ortaya koymaktadır. T4 fonksiyonel genomiği, bu yeni dizilenmiş T4 ile ilişkili genomların yorumlanmasına ve Dünya'daki en bol ve en eski biyolojik varlıklar arasında bulunan fajların karmaşık evrimi ve ekolojisine ilişkin anlayışımızı genişletmeye yardımcı olacaktır.

Rakamlar

Bakteriyofaj T4'ün elektron mikrografları.…

Bakteriyofaj T4'ün elektron mikrografları. İyi tanınan T4 morfolojisi, doğanın prototipiydi…

İplik içi önyargılar (nükleotid çarpıklığı)…

T4 genomunda iplikçik içi önyargılar (nükleotid eğriliği). (A) Kümülatif değerler…

Bakteriyofajın fonksiyonel genom haritası…

Bakteriyofaj T4'ün fonksiyonel genom haritası. T4 genomunun kodlama kapasitesi…

arasındaki ilişkinin şeması…

T4 transkripsiyonel paterni ve farklı mekanizmalar arasındaki ilişkinin diyagramı…

T4 destekçilerinin logosu. Az kalsın…

T4 destekçilerinin logosu. Her hizalamadaki hemen hemen tüm dizilerde promotör vardır…

T4 RBS'nin logosu. Tercüme…

T4 RBS'nin logosu. Açıklamalı T4 GenBank dosyasının çeviri başlatma bölgeleri…

T4 replizomu. Bir T4 DNA replikasyon çatalı modeli ve…

T4'ün yapısal bileşenleri…

T4 parçacığının yapısal bileşenleri. Parçacığın özellikleri çözüldü…

Üç boyutlu görüntü rekonstrüksiyonu…

Kriyoelektron mikroskobundan T4 tüp taban plakasının üç boyutlu görüntü rekonstrüksiyonu. (A) Stereo görüntü…

T4 timidilat sentazın yapısı.…

T4 timidilat sentazın yapısı. T4 dizisi, mevcut diğer…

Timidilat sentazların filogenetik ağacı…

Timidilat sentazların ve deoksinükleotit hidroksimetilazların filogenetik ağacı. Tüm protein dizileri elde edildi…


DNA'nın Polimeraz Zincir Reaksiyonu ile Amplifikasyonu

Moleküler klonlama, tek tek DNA fragmanlarının bakterilerde çoğaltılmasına ve büyük miktarlarda izole edilmesine izin verir. Tek bir DNA molekülünün büyük miktarlarını izole etmenin alternatif bir yöntemi, polimeraz zincir reaksiyonu (PCR)1988 yılında Kary Mullis tarafından geliştirilmiştir. DNA molekülünün bazı dizilimlerinin bilinmesi koşuluyla PCR, tamamıyla gerçekleştirilen reaksiyonlarla çarpıcı bir DNA amplifikasyonu elde edebilir. laboratuvar ortamında. Esasen, DNA polimeraz, tanımlanmış bir DNA segmentinin tekrarlanan replikasyonu için kullanılır. DNA moleküllerinin sayısı üstel olarak artar, her replikasyon turunda ikiye katlanır, böylece az sayıda ilk şablon kopyasından önemli miktarda DNA elde edilebilir. Örneğin, 30 replikasyon döngüsü ile büyütülen tek bir DNA molekülü, teorik olarak 2 30 (yaklaşık 1 milyar) soy molekülü verecektir. Böylece tek DNA molekülleri, moleküler klonlama ile izole edilebilen veya ayrıca doğrudan kısıtlama endonükleaz sindirimi veya nükleotit dizilimi ile analiz edilebilen, kolaylıkla saptanabilir miktarlarda DNA verecek şekilde amplifiye edilebilir.

DNA'nın PCR amplifikasyonu için genel prosedür Şekil 3.27'de gösterilmektedir. Başlangıç ​​materyali, klonlanmış bir DNA parçası veya DNA moleküllerinin bir karışımı, örneğin insan hücrelerinden alınan toplam DNA olabilir. Belirli bir DNA bölgesi, bölgeyi çevreleyen nükleotid dizisinin bilinmesi koşuluyla, böyle bir karışımdan amplifiye edilebilir, böylece primerler istenen noktada DNA sentezini başlatmak üzere tasarlanabilir. Bu tür primerler genellikle 15 ila 20 baz DNA içeren kimyasal olarak sentezlenmiş oligonükleotidlerdir. Tamamlayıcı DNA ipliklerinden zıt yönlerde DNA sentezini başlatmak için iki primer kullanılır. Reaksiyon, şablon DNA'nın yüksek bir sıcaklığa (örneğin, 95ଌ) ısıtılmasıyla başlatılır, böylece iki iplik ayrılır. Daha sonra, primerlerin şablon şeritler üzerindeki tamamlayıcı dizileriyle eşleşmesini sağlamak için sıcaklık düşürülür. DNA polimeraz daha sonra her bir şablona tamamlayıcı yeni bir iplikçik sentezlemek için primerleri kullanır. Böylece bir amplifikasyon döngüsünde, bir şablon molekülden iki yeni DNA molekülü sentezlenir. İşlem, her bir replikasyon turundan kaynaklanan DNA moleküllerinde iki kat artışla birçok kez tekrarlanabilir.

Şekil 3.27

DNA'nın PCR ile amplifikasyonu. Amplifiye edilecek DNA bölgesi, DNA sentezini başlatmak için kullanılan iki dizi ile çevrilidir. Başlangıç ​​çift sarmallı DNA, sarmalları ayırmak için ısıtılır ve daha sonra primerlere (genellikle 15 (daha fazla) oligonükleotidler) izin vermek için soğutulur.

PCR'de yer alan çoklu ısıtma ve soğutma döngüleri, termocycler adı verilen programlanabilir ısıtma blokları tarafından gerçekleştirilir. Bu reaksiyonlarda kullanılan DNA polimerazlar, bakterilerden elde edilen ısıya dayanıklı enzimlerdir. termos aquaticus, yaklaşık 75'lik sıcaklıklarda kaplıcalarda yaşayan. Bu polimerazlar, çift sarmallı DNA sarmallarını ayırmak için kullanılan yüksek sıcaklıklarda bile stabildir, bu nedenle PCR amplifikasyonu hızlı ve otomatik olarak gerçekleştirilebilir. PCR amplifikasyonundan önce bir cDNA kopyasını sentezlemek için ters transkriptaz kullanılıyorsa, RNA dizileri de bu yöntemle amplifiye edilebilir.

Primerlerin belirlenebileceği bir gen dizisinin yeterince biliniyorsa, PCR amplifikasyonu, bir komplekste istenen DNA dizisinden sadece birkaç molekül içerebilen başlangıç ​​materyalinden kolayca saptanabilir ve manipüle edilebilir miktarda DNA elde etmek için son derece güçlü bir yöntem sağlar. diğer moleküllerin karışımı. Örneğin, birkaç kilobaza kadar tanımlanmış DNA dizileri, toplam genomik DNA'dan kolaylıkla amplifiye edilebilir veya tek bir cDNA, toplam hücre RNA'sından amplifiye edilebilir. Bu amplifiye DNA segmentleri daha sonra örneğin ilgilenilen bir gen içindeki mutasyonları tespit etmek için daha fazla manipüle edilebilir veya analiz edilebilir. Bu nedenle PCR, rekombinant DNA teknikleri repertuarına güçlü bir katkıdır. Gücü, özellikle kalıtsal hastalıkların teşhisi, gelişim sırasında gen ekspresyonu çalışmaları ve adli tıp gibi uygulamalarda belirgindir.


Bakteriyel Virüslerin Çoğaltılması

T4-Benzeri Fajların DNA Replikasyonu

Serolojik olarak ilgili E. koli T2, T4 ve T6'yı enfekte eden bakteriyofajlara yaygın olarak T-çift fajlar denir. 170 kbp uzunluğunda bir dsDNA genomuna sahiptirler ve terminalleri genomun %3'ünün tekrarını içerir. Ek olarak, T-çift fajların genomu, DNA'yı endonükleazlardan koruyan ve çift sarmal stabilitesi sağlayan glukosillenmiş hidroksimetilsitozinler içerir. T-çift fajlar kendi replikasyon makinelerini kodlarlar, bu da onları DNA replikasyonunun genel mekanizmasını incelemek için iyi adaylar yapar.

Enfeksiyondan sonraki erken aşamalarda, T4 DNA replikasyonu sadece bir replikasyon orijininden başlar. T4 gp59 tarafından DNA'ya yüklenen T4 sarmal/primaz kompleksi (gp41/gp61), primaz aktivitesi periyodik olarak Okazaki'yi başlatmak için RNA primerlerini sentezlerken aynı zamanda gecikmeli iplik sentezinde 5'-3' yönünde işlemsel olarak hareket eder. parça sentezi. Öncü iplik sentezi, erken veya orta promotörlerden bir konakçı RNA polimeraz tarafından sentezlenen bir RNA molekülü tarafından başlatılır. DNA polimeraz (gp43), DNA polimerazı DNA'ya sıkıca tutan, kayan bir kıskaç görevi gören bir trimer olan gp45 tarafından desteklenen her iki ipliğin DNA sentezini katalize eder. gp44/gp62 kompleksi, gp45'in DNA'ya bağlanmasını sağlamak için ATP'nin hidrolizini kullanır. T4 DNA replikasyon başlangıcı replikasyon kaynağına bağlı olmasına rağmen, T4 DNA replikasyon çatallarının çoğu, genom boyunca rastgele pozisyonlarda DNA primerleri olarak rekombinasyon ara maddeleri kullanılarak başlatılır. Replikasyon çatalı 3′-ucuna ulaştığında, zincirin gecikmeli iplik sentezini şablonlayan tek iplikli kısmı, uçlarının terminal fazlalığı nedeniyle diğer DNA moleküllerinde bir homoloji bölgesini işgal eder ve rekombinasyona bağlı bir DNA replikasyon yolunu gerçekleştirir. Erken veya orta promotörlerden eksprese edilen genlere bağlı olan ve istilacı 3' DNA uçlarından başlatılan 'join-copy replikasyonu' olarak adlandırılır. Bu, genomun çok sayıda kovalent olarak bağlı kopyalarını içeren replike DNA ara ürünlerinin görünümünü destekler. Bir endonükleaz, istila edilmiş DNA zincirlerinden herhangi birinde kesildiğinde, istilacı bir DNA'nın tek sarmallı bölümlerinin kopyalanmasına izin vermek için 3' uçlardan 'birleştir-kes-kopyala rekombinasyonu' başlatılır. Bu yol, ağırlıklı olarak geç enfeksiyon zamanlarında sentezlenen endo VII veya terminaz proteinlerinin etkisini gerektirir, bu da birleştirme-kesme-kopyalamayı DNA replikasyonu için geç yol haline getirir, çünkü replikasyonun başlangıç ​​başlangıcı T4 gelişimi sırasında durur ( Şekil 1 ).

Şekil 1 . Homolog rekombinasyonun ara maddelerinden DNA replikasyonunun başlatılması. Şekil, ebeveyn 2'nin ssDNA ucunun ebeveyn 1'in homolog dsDNA'sını nasıl işgal ettiğini gösterir. mutajenez ve yatay gen transferinde. ABD Ulusal Bilimler Akademisi Bildirileri 98: 8306-8311, telif hakkı (2001) Ulusal Bilimler Akademisi, ABD, Ulusal Bilimler Akademisi'nin izniyle.