Bilgi

Çinko parmak nükleaz özgüllüğü

Çinko parmak nükleaz özgüllüğü


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Bir ZFN'nin bir genomda yalnızca belirli bir konumda kestiğinden emin olmak istersem, bunu sağlamak için kaç alt birime ihtiyacım olur?

İnsan genomu kabaca 3 milyar baz çiftiyse, 4^16 3 milyarı aştığı için 16 baz çifti olan bir diziye ihtiyacımız var (eğer düşüncelerim doğruysa). Ama sonra ZFN'nin alt birimlerinin bu duruma nasıl geldiğini tam olarak anlamıyorum.


İnsan diploid genomu ~6.5 milyar bp'dir, bu nedenle yalnızca bir kez meydana gelme olasılığı olan bir dizinin uzunluğunu bulmanız gerekir (dizinin tamamen rastgele olduğu varsayılarak):

$4^n=6.5cdot10^9$

$ncdot log(4)=log(6.5)+9$

$n=frac{log(6.5)+9}{log(4)}$

$nyaklaşık16.30$

Bu makaleye göre, bir ZFN'nin her parmağı 3 bp'yi tanır, bu da benzersiz bir siteyi olasılıksal olarak tanımak için $frac{18}{3}=6$ parmağa ihtiyacınız olduğu anlamına gelir. İlginç bir şekilde, makale ayrıca şunları söylüyor:

Dimerizasyon gereksinimi, bu nedenle büyük bir avantajdır: bir monomer aktif olmadığı için, tek bağlanma bölgelerinde bölünme meydana gelmez. Bölünme reaktifi, yalnızca parmaklar yeterli özgüllüğe sahipse hedefte birleştirilir ve iki proteinin bağlanması için birleşik gereksinim, genel özgüllüğü çok yararlı bir aralığa getirir; örneğin, iki üç parmaklı protein, prensipte, karmaşık bir genomda bile tek bir hedefi seçmek için yeterli olan 18 bp'nin yerini belirtir.


Biyouyumluluk, Yüzey Mühendisliği ve İlaçların, Genlerin ve Diğer Moleküllerin Teslimi

4.32.1.2.2 Çinko parmak nükleazları

Çinko Parmak Nükleazları (ZFN'ler), ilk yaygın olarak kullanılan programlanabilir DNA bağlayıcı protein sistemiydi. 11 ZFN'ler, gen düzenlemelerini mümkün kılmak için bölgeye özgü çift sarmallı DNA kırılmaları yapabilen bir sistem üretmek için bir bakteri nükleaza kaynaşmış bir çinko parmak proteinleri zincirinden oluşur (Şekil 1(A)). Çinko parmak proteinleri, her biri 3-4 baz çiftli DNA dizisini tanıdıkları için bölgeye özel hedefleme sağlar. 6,12 ZFN'lerde, genom içinde daha uzun, daha spesifik bir lokusu tanımak için bir çinko parmak proteinleri zinciri kullanılır. ZFN teknolojisinde yaygın olarak kullanılan, bu çinko parmak proteinleri zincirine kaynaştırılan nükleaz, bir DSB'yi tanıtmak için dimerize olması gereken FokI'dir. 13 Bu nedenle, DNA 14'ü hedeflemek ve kesmek için bir çift ZFN birlikte kullanılır (Şekil 1(A)). Yukarıda açıklandığı gibi, bir DSB'nin eklenmesi, doğal DNA hasar tepki yolunu aktive ederek, HDR tarafından belirli gen düzenlemelerinin sunulmasını sağlar. 15,16 ZFN, insan somatik 17 ve pluripotent kök hücrelerinde gen düzenlemeye başarıyla uygulanmıştır. Ancak 18 ZFN'nin doğal bir dezavantajı vardır. Yani, tandem çinko parmak alanlarını yüksek afinite zincirine monte etmek zordur. Ek olarak, laboratuvar prosedürlerinin, ZFN uzmanı olmayan herhangi bir laboratuvar çalışanı için zaman alıcı olduğu kanıtlanmıştır ve bu da, etkili bir düzenleme oluşturmak için önemli miktarda çaba harcanmasına neden olur. ZFN sisteminin birincil avantajı, DNA hedeflemesinin özgüllüğünü artırabilen ve hedef dışı etkileri azaltabilen dimerize FokI'nin kullanılmasıdır.


Arka plan

İnsan genital ülseratif hastalığının bir nedeni olarak Herpes simpleks virüsü tip II

Herpes simpleks virüsü tip I ve II (sırasıyla HSV-1 ve 2), varicella-zoster (suçiçeği) virüsü ile birlikte, herpes virüsü virüslerin taksonomik ailesi [1]. Bu büyük ölçüde nörotropik virüslerle insan enfeksiyonu aktif veya gizli olabilir [1, 2]. HSV-1 veya HSV-2 ile aktif enfeksiyon, sırasıyla oral veya genital mukozanın ülseratif lezyonlarına yol açar, [3, 4] bu viral türlerle olan gizli enfeksiyon büyük ölçüde asemptomatiktir. Gizli HSV-2 enfeksiyonu öncelikle sakral kök gangliyonlarının nöronlarında meydana gelir. Bu nedenle, HSV-2'nin klinik spektrumunun birincil aktif enfeksiyonu, ardından yaşam boyu bir gecikme fazının çözülmesini ve kurulmasını içerdiği söylenebilir [4, 5]. Primer HSV-2 enfeksiyonu, vulva veya penis üzerinde kırılarak sığ, ağrılı ülsere edici lezyonlar bırakan kabarcıklar veya veziküllerin görünümü ile karakterizedir [6, 7]. Bu ülserler 2-3 hafta içinde kendiliğinden iyileşir, ancak bağışıklığı baskılanmış hastalarda iyileşme çok yavaş olabilir [7]. Latent-HSV-2, tekrarlayan klinik hastalık epizodları ile karakterizedir (yılda 4-5), reaktivasyon epizodları arasında aralıklı olan subklinik durum, enfeksiyöz viral dökülme ve genital salgılarda HSV-2 bulaşması ile ilişkilendirilebilir. Semptomatik HSV-2 enfeksiyonlarının insidansı coğrafi olarak değişir ancak HIV pozitif bireylerde daha yüksektir [8-10]. Aktif-HSV-2 enfeksiyonu ile ilişkili genital lezyonlar, cinsel yolla bulaşma veya insan immün yetmezlik virüsü tip I (HIV-1) riskinin artmasıyla ilişkilendiren kanıtlar bulunduğundan, özel bir halk sağlığı sorunu haline gelmiştir [5-8]. ]. Bu nedenle, HSV-2 ve diğer genital ülseratif hastalıkların tedavisi [9], HIV-1 cinsel yolla bulaşma ve edinme riskinin azaltılması düşünüldüğünde [10-12] kabul edilebilir bir önlemdir.

HSV-2 ediniminin tedavisi veya önlenmesi için mevcut seçeneklerdeki zorluklar

HSV-2 tedavisi için mevcut biyomedikal müdahaleler sadece aktif olarak kopyalanan HSV-2 partikülleri için geçerlidir [13]. Bu, enfeksiyonu temizlemek yerine sadece HSV-2'nin ülseratif lezyonlarını [14, 15] tedavi etmekle klinik alakalarını sınırlar. Spesifik olarak, HSV-2'yi tedavi etmek için mevcut kemoterapi seçenekleri, latent virüs etkilenmezken, yalnızca aktif olarak replike olan virüsü inhibe eder. Bununla birlikte, gizli HSV-2, diğerleri arasında HIV ile enfeksiyon veya kemoterapi tedavisinden sonra, soğuk algınlığının neden olduğu bir bağışıklık baskılanması sırasında veya sonrasında reaktivasyonu takiben gelecek genital ülserasyon epizodlarının kaynağıdır [16, 17]. Yeniden etkinleştirilebilen yaşam boyu süren bu gizli enfeksiyon tablosu, HSV-2 enfeksiyonlarının biyomedikal yönetimi için benzersiz zorluklar sunar [18]. Mevcut biyomedikal kanıtlara dayalı olarak etkili bir HSV-2 aşısı geliştirmek için önemli çabalar olmuştur ve bunlar devam etmektedir [19, 20]. Spesifik olarak, adjuvanlarda formüle edilmiş veya canlı-zayıflatılmış replikasyon-yetersiz (disable-enfeksiyöz tek döngü-DISC, ICP8 gen mutasyonu) içinde eksprese edilen tek veya çift bileşenli (gB2 ve gD2) rekombinant glikoproteinleri içeren önceki HSV-2 aşı adaylarının randomize klinik çalışmaları ) veya replikasyon yetkin (ICP10 gen mutasyonu) HSV-2'den türetilen viral vektörler, HSV-2'nin cinsel yolla bulaşmasına veya edinilmesine karşı koruma nihai hedefine yönelik yalnızca kısmi etkinlik göstermiştir [21-25].

-HSV-2'nin virolojisi ve entegrasyon öncesi viral genom dilimleme kavramı (PRINT-vGSX)

Diğer jenerik üyeleri gibi alfaherpesviridae HSV-2 alt ailesi, en az 10 viral glikoprotein içeren bir dış lipid zarfı, en az 15 viral protein içeren bir ara tegument tabakası ve çift sarmallı DNA genomunu içeren bir ikosahedral nükleokapsidi olan büyük, zarflı bir virüstür [26]. Bir HSV-2 suşunun tam dizili genomu, HG52 (Dolan et al.[27]), HSV-2 genomik DNA'sının, U olarak belirtilen çift sarmallı DNA'nın (uzun 126 kb ve kısa 26 kb kısa) iki benzersiz bölgesinde düzenlendiğini ortaya koymaktadır.L ve senS. Bunlar, iki bölgenin izomerizasyonuna ve rekombinasyonuna kolayca izin veren ters çevrilmiş tekrar dizileri (TRL-IRL ve IRS-TRS) ile parantez içine alınır [27, 28]. Tüm genom, %70.4'lük bir G+C içeriğine sahiptir ve üç kategoride gruplandırılabilen yaklaşık 74 proteini kodlayan 84 açık okuma çerçevesi içerir: (i) ani-erken genler (transkripsiyonu viral olarak kodlanmış bir aktive edici protein olan VP16'ya bağlıdır ve viral α proteinlerini kodlar) (ii) erken genler (α proteinleri tarafından çalıştırılan ve ürünleri (β proteinleri) DNA replikasyonunda yer alan) ve (iii) geç genler, ürünleri (y proteinleri) virion yapısal proteinleri ve virüs partikül montajı ve çıkışı için gerekli proteinlerdir. Viral zarf glikoproteinlerinin (gD) çoğu antijenik olarak HSV-1'inkilerle ilişkilidir, oysa gG1 ve gG2 tipe özgüdür [27, 29]. Birçoğu virüs büyümesi için vazgeçilmez olan bu çok sayıda gen ürünü dizisi laboratuvar ortamında, HSV-2 tarafından, enfekte olmuş konak hücrede apoptozun önlenmesi, interferon indüksiyonu ve üretimi için yolların bloke edilmesi ve HSV-2 antijen sunumunun tip bağlamında aşağı regülasyonu dahil olmak üzere konakçı savunmalarının kaçmasına yönelik olarak geliştirilen etkili virülansın altında yatar. I Majör-histo-uyumluluk kompleksi (MHC) [30].

Doğrusal çift sarmal temelinde (ds) HSV-2'nin DNA genomik yapısı [27] ve bakterilerin doğasında bulunan ilkel anti-faj savunmasının işleyişi, kısıtlama modifikasyonu (RM) sistemi, HSV-2 genomik DNA'sına doğrudan saldırma ve bozma veya kesme olasılığı incelenmiştir. HSV-2'ye karşı alternatif, yeni bir biyomedikal müdahale olarak önerilmiştir [31]. Spesifik olarak, gösterdik ki Escherichia koli HSV-2 genomunu 800'den fazla parçalayan kısıtlama enzimi (REase)-EcoRII, enfeksiyöz (aktif olarak replike olan) HSV-2 partiküllerinin genom bölümlerini çıkarmak veya latent-HSV-2 genomik DNA'sını enfekte hücreler içinde. EcoRII 5'-CCWGG-3' (W = A veya T) site özgüllük palindromunun dizilerinin, insan konakçı genomunda yaygın olduğu ve dolayısıyla bir konakçı genom toksisitesi kaynağı olduğu kaydedildi. Bu bulgu, HSV-2/EcoRII tabanlı terapötik modelleri yalnızca mikrobisitler ile sınırladı [32, 33] ve HSV'nin genom dizilerine benzersiz özgünlükle yapay REazlar (veya çinko parmak nükleazları - ZFN'ler) [34-36] mühendisliğinin gerekliliğini vurguladı. -2 terapötik keşif için güvenli öncüler olarak canlıda. brüt et al.[37], yakın zamanda bu tür HSV-1'e özgü hedef arama (mega-) endonükleazlarını tanımladılar ve Afrika yeşil maymun böbrek fibroblastı (COS-7) ve BSR hücrelerinde ekspresyonlarının düşük ve orta enfeksiyon çeşitliliğinde HSV-1 tarafından enfeksiyonu inhibe ettiğini gösterdiler ( MOI'ler), viral yükte önemli bir azalmaya neden olur. Ayrıca, kalan viral genomlar, viral genomun bölünmesine dayalı bir etki mekanizması ile tutarlı olarak meganükleaz bölünme bölgesinde yüksek bir mutasyon oranı (%16'ya kadar) sergiler. Bu çalışma, replikatif ve latent DNA viral formlarını ele alma potansiyeline sahip alternatif bir antiviral ajan sınıfı olarak mega (ve çinko parmak) nükleazları vurguladı [37].

Bu yazıda, yapının tanımlanması, montajı ve modellenmesi canlıda çinko parmak dizilerinin (ZFA'lar), ZFN'lerin ve ZFN-genotipini HSV-2 genomunun dizilerine benzersiz bir özgüllük ile dönüştüren viral vektörlerin terapötik potansiyeli ilk kez sunulmaktadır.


Wiskott-Aldrich Sendromu Lokusunun Genom Düzenlemesi için Çinko Parmak Nükleazlarının CRISPR'ye Özgü Nükleazlarla Karşılaştırılması

Wiskott-Aldrich sendromu (WAS) dahil birincil immün yetmezlikler, az sayıda düzeltilmiş hematopoietik kök hücre hastaları iyileştirebileceğinden, spesifik nükleazlar (SN'ler) kullanan genom düzenleme stratejileri için ana hedeftir. Bu çalışmada, çeşitli WAS genine özgü CRISPR/Cas9 sistemleri tasarladık ve bunların etkinliğini ve özgüllüğünü homodimerik ve heterodimerik WAS'a özgü çinko parmak nükleazları (ZFN'ler) ile karşılaştırdık, K-562 hücrelerini hücresel model ve plazmit nükleofection veya entegrasyon olarak kullandık. - teslimat için yetersiz lentiviral vektörler (IDLV'ler). Çeşitli CRISPR/Cas9 ve ZFN SN'leri, teslimat için plazmit nükleofection kullanıldığında benzer verimlilik gösterdi. Bununla birlikte, ZFN'leri eksprese eden ikili IDLV'ler, Cas9'u eksprese eden ve RNA'yı veya Cas9'u eksprese eden ve RNA'yı aynı vektörde yönlendiren kılavuz RNA'yı veya hepsi bir arada IDLV'leri ifade eden ikili IDLV'lerden daha verimliydi. WAS tarafından düzenlenen hücrelerde γ-H2AX odak oluşumundaki artışlarla ölçülen heterodimerik ZFN'ler ve CRISPR/Cas9'un özgüllüğü, her ikisi için de benzerdi ve her ikisi de kullanılan dağıtım sisteminden bağımsız olarak homodimerik ZFN'lerden daha iyi performans gösterdi. İlginç bir şekilde, IDLV'ler kullanılarak SN'lerin verilmesinin, plazmit nükleofection'dan daha verimli ve daha az genotoksik olduğunu gösteriyoruz. Ayrıca homodimerik ZFN'ler ve CRISPR/Cas9'un homoloji yönelimli gen knock-in stratejileri için benzer davranışlarını gösteririz, donörlerin sırasıyla %88 ve %83'ü WAS lokusuna yerleştirilirken homodimerik ZFN'ler kullanıldığında eklemelerin sadece %45'i hedefteydiler. Özetle, verilerimiz, CRISPR/Cas9 ve heterodimerik ZFN'lerin, WAS için SN tabanlı gen tedavisi stratejilerini daha da geliştirmek için iyi alternatifler olduğunu göstermektedir. Bununla birlikte, WAS'a özgü heterodimerik ZFN'lerin IDLV teslimi, bu çalışmada karşılaştırılan tüm sistemler arasında en iyi seçenekti.

Anahtar Kelimeler: CRISPR/Cas9 K562 Wiskott-Aldrich sendromu genom düzenleme bütünleştirici eksik lentiviral vektörler (IDLV) çinko parmak nükleazları (ZFN).


Soyut

Nadir tümöre özgü lenfositlerden izole edilen yüksek aviditeli T hücre reseptörü (TCR) genlerinin poliklonal T hücrelerine transferi, çekici bir kanser immünoterapi stratejisidir. Bununla birlikte, TCR gen transferi, yüzey ekspresyonu için rekabet ve eksojen ve endojen TCR zincirleri arasında uygun olmayan eşleşme ile sonuçlanır, sonuçta ortaya çıkan TCR'lerin optimalin altında aktivite ve potansiyel olarak zararlı öngörülemeyen antijen spesifiklikleri ile sonuçlanır. Endojen TCR β ve Î ± zincir genlerinin bozulmasını destekleyen çinko parmak nükleazları (ZFN'ler) tasarladık. ZFN'lerle tedavi edilen lenfositler, CD3-TCR'nin yüzey ekspresyonundan yoksundu ve interlökin-7 (IL-7) ve IL-15 ilavesiyle genişledi. Wilms tümör 1 (WT1) antijeni için spesifik bir TCR'nin lentiviral transferinden sonra, bu TCR-düzenlenmiş hücreler yeni TCR'yi yüksek seviyelerde eksprese etti, kolayca yakın saflığa genişletildi ve donör-eşleştirilmiş, düzenlenmemiş ile karşılaştırıldığında spesifik antijen tanımada üstündü. TCR ile transfer edilen hücreler. Düzenlenmemiş TCR ile aktarılan hücrelerin aksine, TCR ile düzenlenen lenfositler, anti-tümör aktivitelerini in vivo korurken hedef dışı reaktiviteye aracılık etmediler, bu nedenle T hücresi spesifikliğinin tam olarak düzenlenmesinin, gelişmiş biyogüvenlik profilleri olan tümöre özgü lenfositler oluşturduğunu gösterdi.


Çinko Parmakların Keşfi ve Gen Düzenleme ve Genom Manipülasyonunda Uygulamaları

Klasik Cys'in keşfi hakkında bir açıklama verilir.2Onun2 etkileşimi üzerine biyokimyasal çalışmaların yorumlanmasından kaynaklanan çinko parmak Xenopus 5S RNA ile protein transkripsiyon faktörü IIIA ve yapısı ve DNA ile etkileşimi üzerine yapısal çalışmalar. Parmak, bir çift sistein ve bir çift histidine bağlanmış bir çinko iyonu ve bir iç hidrofobik çekirdek tarafından stabilize edilmiş kendi kendine yeten bir bölgedir. Bu keşif, yalnızca yeni bir protein kıvrımını değil, aynı zamanda yeni bir DNA tanıma ilkesini de gösterdi. Diğer DNA bağlayıcı proteinler genellikle çift sarmalın iki katlı simetrisinden yararlanırken, çinko parmaklar değişen uzunluklardaki nükleik asit dizilerini tanımak için doğrusal olarak art arda bağlanabilir. Bu modüler tasarım, DNA'nın (veya RNA'nın) spesifik olarak tanınması için çok sayıda kombinatoryal olasılık sunar. Bu nedenle, insan genomunun genlerinin %3'ünü içeren çinko parmağın doğada yaygın olarak bulunması şaşırtıcı değildir.


5'-CNN-3' ailesi DNA dizilerinin tanınması için çinko parmak alanlarının geliştirilmesi ve bunların yapay transkripsiyon faktörlerinin yapımında kullanılması

Endojen genlerin yönlendirilmiş düzenlenmesi için transkripsiyon faktörlerinin tasarımında son yıllarda önemli ilerleme kaydedilmiştir. Pek çok strateji, her yeni hedef dizi için uygulanması gereken seçim yöntemlerini içermesine rağmen, istenen bir diziye bağlanan yapay transkripsiyon faktörlerini oluşturmak için her biri üç baz çiftli bir DNA dizisini tanıyan önceden tanımlanmış çinko parmak alanlarının bağlanmasına dayanan bir yaklaşım geliştirdik. . Bu alanlar, yüksek özgüllüğe sahip benzersiz 18 baz çiftli DNA dizilerini tanımak için birleştirilebilir. Burada, 16 5'-CNN-3' alt bölgesinin 15'ine bağlanan çinko parmak alanlarının gelişimini ve karakterizasyonunu rapor ediyoruz. Bu alanlar, faj görüntüleme seçimi, siteye yönelik mutajenez ve de novo tasarımın bir kombinasyonu yoluyla oluşturuldu. Ayrıca, bu alanlar, ERBB-2 promotörünü hedefleyen oldukça spesifik bir altı parmak proteini oluşturmak için kullanıldı. Düzenleyici alanlara kaynaştırıldığında, bu protein, endojen ERBB-2 geninin ekspresyonunu yukarı ve aşağı regüle etme yeteneğine sahipti. Bu önceden tanımlanmış çinko parmak alanları koleksiyonunun eklenmesiyle, çoğu 5'-CNN-3'-, 5'-GNN-3'- ve 5'-ANN-3' içeren diziler artık yönlendirilmiş gen için hızla hedeflenebilir. düzenlenmesi ve nükleaz bölünmesi.


MALZEMELER VE YÖNTEMLER

Protein bağlayıcı mikrodizi deneyleri

İki PBM 'all-10-mer' tasarımının dizileri http://hugheslab.ccbr.utoronto.ca/supplementary-data/C2H2_modularity/ adresinde verilmiştir. PBM'lerin tasarımı ve kullanımına ilişkin ayrıntılar başka bir yerde açıklanmıştır (41, 47, 49, 50). Plazmitler Ek Tablo S1'de listelenmiştir. ZFA'lar, SacI-BamHI fragmanları olarak, değiştirilmiş bir T7 güdümlü GST ekspresyon vektörü olan pTH5325'e klonlandı (bkz. Ek Verilerin Ek Belgesi). Kısaca, 25 µl'lik bir ortamda 150 ng plazmit DNA kullandık. laboratuvar ortamında RNase inhibitörü ve 50 μM çinko asetat ile desteklenmiş bir PURExpress In Vitro Protein Sentez Kiti (New England BioLabs) kullanılarak transkripsiyon/çeviri reaksiyonu. 37°C'de 2 saatlik bir inkübasyondan sonra, son bir PBS/%2 yağsız süt/ml başına 0.2 mg BSA/50 μM çinko asetat/0.1 karışımı için 137.5 ul protein bağlama çözeltisine 12.5 ul karışım ilave edildi. % Ara-20. Bu karışım daha önce PBS/%2 yağsız süt ile bloke edilen bir diziye ilave edildi ve bir kez PBS/%0.1 Tween-20 ve bir kez PBS/%0.01 Triton-X 100 ile yıkandı. Oda sıcaklığında 1 saatlik inkübasyondan sonra, dizi bir kez PBS/%0.5 Tween-20/50 uM çinko asetat ve bir kez PBS/%0.01 Triton-X 100/50 uM çinko asetat ile yıkandı. Cy5 etiketli anti-GST antikoru eklendi, PBS/%2 yağsız süt/50 uM çinko asetat içinde seyreltildi. Oda sıcaklığında 1 saatlik inkübasyondan sonra, dizi üç kez PBS/%0.05 Tween-20/50 uM çinko asetat ve bir kez PBS/50 uM çinko asetat ile yıkandı. Dizi daha sonra 2 μM çözünürlükte bir Agilent mikrodizi tarayıcı kullanılarak görüntülendi.

Mikrodizi verilerinin analizi

Görüntü spot yoğunlukları, ImaGene yazılımı (BioDiscovery) kullanılarak ölçülmüştür. Her 8-mer için göreceli tercihi tahmin etmek için iki farklı puan hesaplandı: Z-skor, her biri 8-mer içeren 16 veya 32 nokta boyunca ortalama sinyal yoğunluğundan hesaplanmıştır.E-skor' (zenginleştirme için), ROC eğrisinin Altındaki Alan'ın ( 41) bir varyasyonudur ve yüksek oranda tekrarlanabilir olduğu ve ayrı deneyler arasında karşılaştırmayı kolaylaştırdığı için burada kullanılır. Her ZFA, iki farklı evrensel mikrodizide (ME ve HK olarak belirlenmiş) test edildi. E-skor verileri metinde tartışılmıştır, ancak her ikisi de Z- ve E-skor verileri, http://hugheslab.ccbr.utoronto.ca/supplementary-data/C2H2_modularity/ adresindeki ek verilerde sağlanır. Mikrodizi verileri GEO'ya depolanmıştır (erişim numarası GSE25723).


TALEN'ler ve ZFN'ler

Dünya artık genomun hedeflenen düzenlenmesi için iki ana teknolojiye sahiptir: çinko parmak nükleazları (ZFN'ler) ve TAL efektör nükleazları (TALEN'ler). Prensipte bu teknolojiler, genomdaki hemen hemen her yeri hedefleyebilir ve oradaki DNA'yı düzenleyebilir. Bunlar zaten araştırma ve tıpta devrim yaratmaya başladı ve önümüzdeki yıllarda potansiyelleri çok büyük görünüyor, bu yüzden nasıl çalıştıklarına kafa yormak için oturdum.

Gen hedefleme, oldukça yeni olsa da, & #8217t olarak ZFN'ler veya TALEN'ler olarak yeni. 1980'lerin sonlarında, Cappechi, Evans ve Smithies, homolog rekombinasyonun hücresel sürecinin, yeni bir ilgi dizisi için genomik DNA'yı değiştirmek için kaçırılabileceğini anladılar. Homolog rekombinasyon - enzimlerin birbirine benzer iki DNA parçasını değiştirdiği yer –, tüm canlı organizmalara özgü bir mekanizmadır. Bakteriler bunu faydalı genleri birbirleriyle değiş tokuş etmek için kullanır, biz hayvanlar mayoz sırasında kromozom çiftlerimizi çaprazlamak için kullanırız, bu önemlidir, çünkü doğal seçilimin tüm kromozomlar yerine tek tek genler üzerinde etki etmesine izin verir. Aksi takdirde, gerçekten faydalı bir gen, gerçekten kötü bir genin hemen aşağısında olsaydı, asla pozitif seçilimin tadını çıkaramazdı. Her neyse, Cappechi, Evans ve Smithie, bir organizmada var olan bir gene homolog (yani benzer, özdeş olmayan) DNA yaratabilir ve bu DNA'yı bir hücrenin çekirdeğine sokabilirseniz, bu DNA'yı geçirgenleştirmek için elektroporasyon gerektiren bir hücrenin çekirdeğine yerleştirebilirseniz, bunu anladılar. hücre zarının yeniden birleşip hücrenin genomuna entegre olma şansı vardı. Bunu fare embriyonik kök hücrelerine uygulayarak ve çalışan genleri değiştirmek için genlerin mutant, işlevsel olmayan versiyonlarını fare genomunda yeniden birleştirerek, kendilerine 2007 Nobel Ödülü kazandıran bir başarı olan nakavt fareyi icat ettiler.

Bu başarı, o zamandan beri hemen hemen tüm ters genetiğin (yani bir genotip oluşturma, ortaya çıkan fenotipi inceleme) temeli olmuştur. Ama sadece parmaklarınızı çaprazlamak ve homolog DNA'nın yeniden birleşmesini ummak oldukça verimsiz bir süreçtir –, hücrelerin yalnızca çok küçük bir kısmı başarılı bir yeniden birleştirme elde eder.

Bu süreç kısmen verimsizdir, çünkü homolog rekombinasyon, önce DNA'nın ilgili bir yerde çift sarmallı bir kırılma geçirmesini ve ardından onarım mekanizmalarının, yeni (eski yerine) DNA'yı kırık uca kaynaştırarak bu kırılmayı onarmasını gerektirir. . Dolayısıyla, oturup bu süreci hızlandırmanın yollarını beyin fırtınası yapacak olsaydınız, ilk önce genomik DNA'yı kesme fikrine, çift zincirli kırılmayı yaratma fikrine varabilirsiniz.

Biyoloji, çift sarmallı kopmalar yaratmak için tam da böyle bir mekanizmaya sahiptir: kısıtlama enzimleri. Bazı bakteri türleri, istilacı bakteriyofajların (bakterileri enfekte eden virüsler) DNA'sını parçalamak için bu enzimleri geliştirdi. Bakteriler bu dizileri metillerler. sahip olmak Dost ateşini önlemek için DNA. Parlak. On yıllardır, biz insanlar bu mekanizmayı her türlü biyoloji protokolü için ele geçirdik. Geriye dönüp düşünürseniz, dizilemeden önceki günlerde onları adli tıp ve babalık testlerinde DNA parmak izi için kullandığımızı hatırlarsınız. Kısıtlama enzimleri, bağlanma özgüllüklerinde tek nükleotit çözünürlüğüne sahiptir, bu nedenle bir SNP, bir kısıtlama bölgesine sahip olmak ile bir kısıtlama bölgesine sahip olmamak arasındaki fark olabilir. Bu nedenle, iki farklı kişinin DNA'sını aynı kısıtlama enzimine maruz bırakırsanız, onları farklı yerlerden keserek farklı uzunluklarda parçalara neden olur. Sınırlama parçası uzunluk polimorfizmleri veya RFLP'ler olarak adlandırılan uzunluklardaki bu farklılıklar, OJ denemesinde belirgin bir şekilde öne çıkmıştır.

Kısıtlama enzimleriyle ilgili sorun, tanıma dizilerinin gerçekten kısa olması ve bu nedenle herhangi bir kısıtlama enziminin genomda yüzlerce veya binlerce yeri kesecek olmasıdır. Örneğin EcoRI ve SamI kısıtlama enzimlerinin tanıma siteleri:

Her biri sadece altı baz. Bunun yerine ihtiyaç duyulan şey, tüm genomdaki bir pozisyona özgü olacak kadar uzun olan çok daha uzun bir diziyi tanıyacak bir kısıtlama enzimiydi.

Meganükleazlar sadece budur. Ön eke rağmen, 1 milyon baz çifti dizisini, sadece 12-40 baz çifti dizisini tanımazlar, ancak çoğu durumda bu, tüm organizmanın genomunda bir ve yalnızca bir tanıma alanına sahip olmak için zaten yeterlidir. . Yani hedeflemek istediğiniz genomik site sadece olur bilinen bir meganükleaz tarafından tanınan diziyi taşımak için, o zaman iş başındasınız. Ama hedeflemek isteyebileceğiniz 4 18/2 olası 18 baz çifti dizisi vardır ve işi yapmak için sadece 4 18/2 farklı meganükleazla karşılaşmayacaksınız. İnsanlar yeni meganükleazlar üretmek için rastgele mutajenez ekranları kullanmayı denediler, ancak bir miktar başarılı oldular, ancak biz hala sadece hedeflemekten çok uzağız. herhangi olası sıra.

Meganükleazların yararlı olduğu kanıtlanmıştır ve bugün onları Cellectis'ten satın alabilirsiniz, hiçbir şekilde resmin dışında değildirler. Ancak bilimde asla devrim yapmadılar çünkü yeterince programlanabilir değillerdi. Teklifinizi yapmak için onları sıfırdan tasarlayamazsınız.

Cys'i girin2Onun2 çinko parmak proteini. Bunlar, transkripsiyon faktörleri olarak işlev gören, yani seçici olarak gen promotörlerine bağlanarak gen ekspresyonunu düzenleyen diziye özgü DNA bağlayıcı proteinlerdir. Biz insanlar da dahil olmak üzere birçok tür bunlara sahiptir (EGR1 geni bir çinko parmak transkripsiyon faktörünü kodlar). Ancak bir meganükleazdan daha fazla ‘yeniden programlanabilir’ olmayan binlerce transkripsiyon faktörümüz olsa da, çinko parmağın güzelliği modüler olmasıdır. Her çinko parmak, her biri bir DNA çift sarmalının ana oluğuna uyan ve seçici olarak 3 baz çiftli bir diziye bağlanan bir a-sarmallı iki ila dört alana sahiptir.

En yaygın olarak kullanılan çinko parmaklarda üç adet ‘parmak’ (DNA-bağlama alanı) bulunur, bu da sizin 9-baz özgüllüğünüz olduğu anlamına gelir. Çinko parmak proteinleri daha sonra çiftler halinde kullanılır ve size 18-baz özgüllüğü verir. Bu, istediğiniz hemen hemen tüm dizileri benzersiz bir şekilde hedeflemek için yeterlidir.

Çinko parmaklar kendi başlarına DNA'yı bağlarlar. Yani yapmanız gereken tek şey, bir geni aktive etmek için bir promotöre seçici olarak bağlanacak bir protein tasarlamaksa, orada işiniz biter. Ama onları DNA'da hedeflenen kırılmalar yaratmak için kullanmak istiyorsanız, onlarla birlikte gitmek için bir makasa ihtiyacınız var. Doğal olarak, çinko parmaklara kaynaştırabileceğiniz başka bir DNA parçalayan protein veya bir proteinin alanı ararsınız. Tüm kısıtlama enzimlerinin DNA parçalama yeteneği vardır, ancak protein katlanmasının ne kadar karmaşık olduğunu bilirsiniz: çoğu, DNA bağlama kabiliyetine bağlı DNA parçalama kabiliyetine sahiptir ve ikisini net bir şekilde ayıramazsınız. Ancak Sugisaki & Kanazawa 1981 tarafından izole edilen FokI kısıtlama enzimi, tam da ihtiyacınız olan şeye sahiptir: hiçbir dizi spesifikliği olmayan ve enzimin DNA-bağlama alanından tamamen ayrı işlev görebilen bir DNA parçalama alanı.

Şimdi, her biri toplam 18 baz çifti özgüllüğü için üç parmağa sahip, ilgilenilen bir bölgenin yukarı ve aşağı akışına bağlı ve her biri aralarında bir FokI DNA parçalama alanına kaynaşmış iki çinko parmak proteinini hayal edin. Bu bir çinko parmak nükleazı. İnsanlar, her protein üzerindeki FokI bölünme alanını biraz farklı hale getirebildiler ve DNA'yı ancak şu şekilde parçalayabildiler: heterodimerler (iki farklı FokI alanının kombinasyonu) yerine homodimerler, hedef dışı etkileri azaltmak için. Daha spesifik olmak için daha uzun süre kullanabilirsiniz: Sigma-Aldrich tarafından ZFN'leri satmak için tek ticari lisans altında satılan CompoZr özel ZFN'leri, 24 – 36 bazı tanır. (Bu arada, ZFN'ler patentli olsa da, yasal olarak kendinizinkini yuvarlayabilirsiniz ve Zinc Finger Consortium, ZFN'leri sentezlemek için açık kaynaklı protokoller ve bunları tasarlamak için yazılım sağlar.)

Çinko parmakların belirli bir DNA dizisini hedefleyen tasarımı, umduğunuz kadar mükemmel veya zarif değil: Googling ‘zinc finger code’'yi deneyin ve benden daha iyi şansınız olup olmadığına bakın. Alfa sarmalındaki hangi amino asit dizilerinin hangi DNA baz üçlülerine karşılık geldiğini gösteren güzel bir tablo umuyordum. Görünüşe göre o kadar basit değil çünkü parmaklar birbirleriyle etkileşiyor ve birbirlerinin katlanma özelliklerini değiştiriyor: “hem doğal hem de tasarlanmış çok parmaklı ZFP'lerde… tek tek parmaklar her zaman tamamen modüler birimler olarak işlev görmez” [Hurt 2003]. Bu yüzden hala biraz deneme yanılma var ve her zaman tam olarak istediğiniz sıralamayı hedefleyemezsiniz ve ideal sitenizden biraz uzakta başka bir siteye yerleşmeniz gerekebilir.

Buna rağmen, çinko parmakların oldukça devrimci olduğu kanıtlanmıştır. En ünlüsü, bugüne kadar yaşamlarımızdaki en müthiş biyolojik ilerlemelerden birinde rol oynamış olmalarıdır: HIV için kök hücre gen tedavisi. 1990'ların ortalarına gelindiğinde, insanlar HIV'in hücreleri enfekte etmek için bir reseptör olarak CD4 proteinine (CD4+ T hücrelerinde bulunur) ihtiyaç duyduğuna dair bir fikre sahipti. Samson 1996a, CCR5 genini karakterize etti; yardımcı alıcı HIV – için virüsün T hücrelerine girebilmesi için önce CD4'e sonra da CCR5'e bağlanması gerekir. Samson 1996b, gen ürününün 32bp çerçeve kayması silme (şimdi CCR5Δ32 aleli olarak adlandırılır) ile tamamen devre dışı bırakıldığı bir CCR5 aleli keşfetti. Bu allelin Avrupalılarda yaklaşık %10 sıklığı vardır (diğer popülasyonlarda görülmez) ve Samson, 723 HIV vakasında HIV pozitif hiçbir insanın bu allel için homozigot olmadığı ve hatta heterozigotların tüketildiği için HIV enfeksiyonuna direnç vermesi gerektiği sonucuna varmıştır. %35. Bu nedenle CCR5'in genomdan silinmesi HIV için potansiyel bir terapötik yol gibi görünüyordu. 2010 yılına kadar birkaç grup, farelerde CCR5'i bozmak ve HIV direnci üretmek için ZFN kullanmanın fizibilitesini gösterebilmişti. Perez 2008, insan CD4+ T hücrelerinde CCR5'i bozmak için ZFN'leri kullandı, CCR5 alellerinin yaklaşık %50'sinin bozulmasını sağladı ve ardından bu hücreleri bağışıklığı yetersiz NOG farelere nakletti ve CCR5-bozulmuş CD4+ hücrelerine sahip farelerin daha az virüs ürettiğini ve daha yüksek düzeyde tutulduğunu gösterdi. CD4+ hücre sayısı (her ikisi de HIV enfeksiyonu şiddetinin göstergesi), modifiye edilmemiş CD4+ hücreleri alan kontrol farelerine göre. Bu yaklaşım hızla devam etmekte olan bir klinik araştırmaya geçti (Ayrıca ZFN'lerin patentini elinde bulunduran şirket olan Sangamo'nun klinik denemesine yönelik bu kendi kendini destekleyen ancak iyi yazılmış girişine bakın). Diğer bir yaklaşım, modifiye edilmiş CD4+ hücrelerini nakletmek yerine, CD4+ hücrelerini oluşturan kök hücreleri modifiye etmek ve böylece kalıcı bir HIV-dirençli hücre kaynağı yaratmaktır. Holt 2010, tam olarak bunu, insan kordon kanından alınan, CCR5'i bozmayı hedefleyen ZFN'lerle transfekte edilen ve farelere nakledilen hematopoietik (kan oluşturan) kök hücreleri kullanarak yaptı. HIV, bozulmamış hücrelerin çoğunu hızla öldürerek, enfekte olma yeteneği olmayan bir homozigot CCR5 nakavt hücre popülasyonu bıraktı. Holt'un kök hücre kullanarak – yaklaşımı –, HIV'den tamamen kurtulmuş (bence) bir kişinin durumuna benziyor. Allers 2011, CCR5Δ32 homozigot olan uyumlu bir donörden kemik iliği nakli alan HIV pozitif bir lösemi hastası hakkında rapor veriyor, hasta artık HIV ile enfekte görünmüyor. Henüz hiç kimse bir hastanın kendi ZFN ile modifiye edilmiş hücrelerine bu tür bir nakil yapmadı, ancak sıradaki bu olabilir. (Bu tür bir prosedür, HIV'e ek olarak zaten hayatı tehdit eden lösemisi olan hastalarla sınırlıdır, çünkü kemik iliği nakli inanılmaz derecede risklidir).

Çinko parmak nükleazlarının tümü bu noktada büyümüştür, zaten klinik bir deneye tabi tutulmuştur. Ancak şu anda tüm vızıltı, yeni, nispeten test edilmemiş ancak çok umut verici bir alternatif hakkında: transkripsiyon aktivatör benzeri efektör nükleazlar veya TALEN'ler.

ZFN'ler ve biyolojideki diğer pek çok harika şey gibi, insanlar TALEN'leri sıfırdan icat etmediler – bunun yerine, yapmak istediğimiz şeyi yapmak için evrimleşmiş son derece uzmanlaşmış bir organizmadan biyolojik araçlar çaldık. TALEN'ler, DNA bağlayıcı proteinlerden yararlanır. Ksantomonas bakteri cinsi. Ksantomonas are plant pathogens that produce proteins to specifically bind to and up- or down-regulate promoter sequences in host genes important to the disease process – much like a transcription activator would. Hence the “transcription activator-like” part of the name. The central region of the TAL protein is made up of 17 to 18 repeats of the same 34 amino acid unit, with amino acids 12 and 13 of each unit determining what single DNA nucleotide it binds to. And unlike ZFNs, these units are pretty much completely modular and spell out an almost-unambiguous code for the targeted DNA sequence. Here’s the beautiful elegant table you’ve been waiting for:

Amino acids 12 & 13 DNA letter targeted
NI A
HD C
NN G or A
NK G
NG T

So with, say, 17 repeats = 17*34 = 578 amino acids plus the non-repeating C- and N-terminal sequences of a TAL, you can uniquely target a 17 base pair DNA sequence. Use two TALs and you can recognize 34 bases put FokI DNA-cleaving domains in between them, and you’ve got a TALEN.

The process for synthesizing TALENs – creating your custom amino acid sequence to bind the DNA sequence of interest, adding FokI, and so on – is not exactly trivial. For a 20-page protocol on how to make your own, see Sanjana 2012, and for some open source resources to help you design it, see Cornell University’s TALE-NT tools. Or you can buy a custom-designed one from Cellectis, which holds the exclusive commercial license on TALENs, for $5000.

TALENs are quite new at this point but have already been used in some cool applications. Ding 2013 reports on using them to make isogenic models of human disease – pairs of cell lines that are (theoretically) identical except for the single site of a disease-causing genetic mutation. (This is what we at Prion Alliance have proposed to do for FFI using ZFNs in our Rare Disease Challenge proposal). In practice, the cell lines didn’t turn out quite identical: the TALENs exhibited minimal off-target effects, but simply growing cells in culture leads to the gradual accumulation of mutations here and there (just as aging leads to gradual accumulation of somatic mutations in cells in your body).

Durai 2005, writing about ZFNs, says that making a double-stranded DNA break at an appropriate location can increase the efficiency of homologous recombination by 50,000-fold. But even with highly site-specific ZFNs or TALENs there is still no one ‘at the wheel’ making sure the ZFNs/TALENs and the new homologous DNA all end up at the right place at the right time and that DNA repair mechanisms stitch the chromosome back together in the way you want. So after you’ve used your ZFNs/TALENs you have to do sequencing to see what fraction of the cells got successful integration of the edits you were trying to make. In practice it will be some small-ish fraction of cells (say, anywhere from 1.6% to 34% in a recent report by Ding 2013) and so you’ll select those for your further experiments and cull the rest.

That’s one reason why these technologies are still a long ways from allowing us to perform gene therapy in every cell of an adult human. But in the immediate term, these will be amazing tools for research, letting us create new models of human diseases. In the slightly longer term, there is also the possibility that they’ll play a role in making it possible to transplant modified versions of your own cells back into your body, like they did in HIV. While that’s harder to do with brain than blood, Stem Cells Inc has already brought human neural stem cell transplants to the clinical development stage, so don’t rule it out.

update 2013-01-22: I just learned that the folks behind the Ding 2013 paper are sharing their plasmids through addgene.org as a public resource to help other researchers build their own TALENs. Awesome! Also another quick update: if you watched the Nature Biotechnology video on Youtube at the top of this post, you should be aware that this graphic at 1:24 is not really accurate:

The above graphic depicts the template for homology-directed repair (HDR) as being of the same length as the piece of DNA that was cut out of the original genome. In fact, HDR depends upon homology between the new piece of DNA and the existing, uncut parts of the genome, so the introduced piece of DNA on top that you are trying to knock into the genome would need to extend beyond the points of the cut. So it should look something more like this:

Although, while qualitatively more correct, even this graphic does not depict properly the uzunluk of homology required for HDR. For ZFNs, apparently the new template DNA can be just

100b longer than the cut site on each side. That’s a big improvement over conventional knock-in without ZFNs/TALENs, which requires several kb of homology on each side of the desired mutation.

update 2013-01-22 #2: The question arose today as to whether TALENs, like ZFNs, could be designed to only function as heterodimers so as to reduce off-target effects. The answer is yes: Cade 2012 uses ‘obligate heterodimer’ TALENs in zebrafish and compares the results to homodimeric TALENs. Predictably, the ‘obligate heterodimer’ TALENs have fewer off-target effects.

update 2013-01-22 #3: We also had a discussion about costs for TALENs. As mentioned above, Cellectis sells custom-designed TALENs for $5000 a pair. Buying the requisite kit from addgene will run you just $300, plus several days of labor (assuming you know what you’re doing!) And although U.S. patent application EP2510096A2 looks to preclude anyone but Cellectis from selling TALENs commercially, research institutions do produce them internally as a service to research groups within the institution. I’m told that the ‘all-in’ price for getting TALEN-modified cell lines runs about $14,000. That includes design and assembly of TALENs, screening for cells that take up the TALEN plasmids, then screening for successfully modified cells and unmodified wild-type cells.

update 2013-06-07: Sigh – outdated no sooner than it was posted! Şimdi the hot new genome-editing technology is CRISPR, see e.g. Cong 2013. Also a colleague pointed out that the screenshot from that YouTube video above is inaccurate in another way – most of the time you don’t need to make 2 double-stranded breaks, just one, in order to get homology-directed repair to kick in.

About Eric Vallabh Minikel

Eric Vallabh Minikel is on a lifelong quest to prevent prion disease. He is a scientist based at the Broad Institute of MIT and Harvard.


In vitro selection of zinc fingers with altered DNA-binding specificity

Makale Görünümleri, Kasım 2008'den bu yana tüm kurumlar ve bireyler arasında COUNTER uyumlu tam metin makale indirmelerinin toplamıdır (hem PDF hem de HTML). Bu metrikler, son birkaç güne kadar olan kullanımı yansıtacak şekilde düzenli olarak güncellenir.

Atıflar, Crossref tarafından hesaplanan ve günlük olarak güncellenen, bu makaleye atıfta bulunan diğer makalelerin sayısıdır. Crossref alıntı sayıları hakkında daha fazla bilgi edinin.

Altmetrik Dikkat Puanı, bir araştırma makalesinin çevrimiçi olarak aldığı dikkatin nicel bir ölçüsüdür. Çörek simgesine tıklamak, altmetric.com'da verilen makale için puan ve sosyal medya varlığı hakkında ek ayrıntılar içeren bir sayfa yükleyecektir. Altmetric Dikkat Puanı ve puanın nasıl hesaplandığı hakkında daha fazla bilgi edinin.

Not: Özet yerine, bu makalenin ilk sayfasıdır.


Videoyu izle: ขนมเปยะฟงเกอรนมสด แปงชนเดยว ไมตองแชถว วธทำละเอยดมากๆ ทำกนไดไมยากอรอยดวยจรา (Haziran 2022).