Bilgi

12.18: Ribozomlar - Biyoloji

12.18: Ribozomlar - Biyoloji



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Proteinlerin sentezi, bir hücrenin enerjisini diğer herhangi bir metabolik süreçten daha fazla tüketir. Her bir amino asidin bir amino grubu (NH2) ve bir karboksil (COOH) grubu. Bu reaksiyon ribozomlar tarafından katalize edilir ve bir su molekülü oluşturur.

Protein Sentez Makinaları

mRNA şablonuna ek olarak, birçok molekül ve makromolekül, çeviri sürecine katkıda bulunur. Her bileşenin bileşimi türler arasında farklılık gösterebilir; örneğin ribozomlar, organizmaya bağlı olarak farklı sayıda rRNA ve polipeptitten oluşabilir. Bununla birlikte, protein sentez makinelerinin genel yapıları ve işlevleri, bakterilerden insan hücrelerine karşılaştırılabilir. Çeviri, bir mRNA şablonunun, ribozomların, tRNA'ların ve çeşitli enzimatik faktörlerin girişini gerektirir.

Polisomlar

Bir mRNA çevrilmeden önce bile bir hücre, ribozomlarının her birini oluşturmak için enerji harcamak zorundadır. İçinde E. koliHer hücrede herhangi bir zamanda 10.000 ile 70.000 arasında ribozom bulunur. Bir ribozom, yapısal ve katalitik rRNA'lardan ve birçok farklı polipeptitten oluşan karmaşık bir makromoleküldür. Ökaryotlarda nükleolus, rRNA'ların sentezi ve montajı için tamamen özelleşmiştir.

Ribozomlar prokaryotlarda sitoplazmada, ökaryotlarda sitoplazmada ve kaba endoplazmik retikulumda bulunur. Mitokondri ve kloroplastların ayrıca matris ve stromada, sitoplazmada dış zarlarının hemen dışındaki ribozomlardan daha çok prokaryotik ribozomlara benzeyen (ve benzer ilaç duyarlılıklarına sahip olan) kendi ribozomları vardır. Ribozomlar, protein sentezlemedikleri zaman büyük ve küçük alt birimlere ayrışırlar ve translasyonun başlaması sırasında yeniden birleşirler. koli, küçük alt birim 30S olarak tanımlanır ve büyük alt birim 50S olmak üzere toplam 70S'dir (Svedberg birimlerinin katkı maddesi olmadığını hatırlayın). Memeli ribozomları, toplam 80S için küçük bir 40S alt birimine ve büyük bir 60S alt birimine sahiptir. Küçük alt birim mRNA şablonunun bağlanmasından sorumludur, oysa büyük alt birim tRNA'ları sırayla bağlar. Her mRNA molekülü aynı anda birçok ribozom tarafından çevrilir, tümü aynı yönde protein sentezler: mRNA'yı 5'den 3'e kadar okumak ve polipeptidi N ucundan C ucuna sentezler. Tam mRNA/poli-ribozom yapısı, polisom.

TRNA'lar

tRNA'lar, RNA polimeraz III tarafından genlerden kopyalanan yapısal RNA molekülleridir. Türlere bağlı olarak, sitoplazmada 40 ila 60 tip tRNA bulunur. Adaptör görevi gören spesifik tRNA'lar, mRNA şablonundaki dizilere bağlanır ve ilgili amino asidi polipeptit zincirine ekler. Bu nedenle, tRNA'lar, aslında RNA dilini proteinlerin diline "çeviren" moleküllerdir.

64 olası mRNA kodonundan -veya A, U, G ve C üçlü kombinasyonlarından- üçü protein sentezinin sonlandırılmasını ve 61'i polipeptit zincirine amino asitlerin eklenmesini belirtir. Bu 61 kodondan biri (AUG) ayrıca çevirinin başlamasını da kodlar. Her tRNA antikodonu, mRNA kodonlarından biriyle baz çifti oluşturabilir ve genetik koda göre bir amino asit ekleyebilir veya translasyonu sonlandırabilir. Örneğin, CUA dizisi, uygun okuma çerçevesindeki bir mRNA şablonu üzerinde meydana gelirse, lösin amino asidine bağlanacak olan tamamlayıcı diziyi, GAU'yu ifade eden bir tRNA'yı bağlayacaktır.

Translasyonun adaptör molekülleri olarak, tRNA'ların bu kadar küçük bir pakete çok fazla özgüllük sığdırabilmesi şaşırtıcıdır. tRNA'ların üç faktörle etkileşime girmesi gerektiğini düşünün:

  1. Doğru aminoasil sentetaz tarafından tanınmaları gerekir.
  2. Ribozomlar tarafından tanınmaları gerekir.
  3. mRNA'da doğru diziye bağlanmaları gerekir.

Aminoasil tRNA Sentetazlar

RNA polimeraz III tarafından tRNA öncesi sentez süreci, yalnızca adaptör molekülün RNA bölümünü oluşturur. Karşılık gelen amino asit daha sonra, tRNA işlenip sitoplazmaya aktarıldıktan sonra eklenmelidir. Her tRNA molekülü, tRNA'nın "yüklenmesi" süreci boyunca, aminoasil tRNA sentetazları adı verilen bir grup enzim tarafından doğru amino asidine bağlanır. En az bir tür aminoasil tRNA sentetaz 20 amino asidin her biri için mevcuttur; aminoasil tRNA sentetazlarının tam sayısı türlere göre değişir. Bu enzimler, bir amino asit ve adenosin monofosfat (AMP) arasındaki yüksek enerjili bağı katalize etmek için önce ATP'yi bağlar ve hidrolize eder; Bu reaksiyonda bir pirofosfat molekülü dışarı atılır. Aktive edilmiş amino asit daha sonra tRNA'ya aktarılır ve AMP serbest bırakılır.


Ambigrammatik narnavirüslerin kalıcılığı, ters açık okuma çerçevesinin çevirisini gerektirir

Narnavirüsler, çeşitli mantarlarda, bitkilerde, protistlerde, eklembacaklılarda ve nematodlarda tespit edilen RNA virüsleridir. Başlangıçta RNA'ya bağımlı RNA polimerazı (RdRp) kodlayan basit tek genli segmentsiz virüsler olarak tanımlansalar da, "ambigrammatik" olarak adlandırılan bir narnavirüs alt kümesi, zıt iplikler üzerinde kodlanmış örtüşen açık okuma çerçevelerinden (ORF'ler) oluşan benzersiz bir genomik konfigürasyon barındırır. . Filogenetik analiz, bu olağandışı genom organizasyonunu sürdürmek için seçimi destekler, ancak işlevsel araştırmalar eksiktir. Burada, örtüşen ORF'lerin narnavirüs replikasyonundaki fonksiyonel rolünü araştırmak için sivrisinek enfekte eden Culex narnavirus 1'i (CxNV1) bir model olarak kuruyoruz. CxNV1'de, bilinen proteinlere homolojisi olmayan bir ters ORF, RdRp'yi kodlayan 3.2 kb'lik segmentin neredeyse tamamını kapsar. Ek olarak, ikinci varsayılan CxNV1 segmentinde, 0.8 kb "Robin" RNA'da iki karşıt ve neredeyse tamamen örtüşen yeni ORF bulunur. Saf bir sivrisinek hücre hattında CxNV1'i başlatmak için bir sistem geliştirdik, ardından her iki segmentin kalıcılığı için işlevsel RdRp'nin gerekli olduğunu ve kalıcılık için RdRp segmentinde bozulmamış bir ters ORF gerektiğini gösterdik. Kalıcı olarak CxNV1 ile enfekte olmuş hücrelerin kütle spektrometrisi, bu ters ORF'nin çevirisi için kanıt sağladı. Son olarak, ribozom profili oluşturma, konakçı mRNA veya birlikte enfekte eden RNA virüsleri üzerindeki aktif olarak çevrilen ribozomlardan farklı olan dört CxNV1 RNA dizisinin tümü için çarpıcı bir ayak izi modeli verdi. Birlikte ele alındığında, bu veriler, potansiyel olarak viral RNA'yı ribozomlarla koruyarak, ambigrammatik narnavirüslerin kalıcılığı için çeviri sürecinin kendisinin önemli olduğu olasılığını yükseltir, böylece replikasyon ve iletim için şimdiye kadar tarif edilmemiş bir viral taktik önerir.

ÖNEM RNA virüslerini anlamamızın temeli, viral proteinleri kodlayan viral genom olarak hangi RNA iplik(ler)inin iletildiğinin bir açıklamasıdır. Ambigrammatik narnavirüsler kalıbı bozar. Genel olarak mantarlarda, bitkilerde ve böceklerde bulunan bu virüsler, viral genomun neredeyse tam uzunluğunu içeren, zıt ipliklerde kodlanmış iki örtüşen genin benzersiz özelliğine sahiptir. Bu tür kapsamlı örtüşme diğer RNA virüslerinde görülmez ve dizideki evrimsel esnekliğin azalması pahasına gelir. Bu çalışma, bu maliyeti dengeleyen faydaları araştırarak motive edilmiştir. Culex narnavirus 1'deki ambigrammatik genom konfigürasyonu için ilk kez fonksiyonel bir gereklilik gösteriyoruz; bu, her iki zincirin translasyonunun bu virüse nasıl fayda sağlayabileceğine dair bir model önermektedir. Çalışmamız, kodlama zincirinin kanonik tanımlarıyla tanımlanan stratejilerden farklı olarak, viral kalıcılık için yeni bir planı vurgulamaktadır.


Ubiquitin Bağlantıları Kirpi Sinyalini Düzenlemek İçin İntraflagellar Transporta Düzleştirildi

Kirpi ligandının yokluğunda, yamalı-1 (Ptch1) kirpiklere yerleşir ve siliyer birikimini ve pürüzsüzleştirilmiş (Smo) aktivasyonunu önler. Ligand bağlanması üzerine, Ptch1 kirpiklerden çıkarılır, Smo baskılanır ve sinyallemeyi aktive ettiği kirpiklerde birikir. Bu dinamik hareketleri düzenleyen mekanizmalar iyi anlaşılmamıştır, ancak Ift27 ve BBSome dahil olmak üzere intraflagellar taşıma bileşenlerindeki kusurlar, yol aktivasyonu olmadan kirpiklerde Smo'nun birikmesine neden olur. Ligand kaynaklı yol aktivasyonunun yokluğunda, Smo'nun her yerde bulunduğunu ve kirpiklerden çıkarıldığını ve bu işlemin Ift27 ve BBSome bileşenlerine bağlı olduğunu bulduk. Kirpi sinyalinin aktivasyonu, Smo ubiquitination'ı ve siliyer uzaklaştırılmasını azaltarak birikmesine neden olur. Bir E1 ligaz inhibitörü tarafından veya hücre içi döngü 3'teki iki lizin tortusunu mutasyona uğratarak Smo'nun yaygınlaştırılmasının bloke edilmesi, Smo'nun yol aktivasyonu olmadan silialarda anormal bir şekilde birikmesine neden olur. Bu veriler, alıcının her yerde bulunma durumunu düzenleyerek kirpi sinyali sırasında Smo'nun siliyer seviyesini kontrol etmek için bir mekanizma sağlar.

Özet Kirpi sinyali, alıcıların ve efektörlerin kirpiklerin içine ve dışına dinamik hareketini içerir. Smo dinamiklerinin, bu reseptörün siliyer seviyelerini kontrol etmek için intraflagellar taşıma sistemi ile etkileşimini düzenleyen ubiquitination tarafından düzenlendiğini bulduk.


12.18: Ribozomlar - Biyoloji

Anlamayan sizler için:
Talimatları okuyun, hepsi orada anlatılıyor!

Oy vermek ve yorum yapmak için giriş yapın / kaydolun!

Newgrounds hesapları ücretsizdir ve kayıtlı kullanıcılar daha az reklam görür!

İyiydi ama fazla kolaydı. Bence oyuncu "oyna" yı tıkladığında talimatları göstermelisin, biliyorsun, talimatları gösteriyorsun ve aşağıdaki oyunu oyna buton.

Ve pac-man ile molekülleri yediğin için puan vermemelisin.

Bayıldım! Eğitimi eğlenceli hale getirmenin yolu! Bu bir proje için miydi yoksa sadece eğlenmek için mi yaptın? Çünkü öldürücü bir biyoloji projesi olurdu!

Hem proje hem de eğlence için aslında. Ben de bunun için iyi bir not aldım!
İyi ki beğenmişsin! Teşekkürler!

Tamam olduğunu düşündüm ve tüm talimatları okursanız o kadar da karmaşık değil.

İyi konsept ama ekranı onlarla doldurduğunuzda bile, sizi öldürmek üzere olan doğru kodonla eşleşmediğinde sahip olabileceğiniz antikodonların sınırı ile bunu çok zorlaştırıyorsunuz. İyi fikir, sadece biraz düzeltmeye ihtiyacı var.

Çok uğraştırmış gibi ama nasıl oynayacağımı bulamadım. Bu oyunu oynamak için rna hakkında çalışma bilgisine ihtiyacınız var gibi görünüyor.

RNA'nın ne olduğunu biliyor musun?
Talimatları okuyun lütfen. Bu bir oyun, talimatlara göre oynuyorsunuz.
Umarım seni kızdırmışımdır :)


Bölüm 2: Ribozom Tarafından mRNA Gözetimi

00:00:07.22 Merhaba. Benim adım Rachel Green
00:00:09.14 ve Johns Hopkins Üniversitesi Tıp Fakültesi'ndeyim
00:00:12.01 ve Howard Hughes Tıp Enstitüsü'nde.
00:00:14.12 Bugün sizinle paylaşacaklarım
00:00:15.20 kendi laboratuvarımdan bir hikaye
00:00:17.06 ribozomun nasıl olduğuna odaklanarak,
00:00:18.21 ökaryotik hücrelerde,
00:00:19.29 kötü haberci RNA'ları tanımlar
00:00:21.24 hücrede bir dizi olayı tetiklemek için
00:00:24.15 eksik protein ürününün bozulmasına yol açan,
00:00:27.15 haberci RNA bozulmasına,
00:00:29.01 ve ribozom kompleksinin geri dönüşümüne.
00:00:33.02 Peki, hangi haberci RNA kusurlu
00:00:35.02 hücrede izlemek ister misin?
00:00:36.28 Sorun ne olabilir
00:00:39.00 ökaryotik bir hücrede belirli bir haberci RNA ile mi?
00:00:42.03 mRNA işleme hakkında öğrendiklerimizden hatırladığımız gibi,
00:00:44.04 ökaryotik haberci RNA'ların
00:00:46.06 çekirdekten bir kapakla çık
00:00:48.01 5' sonunda
00:00:49.08 ve 3' ucunda bir polyA kuyruğu ile,
00:00:51.20 ve bunlar ökaryotik hücrelerde bir haberci RNA üzerindeki anahtar imzalardır.
00:00:55.08 ribozomu söyler
00:00:57.02 bunun iyi bir mesaj olduğunu
00:00:58.13 ve bunun tercüme edilmesi gerektiğini.
00:01:00.12 Ayrıca, tipik haberci RNA'ların
00:01:02.05 bir başlangıç ​​kodonu var
00:01:03.18 açık okuma çerçevesinin başlangıcını işaret eder
00:01:05.21 ve bir durdurma kodonu
00:01:07.24 açık okuma çerçevesinin sonunu belirtir,
00:01:09.26 ve hücrenin yapmak istediği şey
00:01:11.13 başlangıçta başlar ve sona gider
00:01:13.07 ve tam uzunlukta bir protein yapın.
00:01:15.03 Peki, ne yanlış gidebilir?
00:01:16.05 Pek çok olay olabilir
RNA işlemede veya mutasyonlarla 00:01:18.24
00:01:21.01 bir haberci RNA ile sonuçlanır
00:01:22.22 bu aslında optimal olmayabilir.
00:01:24.20 Birçoğunuzun duymuş olabileceği bir örnek
00:01:26.18, örneğin, eğer bir haberci RNA ise
00:01:28.22 bir erken sonlandırma kodonu içerir.
00:01:30.12 Yani, bunun yerine
00:01:32.10 açık okuma çerçevesinin sonunda sadece bir durdurma kodonuna sahip,
00:01:34.14 onlar, başka bir sürecin mutasyonu ile
00:01:36.22 - belki yanlış bir ekleme işlemi -
00:01:38.04 gelen bir sonlandırma kodonu var
00:01:40.28 açık okuma çerçevesinin başlarında.
00:01:42.06 Şaşırtıcı bir şekilde ökaryotik hücreler
00:01:43.21 yerinde bir mekanizma var
00:01:45.19 bir sonlandırma kodonunun olup olmadığını belirlemek için
00:01:47.01 doğru sonlandırma kodonu veya yanlış sonlandırma kodonudur.
00:01:50.24 Ve bu olaylar dizisini tetiklerler
00:01:52.08 sonuçta haberci RNA bozulmasına yol açar.
00:01:54.27 Olası bir soruna başka bir örnek
00:01:57.12 haberci RNA ile
00:01:58.20, endonükleolitik olarak bölünmüş bir haberci RNA olacaktır.
00:02:00.12 Haberci RNA bir bölünme aldıysa
00:02:02.14 ortasında,
00:02:03.26 ribozom sonunda asla bir durdurma kodonuna ulaşamaz,
00:02:06.12 ve ribozom sıkışır
00:02:07.29 bir durdurma kodonunun yokluğunda
00:02:09.08 ve normal fesih sürecini teşvik etme yeteneği.
00:02:11.27 Yani, bu bir haberci RNA
00:02:13.08 hücrenin kurtulmak ve bir daha kullanmamak istediği.
00:02:15.15 Aynı zamanda o tamamlanmamış polipeptit ürününden de kurtulmak istiyor.
00:02:19.25 Olabileceğini hayal edebileceğiniz son bir örnek
00:02:22.27 haberci RNA'nın aslında bir durdurma kodonu olmayabileceğidir,
00:02:25.25 bazı yanlış ekleme olayı veya mutasyon yoluyla,
00:02:28.02 ve bu durumda ribozom
00:02:29.14 aslında sonuna kadar gidebilir
00:02:32.16 o genin 3' çevrilmemiş bölgesi
00:02:35.06 ve bir polyA kuyruğuyla karşılaşın.
00:02:37.02 PolyA, lizini kodlar,
00:02:38.16 ve ne olduğu düşünülüyor
00:02:40.04 ribozomun lizin-lizin-lizin-lizin ürettiğini algılaması,
00:02:42.27 ve bir süreci tetikler
00:02:47.22 hücrede çürüme ve kurtarma
00:02:49.08 durmaksızın bozunma olarak adlandırdığımız.
00:02:50.21 Yani, Saçma Aracılı Bozunma,
00:02:51.27 Hareketsiz Çürüme,
00:02:53.00 ve Kesintisiz Çürüme
00:02:54.14 muhtemelen birbiriyle ilişkili üç süreçtir
00:02:56.01 hepsi hedeflendi
00:02:57.26 u hücresinde kontrol altında tutmak için
00:02:59.12 nüretken haberci RNA'lar,
00:03:01.04 haberci RNA'lardan kurtulmak,
00:03:02.19 protein ürününün bozulması,
00:03:04.02 ve ribozomları kurtarmak
00:03:05.20 sonraki çeviri olayları için,
00:03:07.04 ve bugünkü dersin odak noktası da bu olacak.
00:03:10.06 Peki, nasıl ilgilenmeye başladık
00:03:11.18 bu çürüme süreçlerinde,
00:03:13.20 mRNA gözetimi?
00:03:14.27 İlgi duymaya başladık
00:03:16.27 çünkü literatürde fark ettik
00:03:18.16 ilginç bir gözlem.
00:03:19.28 Birkaç yıl boyunca,
00:03:21.11 fesih sürecini inceledik
00:03:24.25 ökaryotik sistemlerde,
00:03:26.17 burada bir durdurma kodonu tanınır
00:03:28.20 ökaryotik hücrelerde sonlandırma faktörlerine göre
00:03:31.02 büyüyen polipeptit zincirini serbest bırakmak için.
00:03:32.27 Ve biz bu faktörleri inceledik
00:03:34.04 ve biyokimyasal olarak nasıl çalıştıkları
00:03:35.16 birkaç yıldır.
00:03:37.20 Roy Parker'ın laboratuvarından çıkan bir yayın vardı, ancak,
00:03:40.06 Roy'un laboratuvarının mayadaki bir haberci RNA'ya yerleştirdiği yer
00:03:43.06 uzun bir gövde-döngü yapısı
00:03:44.26 - 34 baz çifti uzunluğundaydı, bu gövde -
00:03:48.08 ve aslında çok büyük bir yapıydı
00:03:49.28 hiçbir ribozomun kolayca içinden geçemeyeceği.
00:03:53.10 Ve Roy'un laboratuvarının gözlemlediği şey
00:03:55.08 bu haberci RNA
00:03:58.00 ökaryotik hücrede çürüme hedeflendi
00:03:59.22 No-Go-Decay adını verdiği bir süreçte,
00:04:01.12 çünkü ribozom bunu geçemez,
00:04:03.19 ancak bu çalışmadaki temel gözlem
00:04:06.06, bu mRNA bozunma sürecinin
00:04:07.21 iki proteine ​​bağımlıydı,
00:04:09.05 Dom34 ve Hbs1,
00:04:11.24 homolog olduğu ortaya çıktı
00:04:13.26 ökaryotik sonlandırma faktörlerinin
00:04:16.06 eRF1 ve eRF3
00:04:17.24 çalıştığımız,
00:04:19.08 ve biz onları biyokimyasal olarak inceliyorduk.
00:04:21.08 Yani, bu önemli bir içgörü gibi görünüyordu,
00:04:22.16 çünkü önerdiği şey
00:04:24.06, kötü bir haberci RNA'nın tanınmasıydı
00:04:26.10 aslında şüphelenebileceğiniz gibi ribozom odaklıdır,
00:04:28.09 çünkü ribozom enzim olmalıdır,
00:04:31.15 veya katalizör veya makromolekül,
00:04:34.10 mesajın iyi olup olmadığına karar verir.
00:04:36.00 Çok mantıklı bir fikir gibi geldi
00:04:37.12 belirleyenin ribozom olduğu
00:04:39.08 haberci RNA'nın iyi mi kötü mü olduğu.
00:04:40.22 Çevirmeli miyim yoksa çevirmemeli miyim?
00:04:43.16 Ve işte bizim işimiz burada başladı.
00:04:46.12 Dom34'ün eRF1'in bir homologu olduğunu biliyorduk
00:04:48.10 ve buradaki bu yapısal görüşte bu vurgulanıyor.
00:04:50.18 eRF1 ve Dom34'ün bilinen yapıları vardı.
00:04:53.24 eRF1, durdurma kodonlarını tanımada,
00:04:55.16 burada bir kodon tanıma motifi var
00:04:57.21 NIKS etki alanı olarak adlandırılır,
00:04:59.21 ve en üstte, ribozomun büyük alt birimiyle etkileşime girerek,
00:05:02.17 bir tri-amino asit motifidir, bir GGQ motifidir,
00:05:06.01 peptit salınımının katalizinden sorumludur.
00:05:09.17 Dom34'ün benzer domainlere sahip olduğunu görüyoruz.
00:05:12.08 Bu alan açıkça bu alanla ilgili
00:05:14.16 - bunu beta sayfaları açısından görebilirsiniz
00:05:16.01 ve alfa sarmalları.
00:05:18.02 Ancak, GGQ motifli bu alan eksik
00:05:20.18 büyüyen polipeptit zincirini serbest bırakmaktan sorumlu olacak.
00:05:24.06 Ayrıca görüyoruz ki
00:05:25.29 kodon tanıma motifi yok,
00:05:27.10 ama diğer ortak özellikleri
00:05:29.10 bu alana sahipler mi, burada,
00:05:30.29 GTPaz'larla etkileşime girdiği bilinen
Sonlandırma adımı için gerekli olan 00:05:33.05.
00:05:35.08 Bu bizim başlangıç ​​noktamızdı.
00:05:36.29 Şuna benzeyen bir proteinimiz vardı:
00:05:38.26 bir sonlandırma faktörüyle ilgiliydi,
00:05:40.08 ve ribozomu devreye sokmamız gerektiğinden şüphelendik,
00:05:42.08 ve biyokimyasal araçlara sahiptik
00:05:44.00 soru sormak için kullanmak istediğimiz
00:05:46.00 Dom34'ün neler yapabileceği hakkında
00:05:47.20 haberci RNA bozunmasını sağlamak için
00:05:49.20 Roy Parker'ın laboratuvarının gözlemlediği.
00:05:52.20 Bu fikirleri göz önünde bulundurarak,
00:05:53.28 Dom34 ve Hbs1'i dahil ettik.
00:05:57.20 sonlandırma faktörlerinin bu homologları,
00:05:59.19 laboratuvarımızda mevcut olana,
00:06:02.08, in vitro yeniden yapılandırılmış bir çeviri sistemidir
00:06:05.07 Saccharomyces cerevisiae mayasından.
00:06:09.15 Laboratuvarımızda, dondurucuda,
00:06:11.00 ribozomun bileşenlerini saflaştırdık,
00:06:12.24 ribozomun küçük ve büyük alt birimleri.
00:06:14.17 tRNA'larımız vardı, haberci RNA'larımız,
00:06:17.11 Beş temel başlatma faktörümüz vardı
00:06:19.04 John Lorisher'ın laboratuvarının gerekli olduğunu gösterdiği
00:06:21.07 in vitro başlatma için
00:06:23.17 bir AUG kodonunda
00:06:24.26 ve başlatıcı tRNA'yı ribozoma sokmak,
00:06:27.17 uzama faktörlerimiz vardı,
00:06:28.20 sonlandırma faktörlerimiz vardı,
00:06:29.28 ve bu listeye Dom34 ve Hbs1'i ekledik.
00:06:33.19 Böyle yeniden yapılandırılmış bir sistem bize ne yapmamızı sağlar?
00:06:35.28 ribozom kompleksleri oluşturmak içindir
00:06:38.02 çeşitli haberci RNA'lar ile
00:06:39.18 çeşitli peptitlerin belirtilmesi
00:06:44.24 ve çeviri sistemindeki diğer adımlar.
00:06:46.12 Örneğin,
00:06:47.21 ribozomun aminoasil bölgesine giden bir durdurma kodonu
00:06:49.15 bir faktör tarafından tanınmak,
00:06:50.16 veya bir duyu kodonu yerleştirebiliriz,
00:06:52.05 ve bu komplekslerin aktivitelerini takip edebiliriz.
00:06:55.07 Burada gösterilen mavi bir top
Büyüyen polipeptit zinciri için 00:06:56.28,
00:06:58.02 etiketleyebileceğimizi belirtmek için
00:07:00.08 tRNA substratları,
00:07:01.14 tRNA'ları etiketleyebiliriz,
00:07:02.20 amino asitleri etiketleyebiliriz,
00:07:04.03 haberci RNA'ları etiketleyebiliriz,
00:07:05.10 ribozomları etiketleyebiliriz,
00:07:07.03 ve sistemdeki çeşitli bileşenlerin kaderini takip edebiliriz
00:07:09.29 biyokimyasal reaksiyonlar hakkında soru sormak için.
00:07:12.22 Ve biz de öyle yaptık,
00:07:14.24 ve size bir örnek göstereceğim
00:07:16.08 gerçekleştirdiğimiz bir biyokimyasal reaksiyonun
00:07:18.04 bir şeyler öğrenmek
00:07:19.26 Dom34 ve Hbs1 işlevi hakkında,
00:07:22.06 bu faktörlerin anlaşılması
00:07:23.23 gerçekten az önce mRNA bozulmasına dahil olmuştu
00:07:25.17 ve gerçekten bilinmiyordu
00:07:27.15 ribozom üzerinde yapabilecekleri.
00:07:28.28 Peki, bu durumda ne yaptık
00:07:30.16 biyokimyasal sistemimizi mi kullandık
00:07:31.28 iki farklı ribozom kompleksini yeniden oluşturmak için.
00:07:34.08 Soldaki için,
00:07:37.00 Yaptığımız şey bir kompleks oluşturmak,
00:07:38.20 bir dipeptidil-tRNA,
00:07:39.21 burada P bölgesinde bir tRNA üzerinde iki amino asidimiz var
00:07:42.06 - Başlayarak ve uzatarak oraya ulaştık
00:07:44.28 bir tur protein sentezi için -
00:07:46.18 ve A bölgesine bir durdurma kodonu yerleştirdik,
00:07:48.03 ama sonuçta önemli değil.
00:07:49.15 Ve bu komplekste
00:07:51.14 Amino asidin etiketlendiğini görüyoruz.
00:07:52.24 Yani, metionil-tRNA üzerinde,
00:07:54.02 metiyonin radyoaktif bir etiket taşır.
00:07:56.17 Diğer tarafta da benzer bir kompleks oluşturduk, burada,
00:07:59.05 ama bu durumda tRNA'nın kendisi
00:08:01.01 radyoaktif olarak etiketlendi
00:08:02.08 ve tRNA'yı takip edebiliriz
00:08:03.24 amino asitler yerine.
00:08:06.20 Bu durumda,
00:08:07.28 biz bu kompleksleri aldık,
00:08:09.06 bu büyük ribozomal etiketli kompleksler
00:08:10.22 farklı yerlerde etiketlerle,
00:08:12.24 ve onları doğal bir jel üzerinde çalıştırdık.
00:08:14.16 Yerel bir jel onların çalışmasına izin verir
00:08:16.10 aşağı yukarı bozulmamış
00:08:17.12 tüm bileşenleri orada.
00:08:18.28 Ve etiketin nereye gittiğini sorduk.
00:08:21.02 Jelin tepesinde,
00:08:22.12 bozulmamış ribozom kompleksi çalışır
00:08:23.26 burada 80S konumunda.
00:08:26.10 Ve gördüğümüz şey, herhangi bir faktörün yokluğunda
00:08:28.19 büyük bir 80S kompleksi olarak çalışıyor.
00:08:30.27 Ancak eRF1 ve eRF3'ü eklediğimizde
00:08:32.20 - bilinen sonlandırma faktörleri -
00:08:34.08 tam olarak beklediğimiz şey oluyor,
00:08:36.13, buradaki durumda
00:08:38.27 peptidi takip ettiğimiz yerde,
00:08:40.06 peptidi serbest bırakırız,
00:08:41.24 dipeptid Met-Phe.
00:08:44.08 Burada sağda,
00:08:45.15 etiketlenmiş bir tRNA'mız var,
00:08:46.28 ne olur tRNA burada üretilir
00:08:50.01 - bu deasile edilmiş bir tRNA'dır
00:08:51.12 amino asitler eksik.
00:08:53.14 Bu, sonlandırma faktörlerine sahip serbest bırakılan üründür.
00:08:56.04 Sonra ne olduğunu sorduk
00:08:57.23 Dom34 ve Hbs1'i eklediğimizde
00:08:59.04 rol oynuyor gibi görünen bu faktörler
00:09:00.26 mRNA gözetiminde,
00:09:02.03 ama ribozom üzerinde ne yaptıklarını bilmiyoruz,
00:09:03.19 ve farklı bir grubun ortaya çıktığını gördük,
00:09:05.21 burada - bir peptit bandı değil -
00:09:07.23 ve burada farklı bir grup
00:09:09.10 - deasile edilmiş bir tRNA bandı değil.
00:09:11.28 Ve o sırada akıl yürüttüğümüz şey
00:09:14.16 yaygın olan bir grup gördüğümüzde
00:09:15.26 bu iki farklı komplekse,
00:09:18.06 ama sonuçtan farklı
eRF1 ve eRF3 ile reaksiyonun 00:09:20.14
00:09:22.28 Bunun bir peptidil-tRNA olabileceğini düşündük.
00:09:25.04 Aslında olan buydu
00:09:26.26 Dom34 ve Hbs1 idi.
00:09:28.05 bu ribozom kompleksleriyle etkileşime girdiğinde,
00:09:29.27 aslında sürümle sonuçlanıyor
tüm peptidil-tRNA kompleksinin 00:09:32.07,
00:09:34.12 ve bunu teyit edebildik
00:09:36.04 peptidil hidrolaz olarak bilinen farklı bir reaktif ekleyerek,
00:09:38.12 serbest peptidi serbest bırakır
00:09:40.12 veya serbest tRNA.
00:09:41.22 Yani bu önemli bir biyokimyasal reaksiyondu
Eskiden tanımladığımız 00:09:43.28
00:09:46.10 Dom34 ve Hbs1 proteinleri için yeni bir aktivite,
00:09:49.22 ve bu aktivite önerildi
00:09:52.22 bu proteinlerin yaptıklarının o kısmı
00:09:54.08 ribozomları tanıyorlar mıydı?
00:09:55.16 ve istikrarı bozan bir olayı kolaylaştırıyorlardı
00:09:58.24 serbest bırakılmasına yol açtı
00:10:00.12 ribozomdan bir peptidil-tRNA.
00:10:03.01 Yani, bu bir biyokimyasal hikayenin başlangıcıydı
00:10:05.05 ve bu hikayenin bir nevi özeti.
00:10:07.21 Zamanla bulduklarımız
00:10:09.03 o bir ribozom kompleksiydi,
00:10:11.04 Dom34 ve Hbs1 ile sunulduğunda.
00:10:13.18 aslında Dom34 ve Hbs1 ne yaptı
00:10:16.10 ribozomal alt birimlerden etkili bir şekilde ayrıldı.
00:10:19.00 Peptidil-tRNA, büyük alt birim ile bölünme eğilimindeydi,
00:10:22.06 polipeptit zincirinin uzunluğuna bağlıdır.
00:10:25.06 Bulduğumuz şey, Dom34 ve Hbs1'in bu reaksiyonunun
00:10:27.26 kodondan bağımsızdı.
00:10:29.12 Bu yapıyla tutarlıydı
Birkaç slayt önce size gösterdiğim 00:10:31.08
00:10:33.04 burada bu proteinde kodon tanıma alanı yok, Dom34.
00:10:36.25 Peptitin tRNA'dan salınmadığını gördük.
00:10:39.02 Bu, Dom34 proteininin
00:10:42.12, bu aktiviteden sorumlu olan GGQ motifinden yoksundur
00:10:45.24 sonlandırma faktörlerinde.
00:10:48.04 Ve bir kenara, bu proteinler
00:10:50.10 alt birimleri ayırmayı tercih ediyor
00:10:52.18 haberci RNA şablonu burada kısa olma eğiliminde olduğunda.
00:10:55.08 Yani, haberci RNA kısaysa
3' ucundan 00:10:56.26
00:10:58.24 ribozomun duvarına geliyor,
00:11:00.16 aslında bunun tercih edilen bir biyokimyasal substrat olduğunu bulduk
00:11:03.02 bu proteinler için.
00:11:05.03 Peki, tüm bunlar ne kadar mantıklı?
00:11:06.19 Dom34 ve Hbs1 hakkında bildiklerimize göre
00:11:08.19 Sözde No-Go-Decay sürecinde mi?
00:11:11.08 Aynı zaman diliminde
00:11:13.06 biyokimyasal reaksiyonlar gerçekleştirdiğimiz
00:11:14.26 Bunu in vivo olarak inceleyen çok sayıda laboratuvar vardı,
00:11:17.02 ve bir dizi önemli anlayışla ortaya çıktılar,
00:11:19.02 özellikle, Toshi Inada'nın laboratuvarı.
00:11:20.27 Ve sunduğu modellere uyuyor,
00:11:22.16 fikir şu ki ribozom sıkışıyor
00:11:24.22 haberci RNA'da belirli bir yerde,
00:11:27.08, örneğin, büyük bir kök halka yapısı olabilir.
00:11:30.18 Aslında gerçekleşen bir endonükleolitik bölünme var
00:11:32.26 ribozomun arkasında,
00:11:34.06 ve bu Toshi'nin laboratuvarında belgelendi,
00:11:36.14 endonükleolitik olarak bölünmüş bir haberci RNA'ya yol açar.
00:11:39.24 Ve birçok ribozom olduğu düşünülürse
00:11:42.22 herhangi bir haberci RNA üzerinde,
00:11:43.29 Bunun anlamı tüm ribozomlar
00:11:45.16 endonükleolitik bölünme bölgesinin arkasından gelen
00:11:48.02 endonükleolitik olarak bölünmüş uçla karşılaşır,
00:11:51.18 ve bunların bu proteinler için ideal hedefler olacağını,
00:11:53.17 Dom34 ve Hbs1.
00:11:55.02 Bu faktörlerin yokluğunda,
00:11:56.25 ribozom mesaja takıldı
00:11:58.22 inmenin hiçbir yolu yok.
00:12:00.06 Ve bu faktörlerin izin verdiği şeyler
00:12:03.02 bu ribozom komplekslerinin geri dönüşümü içindir
00:12:04.24 kusurlu haberci RNA'larında,
00:12:06.12 geri dönüşüm reaksiyonuna yol açıyor
00:12:08.04 ve bu ribozomların yeniden kullanımı.
00:12:11.08 Yani, biyokimyasal verilerimiz güzel bir şekilde uyuyor
00:12:14.07 sahadaki diğer sonuçlarla birlikte
00:12:15.20 bozulmamış hücrelerde gerçekleşiyordu.
00:12:17.25 Ve bunlar bizim düşüncelerimizdi,
00:12:19.19 ve bundan sonra daha genel bir soru sormak istedik.
00:12:22.02 Bu proteinlerin biyokimyasal aktivitelerini bilmek,
00:12:24.18 ve bu proteinlerin nasıl çalıştığını biraz bilmek
00:12:26.15 muhtelif hücrelerde muhabirlere davrandı,
00:12:29.29 hakkında sorular sormak istedik
00:12:32.04 genel biyolojik önemi
00:12:33.21 kurtarma müdahalesi.
00:12:35.04 Bir hücrede tipik olarak hangi haberci RNA'lar hedeflenir?
00:12:37.07 Vahşi tür koşullarında aynıdır
00:12:39.20 veya stres koşullarında mı?
00:12:41.04 Ve bunu nasıl düşünebiliriz?
00:12:43.08 Başından beri Dom34'ün
00:12:45.02 mayada gerekli olmayan bir gendir,
00:12:47.14 ama bunun yüksek ökaryotlarda gerekli olduğunu biliyoruz.
00:12:49.26 Yüksek ökaryotlarda bu gene Pelota denir
00:12:52.01 ve farelerde embriyonik bir öldürücüdür.
00:12:55.14 Yani, yüksek ökaryotlarda önemli bir gen.
00:12:58.08 Ancak, mayadaki Dom34 silme işleminin
00:13:01.19 çeşitli farklı şeylerle sentetikti
00:13:04.06, örneğin,
00:13:05.26 ribozomal protein geninin silinmesi.
00:13:07.12 Ve bir ribozomal protein genini sildiğinizde,
00:13:10.01 örneğin, bir ribozomal protein geninin bir kopyası,
00:13:12.24 hücrede ribozom yetersizlikleri olduğunu,
00:13:15.22 çünkü biyogenez buna ayak uyduramıyor
00:13:17.24 yapması gerekenler ile.
00:13:19.06 Ve fikir şu olabilir:
00:13:21.02 ribozomlar için bir kurtarma faktörünü silerseniz,
00:13:23.06 ve bunu bir ribozom biyogenez kusuruyla bir araya getirin,
00:13:26.27 işte o zaman hücreler gerçekten hastalanır,
00:13:28.17 ve bu, sentetik ölümcüllüğü açıklar.
00:13:31.02 Ve bundan sonra gerçekten sormak istediğimiz soru
00:13:33.04, "Hücresel hedefler ne olabilir?
00:13:35.23 Dom34'ün işlevi ve Dom34 kurtarma için?"
00:13:38.10 Şanslıydık çünkü o zamanlar
00:13:40.16 bu fikirleri düşünüyorduk
00:13:41.29 Çevrimiçi olan yeni bir yaklaşım vardı
00:13:43.23 Jonathan Weissman'ın laboratuvarından
00:13:45.07 ve Nick Ingolia tarafından geliştirilmiştir,
00:13:46.23 laboratuarında doktora sonrası.
00:13:48.05 Ribozom profilleme olarak bilinen bir yöntemdi
00:13:49.22 sistematik olarak bakmanıza izin verir
00:13:52.03 bir hücredeki tüm ribozomların işgali sırasında
00:13:54.19 çeşitli mRNA şablonlarında.
00:13:56.26 Ve biz şunu düşündük:
00:13:58.22 Dom34 bir işlevi yerine getiren bir protein olsaydı,
Örneğin maya hücrelerinde 00:14:01.04,
00:14:02.26 Vahşi tipte bir türümüz ve bir nakavt türümüz olsaydı,
00:14:04.29 sorabiliriz
00:14:06.27 Dom34'ün maya hücrelerindeki rolü nedir
00:14:08.12 ribozomların nerede biriktiğini sorarak
00:14:10.21 bu proteinden yoksun suşlarda.
00:14:13.11 Ribozom profillemesinin arkasındaki temel fikir
00:14:15.19 tüm ribozomları alabilir misin
00:14:17.13 bir hücredeki haberci RNA'lar üzerinde bulunanlar,
00:14:18.28 ve bu haberci RNA'ları izole edebilirsiniz
00:14:20.14 kendilerine bağlı ribozomlarla.
00:14:21.29 Bir nükleaz kullanarak,
00:14:23.19 tüm özgür haberci RNA'yı sindirebilirsin,
00:14:25.22 haberci RNA'nın sadece küçük bir kısmını bırakarak
00:14:27.29 bir ribozom tarafından korunan,
00:14:29.24 ve bu korumalı mRNA biti
00:14:31.26, yaklaşık 30 nükleotit uzunluğundadır.
00:14:34.18 Daha sonra 30 kadar nükleotid uzunluğundaki haberci RNA'yı izole edebilirsiniz.
00:14:38.19 hücredeki tüm ribozomlardan,
00:14:40.10 Tümüyle sıralama için gönderebilirsiniz.
00:14:43.20 Yüz milyonlarca okuma alıyorsunuz
00:14:45.14 hücreden ribozom ayak izleri
00:14:47.01 ve doluluk nedir diye sorabilirsiniz
00:14:48.22 - mesajlardaki ribozomların küresel işgali -
00:14:51.08 bir hücrede.
00:14:53.20 Genellikle bu deneyi birleştirirsiniz
00:14:54.19 bir mRNA dizi deneyi ile,
00:14:56.08 bir hücredeki tüm haberci RNA'ları rastgele parçalara ayırdığınız yer
00:14:59.08 klonlama önyargılarını hesaba katabildiğinizden emin olmak için
00:15:01.14 ve bir hücreden gelen diğer potansiyel eserler,
00:15:03.16 ve sonra da sorabilirsiniz
00:15:05.11 Bir ribozomun belirli bir haberci RNA'yı ne kadar verimli bir şekilde işgal edeceği
00:15:07.20 çünkü her haberci RNA'nın ne kadarının mevcut olduğunu biliyorsunuz
00:15:10.12 ve kaç tane ribozom ayak izinin olduğunu biliyorsun.
00:15:13.24 Yani, kullanmayı düşündüğümüz deney buydu.
00:15:16.10 in vivo rolü hakkında soru sormak için
00:15:18.12 kurtarma faktörleri için.
00:15:20.02 Herkes gibi başladık,
00:15:21.18 bazı örnekler göndermek ve sistemin ne kadar iyi çalıştığını sormak,
00:15:24.08 ve bu bana bir fırsat veriyor
00:15:25.24 Bu tür verilerin neye benzediğini size göstermek için.
00:15:27.26 Yaptığımız şeye tabi olduk,
00:15:30.16 yabani tip mayadan ve Dom34 mutant mayadan
00:15:32.19 - kayıp Dom34 -
00:15:34.06 ribozom ayak izleri ve mRNA-seq verileri.
00:15:36.26 Bu verilerle yapabileceğiniz ilk şey
00:15:38.24, okuma çerçevelerine nasıl hizalandıklarını sorabilirsiniz.
00:15:41.14 Ve çok basit bir şekilde görebilirsiniz,
00:15:42.29 üstteki bu panelde,
00:15:45.07 eğer ribozom ayak izlerini alırsak
00:15:46.29 ağırlıklı olarak tek bir okuma çerçevesiyle eşleşirler
00:15:50.05 tüm açık okuma çerçeveleri içinde,
00:15:52.22 ribozomları düşündürüyor
00:15:54.11 aynı anda üç nükleotidi hareket ettiriyor
00:15:56.22 bir haberci RNA şablonu aşağı,
00:15:58.08 ve bu metodolojinin
00:16:00.22 bu üç nükleotid hareketi.
00:16:02.04 Ayak izi imzasında bir periyodiklik var.
00:16:05.20 Aksine, mRNA-seq verilerine bakabilirsiniz.
00:16:07.28 ve okumaların üç kareye de dağıldığını görün,
00:16:11.12 çünkü ribozom herhangi bir periyodiklik dayatmaz
00:16:13.02 bu çerçevelere
00:16:14.20 ve böylece tüm okuma çerçevelerine eşit olarak dağılırlar.
00:16:16.10 Yani bu, ele geçirdiğimizi düşündürdü
00:16:18.04 çeviriyle ilgili bir şey
00:16:20.14 ve bir haberci RNA şablonu boyunca üç nükleotid hareketi.
00:16:23.12 Açık okuma çerçevelerinde de bunun doğru olduğunu görebilirsiniz.
00:16:26.18 tüm başlangıç ​​kodonlarını hizalarsanız,
00:16:28.22 burada, genin başlangıcına,
00:16:31.16 ve tüm durdurma kodonlarını hizalayın
00:16:33.04 ve ortalama gen veya metage analizi dediğimiz şeyi yaparsınız.
00:16:36.14 her şeyden önce, mRNA-seq'in okuduğunu görebiliyorsunuz,
00:16:39.04 yeşil,
00:16:40.22 açık okuma çerçevesi boyunca dağıtın,
00:16:42.11 ve genin çevrilmemiş bölgelerinde, burada,
00:16:45.06 ve genin 3' ucunda.
00:16:47.04 Yani, bu bölgeler mesajın tamamına dağıtılır.
00:16:49.07 Buna karşılık, ribozom ayak izleri
00:16:51.05 açık okuma çerçevesi boyunca dağıtın,
00:16:53.07 'start' ile başlayıp 'stop' ile bitiyor.
00:16:56.03 Ve aslında buradaki bu verilerde,
00:16:57.23 Üç nükleotid periyodikliğinin ortaya çıktığını görebilirsiniz.
00:16:59.23 Kendimize çok güvendik
00:17:01.14 bunun bize ribozom aktivitesinin bir imzasını verebilecek bir yöntem olduğunu
00:17:04.14 hücrede
00:17:06.01 bize işlev hakkında yeni bir şeyler söyleyebilir
00:17:08.01 bu kurtarma faktörlerinden.
00:17:10.04 Size küçük bir dokunuş daha eklediğimizi söyleyeceğim
00:17:12.14 analiz türünü genişletmek için bu çalışmalara
00:17:15.14 tam uzunluktaki ribozom ayak izleri
00:17:17.28 düşünmemize izin verebilir.
00:17:19.23 Düşündüğümüz şey şuydu,
00:17:21.25 Hücrede ribozomları engelleyen büyük engeller olsaydı
00:17:23.29 geçmekten,
00:17:25.22 Bir haberci RNA üzerinde istiflenmiş tek bir ribozom olmayabilir,
00:17:27.20 ama iki.
00:17:29.02 Yani, biz bunlara disome diyoruz ve aslında bunu yapabilirsiniz.
00:17:30.26 RNAse tedavisinden sonra burada bu siyah izi görüyoruz.
00:17:33.04 aslında biraz da olsa bir baş belası tepe noktası görebiliriz
00:17:35.00 ve böylece o kasvetli zirveyi de izole ettik,
00:17:36.24 hücredeki büyük duraklamaların akıl yürütmesi
00:17:40.04 sorun teşkil eden ve kurtarılmaya tabi olabilecek
00:17:42.02 bu zirvede zenginleştirilebilir.
00:17:43.23 Ayrıca bir jelden mRNA parçalarımızı kesmek konusunda da cömert davrandık.
00:17:47.21 çünkü yapabileceğimizi biliyorduk.
00:17:49.05 Dom34 ve Hbs1'in biyokimyasal aktivitesine dayanmaktadır.
00:17:52.08 kısa mRNA ayak izlerini düşündük
00:17:55.17 aslında önyargılı da olabilir
00:17:58.28 tercihlerinde Dom34 enzimi,
00:18:00.28 çünkü Dom34'ün kısa mesajcı RNA şablonlarını sevdiğini biliyoruz.
00:18:03.15 Böylece daha kısa ve daha uzun ayak izlerini de izole ettik,
00:18:06.02 bu yüzden parçalarımızı bir jelden dilimleme konusunda cömert davrandık.
00:18:08.27 Peki, bu veriler neye benziyor?
00:18:11.08 Yabani tip bir soydan alırsak
00:18:13.11 veya bir Dom34 delta suşu.
00:18:14.19 bu ayak izlerini alırsak,
00:18:16.12 onları yüksek verimli sıralama için göndeririz,
00:18:18.08 ve ortalama uzunluğun ne olduğunu sorun
Elde ettiğiniz parçaların 00:18:20.25, örneğin,
00:18:22.27 tek bir ribozomdan, bir monozom zirvesinden,
00:18:25.26 Bu parçalar neye benziyor?
00:18:27.11 Burada dağılımı görebiliriz,
00:18:28.25 x eksenindeki okuma uzunluğuna baktığımızda
00:18:31.02 ve y ekseninde bu okuma uzunluğuna sahip okumaların kesrine bakarız,
00:18:36.07 Gördüğümüz şey, okumalarımızın çoğunluğunun
00:18:39.01 bu aralıkta 28-30 nükleotid uzunluğundadır.
00:18:40.23 Weissman laboratuvarı tarafından incelenen orijinal parça uzunluğu buydu,
00:18:43.14 ve biz bunun tam bir ribozom olduğunu düşünüyoruz
00:18:45.06 ona bağlı tam uzunlukta bir haberci RNA ile.
00:18:48.04 Aslında burada küçük bir tepe görüyoruz,
00:18:49.26 21 nükleotid uzunluğunda.
00:18:51.08 Bu, karakterize edilmiş bir parçadır
00:18:53.01 Liana Lareau tarafından,
00:18:54.28 ve bunu ne olarak tanımladı
00:18:56.20 muhtemelen ribozomun döndürülmüş veya cırcırlı bir durumunu temsil ediyor
00:18:59.08 bir haberci RNA boyunca yer değiştirme sürecinde,
00:19:03.05 ve bu, burada daha fazla tartışmanın odak noktası olmayacak.
00:19:05.20 Son olarak, en çok ilgilendiğimiz fragmanlar
00:19:08.08 bu kesilmiş parçalar burada mı
00:19:10.20 yaklaşık 16 nükleotid uzunluğunda zirve yapar,
00:19:12.12 ve inanıyoruz ki,
00:19:14.08 ve bunu destekleyecek kanıtlar göstereceğim,
00:19:15.28 bunların kısa mesajcı RNA parçaları olduğu
00:19:17.20 bir haberci RNA şablonunun sonuna kadar uzanan ribozomlara bağlanır,
00:19:20.28 ve dolayısıyla orada sadece 16 nükleotit var,
00:19:22.26 ancak bunlar ana hedeflerdir
Hücrede Dom34 eyleminin 00:19:25.04.
00:19:27.24 Peki, veriler neye benziyor?
00:19:29.09 100 milyon sıralama okuması alırsınız
00:19:30.20 vahşi tip ve mutant bir türden
00:19:32.08 ve soruyorsunuz, transkriptomu nasıl dağıtıyorlar?
00:19:34.13 Bir haberci RNA boyunca nasıl dağılırlar?
00:19:36.02 Böylece, bol bir gene bakabiliriz,
00:19:37.27 burada, PGK1.
00:19:39.04 Bu sadece bir bahçe çeşidi geni.
00:19:40.29 Ribozomun okuduğunu görebiliriz
00:19:43.09 tüm uzunluğu boyunca dağıtın,
00:19:44.27 açık okuma çerçevesinin başından sonuna kadar,
00:19:47.14 ve gördüğümüz şey, bir Dom34 nakavt (KO) suşunda
00:19:51.02 desen gerçekten çok eşdeğer.
00:19:52.24 Tipik ribozom profilleme verileri böyle görünür.
00:19:55.02 Hareketli.
00:19:56.18 Bu sıçramaya dahil
00:19:58.08 muhtemelen ribozomlar tarafından doğal bir duraklamadır,
00:19:59.18 ve sıralama yanlılıkları,
00:20:01.06 ve klonlama önyargıları,
00:20:02.26 ve amplifikasyon önyargıları.
00:20:04.12 Ama gördüğünüz şey, bizim bilmekle ilgilendiğimiz şey açısından.
00:20:07.19 bu özel gende
00:20:09.15 belirgin bir aksama olmadı.
00:20:10.29 Bu gende belirgin bir duraklama yoktu,
00:20:12.29 veya Dom34 eylemine yol açan sorunlar.
00:20:15.09 Ribozom yığınları yoktu
00:20:16.26 biriken Dom34 yokluğunda.
00:20:19.24 Bu verileri gördüğümüz gibi,
00:20:21.00 Aletlere gerçekten sahip olup olmadığımız konusunda endişelenmeye başladık, ancak
00:20:23.20 önemli duraklamaları gözlemlemek için,
00:20:25.29 ve güzel bir numara yaptık.
00:20:27.07 Mayaya bir histidin analoğu koyduk
3-AT - 3-aminotriazol olarak bilinen 00:20:29.18
00:20:31.05 aslında histidin biyosentezini bloke ediyor
00:20:34.09 ve aslında yapmanızı sağlar.
00:20:36.18 hücrede histidin eksikliğin var
00:20:38.20 ve bu nedenle duraklamalar olacağını tahmin ettik,
00:20:40.06 histidin kodonlarında biriken ribozomlar
00:20:42.26 genom boyunca.
00:20:44.16 Ve aslında tam olarak gördüğümüz buydu.
00:20:46.08 Vahşi tipte veya Dom34 nakavt suşunda,
00:20:47.22 birdenbire ribozom yığınları görüyorsunuz
00:20:50.14 tam olarak histidin kodonlarının olduğu yer
00:20:52.04 genomdaki her gen boyunca.
00:20:54.12 Yani, bu bizim için gerçekten güzel bir göstergeydi
00:20:56.15 ribozom fonksiyonları hakkında bir şeyler anladığımızı
00:20:59.23 - histidin yokluğunda ribozomlar histidin kodonlarında duraklamalıdır -
00:21:02.29 ve gerçekten de, tahmin ettiğimiz gibi,
00:21:05.00 Dom34 genel amino asit açlığına yanıt vermiyor,
00:21:08.19 ve olacağını tahmin etmemiştik,
00:21:09.29 ama bize sonucun türü hakkında bir fikir verdi
00:21:11.28 bu verilerin verebileceği
00:21:13.28 - duraklatma hakkında bir şeyler anlayabileceğimizi
00:21:15.22 ve belki bir şeyi deşifre edebiliriz
00:21:17.21 Dom34 işlevi hakkında.
00:21:19.29 Yani, elindeki o aletlerle,
00:21:21.10 Transkriptomumuza daha küresel olarak bakmaya başladık
00:21:23.01 ve sor, herhangi bir gen var mıydı
00:21:25.02 üzerinde artan sayıda okunan
Vahşi tip bir suşa göre Dom34 silme suşunda 00:21:26.24.
00:21:30.01 Bu deneyi yapma şekliniz
00:21:31.22, belirli bir gen üzerindeki tüm okumaları alabilir misiniz?
00:21:33.23 ve onu çizebilirsin
00:21:36.00 - mRNA-seq tarafından okunanların sayısı
00:21:38.16 vahşi türe karşı nakavtta,
00:21:40.14 ve x eksenine koyun,
00:21:42.04 veya ribozom ayak izlerinin sayısındaki fark
00:21:44.04 vahşi tip suşa karşı nakavt suşunda belirli bir gen üzerinde -
00:21:48.01 ve gördüğünüz şey çok ilginç olmayan bir kalıp
00:21:50.02 yüksek verimli bir deney perspektifinden,
00:21:51.19 genlerimizin neredeyse tamamı
00:21:53.21 ilginç desen farklılıklarına sahip değil.
00:21:55.09 Hepsi tek bir çevrede çıkıyor,
00:21:56.26 bu, vahşi bir tür ve bir nakavt suşu anlamına gelir
00:21:59.11 yaklaşık olarak aynı sayıda okumamız var.
00:22:01.18 Her ikisi de mRNA-seq'e göre,
00:22:03.07 yani Dom34 belki bir çürüme faktörü değildir,
00:22:05.26 ve aynı zamanda ribozomlar tarafından işgal edilir.
00:22:09.06 Bir istisna vardır,
00:22:10.26 Konuya geri döneceğim.
00:22:12.02 Hac1 olarak bilinen bir gen.
00:22:13.26 Bu gerçekten çok ilginç bir transkripsiyon faktörü
00:22:15.14 ve bizim büyük pozitifimiz oldu
00:22:17.05 bize şunu söyledi, bizce,
00:22:19.02 Dom34'ün hücrede nasıl çalıştığı.
00:22:21.07 Size benzer bir plan daha göstereceğim, ancak,
00:22:24.01 bize yeni ve heyecan verici bir şey gösterdi
00:22:25.25 hücredeki Dom34 işlevi hakkında,
00:22:27.28 ve bu kısa okumalarla ilgiliydi.
00:22:30.13 Yani, aslında, önceki slaytta
00:22:32.01 odaklandığım şey tam uzunlukta okumalardı
Dom34 silme mutantında oluşturulan 00:22:33.27,
00:22:35.18 30 nükleotid uzunluğundaki standart ribozom okur.
00:22:40.18 Ve aslında burada x ekseninde gösterilen bu,
00:22:42.21 vahşi bir türe bakarsak
00:22:44.18 veya bir Dom34 nakavtına karşı vahşi tip bir suş,
00:22:46.16 uzun tam uzunlukta okur
00:22:48.21, genomdaki tüm genler boyunca hemen hemen aynıdır.
00:22:51.04 Dağıtımlarında hiçbir fark yok.
00:22:56.02 Bununla birlikte, özellikle kısa okumalara bakarsak,
00:22:57.22 15-18 nükleotid okur
00:22:59.16 Dom34'te vahşi tip suşa karşı,
00:23:01.28 bu dağılım oldukça çarpıcı biçimde çarpık,
00:23:03.24 bir Dom34 nakavt suşunda olduğunu düşündürür
00:23:06.18 bu kısa mer parçalarında ribozom doluluğu
00:23:10.06 önemli ölçüde zenginleştirilmiştir,
00:23:12.18 Dom34 fikriyle tutarlı
00:23:14.22 özellikle sorumludur
00:23:16.18 normal şartlar altında bu ribozomları temizlemek için,
00:23:18.14 ve Dom34 eksik olduğunda
00:23:20.25 aslında o kısa metin okumalarıyla zenginleştin
Dom34 nakavt suşunda 00:23:22.26.
00:23:24.23 Yani, bu heyecan verici bir fikirdi
00:23:26.08 ve biyokimyamızla uyumluydu
00:23:27.26 ve bu projeye girerken sahip olduğumuz fikirler.
00:23:30.12 Yani, aslında sırada biz varız.
00:23:33.08 Size bundan sonra göstermek istediğim şey
00:23:34.22 HAC1 geni hakkında öğrendiklerimiz
00:23:36.26 ve artan ribozom doluluğumuz
00:23:38.14 Dom34 nakavt suşunda,
00:23:40.02 çünkü çok net bir şekilde sona eriyor,
00:23:42.26 Dom34'ün mayada olumlu etkisi,
00:23:44.18 ve bize Dom34 işlevi hakkında bir şeyler anlatıyor.
00:23:47.03 Ama önce size HAC1 geninden biraz bahsetmem gerekiyor.
00:23:50.08 HAC1 geni.
00:23:54.16 katlanmamış protein yanıtında yer alan bir transkripsiyon faktörünü kodlar
00:23:56.20 Peter Walter'ın laboratuvarı tarafından kapsamlı bir şekilde incelendi,
00:23:59.17 ve mayada bunun tek gen olduğu ortaya çıktı
00:24:02.19 maya hücrelerinde çekirdekten ihraç edilir
00:24:05.16 sağlam bir intron ile - çekirdekteki spliceosome tarafından eklenmez.
00:24:08.29 Aslında, sitoplazmada eklenmiş
00:24:11.25, kanonik olmayan bir yol olan bir endonükleaz tarafından,
IRE1 olarak bilinen 00:24:15.03
00:24:16.23 özellikle IRE1 endonükleaz olduğunda
00:24:18.25 katlanmamış proteinler tarafından aktive edilir
00:24:21.03 endoplazmik retikulumda.
00:24:23.01 Yani, bunun anlamı maya hücrelerinin sitoplazmasında
00:24:25.24 eklenmemiş bir gene oturur
00:24:27.26 şuna benziyor, HAC1 geni,
00:24:29.16 bir başlatma kodonu ve bir durdurma kodonu ile.
00:24:31.01 Ve imza bekliyor
00:24:32.24 bu olağandışı birleştirme yolu tarafından bölünecek.
00:24:36.29 Ama bildiklerimiz aslında
00:24:39.19 bazı yapısal eklemeler var
00:24:41.09 5' ek yerinde gerçekleşir,
00:24:42.22 ve bunun verimsiz olduğunu biliyoruz çünkü bu belgelendi,
00:24:44.28 ve biliyoruz ki bu türden bir miktar
00:24:47.15 kesilmiş haberci RNA hücrede oturuyor
00:24:49.05 normal hücrelerde bile.
00:24:51.04 Ve bize bu, Hareketsiz bir alt tabaka gibi göründü.
00:24:54.04 Açık bir okuma çerçevesi
00:24:55.22, durma kodonu olmadan biter
00:24:57.08 ve Dom34 tarafından kurtarılması gerekebilir.
00:24:59.14 Ve aslında bu doğru.
00:25:01.17 Ribozom profilleme verilerimize bakabiliriz
00:25:03.18 özellikle HAC1 geni boyunca hizalanmış,
00:25:05.22 ve her iki setin altında görüyoruz,
00:25:08.18 burada, vahşi tip okur
00:25:10.20 ve vahşi tip ribozom ayak izleri,
00:25:12.14 ve bunların üzerinde Dom34 nakavt ayak izleri,
00:25:14.26 ve gördüğün şey şu
00:25:17.05 her ikisi de kötü okumalar için
00:25:18.18 - yani arka arkaya iki ribozom için izole ettiğimiz tepeler -
00:25:20.29 ve kısa okumalar
00:25:24.10 - tek bir monozom zirvesinin 16-mer okumaları,
00:25:26.28 yani sadece bir ribozom -
00:25:29.08 Dom34 silme türünde önemli ölçüde zenginleştiğimizi görüyoruz
vahşi tip suşa göre 00:25:32.12,
00:25:34.20 fikirle tutarlı
00:25:36.16 gerçekten de ribozomlar
00:25:38.15 bu endonükleolitik olarak bölünmüş kavşakta yığılır,
00:25:40.04 yani intronu kaçırıyoruz, şimdi,
00:25:41.21 çünkü bu endonükleolitik olarak bölünmüştür.
00:25:43.09 Ribozomlar sıkışmış.
00:25:45.03 Normal şartlar altında,
00:25:47.02 Dom34 tarafından temizlendiler,
00:25:49.06 ve bir delta-Dom34 suşunda
00:25:51.19 bu pozisyonlarda ribozom biriktirirsiniz.
00:25:53.22 Demek bu güzel bir imzaydı
00:25:55.26 bu proteinin hücredeki işlevi.
00:25:57.28 Dahası, baktığımızda aslında,
00:25:59.20 duraklatılmış ribozom setinin akış yukarısında,
00:26:01.02 hücrede Dom34 etkinliğinin başka bir imzasını gördük
00:26:04.20 çok benzer görünüyordu:
00:26:06.10 Dom34 deltasında bir dizi kısa okuma
00:26:09.05 ve Dom34 deltasında bir dizi kötümser tepe okuması,
00:26:12.21 aslında olduğu fikriyle tutarlı
00:26:15.05 ribozom bu ilk konumda duraklatıldığında,
00:26:17.01 IRE1 tarafından normal bir endonükleolitik bölünme yoluyla
00:26:20.12 Başka bir bölünme daha var,
00:26:22.20 muhtemelen endonükleaz tarafından
00:26:24.14 Bu genellikle No-Go-Decay denilen bu sürece dahil olur,
00:26:27.02 bu ikinci bir endonükleolitik bölünme
00:26:30.04 başka bir ribozom setine yol açar
00:26:32.16 bu sistem tarafından temizlenen birikti.
00:26:35.16 Yani, bu bizim içindi,
00:26:37.06 Dom34'ün hücrede yaptıklarına güzel bir örnek
00:26:39.13 bu tek gen üzerinde,
00:26:41.07 ve geçmişe bakıldığında
00:26:43.10 Bunun tutarlı olabileceğini düşünüyoruz
00:26:45.02 normal hücrelerde olduğu fikriyle
00:26:46.27 çok az Dom34 hedefi var
00:26:48.19 kriz olan,
00:26:50.08 bunlar Dom34'ün harekete geçmesi gereken büyük, büyük hedefler.
00:26:52.27 Ama model için kanıt sağladı,
00:26:54.16 yani ribozomlar durakladığında,
00:26:57.01 endonükleolitik bölünmeler olur,
00:26:59.00 ve bu endonükleolitik bölünmeler gerçekleştiğinde
00:27:00.24 bu sistem devreye girer ve ribozomları kurtarır,
00:27:03.19 ve bu sistemin yokluğunda
00:27:05.05 ribozom yığınları biriktirirsiniz.
00:27:07.01 Yani, gerçekten çok tutarlı bir veri setiydi.
No-Go-Decay modeli için 00:27:09.08,
00:27:11.12 ve bir krizde ribozomların ne yaptığı.
00:27:13.19 Bize çok fazla hedef sağlamadı.
00:27:16.28 Pekala, şimdi size başka bir hikaye anlatacağım,
00:27:18.28 ilgili
00:27:20.26 ve Dom34'ün rolüyle ilgili.
00:27:22.11 Dom34 de olaya karışmıştı
Bu Kesintisiz Çürüme yolunda 00:27:24.10
00:27:26.13 ilk iki slaytta anlattım.
00:27:28.29 Kesintisiz Çürüme, bahsettiğim gibi,
00:27:30.26 ribozom karşılaştığında olan şeydir
00:27:33.16 bir polyA kuyruğudur ve poli-lizini çevirir.
00:27:36.00 Buradaki fikir, poli-lizinin ribozomla konuşmasıdır,
00:27:38.19 çıkış tünelinden,
00:27:40.07 ve "Bu bir sorun.
00:27:41.19 Burada durup bu ribozomları kurtarmamız gerekiyor.
00:27:43.18 mesajın kalitesini düşür,
00:27:45.06 ve protein ürününü bozun,
00:27:46.20 çünkü poli-lisin mantıklı değil."
00:27:48.14 Ve böylece model oldukça benzer,
00:27:49.28 burada bir kök döngüye girmek yerine,
00:27:51.20 Roy Parker'ın çalışmasında olduğu gibi,
00:27:53.08 ribozomlar bir polyA kuyruğuna girer,
00:27:55.24 endonükleolitik bölünme gerçekleşir,
00:27:57.10 ve bu belgelendi,
00:27:59.00 böylece tekrar takip eden ribozomlar temizlenecek
00:28:02.00 bu proteinler Dom34 ve Hbs1 tarafından
00:28:04.11 ve bu ribozomlara ne olabileceğinden tam olarak emin değiliz.
00:28:07.01 Ama bilmek istediğimiz şuydu:
00:28:08.23 bu tür bir faaliyetin kanıtı var mıydı
00:28:11.00 Maya hücrelerimizde
00:28:12.09 var olan Dom34 verilerinden deşifre edebileceğimiz.
00:28:15.29 Size ilk olarak söyleyeceğim şey şudur:
00:28:18.03 Aslında hücrede tekrarlanan lizinlerin ne yaptığına dair bir fikir edinebiliriz.
00:28:22.08 onlarla karşılaşan ribozomlara,
00:28:24.02 ve bunu maya genomundaki tüm ribozomlara bakarak yapabiliriz,
00:28:27.08 veya maya transkriptomunda,
00:28:28.22 ve aslında bir tür ortalama gen yapabiliriz
00:28:30.20 veya metajen analizleri
00:28:32.08 tekli lizinleri alıp birlikte sıraladığımız yer,
00:28:35.01 veya arka arkaya iki lizin içeren genler
00:28:37.01 ve onları bir araya getirin,
00:28:39.02 veya üç veya veya beş vb.
00:28:42.02 Ve hemen görebilirsiniz
00:28:44.02 genom analizi düzeyinde anlatılanlar,
00:28:46.08 ki bu art arda birden fazla lizin
00:28:48.24 aslında ribozomun biraz kekelemesine neden olur
00:28:51.10 - burada daha büyük zirveleriniz var,
00:28:52.24 ribozomlar sıkışmış -
00:28:54.09 ve bu tür uzunluk boyunca yayılır
00:28:56.18 poli-lisin yolunun.
00:28:58.05 Yani, bu ribozom profilleme verilerini kullanıyor
00:29:01.14 ribozom doluluğu hakkında soru sormak için,
00:29:03.16 fikirle tutarlı
00:29:05.10 poli-lisin bir problemdir.
00:29:06.26 Yine de söylemeliyim ki,
00:29:08.14 bu poli-lizinlerin genlerin ortasında olduğu
00:29:09.28 - bunlar sadece normal kodlama lizinleridir.
00:29:12.20 Yani, arayabileceğimizi düşündüğümüz başka bir yolumuz vardı.
00:29:16.12 ribozomlar poli-lisin ile karşılaştığında ne olur,
00:29:18.15 ve bu maya hücrelerini manipüle ederek oldu
00:29:20.09 özel bir şekilde,
00:29:22.17 ve bunu size bu deneyde anlatacağım, burada.
00:29:24.23 Görebildiğiniz şey, örneğin,
00:29:26.13 bireysel bir gen alırsak -
00:29:28.23 bu gen ENT5 olarak bilinir,
00:29:30.15 bu sadece ortalama bir maya geni -
00:29:31.28 ve vahşi tipte ve Dom34 nakavt suşunda görebiliriz.
00:29:34.14 bunlar ortalama uzunluk okumalarıdır,
00:29:35.28 bunlar Jonathan Weissman'ın laboratuvarında okunan 30-mer'lik okumalar
00:29:37.26 orijinal olarak karakterize edilir,
00:29:39.08 ve gördüğümüz şey, beklediğimiz şeydir,
00:29:40.24 olan ribozom açık okuma çerçevesinde okur,
00:29:43.06 ama 3'UTR'de değil
00:29:44.28 ve polyA kuyruğunda değil,
00:29:46.09 ve bu mantıklı çünkü bu normal bir gen
00:29:48.10 normal bir durdurma kodonu ile
00:29:49.27 ve ribozomlar durdurma kodonunu tanır.
00:29:51.18 Ama yaptığımız deney
00:29:53.01 aslında bir maya suşuna mı soktuk
00:29:55.03 bir baskılayıcı tRNA,
00:29:56.22 ve baskılayıcı tRNA'lar ne yapar?
00:29:58.12 onlar stop kodonlarını yanlış mı tanıyorlar?
00:30:00.14 ve durdurma kodonlarını okurlar,
00:30:02.24 durdurma kodonlarının atlanmasına izin veriyor
00:30:04.20 bir düzeyde,
00:30:06.08 ve dolayısıyla 3'UTR'ye çeviri
00:30:08.16 ve 3'UTR'de başka bir durdurma kodonu bulunmayan genlerde,
00:30:10.29 polyA kuyruğuna.
00:30:13.18 Ve burada gördüğümüz şey.
00:30:15.02 bunlar şu anda incelediğimiz tam uzunlukta okumalar.
00:30:16.25 bir baskılayıcı tRNA koyarsak
00:30:18.19 bir maya suşuna girin ve aynı gene bakın,
00:30:22.02 burada durma kodonunu okuyoruz,
00:30:24.15 3'UTR'de ribozom okumaları biriktiriyoruz,
00:30:28.13 ancak gelişmiş ribozom okumalarına sahibiz
00:30:30.21 Dom34 mutantında.
00:30:32.14 Yani, bu kanıttır ki
00:30:34.10 bir durdurma kodonunu okuduğunuz zaman
00:30:35.28 ve 3'UTR'yi okuyun
00:30:37.16 ve polyA kuyruğuna,
00:30:39.02 normal şartlar altında bu ribozomlar.
00:30:40.29 bu polyA'nın tam üstünde duruyor.
00:30:42.18 Dom34 tarafından temizlenecektir.
00:30:44.28 Ve yokluğunda büyük bir yığınımız var,
00:30:47.13 Dom34'ün hücrelerde kesinlikle yaptığı bir şey bu.
00:30:51.05 Daha da çok sevindik,
00:30:52.28 kısa-mer'e baktığımızda
00:30:54.14 bu endonükleolitik bölünmenin belirtilerini görmek için
00:30:56.10 poli-lizin okumak için önerildi.
00:30:59.11 Burada tekrar baktığımızda görüyoruz ki,
00:31:01.10 anlamsız baskılayıcı tRNA ile aynı suşta
00:31:03.18 ve tam uzunluktaki ribozom okur
00:31:05.20 tam burada polyA kuyruğunun kavşağında oturuyor.
00:31:09.11 Bu imzanın arkasından geldiğimizi görüyoruz.
00:31:11.02 sarı okumalar görüyoruz
00:31:12.15 - bunlar kısa kısa okumalardır. Bunlar kesilmiş olan haberci RNA'lardır.
00:31:16.10 ve ribozom o haberci RNA'nın sonuna kadar koştu,
00:31:18.28 ve aslında takip ediyorlar,
00:31:20.21 bu gri tepe, çünkü endonükleolitik bölünme,
00:31:23.19 düşünüyoruz ve gösterildi,
00:31:24.27 öndeki ribozomun arkasında gerçekleşir.
00:31:27.06 Yani, bu ribozom polyA kuyruğuyla karşılaşır,
00:31:300.00 bir şekilde onunla mücadele ediyor,
00:31:31.18 ribozom bunu bir problem olarak okur,
00:31:33.08 endonükleolitik bölünme bunun arkasında gerçekleşir,
00:31:36.06 ve bir okuma birikimi elde edersiniz.
00:31:38.12 Yine, Dom34 için net bir rol belirlemek
00:31:41.20 polyA kuyruğunu okuduğunuzda.
00:31:44.02 Bu bir nevi oluyor mu?
00:31:46.16 Ya buna daha küresel bir şekilde bakarsak?
00:31:48.04 Bu tür bir imzayı alabiliriz
00:31:50.01 ve bunu daha küresel veya metajen analizi türünde yapabiliriz,
00:31:54.00 hizaladığımız yer, burada, 0,
00:31:55.25 polyA kuyruğu ile bağlantı.
00:31:58.08 Ve işte oradalar,
00:32:00.02 bunlar 30 nükleotid uzunluğundaki gri okumalardır.
00:32:01.12 Tüm polyA kuyruklarını bir araya getirdik
00:32:03.01 tüm genlerde
00:32:04.16 bastırılmış anlamsız kodonlara sahip
00:32:06.04 baskılayıcı tRNA tarafından.
00:32:07.18 Burada gördüğümüz gri yığının okunuşu
00:32:10.04 - bunlar polyA kuyruğunu okuyan ribozomlardır -
00:32:12.22 ve işte ribozom yığını
00:32:15.01 kesilmiş haberci RNA'ların arkasından geliyor
00:32:17.00 ribozomun sonucu olan
00:32:19.19 bu polyA kuyruğunu okuyorum.
00:32:20.27 29 nükleotidlik bir gecikme
00:32:23.05 ve bu boşlukla tutarlı
00:32:24.24 öne sıkışmış bir ribozomdan bekleyeceğimiz
00:32:26.22 ve arkadan gelen bir endonükleaz.
00:32:28.20 Yani, bu, ne olduğuna dair küresel bir görüş.
00:32:31.12 Kesintisiz Çürüme denilen şey gibi görünüyor.
00:32:33.14 Ribozomlar bizim için bir imzadır
00:32:35.24 Kesintisiz Çürümeyi tanımlar
Bu Dom34-delta türünde 00:32:37.14.
00:32:40.06 Yani, tartışabilirsiniz, ancak,
00:32:41.19 bu özellikle geniş değil
00:32:43.14 ve geniş kapsamlı
00:32:45.25 çünkü saçma sapan bir baskılayıcı tRNA koyduk
00:32:47.19 bu maya suşuna,
00:32:49.04 ve bu belki de genel bir fenomen değildir.
00:32:50.19 Ama tartışacağım şey
00:32:52.03 aslında erken poliadenilasyon
00:32:55.02 ökaryot hücrelerde bol ve düzenli bir olaydır,
00:32:58.26 ve bu olayın imzası
00:33:00.28, çeşitli kalite kontrol yolları tarafından büyük ölçüde silinir
00:33:04.18 her zaman gerçekleşen,
00:33:06.10 erken poliadenilasyonun imzasını atmak
00:33:08.22 normal deneylerle görünmez.
00:33:11.04 Ve bunlar bunun iki örneği.
00:33:12.22 RNA14 mayadaki bir gendir,
00:33:14.14 ve YAP1,
00:33:16.14 erken poliadenile olduğu bilinen.
00:33:18.20 2013'te Pelechano ve diğerlerinin önceki sonuçları,
00:33:22.14 aslında RNA dizileme yöntemlerini kullanarak,
00:33:24.01 erken poliadenilasyon bölgeleri belirledi
00:33:26.11 bu iki gende.
00:33:27.21 Ve gördüğümüz şey,
00:33:29.12 Dom34-delta türümüzü kullanarak
00:33:31.20 ve gri ve sarı okumalar arıyorum
00:33:33.20 - uzun okumalar ve kısa okumalar -
00:33:36.21 net bir imza görüyoruz
00:33:38.22 ribozomların bu gende takılı kaldığı
00:33:40.28 endonükleolitik olarak bölünmüş haberci RNA'larda
00:33:43.08 sonuç bu olmalı
00:33:46.00 ribozomun poli-lizin okuması.
00:33:47.26 Size söyleyebileceğim şey, mayaya genel olarak bakarsak,
00:33:50.14 bu türlerde - Dom34-delta türü -
00:33:53.06 ve bu tür okumaların görünümünü kullanın
00:33:55.20 açık okuma çerçevelerinin ortasında
00:33:57.06 bu sürecin imzası olarak
00:33:59.23 Kesintisiz Çürüme oluyor,
00:34:01.13 Size söyleyebileceğim şey inanılmaz derecede geniş.
00:34:03.17 Baktığımız çok, çok, çok sayıda gen,
00:34:06.10 Baktığımız genlerin %50 kadarı,
00:34:08.02 ortasında ribozom yığınları var
00:34:10.22 Dom34 hücreden atılırsa,
00:34:12.26 bunun aslında olduğunu öne sürüyor
00:34:15.10 Maya hücrelerinde gerçekleşen çok düzenli bir olay
00:34:17.26 ve bunun daha yüksek ökaryotlarda olacağından şüpheleniyorum.
00:34:20.10 Bu slayta geri döneceğim,
00:34:22.08 parça boyutlarının dağılımından bahsettiğim yer,
00:34:24.10 bitirmenin ve size söylemenin bir yolu olarak
00:34:26.10 Dom34'ün hücrede ne kadar önemli olabileceğini düşünüyoruz.
00:34:28.29 Yani, size başlangıçta gösterdim
00:34:31.00 eğer tarafsız bir şekilde,
00:34:32.22 jelden büyük bir dilim kesin
00:34:34.18 ve tam uzunluktaki ribozom okumalarında kaç ribozom olduğunu sorun
00:34:37.22 kısa okumalara karşı,
00:34:39.08 Burada görebileceğiniz şey, okunanların yaklaşık %5'iydi,
00:34:42.23 belki, burada bu bölgede olanlar,
00:34:44.13 Eğer onları birkaç uzunlukta toplarsak.
00:34:46.16 Yani, bunların tipik Dom34 hedefleri olduğunu söyleyebilirsiniz.
00:34:48.24 Kısa okumalar
00:34:50.16 ve genellikle Dom34 sistemi tarafından hedef alınabilirler.
00:34:53.15 Ve size söyleyebileceğim şey, Dom34'ü nakavt edersek.
00:34:55.29 bu aslında vahşi bir tür
00:34:57.18 burada bakıyoruz.
00:34:59.01 Dom34'ü nakavt edersek, bu zirve boyutu iki katına çıkar.
00:35:01.13 Yani, bu durumda okumaların en az %5'i,
00:35:04.02 biraz güvenle söyleyebiliriz ki,
00:35:06.01, hücredeki Dom34 eyleminin sonucu olabilir,
00:35:08.26 aslında bunu öneriyor
00:35:10.16 Hücrede çok sayıda kısa metin okuması var
00:35:12.16 ve kısa boylular olduğunu hayal edebilirsiniz
00:35:14.08 ara süreçlerden kaynaklanan
00:35:16.01 haberci RNA'ların eksozomal bozunması,
00:35:19.20 ve bunun anlamamıza yardımcı olduğunu iddia edeceğiz
00:35:22.07 bu genin yüksek ökaryotlarda neden gerekli olduğu,
00:35:24.17 ve yakında bununla ilgili daha fazla şey öğreneceğimizden şüpheleniyorum,
00:35:27.09 ve mayada gerekli değildir,
00:35:29.02 ancak ribozomların sınırlandığı durumlarda gerekli hale gelir.
00:35:31.29 Bence anlamamıza yardımcı oluyor
00:35:33.25 Dom34'ün in vivo rolü.
00:35:35.14 Önemli bir rol oynar,
00:35:37.00 bu yüzden yüksek ökaryotlarda embriyonik öldürücüdür,
00:35:38.26 ve bu rolü ortaya çıkardık
00:35:40.16 genetik olarak manipüle edilebilir bir sistemde çalışarak
00:35:42.08 burada geni gerçekten silebiliriz
00:35:44.06 ve süreci gerçek zamanlı olarak inceleyin.
00:35:47.05 Bu yüzden durup bitireceğim
00:35:53.14 anladığını umduğumu söyleyerek
00:35:55.11 genel olarak mRNA gözetimi hakkında bir şeyler,
00:35:57.04 ve sanırım eve dönüş mesajı
00:35:59.16 gerçekten merkezde
Herhangi bir mRNA gözetim sürecinin 00:36:01.12
00:36:03.02 ribozomdur.
00:36:04.17 Ribozom, haberci RNA'ları okur
00:36:06.12 ve ribozomun özellikleri
00:36:08.06 ve ribozomal makineler
00:36:09.23 faktörleri tanımaktan ve işe almaktan sorumlu olanlar
00:36:12.07 anlamak için
00:36:14.20 haberci RNA'lar bir şekilde kusurlu olduğunda
00:36:16.01 ve bozulma için hedeflenmesi gerekiyor
00:36:19.14 normal yollarla,
00:36:20.26 eksik protein ürününün bozunma için hedeflenmesi gerektiğini,
00:36:23.27 ve ribozomların kendileri
00:36:25.20 normal sonlandırma sürecinden bağımsız bir yol ile kurtarılması gerekir,
00:36:29.08 ribozom homeostazı için havuza geri konmak için.
00:36:33.14 Ve bununla birlikte laboratuvarımdaki ana oyunculardan bahsedeceğim
00:36:35.26 işi kim yaptı.
00:36:37.06 Laboratuvardaki en eski biyokimyasal çalışma
00:36:39.10 Chris Shoemaker tarafından yapıldı,
00:36:41.07 ve tüm ribozom profilleme çalışmaları
00:36:42.20 gerçekten Nick Guydosh tarafından yapıldı,
00:36:44.22 laboratuvarda yeni bir doktora sonrası.
00:36:47.03 Ayrıca finansman kaynaklarıma da teşekkür etmek istiyorum.
NIH ve Howard Hughes Tıp Enstitüsü'nden 00:36:49.01.
00:36:51.13 Teşekkürler.

  • Bölüm 1: Protein Sentezi: Yüksek Doğruluklu Moleküler Bir Olay

Sentetik biyolojide keşif, yeni sanayi devrimine bir adım daha yakın

Bilim adamları, mikroskobik biyolojik fabrikalar için yeni parçalar üretmek için gereken süreyi kısaltan bir yöntem geliştirdiklerini bildirdiler.

Yöntem, süreyi 2 günden sadece 6 saate indiriyor. Imperial College London'dan bilim adamları, araştırmalarının onları bu biyolojik fabrikaların parçalarının seri üretilebileceği yeni bir tür sanayi devrimine bir adım daha yaklaştırdığını söylüyor. Bu fabrikalar, hastalar için daha iyi ilaç dağıtım tedavileri, minerallerin derin yeraltından çıkarılma yöntemindeki iyileştirmeler ve biyoyakıt üretimindeki ilerlemeler dahil olmak üzere çok sayıda uygulamaya sahiptir.

Zararsız bakteriler, hasta sağlık hizmetlerini iyileştirebilecek mikroskobik fabrikalara yeniden tasarlanabilir.

Imperial College London'daki Sentetik Biyoloji ve İnovasyon Merkezi'nin Eş Direktörü ve bugün Nucleic Acids Research dergisinde yayınlanan çalışmanın baş araştırmacısı Profesör Paul Freemont şunları söylüyor:

&ldquoSanayi devriminden önce çoğu ürün elle yapılıyordu, bu da üretimlerinin daha yavaş, üretilmesi daha pahalı ve sayılarının sınırlı olduğu anlamına geliyordu. Sentetik biyolojide de benzer bir noktadayız, uzun ve yavaş bir süreç olan her bir parçayı sıfırdan test etmek ve inşa etmek zorunda kalıyoruz. Çalışmamızda biyolojik parçaların üretimini ve testlerini hızla büyütmeye yardımcı olabilecek yeni bir yöntem gösteriyoruz.&rdquo

DNA'dan oluşan parçalar bilim adamları tarafından yeniden tasarlanır ve biyolojik fabrikalar yapmak için hücrelere yerleştirilir. Bununla birlikte, sentetik biyolojideki önemli bir darboğaz, yeni tip fabrikalar inşa edecek parçaların eksikliğidir. Mevcut zaman alıcı yöntemi kullanarak parçalar oluşturmak için bilim adamlarının bir hücredeki DNA'yı yeniden tasarlamaları ve nasıl çalıştığını gözlemlemeleri gerekiyor.Spesifikasyonlarına göre çalışıyorsa, bilim adamları parça spesifikasyonlarını bir katalogda saklarlar.

Şimdi, Imperial College London'dan bilim adamları, her yeni parça yapmak istediklerinde bir hücreyi yeniden tasarlama ihtiyacını ortadan kaldıran çok daha hızlı bir yöntem geliştirdiler. Ekip, çalışmalarının, daha sofistike biyolojik fabrikalar inşa etmek için kullanılabilecek, kullanıma hazır bileşenlerden oluşan geniş yeni kütüphanelere yol açabileceğini söylüyor.

Imperial College London'daki Sentetik Biyoloji ve İnovasyon Merkezi'nden çalışmanın ortak yazarı James Chappell şöyle diyor:

&ldquoSentetik biyolojideki en büyük hedeflerden biri, süreçlerimizi sanayileştirmenin bir yolunu bulmaktır, böylece bu biyolojik fabrikaları, tıpkı araba üreticileri gibi endüstrilerin bir fabrika hattında toplu üretim araçları ürettikleri şekilde seri olarak üretebiliriz. Bu, bu bilim alanının potansiyelini açığa çıkarabilir ve toplumun birçok yönünü iyileştirmek için kullanılabilecek çok daha karmaşık cihazlar geliştirmemizi sağlayabilir. Heyecan verici bir şekilde, araştırmamız bizi bu gerçeğe bir adım daha yaklaştırarak yeni parçalar geliştirmenin hızlı bir yolunu sunuyor.&rdquo

Bir hücre yeniden yapılandırıldığında, hücredeki yeniden programlanan DNA, haberci ribonükleik asit (mRNA) adı verilen moleküller tarafından hücrenin ribozom adı verilen üretim fabrikalarına iletilen bir mesajı kodlar. Ribozomlar, genetik bilgiyi hücreye işlevleri yerine getirmesi talimatını veren bir komuta çevirir. Örneğin, bilim adamları, bir hücreyi, insan patojenik bakterilerinden gelen kimyasal sinyalleri algılayan ve varlıklarını belirtmek için renk değiştiren bir protein üreten bir enfeksiyon dedektör fabrikasına yeniden tasarlayabilirler.

Çalışmada, Imperial araştırmacıları ilk kez aynı yöntemin bir hücrenin dışındaki bir test tüpünde gerçekleştirilebileceğini gösteriyor. Bu, hücrelerden mRNA ve protein üreten makineyi çıkarmayı ve test tüplerinde hayatta kalmalarına yardımcı olacak enerji ve yapı taşlarını sağlamayı içerir. Ekip daha sonra yeniden programlanmış DNA'larını çözüme ekler ve nasıl çalıştığını gözlemler.

Bu yöntemin avantajı, bilim adamlarının bu hücre benzeri ortamdan litrelerce geliştirebilmeleri, böylece birden fazla yeniden programlanmış DNA'nın aynı anda test edilebilmesi ve bu da parçaların üretim sürecini hızlandırmasıdır.

Araştırmanın bir sonraki aşaması, bu yöntem kullanılarak geliştirilebilecek parça ve cihaz türlerini genişletmektir. Ayrıca, tüm süreci hızlandırmak ve otomatik hale getirmek için robotları kullanarak bir yöntem geliştirmeyi hedefliyorlar.

Imperial College London'daki Sentetik Biyoloji ve İnovasyon Merkezi'nin eş Direktörü Profesör Richard Kitney şunları söylüyor: &ldquoSentetik biyoloji, İngiliz Hükümeti tarafından Birleşik Krallık ekonomisinin yararına yeni endüstriler ve işler yaratma potansiyeline sahip olarak görülüyor. Bu çalışma, Merkez bünyesinde bir dizi endüstriyel uygulamada kullanılabilecek teknoloji geliştirmeye yönelik daha geniş ve büyük bir araştırma programının parçasıdır.&rdquo


12.18: Ribozomlar - Biyoloji

Genetik çeşitlilik, hem organizma hem de hücresel düzeyde fenotipik özellikleri nasıl etkiler (gen düzenlemesine vurgu da dahil olmak üzere)? Genetik varyasyondan hücresel ve organizma fenotiplerine giden moleküler yollar nelerdir? Genomun bu kadar büyük bir kısmı neden karmaşık özelliklerin genetik temeline katkıda bulunuyor?

Laboratuvarımız, bu sorunların üstesinden gelmek için hesaplamalı ve deneysel yaklaşımlar kullanan çeşitli farklı alanlarda eğitilmiş kişileri içermektedir. Genellikle kullanıma hazır istatistiksel yöntemlerin olmadığı problemler üzerinde çalışırız. Bu nedenle, çalışmamızın önemli bir kısmı, biyolojik verilere yeni anlayışlar kazandırabilecek uygun istatistiksel ve hesaplamalı yaklaşımlar geliştirmektir.

Kullanışlı bağlantılar

Laboratuvar Haberleri

Ve yeni doktora öğrencilerimize hoş geldiniz Alyssa Fortier ve Roşni Patel ve yeni postdoc'lar: Şahin Nakvi, Jeff Spence, Hakhamanesh Mostafavi ve Clemens Weiss!

Mayıs: Yeni makaleler, karmaşık özelliklerin genetik mimarisini anlama konusundaki son çalışmamızı ("Omnigenic 2" makalesi) içerir. Xuanyao Liu ve Yang Li: [Bağlantı] ve bağışıklık hücrelerinin kromatin yapısı üzerine Criswell, Marson ve Greenleaf laboratuvarlarıyla olan makalemiz Diego Laboratuvarımızda Michelle Nguyen ve Anja Mezger ile birlikte): [Link] Diego, Xuanyao, Yang ve diğer takımları tebrik ederiz!

Ocak: Hoşgeldiniz Shaila Müşerof Bu ay bize kimler katılıyor!

Aralık: Elveda David ve Emily! İkisi de çok özlenecek. David, NY Genome Center'da kendi laboratuvarını kuracak ve Emily, genomik uzmanlığını danışmanlık dünyasına taşıyor.

9/18/2018. Haber özeti:

Gelenler ve gidenler:
Ağustos: Yeni postdoclarımıza hoş geldiniz Jake Freimer ve Yuval Simons!

Eilon Daphne Koller tarafından kurulan yeni firma Insitro'da ilk bilim adamlarından biri olarak işe başladı. Eilon'a İyi Yolculuklar!

Emily tezini savundu! Tebrikler Emily! Kağıtları bitirmek için yıl sonuna kadar laboratuvarda kalacak.

tebrikler Natalie ve Ben, her ikisi de laboratuvar mezunu, güzel düğünlerinde.

Temmuz: laboratuvar mezunu Alexis Savaşı Johns Hopkins'de Biyomedikal Mühendisliğinde erken görev aldı. Harika haber!

Haziran: Hannah M Antropoloji Bölümü'nden 'antropolojide yaratıcılık' için Robert Baynard Textor ödülünü aldı. Aferin ve hak edilmiş, Hannah!

Mayıs: Arbel mezun oldu ve Molly Przeworski'nin Columbia'daki laboratuvarında doktora sonrası pozisyonuna geçti. Ağustos ayında o ve karısı Maya ikiz erkek bebekleri karşıladılar! Tebrikler! Bu, son 7 yılda laboratuvardaki üçüncü ikiz çift. Bu önemli bir zenginleşme mi?

JonathanPEQG'nin Omnigenic modeli (Evan, Yang ve Xuanyao ile birlikte) hakkındaki genel konuşması burada yayında.

Mart: Natalie Mezun oldu ve Ancestry'de personel bilimcisi olarak bir pozisyona geçti. Tebrikler Natalie! Seni özledik!

Ocak: Kelley Washington Üniversitesi Genom Bilimleri Bölümünde kendi laboratuvarını kurmak için harekete geçti. Washington'daki ilerlemesini takip etmekten heyecan duyuyoruz!

10/25/2017. Haber özeti:

Ekim: ASHG: Natalie konferansın toplumsal cinsiyet dinamikleri konusundaki yan projesinde 7000 kişiye iyi karşılanan bir genel konuşma yaptı ve NASA, Yang, Emily ve David ayrıca çok güzel platform sunumları yaptı. Herkese tebrikler!

Güncelleme: NASA ASHG'leri kazandı en iyi öğrenci konuşması (Melina Claussnitzer ile çalışmak için). Tebrikler!!

Dergilerde çıkan veya çıkmak üzere olan birkaç makalemiz var: Eilon transplant reddini ölçmek için cfDNA kullanımı hakkında Yang ve David LeafCutter'da (birleştirme) Diego karmaşık özellikleri yönlendiren hücre tiplerini tahmin etme üzerine Arbel gen kopyalarında NAGC üzerinde Jessica triklosan ve mikrobiyomlar üzerinde (Ami'nin laboratuvarıyla birlikte çalışıyor).

tebrikler Ziyue onun düğününde!

Eylül: Yang ve Xun kendi laboratuvarlarını kurmaya başladı. İyi yolculuklar!!

tebrikler harold HHMI'den prestijli bir Hannah Gray doktora sonrası fakülte bursu aldı.

Haziran: Hoş geldin NASA, Hannah ve Margaret laboratuvara!

6/22/2017. Son birkaç ayın haber özeti:

Haziran: perspektif parçamızın yayınlanması 'omnigenik' baş yazarlar ile karmaşık özelliklerin modeli Evan Boyle ve Yang Li [PDF Bağlantısı]. Gazetemiz, Ed Yong'un Atlantic ve Stanford haberlerindeki makalesi de dahil olmak üzere sosyal medyada ve başka yerlerde birçok tartışmayı teşvik etti.

Mayıs: Önümüzdeki akademik yıl için yardımcı doçent fakülte pozisyonlarını kabul eden 3 doktora sonrası doktoramızı tebrik ederiz: Kelley Harris (U Washington, Genom Bilimleri), Yang Li (U Chicago, Genetik Tıp) ve Xun Lan (Tsinghua U, Temel Tıp Bilimleri).

Ve Kelley ayrıca Burroughs Wellcome Fund'daki CASI programı aracılığıyla prestijli bir fakülte geçiş ödülü aldı.

Natalie ve Arbel CEHG'den yüksek lisans bursu aldı. Tebrikler! Ve Jonathan Haziran ayından itibaren CEHG'nin eş direktörü olacak.

Diego'in hastalığa neden olan hücre tiplerini çıkarsama konusundaki makalesi bioRxiv'de yayınlandı.

Nisan: Kelley Doktora çalışmasından çarpıcı sonuçlara dayanan çok güzel bir makalesi vardı: İnsan mutasyon spektrumunun hızlı evrimi, bu ay eLife'da [Link] çıkıyor.

harold, Evan ve David her birinin diğer laboratuvarlarla çalışmaları hakkında yeni makaleleri var: Sleuth [Harold] ve Cas9 Binding [Evan] ve GxE [David]'i tespit etmek için ASE.

Mart: Anand, Facebook'ta veri bilimcisi pozisyonuna geçti. İnanılmaz teknik uzmanlığını ve laboratuvardaki birçok projeye gayri resmi katkılarını özleyeceğiz! İyi yolculuklar, Anand!

Aralık 2016. Arbel ve anand'nin büyük örneklerde tekrarlayan mutasyonun site frekans spektrumunu nasıl değiştirdiği üzerine çalışması şimdi PLOS Genetics'te: [Link]. Tebrikler!

Natalie derginin tarihini incelemek için hesaplama yöntemlerini uyguladığı eğlenceli bir makalesi vardı Genetik 1917'den beri [Bağlantı]. [Yazar konumlarının zaman atlamalı grafiği]

Kasım. yair, Evan, ve Natalie'nin SDS ve poligenik adaptasyon hakkındaki makalesi: Son 2000 yılda insan adaptasyonunun tespiti şimdi Science [Link]'te çıktı. Tebrikler!

9/20/2016. Hoşgeldiniz Harold Pimentel geçen ay laboratuvara kim katıldı!

Ayrıca, Eilon Nature Genetics'te yayınlanan bir makalesi var. MHC protein alelleri ile T hücresi reseptör genlerinin ekspresyonu arasındaki trans-etkileşimler (yani trans-eQTL'ler). Leah Sibener ve Chris Garcia'nın yardımıyla bunları protein yapısındaki fiziksel etkileşimler açısından yorumlayabildik [Link]

6/1/2016. Nisan ve Mayıs aylarında bildirilecek çok sayıda heyecan verici haber:

Anıl'ın kağıt üzerinde yeni açık okuma çerçevelerini tespit etmek için ribozom profilleme verilerini kullanma artık eLife [Link]'te çevrimiçi.

Xun'un üzerinde kağıt gen kopyalarının evrimi Science [Link]'te yayınlandı. Bu, Francis Collins'in bir blog yazısı da dahil olmak üzere, biraz ilgi gördü.

Yair, Evan ve Natalie'nin kağıt üzerinde çok yeni poligenik adaptasyon şimdi bioRxiv'de [Link] yayınlandı. Bu, Nature and Science'daki haberler de dahil olmak üzere çok dikkat çekti.

Yair ve Yang ikisi de Cold Spring'in Genomların Biyolojisi Toplantısında konuşma yaptı. Laboratuvar mezunlarının konuşmalarını görmek de harikaydı. Alexis Savaşı, Joe Pickrell ve Dan Gaffneyve diğer birçok meslektaş, arkadaş ve diğer laboratuvar mezunları ile takılmak için.

Burada Alex Cagan tarafından çizilen bir çift harika Yang ve Yair eskizini görebilirsiniz.

4/28/2016. Tebrikler Yang, kimin kağıdı RNA ekleme, genetik çeşitlilik ve hastalık arasındaki birincil bağlantıdır. bugün çıktı [Link]. Bu makale, genetik çeşitlilik, gen düzenlemesindeki çeşitlilik ve hastalık arasındaki bağlantıların ayrıntılı bir muhasebesini sağlamak için laboratuvarımız ve Yoav'ın laboratuvarı arasındaki 7 yıllık ortak projelerden elde edilen verileri kullanır.

3/29/2016. tebrikler Evan (NSF predoc!). Ayrıca Yang ve David K Leafcutter kağıtlarında, şimdi bioRxiv'de, RNA eklemesinin nicelleştirilmesi üzerine.

1/4/2016. Geçmiş olsun ve en iyi dileklerimle Bryce (doktora sonrası, Alkes Price laboratuvarı, Harvard) ve Graham ve Kyle, sırasıyla Salk Enstitüsü ve UCSD'de kendi laboratuvarlarını kuruyor.

11/20/2015. tebrikler Bryce Chicago'daki ustaca doktora savunması için. U Chicago döneminin sonunu işaret eden buruk bir olaydı.

9/14/2015. Bryce ve Graham'ın WASP makalesi (alel-spesifik okumalarla QTL eşlemesi) bugün Nature Methods'da çıktı.

8/18/2015. Cuma günü Tezgahta bir veda yemeği yedik. Audrey ve çekici (sırasıyla U of Idaho ve Mt Sinai'de kendi laboratuvarlarını kuruyorlar). İyi yolculuklar!

Büyük bir hoş geldiniz Kelley Harris ve Ziyue Gao Rasmus Nielsen ve Molly Przeworski'nin laboratuvarlarından yeni postdoc olarak bize katılanlar!

Kısa süreli ziyaretçimiz Dan Lawson'a ve bu ay kısa bir süreliğine bizi tekrar ziyaret edecek olan Alexis Battle'a hoş geldiniz.

Oğulları Yuval'ın doğumu için Eilon ve Michal'i tebrik ederiz!

Bağışlar bölümünde, Kelley (NRSA), David G (EMBO/LLHF), Yang (CEHG), Jessica'ya (NSF predoc) aferin! Ve Natalie ve Evan, biri Genetics'ten, diğeri Systems Biology'den olmak üzere bir çift dahili araştırma hibesi aldı. Tebrikler.

5/22/2015. JKP öğretmeyi neredeyse bitirdi. Haberleri yakalamak: Tebrikler Graham kim alıyor Salk Enstitüsü'nde öğretim üyesi işi!!

Ve tebrikler çekici kim alıyor Mt Sinai'de çalışıyor.

Ve daha fazla tebrikler Yang kim gelecek yıl için bir CEHG doktora sonrası bursu aldı!

Ve Xun'un kağıdı gen kopyalarının evrimi hakkında bioRxiv'de çıktı.

4/2/2015. tebrikler David G. Kim Dan David Ödülü bursu kazandı!

3/31/2015. Şu anda Cornell'de olan eski laboratuvar üyesi Melissa Hubisz'i bir yarışmayı kazandığı için tebrik ederiz. NSF predoc ödül! Ayrıca mansiyon ödülü için Jessica, Emily ve Evan'a da tebrikler.

12/18/2014. Alexis, Zia ve Sidney'nin RNA, ribozomlar ve proteinlerdeki genetik varyasyon ile fenotipik varyasyon arasındaki ilişki hakkındaki makalesi bugün yayınlandı. Tebrikler!

12/16/2014. tebrikler Cristina dün CS'de doktora savunmasını tamamlayan!!

12/04/2014. Anil ve Heejung'un TF bağlama bölgelerindeki DNase verilerini modellemek için çok ölçekli yaklaşımları kullanma konusundaki makalesi bioRxiv'de yayınlanmıştır.

11/11/2014. yeni web sitemiz Bilim Okuyucusu bilimsel öneriler için beta sürümünde çıktı. Buradan kontrol edebilirsiniz: SciReader.org. Aferin Priya, Natalie, Yonggan!

11/11/2014. Bryce ve Graham'ın makalesi ve yazılımı tarafsız allele özgü okuma eşlemesi ve güçlü QTL eşlemesi bioRxiv'de çıktı ve ilgili WASP yazılımı GitHub'da.

9/22/2014. Bu ay çok sayıda yeni gelen: David, Yang, Anand ve Emily konuk akademisyenler: Audrey, Towfique ve Kyle. Hoş geldin!

8/07/2014. Bu hafta Clark Center'daki uzun süreli laboratuvar alanımıza taşınıyoruz! Yeni mekanda olmaktan çok mutluyuz. Diğer haberlerde, anand gelecek yıl için bir CEHG bursu almaya hak kazandı. Aferin, Anand!

6/24/2014. Alexis kendi laboratuvarını kuracak gelecek ay Johns Hopkins'te CS ve Biostats [Link] bölümlerinde. Kendisine yeni görevinde başarılar diliyoruz!!

6/24/2014. aferin Eilon prestijli EMBO bursunu kazanma konusunda! David Eylül ayında katılacak olan Golan, Rothschild ve Fulbright burslarına layık görüldü. Her ikisine de tebrikler!!

6/24/2014. Xun ve Nick'in kağıdı DNA metilasyonu üzerindeki genetik etkiler bioRxiv'de [Link] çıktı.

4/29/2014. Anıl'ın hızlı YAPI Kağıt artık Genetics: Link'te çıktı.

Alexis gelecek hafta Genomların Biyolojisi genetik varyasyonun mRNA, translasyon ve proteinler üzerindeki etkilerini anlama konusunda Zia ve Sydney ile yaptığı çalışmalar hakkında.

4/2/2014. Darren Cusanovich'in makalesi TF'lerin devrilmesi LCL'lerde (Yav'ın laboratuvarıyla birlikte) şimdi PLOS Genetics: Link'te çıktı. Choongwon Jeong'un makalesi Sherpa'dan Tibetlilere yüksek irtifa uyarlamalarının uyarlanabilir introgresyonu (Anna Di Rienzo'nun laboratuvarıyla işbirliği), şimdi Nature Communications: Link'te.

4/1/2014. Heejung Kim'e iyi yolculuklar, kış dönemini Matthew'un Chicago'daki laboratuvarından bizi ziyaret ederek geçirdi.

3/1/2014. Şimdi ailesiyle birlikte Chicago'dan gelen Yair'e hoş geldiniz!

2/10/2014. bizim kağıt insan popülasyonlarında genetik yükGuy Sella'nın laboratuvarı ile ortaklaşa olan , şimdi Nature Genetics'te. (Guy'ın laboratuarında) Yuval Simons'a ve (şimdi Matthew Stephens'ın laboratuarında) Michael Turchin'e aferin! Bağlantı.

2/10/2014. Eran Segal'in laboratuvarından buraya taşınan yeni doktora sonrası Eilon Sharon'a hoş geldiniz. Eilon, Hunter Fraser'ın laboratuvarıyla ortak olacak. Bu dönemin rotasyon öğrencilerine de hoş geldiniz: Peyton Greenside, Natalie Telis, Diego Calderon, Arbel Harpak ve Emily Glassberg!

12/6/2013. Joe Davis, Graham ve Bryce'ın genetik varyasyon ve histon modifikasyonu hakkındaki son makalesi hakkında harika bir blog yazısı yazdı.

12/4/2013. fastSTRUCTURE çıktı! Anıl'ın el yazması ve beta sürümü yazılımına bağlantılar burada.

12/4/2013. Zia'nın mRNA/protein kağıdının evrimi konusundaki bakış açısı için Christine Vogel'a teşekkürler.

11/12/2013. Bu ay laboratuvara katılan Yonggan ve Priya'ya hoş geldiniz!

11/12/2013. RECOMB/ISCB toplantısında DNase QTL'leri hakkındaki makalesi Regulatory and Systems Genomics'te 2012'nin en iyi makalelerinden biri seçilen Jack/Athma/Roger'ı tebrik ederiz.

11/1/2013. NRG'de Hannah Storey'nin, genetik varyasyonun histon modları üzerindeki etkilerini inceleyen - Graham ve Bryce'ın da dahil olmak üzere - son 4 makalesinde güzel bir bakış açısı var.

10/30/2013. Kudos Shyam ASHG'de Afrika popülasyonları için tarihsel çıkarımlar üzerine yaptığı konuşmayla prestijli Charles Epstein Stajyer Araştırma Ödülü'nü (doktora sonrası bölümü) kazandığı için. Graham Coop, laboratuvarımızın bir önceki kazananıdır (2007'de).

10/22/2013. Laboratuar mezununu tebrik ederim Joe Pickrell New York Genom Merkezi'ndeki ilk fakültelerden biri olarak bir pozisyonu yeni kabul eden. Ek olarak, Ziya Han şimdi U. Maryland'deki CS'deki ilk fakülte pozisyonuna geçiş yapıyor. Her ikisine de iyi şanslar!

10/22/2013. Darren'ın 59 TF'yi hedefleyen yıkım deneyleri hakkındaki makalesi ArXiv'de çıktı.

10/17/2013. Zia ve Graham/Bryce'ın Science dergisinde bugün yayınlanan bir çift makalesi var: Primatlarda protein ekspresyonunun evrimi ve genetik varyasyonun histon modifikasyonları üzerindeki etkileri. Zia, Graham ve Bryce'a tebrikler!

10/17/2013. Ben Voight'ın seçimle ilgili 2006 makalesi, Emma Ganley tarafından PLOS Biyoloji'deki 10. yıl dönümü kutlamalarının bir parçası olarak güzel bir blog makalesinde vurgulandı.

10/11/2013. İlk iki Stanford rotasyon öğrencimize hoş geldiniz: Biyoloji bölümünden Ilana Arbisser ve Genetik'ten Michael Sikora!

8/1/2013. Stanford Üniversitesi'ne taşındığımız için mutluyuz. Burası harika bir akademik ortam ve yaşamak için harika bir yer olacak. Bununla birlikte, laboratuvarın 12 yıl boyunca dayandığı Chicago Üniversitesi'ndeki birçok arkadaşımızı özleyeceğiz.

8/1/2013. En yeni postdoc Alexis Battle'ımıza hoş geldiniz! Onun gemide olması harika.

8/1/2013. Bu ay Stanford'a gelen Anil, Stoyan ve Xun'a hoş geldiniz. Laboratuvarın geri kalanı yakında takip edecek veya geçiş döneminde Chicago'dan çalışacak.

Selam Dünya. Laboratuar, Chicago Üniversitesi'nde 12 yıl geçirdikten sonra, 8/1/2013 tarihinde Stanford'a taşındı.


Protein bölgeleri arasındaki kodon kullanımında doğal seçilimdeki değişimlerin nicelleştirilmesi: Bir popülasyon genetiği yaklaşımı

Eşanlamlı kodonların tek tip olmayan kullanımı olan kodon kullanım yanlılığı (CUB), yaşamın tüm alanlarında meydana gelir. Uyarlanabilir CUB, verimli ribozom hareketi ve/veya doğru çeviri için seçimden kaynaklandığı varsayılır. Ampirik ve hesaplamalı kanıtlar, yanlış algılama hata oranındaki değişikliklerin ve çeviri hızının bir proteinin doğal durumuna ulaşma yeteneğini etkileyebileceğini göstermektedir. Katlanma ve işlev arasındaki kritik bağlantı göz önüne alındığında, çok sayıda çalışma kodon kullanımı ile protein yapısı arasındaki ilişkiyi analiz etmiştir. Sonuçlar, kodon kullanımındaki farklılıkları ölçmek için çeşitli yöntemler ve kafa karıştırıcı faktörlerin (örneğin amino asit yanlılıkları) uygun şekilde kontrol edilmemesi nedeniyle genellikle çelişkili olmuştur. Bu eksikliklerden kaçınmak için, protein yapısıyla ilgili doğal seleksiyonda kodona özgü kaymaları ölçmek için açık bir popülasyon genetiği yaklaşımı kullanıyoruz. Sonuçlarımız, kodon kullanımı ile protein yapısı arasında zayıf bir ilişki olduğunu ortaya koymakta, bu da yapılar arasındaki seçim farklılıklarının çok ince olduğunu ve/veya aralıklı olarak meydana geldiğini göstermektedir. Seçimdeki farklılıkların büyüklüğü önemsiz görünse de, sonuçlarımız kodon kullanımı ile protein yapısı arasındaki ilişkinin önceden inanıldığından daha karmaşık olduğunu gösteriyor.Çalışmamız, açıkça evrimsel bir yaklaşımdan kodon kullanımı veya diğer genomik özellikler üzerindeki seçici kaymaları çalışmanın istatistiksel gücünü ve faydalarını göstermektedir.

Rakip Faiz Beyanı

Yazarlar rekabet halinde bir çıkar beyan etmemiştir.


Sonuçlar ve tartışma

İmmüno-çökeltilmiş kapalı döngü ve 4E-BP komplekslerinin analizi

Kapalı döngü modeli, translasyonun başlatılması için mRNA seçimi için yaygın olarak iletilen bir açıklamayı temsil eder [12,18,19]. Kapalı döngü kompleksinin bileşenlerinin global mRNA bağlanma profilini şu şekilde değerlendirdik: S. cerevisiae (Şekil 1A). Kapalı döngü kompleksinin bileşenlerini kodlayan endojen genlerin her biri üzerinde genomik olarak entegre edilmiş karboksi-terminal tandem afinite saflaştırma (TAP) etiketleri taşıyan suşlar kullandık ve bunları toplu kültürde standart üstel büyüme koşulları altında büyüttük. MRNA seçim sürecinin ve dahil olabilecek düzenleyici mekanizmaların sistematik bir analizini sağlamak için, çeviri baskılayıcıları olarak kabul edilen maya eIF4E bağlayıcı proteinlerin (4E-BP'ler), Caf20p ve Eap1p'nin her biri için mRNA bağlanma profilini de araştırdık. (Şekil 1A) [40].

Bu bileşenlerin her biri ile ilişkili mRNA'ların immüno-saflaştırması (IP) için deneysel sistem kurulurken, bir dizi faktöre özel dikkat gösterildi. İlk olarak, TAP etiketlemenin her bir faktörün seviyeleri üzerindeki etkisi değerlendirildi. Sonuç olarak, gözlemledik ki, CDC33-TAP suşu, eIF4E-TAP proteini aşırı eksprese edilir, bu nedenle seçilebilir markörü çıkarmak ve eIF4E seviyelerini vahşi tipe geri yüklemek için bu suşu yeniden yapılandırdık (veriler gösterilmemiştir). İkinci olarak, bu çalışmada kullanılan TAP etiketli suşların tümü, hem büyüme (veriler gösterilmemiştir) hem de polizom profili oluşturma yoluyla global mRNA çevirisi (Ek dosya 1A) açısından değerlendirilmiştir. Suşlar, bu temel translasyon başlatma faktörü genlerinin tek kopyası olarak TAP etiketli aleli taşır, dolayısıyla büyüme ve polisom profillerinin ana suştan ayırt edilemez olması, etiketli proteinlerin tamamen işlevsel olduğunu düşündürür. Üçüncüsü, ribonükleoprotein kompleksleri üzerindeki etkiyi en aza indirmek için IP'mizin 20 dakika içinde tamamlanacağı şekilde ilgili proteinlerin hızlı IP'si için bir manyetik boncuk protokolü geliştirdik. Her bir etiketli proteinin çoğunluğunun saflaştırılması ve dolayısıyla özütten tüketilmesi için saflaştırmaları optimize etmek için özel bir özen gösterildi (Şekil 1B'deki girdileri, akışları ve eluatları karşılaştırın). Aslında, akışta herhangi bir TAP etiketli proteinin saptanabildiği tek IP, Pab1p örneğindeydi. Sonuç olarak, Pab1p hücrede en bol bulunan RNA bağlayıcı proteinlerden biri olmasına rağmen [38], hala bu proteinin %80'den fazlasını tam hücre ekstraktlarından immüno-saflaştırıyoruz (Şekil 1B).

IP'lerin hem kapalı döngü kompleksinin hem de 4E-BP baskı komplekslerinin oluşumuyla tutarlı proteinler içerdiğinden emin olmak için, western blotlar üzerinde çeşitli antikorlarla immüno-saflaştırılmış numuneler incelenmiştir (Şekil 1C,D). Bu lekelerde, her TAP etiketli proteinin göçü, etiketlenmemiş proteine ​​göre geciktirilir (örneğin, Şekil 1C,D'de Pab1p-TAP, eIF4E-TAP ve Caf20p-TAP). eIF4G1-TAP ve eIF4G2-TAP için, TAP epitopundaki protein A, ikincil antikor tarafından saptanır, dolayısıyla bir eIF4G1'e özgü birincil antikor kullanılmış olsa bile bir eIF4G2-TAP protein bandı gözlemlenir (Şekil 1C). Bununla birlikte, bu analizi özetlemek için, kapalı döngü kompleksinin ilgili tüm bileşenleri, eIF4E, eIF4G1 ve Pab1p, eIF4E, eIF4G1, eIF4G2 ve Pab1p'nin uygun IP'lerinde mevcuttu (Şekil 1C). Aynı şekilde, 4E-BP baskı kompleksleri açısından, hem Eap1p hem de Caf20p IP'leri eIF4E içerir, ancak eIF4G1 içermez (Şekil 1D), Şekil 1A'da gösterilen 4E-BP aracılı baskı için genel olarak kabul edilen rekabetçi modelle tutarlıdır [41]. Son olarak, TAP etiketli proteinlerin mRNA başlığı ile uygun şekilde etkileşime girme kapasitesi, Cap afinite kromatografisi (Ek dosya 1B) kullanılarak değerlendirildi. TAP etiketli bileşenlerin her biri reçine üzerinde ilgili etiketlenmemiş proteine ​​benzer şekilde izole edilmiştir, bu da suşlardaki TAP etiketlerinin etiketli proteinlerin RNA veya RNA'ya bağlı proteinlerle etkileşime girme kapasitesini gereğinden fazla etkilemediğini düşündürür.

Zenginleştirilmiş mRNA'lar ve ilişkilerinin fonksiyonel önemi

Üç biyolojik kopya boyunca eIF4E, eIF4G1, eIF4G2, Pab1p, Caf20p ve Eap1p için IP'lerle ilişkili mRNA'lar RNA-seq ile ölçülmüştür (ayrıntılar için Malzemeler ve yöntemlere ve haritalama istatistikleri ve sayıları için Ek dosya 2'ye bakın). Veriler, aynı TAP-etiketli suştan bir toplam RNA örneğine göre her mRNA türü için bir oran oluşturmak üzere işlendi. Kitaplıklar, ortalama 7.8 ± 5.8 milyon benzersiz, haritalanmış okuma derinliğine göre dizildi ve veriler, GLM eşleştirilmiş modeli kullanılarak immüno-çökeltilmiş numunede istatistiksel olarak (yanlış keşif oranı (FDR) <0.05) zenginleştirilmiş transkriptlerin listelerini oluşturmak için kullanıldı. EdgeR (Ek dosya 2'de sağlanan tam listeler). RIP-seq verilerinden oluşturulan bir fonksiyonel zenginleştirme analizi, bir dizi eğilimin belirgin olduğu Şekil 2A'da sunulmaktadır. EIF4E bağlayıcı proteinlerin her ikisi de, Caf20p ve Eap1p, protein ürünleri bir dizi nükleer fonksiyona (örneğin, RNA işleme ve transkripsiyon) katılan IP ile zenginleştirilmiş transkriptlere sahiptir ve muhtemelen translasyon düzenlemesi ile yukarı akış düzenlemesi arasındaki bağlantıyı ortaya koymaktadır. gen ekspresyon yolunda. Önceki bir çalışmada, vahşi tipte ve polisom gradyanlarında mRNA'ların ilişkisindeki herhangi bir değişikliği ölçmek için mikrodiziler kullanarak Caf20p ve Eap1p'nin işlevsel önemini değerlendirdik. caf20Δ ve eap1Δ mutant suşlar [40]. Bu, binden fazla transkriptin potansiyel olarak maya 4E-BP'leri tarafından translasyon düzeyinde düzenlendiğini ortaya koydu. Burada, nakavt suşlarda polisomal ilişki açısından RIP-seq değişikliği yoluyla Caf20p ve Eap1p ile nasıl ilişkili olduğu bulunan mRNA'ları değerlendirebiliriz. Tercihen Caf20p ve Eap1p ile ilişkilendirilen transkriptler, ustaca, ancak önemli ölçüde (bir dizi FDR kesme kullanılarak), polizom fraksiyonlarına kaydırılır. caf20Δ vahşi türe göre zorlanma (Ek dosya 3). İçin eap1Δ vahşi tipe göre mutant suş benzer eğilimler gözlendi eap1Δ grafikler, etki ölçeği, öncekinden önemli ölçüde daha az belirgin olsa da caf20Δ Veriler (veriler gösterilmemiştir), potansiyel olarak hücrede Caf20p'ye göre azalmış bolluğu nedeniyle [38]. Genel olarak, RIP-seq verilerinin mutantlar üzerindeki önceki mikrodizi çalışmalarıyla bu karşılaştırması, 4E-BP'ler için translasyon başlatmanın baskılayıcıları olarak açıklanan rolle tutarlıdır.

Tercihen kapalı döngü bileşenleri ve 4E-BP'ler ile ilişkili transkriptlerin özellikleri. (A) Üstte gösterilen altı proteinin afinite açılanması bakımından zenginleştirilmiş transkript setlerinin her biri için önemli ölçüde fazla temsil edilen (kırmızı) veya yetersiz temsil edilen (yeşil) Gen Ontolojisi terimleri. (M.Ö) Kapalı döngü bileşenleri ve 4E-BP'ler ile zenginleştirilmiş transkriptler için ribozom doluluk [42] ve poli(A) kuyruk uzunluğundaki [43] varyasyonu detaylandıran kutu ve bıyık grafikleri. Transkript setleri arasında bir Wilcoxon rank istatistiksel testi, Pab1p ile zenginleştirilmiş transkriptlerle her iki özellik için de yüksek bir ilişki ortaya çıkardı. Bu grafiklerde renkli kutular, medyanı temsil eden çentik ile üst ve alt çeyreklerin kapsamını göstermektedir. Noktalı başlıklı dikey çizgiler üst ve alt uçları gösterirken, daireler dış değerlerdir.

Bireysel gen listeleri için diğer korelasyonları değerlendirmek için, poli(A) kuyruk uzunluğu [43] ve ribozom doluluğu [42] (Şekil 2B,C) dahil olmak üzere bir dizi farklı parametre ile karşılaştırıldılar. Şaşırtıcı bir şekilde, Caf20p ve Eap1p ile bağlantılı mRNA'lar, eIF4G1 veya eIF4G2 ile bağlantılı mRNA'lar kadar yüksek ribozom doluluklarına sahiptir. Bunun birkaç nedeni olabilir: eIF4E ile etkileşim, Caf20p ve Eap1p'nin mRNA'larla ilişkilendirilebileceği tek yol olmayabilir veya maya 4E-BP'leri, yüksek oranda çevrilmiş mRNA'ların çevirisini, ortalama olarak , 4E-BP ile ilişkili mRNA'lar hala yüksek bir ribozom doluluğuna sahip olabilir. Belki de bu karşılaştırmalardan elde edilen en çarpıcı sonuç, Pab1p ile zenginleştirilmiş transkriptlerin, beklendiği gibi yalnızca daha uzun poli(A) kuyrukları ile değil, aynı zamanda yüksek seviyelerde ribozom işgali ile de ilişkili olmasıdır (Şekil 2B,C). Poli(A) kuyruk uzunluğu ve ribozom ilişkisi arasındaki yüksek düzeyde korelasyon daha önce gözlenmiştir [43], ancak burada, Pab1p ile zenginleştirilmiş transkriptler için ribozom doluluk seviyesinin, diğer bileşenlerle ilişkili transkriptlerden önemli ölçüde daha yüksek olduğunu gösteriyoruz. kapalı döngü kompleksi (Şekil 2C). Bu sonuçlar, Pab1p'nin çevirinin özellikle verimli ve sağlam olduğu mRNA'lar için önemli bir oyuncu olduğunu vurgulamaktadır.

Pab1p RNA bağlanma profili, diğer kapalı döngü bileşenlerinden farklıdır

Farklı RIP-seq veri kümeleri arasındaki varyasyonun ikili bir şekilde nicel bir değerlendirmesini sağlamak için, EdgeR yazılım paketi (Bioconductor) içindeki Genelleştirilmiş Doğrusal Model (GLM) işlevinden türetilen bir etkileşim modeli kullandık [44,45] . Daha spesifik olarak, IP örneklerindeki mRNA düzeylerinin oranını toplam RNA örneğindeki düzeye göre karşılaştırdık (log2(IP/Toplam)) altı immünopresipitasyon deneyinin her birinde her bir gen için ve aralarındaki ikili korelasyonları inceledi (Şekil 3A). Burada, istatistiksel bir kesme ile tanımlananlardan ziyade mRNA zenginleştirme değerlerinin tam profili sunulmaktadır. Bu veriler, GLM'ye göre deneyler arasında önemli ölçüde farklı olduğu bulunan transkriptleri kırmızıyla vurgulayarak, veri kümelerini çapraz karşılaştıran dağılım grafikleri olarak sunulur. Çarpıcı bir şekilde, bu grafikler eIF4F kompleksinin üç üyesinin bağlanma profillerinde gözlemlenen yüksek korelasyonu vurgulamaktadır (0.755, 0.753 ve 0.812 Pearson korelasyonları). Benzer şekilde, Caf20p ve Eap1p için iki 4E-BP bağlanma profili de birbiriyle benzer yüksek korelasyon gösterir. Özellikle, Pab1p, eIF4F kompleksinin bileşenleri ile pozitif korelasyonlar gösterirken, translasyonel baskılayıcılar Caf20p ve Eap1p'den gelen profillerle negatif korelasyon gösteren değerlendirilen tek faktördür.

Kapalı döngü bileşenlerinin her biri ve 4E-BP'ler için RIP-seq deneyleri arasında doğrudan ikili karşılaştırmalar. (A) Dağılım grafikleri, günlükteki değişikliği görüntüler2 altı proteinin her biri için birbirleriyle karşılaştırıldığında medyan kat değişiklikleri (IP/Toplam). FDR <0.05'te edgeR'nin etkileşim GLM modeline göre iki deney arasında önemli ölçüde farklı olduğu belirlenen transkriptler kırmızıyla vurgulanmıştır. (B) İkili karşılaştırmalar arasında önemli ölçüde farklılık gösteren toplam transkript sayısını gösteren tablo (A). Sayılar, her satırda listelenen proteinlere göre sütunlarda listelenen proteinlerin IP'lerinde aşırı temsil edilen transkriptleri temsil eder.

Etkileşim modeli ile farklılık gösteren transkript sayıları Şekil 3B'de gösterilmektedir (Ek dosya 4'te ayrıntılı olarak verilmiştir). Bu, GLM'ye (kırmızı veri noktaları) göre her ikili karşılaştırma için diferansiyel olarak zenginleştirilmiş veya yetersiz temsil edilen transkriptlerin sayısını gösterir ve dağılım grafiklerinde gözlemlenen genel eğilimleri destekler (Şekil 3A). Örneğin, iki eIF4G izoformu, eIF4G1 ve eIF4G2 ile ilişkilerinde önemli ölçüde farklı olarak hiçbir transkript tanımlanmadı. Bu gözlem, bu iki izoformun işlevsel olarak gereksiz olduğunu öne süren son verilerle tutarlıdır [17]. Yukarıdaki verilerle birleştirilen bu sonuçlar, eIF4F kompleksinin eIF4E, eIF4G1 ve eIF4G2'nin mRNA ile etkileşimlerinin büyük çoğunluğunu açıkladığını göstermektedir. Bu, çeviri baskılayıcıları Caf20p ve Eap1p'nin eIF4E ile etkileşim yoluyla çeviriyi engellediği, ancak bağlanma profillerinin eIF4E'ninkiyle minimum korelasyon gösterdiği göz önüne alındığında özellikle ilgi çekicidir. Bunun olası açıklamaları, 4E-BP'lerin mRNA'larla eIF4E'den bağımsız yollarla etkileşime girebilmesi veya 4E-BP-eIF4E kompleksinin mRNA ile daha az kararlı bir şekilde ilişkili olabilmesidir.

Pab1p'nin her mRNA üzerindeki eIF4F kompleksi ile stokiyometrik olması durumunda, Pab1p için mRNA bağlanma profilinin eIF4E, eIF4G1 ve eIF4G2'ninkine benzer olması bekleneceği de açıktır. Ancak, açıkçası durum böyle değil. Pab1p'nin mRNA'nın 3' ucuna bağlandığı ve eIF4F bileşenlerinin 5' ucuyla ilişkili olduğu not edilmelidir. Bu farkın, bu RIP-seq veri kümeleri arasında belirgin olan bazı varyasyonları açıklaması mümkündür. Alternatif olarak, bu veriler kapalı döngü kompleksinin yalnızca bir mRNA alt kümesinin çevirisi ile ilgili olduğunu vurgulayabilir. Şaşırtıcı bir şekilde, Pab1p profili, translasyonel baskılayıcılar Caf20p ve Eap1p'ninkilerle ters orantılıdır (aslında, eIF4G profillerinden ziyade 4E-BP profilleriyle en güçlü anti-korelasyondur) ve Pab1p ile zenginleştirilmiş transkriptler ayrıca daha yüksek ribozomlara sahiptir. doluluk (Şekil 2B), Pab1p ilişkilendirmesi ile aktif çeviri arasında güçlü bir ilişki olduğunu vurgulamaktadır.

RIP-seq zenginleştirme profillerinin kümelenmesi, kapalı döngü kompleksi ve Pab1p aracılığıyla çeviri kontrolünde küresel eğilimleri ortaya koyuyor

RIP-seq veri kümelerinin ikili karşılaştırması önemli bilgiler sağlarken, tüm RIP-seq veri kümelerinde RNA bağlanma profillerinin karşılaştırılması, hiyerarşik bir kümeleme yöntemi kullanılarak eşzamanlı olarak görselleştirilebilir. Bu nedenle RIP-seq verileri bir ısı haritası biçiminde ifade edildi ve her kapalı döngü üyesi için güçlü bir şekilde ilişkili üç biyolojik kopyayı sütunlar olarak ve tek tek transkriptleri satırlar olarak gösterdi (Şekil 4). Minimum sayıda yanlış pozitif sağlamak için, kümeleme analizi için sayıma dayalı bir filtreyle birleştirilmiş daha muhafazakar bir istatistiksel sınır kullanıldı. Daha spesifik olarak, ısı haritası, IP'lerden en az birinde EdgeR'nin GLM modeline göre önemli (FDR <0.01) bir zenginleştirme veya eksik temsil gösteren transkriptlerle ve bunların her birinde 20'den fazla okunan transkriptlerle sınırlıdır. ilgili toplam özüt örnekleri. Toplamda, maya genomundaki açıklamalı genlerin 3.173'ü bu kriterleri karşılamaktadır. Bu nedenle, maya transkriptomunun önemli bir kısmı, toplam mRNA'ya göre çok az fark edilebilir, istatistiksel olarak anlamlı zenginleştirme veya yetersiz temsil gösterir ve ısı haritası bunu yapanlara odaklanır.

RIP-seq veri kümelerinde dört ana küme belirgindir. MRNA bağlanma profillerinin hiyerarşik kümelenmesinden türetilen ısı haritası (log2 Çalışmadaki altı proteinin kat değişiklikleri IP/Toplam) kırmızı ve mavi, sırasıyla fazla ve az temsil edilen mRNA'ları temsil eder. Analiz, altı veri setinden herhangi birinde fazla temsil edildiği veya yetersiz temsil edildiği tespit edilen 3.173 transkript ile sınırlandırıldı ve Malzemeler ve yöntemler bölümünde açıklandığı gibi hiyerarşik kümeleme yapıldı. Sunulan ısı haritası, ilişki modellerinin benzerliğine dayalı olarak I'den IV'e kadar gruplara ayrılmış 7 kümeye ayrılmış 2.767 transkript içerir.

RIP-seq zenginleştirme profillerinin standart hiyerarşik kümelemesi (ayrıntılar için Malzemeler ve yöntemlere bakın) kullanılarak, 2.767 transkripti kapsayan dört geniş grup (I ila IV) tanımlanabilir (Şekil 4 Ek dosya 5). Bu dört görsel olarak farklı grup, kapalı döngü bileşenleri ve translasyon baskılayıcıları Caf20p ve Eap1p ile ilgi çekici ilişki kalıpları sergiler, büyük ölçüde eIF4E/4G1/4G2/Pab1p ve Caf20p/Eap1p'ye göre zenginleştirme/yetersiz temsil blokları olarak kendini gösterir. Grup I, Pab1p dışında test edilen tüm bileşenlerden IP'lerde çoğunlukla yetersiz temsil edilen mRNA'ları içerir. Grup II, Caf20p ve Eap1p çeviri baskılayıcılarının IP'lerinde zenginleştirilmiş mRNA'ları içerir. Grup III, kapalı döngü bileşen IP'lerinde zenginleştirilmiş ancak Caf20p ve Eap1p örneklerinde yetersiz temsil edilen mRNA'ları içeren iki kümeden oluşur: çevirinin oldukça aktif olduğu ve kapalı döngü yoluyla sağlam bir şekilde başlatıldığı mRNA'lar için beklenebilecek bir ilişki profili karmaşık. Son olarak, grup IV, hem eIF4F hem de 4E-BP veri kümeleri arasında zenginleştirilmiş büyük, geniş bir mRNA grubudur ve burada Pab1p veya eIF4F bileşenleri ile zenginleştirme düzeyi tarafından belirlenen üç alt küme ile etkileşim arasında karmaşık bir rekabet olabilir. kapalı döngü bileşenleri ve çeviri baskılayıcılar. Grup IV'teki mRNA'ların kabaca yarısının, aynı mRNA'ların eIF4F ile zenginleştirilmiş olmasına rağmen, Pab1p için yetersiz zenginleştirilmiş olması özellikle ilgi çekicidir. Bu mRNA'lar için, poli(A) kuyruğunun, daha önce Pab1p ile rekabet ettiği öne sürülen Nab2p veya Sgn1p gibi diğer RNA bağlayıcı proteinlerle etkileşime girebileceği akla yatkın görünmektedir [46]. Genel olarak, bu kümeler, kapalı döngü kompleksi aracılığıyla çeviri başlatmanın bazı mRNA'lar için diğerlerinden daha önemli olabileceği olasılığını vurgular. Özellikle, grup III, tercihen kapalı döngü kompleksi ile etkileşime giriyor gibi görünen mRNA'ları ve tercihen 4E-BP'ler ile etkileşime giren grup II mRNA'ları tanımlar.

mRNA'ların bu global translasyonel gruplarını daha ayrıntılı olarak ele almadan önce, daha önce de bulunduğu gibi, GLM modelini ve dağılım grafiklerini (Şekil 3) kullanarak, eIF4E, eIF4G1 ve eIF4G2 IP profilleri arasında yüksek bir yazışma olduğunu belirtmek ilginçtir. Pab1p modeli farklı görünüyor (Şekil 4). Ek olarak, 4E-BP'ler, Caf20p ve Eap1p mayalarının profilleri çok benzer olsa da, diğer IP'ler için gözlemlenen modellerden farklıdır. Bu, özellikle Şekil 4'teki sütunlar üzerinde sunulan kümeleme dendrogramında belirgindir. Gerçekten de eIF4G1 ve eIF4G2 profilleri, dendrogram boyunca ayırt edilemeyecek kadar benzerdir. eIF4F bileşenlerinin eIF4E ve eIF4G benzer bir mRNA etkileşim profili sergilerken, Pab1p için olanın yine farklı görünmesi, tam kapalı döngü kompleksinin yalnızca bir mRNA alt kümesinin translasyonu ile ilgili olduğu bir modele işaret eder. Ayrıca, grup II'de 4E-BP'ler, translasyon faktörlerinin zenginleştirilmediği yerlerde tercihen transkriptlerle etkileşim halinde olarak tanımlanabildiğinden, translasyonu bastırmak için mRNA'lar üzerindeki eIF4E-4E-BP etkileşiminin basit modelinin aşırı basitleştirme olabileceği görülmektedir. .

Şekil 4'te tanımlanan kümeler ve bir bütün olarak RIP-seq veri kümeleri için bağımsız bir doğrulama sağlamak için, TAP etiketli faktörlerin IP'lerinden hazırlanan RNA üzerinde bir dizi kantitatif ters transkriptaz PCR (qRT-PCR) analizi yapılmıştır. ve giriş fraksiyonlarındaki RNA seviyeleri ile karşılaştırılır (Şekil 5). Bu veriler, RIP-seq analizi ile mükemmel bir korelasyon sergiler. Grup III mRNA'lar, eIF4E, eIF4G1, eIF4G2 ve Pab1p ile zenginleştirilmiştir, ancak 4E-BP'ler ile zenginleştirilmemiştir. Grup II mRNA'ları ağırlıklı olarak 4E-BP'lerle zenginleştirilmiştir.Grup IV mRNA'ları, TAP etiketli bileşenlerin çoğu için zenginleştirilmiştir ve grup I mRNA'ları, Pab1p dışındaki tüm faktörler için yetersiz zenginleştirilmiştir. Bu son gözlem özellikle dikkat çekicidir ve Pab1p'nin bu yüksek bolluktaki mRNA'ların translasyonunda anahtar bir rol oynadığını düşündürür. Pab1p'nin, başlatma sırasında alt birim birleştirme [22] ve çeviri sonlandırma/ribozom geri dönüşümü [23] dahil olmak üzere çeviri sürecindeki çeşitli aşamaları geliştirmesi önerilmiştir. Bu nedenle, bir olasılık, Pab1p'nin, kap ile etkileşime giren proteinlerden bağımsız olarak bu adımları geliştirmek için hareket etmesidir. Alternatif olarak, Pab1p şimdiye kadar tanımlanamayan bir şekilde hareket ediyor olabilir.

Kantitatif RT-PCR ile transkript kümelerinin doğrulanması. Şekil, transkript kümelerinin her biri için bir tane olmak üzere dört grafiği göstermektedir. Belirtilen mRNA'lar, etiketlenmemiş kontrol ve kapalı döngü/4E-BP düzenleyici bileşenler için toplam RNA'ya göre IP örneklerinde ölçülür. Hata çubukları, üç tekrarlı deneyden elde edilen ± standart hatadır.

Verilerin qRT-PCR analizi tarafından vurgulanan başka bir yönü, transkriptlerin çeşitli kapalı döngü bileşenleri ve toplam RNA örneğine göre 4EBP'ler ile yetersiz zenginleştirilmesine rağmen, seviye ile karşılaştırıldığında mRNA'ların IP'lerde hala mevcut olmasıdır. etiketlenmemiş bir suştan elde edilen mRNA (Şekil 5, BY4741'i TAP etiketli suşlarla karşılaştırın). Bu, IP deneylerinde (Ek dosya 2) RPKM değerleri (eşlenen milyon okuma başına transkript kilobaz başına okuma sayısı) ile ölçülen RIP-seq verilerinden de açıktır. Başka bir deyişle, eIF4F, Pab1p veya 4E-BP'ler ile yetersiz zenginleştirilmiş mRNA'lar bile, önemli ölçüde azaltılmış bir seviyede de olsa bu bileşenler tarafından hala açıkça bağlıdır.

Zenginleştirilmiş mRNA'ların ve kapalı döngü kümelerinin fonksiyonel analizi

Mayada çeviri başlangıcında kapalı döngü bileşenlerinin işlevsel rolünü daha da deşifre etmek için, gen işlevi açısından eğilimler ve modeller için ısı haritasından türetilen mRNA gruplarını inceledik. Başlangıçta grup III'e odaklandık, çünkü bu grup kapalı döngü karmaşık bileşenlerle en net ilişki modelini sergiliyor. Grup III mRNA'larının yüksek ribozom doluluğu sergilediğini ve protein ürünlerinin ortalama olarak oldukça bol olduğunu bulduk (Şekil 6B,C). Bu, oldukça bol, kararlı proteinlerin üretimi için verimli bir yol olarak hareket eden kapalı döngü kompleksine bağlı translasyon başlangıcı ile tutarlıdır. Bu grup içinde bulunan mRNA'ların fonksiyonel bir analizi, ribozomal proteinler için mRNA'larda çok önemli bir zenginleşmeyi gösterdiği için bu fikre daha fazla ağırlık verir (Şekil 6A) Grup III'teki 395 genin 115'i ribozomal proteinleri kodlar. Ribozomal proteinler için mRNA'ların kapalı döngü mekanizması ile yoğun şekilde zenginleştirilmiş olması gerçeği, ribozomal proteinleri kodlayan mRNA'ların birçoğunun 5' terminal oligopirimidin (TOP) sayesinde ayrı düzenleyici modeller gösterdiği memeli hücrelerindeki durumla ilginç bir paralellik sağlar. motif [47]. yok öyle cis-etkili sekanslar ya maya ribozomal protein mRNA'larında ya da grup III mRNA setinde (veriler gösterilmemiştir) açıktır, ancak bu tür elemanların kapalı döngü kompleks bileşenleri ile gözlemlediğimiz çok yüksek düzeyde birleşmeyi dikte etmesi muhtemel görünmektedir. Grup III mRNA özellikleri ile memeli TOP mRNA'larının özellikleri arasındaki paralellikler daha derine iner. Örneğin, TOP mRNA'ları rapamisinin memeli hedefi (mTOR) tarafından düzenlenmesine özellikle duyarlıdır ve son kanıtlar bunun 4E-BP1 translasyon baskılayıcı yoluyla gerçekleştiğini göstermektedir [48]. TOP mRNA'larının bu şekilde spesifik düzenlenmesi, bu mRNA'ların, kap kompleksine ve muhtemelen kapalı döngü kompleksi inhibisyonuna karşı oldukça hassas olduğunu göstermektedir [48]. Bu nedenle, ribozomal protein mRNA'larının maya kapalı döngü kompleksinin bileşenleriyle spesifik olarak zenginleştirilmesi, mayada paralel bir mekanizmanın var olabileceği olasılığını vurgular.

Transkript kümeleri tarafından kodlanan proteinlerin fonksiyonel analizi. (A) Şekil 4'te tanımlanan dört kümede bulunan transkriptler için önemli ölçüde fazla temsil edilen (kırmızı) veya yetersiz temsil edilen (mavi) Gen Ontolojisi (GO) terimleri. Yalnızca önemli farklılıklar gösteren GO terimleri (bir Fisher testi aracılığıyla karşılaştırma). en az bir küme için genomun geri kalanı FDR <0.01 olan küme ve ayrıca kümeler arasında farklılıklar olduğu (Ki-kare testi FDR <0.01) tasvir edilmiştir. Renk skalası, log tarafından ölçüldüğü gibi GO terim zenginleştirmesinin veya eksik zenginleştirmenin istatistiksel önemini temsil eder.10FDR. Kolaylık sağlamak için GO terimi zenginleştirme günlüğü10FDR değerleri -1 ile çarpılmıştır. (M.Ö) Kapalı döngü bileşenleri ve 4E-BP'ler ile zenginleştirilmiş transkriptler için PaxDb veritabanına [49] göre ribozom doluluk [42] ve protein bolluğundaki varyasyonu detaylandıran, Şekil 2'deki gibi kutu ve bıyık grafikleri. İkili transkript setleri arasında bir Wilcoxon sıralama testi, önemli bir fark ortaya çıkardı (P < 1 × 10 -7 ) her iki grafik için de tek istisna ribozomal doluluk için grup I ve grup III arasındadır; P < 0.03.

Grup III'e benzer şekilde, grup I'deki mRNA'lar yüksek ribozom doluluklarına sahiptir ve protein ürünleri oldukça fazladır (Şekil 6B,C). Bununla birlikte, grup III'e göre grup I için kapalı döngü bileşenleri ile ilişki modeli çok farklıdır. Grup I mRNA'ları genellikle eIF4E, eIF4G1, eIF4G2, Caf20p ve Eap1p için yetersiz temsil edilir. Aslında, Pab1p'nin IP'leri, bu mRNA grubunun toplamda yeterince temsil edilmediği teklerdir (Şekil 4 ve 5). Bu grup içindeki mRNA'ların protein ürünlerinin işlevlerinin bir analizi, amino asit ve nükleotid metabolizmasını, karbonhidrat metabolizmasını/enerji üretimini, tRNA amino-açilasyonunu ve translasyonunu vurgular (Şekil 6A Ek dosya 5). Çarpıcı bir şekilde, bu grup glikolitik faktörleri kodlayan mRNA'ları içerir, örneğin ENO2, TDH3 ve PGK1ve çeviri faktörleri gibi TEF1, TEF2, EFB1, TIF1 ve TIF2hücrede en yüksek oranda eksprese edilen ve dolayısıyla bol proteinler arasındadır. Protein ürünlerinin yüksek bolluğu ile birleştirilmiş eIF4F bileşenleri ile bu gruptaki mRNA'ların yetersiz temsili, kapalı döngü kompleksinin bu mRNA grubu için grup III mRNA'larına göre yüksek verimli translasyon başlatma için çok daha az alakalı olduğunu düşündürür. Bu nedenle, bu tür mRNA'ların yüksek verimli translasyon başlatmaları için kapalı döngü mekanizmasına bir alternatif gerektirmesi mantıklıdır. Bir olasılık, Pab1p'nin, özellikle grup I mRNA'larının Pab1p'yi engelleyen tüm kapalı döngü protein bileşenleri ile yetersiz temsil edildiği düşünüldüğünde, bir şekilde böyle bir alternatif yüksek verimli mekanizmaya dahil olmasıdır. İlginç bir şekilde, böyle bir modelle ilgili olarak, Pab1p IP'lerinde istatistiksel olarak fazla temsil edilen mRNA'lar, ortalama olarak daha uzun poli(A) kuyrukları ve ortalamadan daha yüksek ribozom işgali sergiler (Şekil 2B,C). Pab1p'nin çeviri sürecinde birden fazla adımda hareket etmesi daha önce önerildi: dahili başlatma, 60S ribozomal alt birim birleştirme ve çeviri sonlandırma. Bu nedenle, bu faaliyetlerden birinin, grup I mRNA'larının eIF4F bileşenleri ile daha az iyi etkileşime girseler bile yoğun şekilde çevrilmiş göründüğü gözlemini açıklaması mümkündür. Bu mRNA kohortuna yönelik gözlemler, Pab1p ve 4E-BP'ler arasındaki mRNA bağlanma profilleri açısından ters korelasyon ile birleştirilmiş, Pab1p etkileşiminin çeviri verimliliğinin önemli bir tahmin edicisini temsil ettiği bir tabloya katkıda bulunur.

Isı haritasındaki grup II mRNA'ları, tercihen 4E-BP'lerle ilişkili olan mRNA'ları içerir ve bu nedenle translasyonel olarak baskılanmalıdır. Yukarıda olduğu gibi, bu transkriptler eIF4E için yetersiz zenginleştirilmiş görünse de, mRNA'lar IP deneylerinde hala açıkça mevcuttur, ancak diğer ağır bağlı transkriptlere göre yetersiz zenginleştirilmiştir. Grup II'den mRNA'ların fonksiyonel bir analizi, hidrofobik ve bazik amino asitler için olanlar da dahil olmak üzere belirli amino asit biyosentetik yolakları için güçlü zenginleştirmeyi tanımlar (Şekil 6A Ek dosya 5), ​​ancak birçok amino asit biyosentetik geninin de mevcut olduğu belirtilmelidir. Grup I ve IV. Bununla birlikte, amino asit biyosentezini kontrol eden Gcn yolu ile maya 4E-BP'leri arasında ilgi çekici bağlantılar tespit edilmiştir [50]. Genel olarak, belirli mRNA'ların 4E-BP'lerle zenginleştirildiği bulgusu, bu tür mRNA'ların sınırsız, üstel büyümede kritik olmadığı varsayımıyla tutarlıdır, dolayısıyla çeviri 4EBP baskılayıcıları sayesinde bastırılır. Bu analiz aynı zamanda maya 4E-BP'lerinin translasyon başlatmanın global düzenleyicileri olmadığı, bunun yerine mRNA'ya özgü bir şekilde düzenleme işlevi gördüğü hipotezi ile de tutarlıdır [40,51,52].

Son olarak, grup IV tarafından temsil edilen büyük grup, hem eIF4F hem de baskıcı 4E-BP'ler ile güçlü etkileşimler ile karakterize edilir. Bu mRNA grubu tarafından kodlanan proteinler, çok geniş bir fonksiyon yelpazesi sergiler, bu grup, transkripsiyon, protein fosforilasyonu ve hücre döngüsü ile bağlantılı fonksiyonlar bakımından zengindir ve translasyon ve ribozom ile bağlantılı fonksiyonlar için yeterince zengin değildir. Bu grup, mRNA'ları kodlayan 127 protein kinazın 79'unu içerirken, başka hiçbir grup herhangi bir protein kinaz mRNA'sını içermez. Bu nedenle, bu grubun, sinyalizasyon ve yolların aktivasyonu ve uyaranlara verilen yanıtlar da dahil olmak üzere hücrede sıkı bir şekilde düzenlenen süreçler için mRNA'lar içerdiği görülmektedir. 4E-BP'lere göre kapalı döngü tarafından bağlanan tek bir mRNA düzeyinde hassas bir dengenin bulunduğu bu süreçlerin sonlu kontrol altında olduğunu öneriyoruz. Bu grubun, 4E-BP baskısının hafifletilmesi yoluyla translasyonun derepresyonunun, bir 'moleküler el frenini' serbest bırakmanın bir yolunu temsil edeceği şekilde hazırlandığı da doğru olabilir.

MRNA'ya bağlı eIF4E ile protein etkileşimlerinin stokiyometrisinin tahmini

Büyük bir mRNA grubunun hem eIF4G hem de 4E-BP'lerin (Şekil 4, grup IV mRNA'lar) immünopresipitasyonlarında aşırı temsil edildiği bulgusu, çeşitli eIF4E bağlayıcı proteinler arasındaki mRNA'lar üzerinde eIF4E ile rekabetçi etkileşim potansiyelini vurgular. Dört eIF4E bağlayıcı proteinin etkileşimlerinin toplamının, başlatma için kapı bekçisi olarak eIF4E için RNA bağlanma profiline yaklaşık olması gerektiği varsayımından yola çıkarak (ve dolayısıyla çeviri Şekil 7A,B), bunu matematiksel olarak basit bir doğrusal kombinasyon yoluyla ifade edebiliriz. dört profilden (Şekil 7C).

eIF4E bağlama için bir stokiyometrik model, CAF20 ve EAP1 önemli aykırı değerler olarak mRNA'lar. (A) Dört proteinin, eIF4G1, eIF4G2, Caf20p ve Eap1p'nin hepsinin, sırayla karmaşık bir dengede mRNA'ları bağlayan kap bağlayıcı protein eIF4E'yi bağladığı stokiyometrik model için teorik temeli gösteren diyagram. Bu model, eIF4E mRNA bağlanma profilinin diğer kapalı döngü protein profillerinin doğrusal bir kombinasyonu yoluyla modellenebileceğini varsayar. (B) Dört eIF4E bağlayıcı proteinin her biri için mRNA zenginleştirme ısı haritaları ve modelin RIP-seq verilerine en iyi şekilde uymasına dayalı olarak eIF4E için öngörülen bir mRNA zenginleştirme ısı haritası, bu da eIF4E için gözlemlenen mRNA zenginleştirmesiyle karşılaştırılabilir. Tahmin edilen ve gözlemlenen ısı haritası profilleri arasında R 2 = 0.75 ile mükemmel bir korelasyon gözlemlenmiştir. (C) eIF4E için bağlanma profilinin tüm eIF4E bağlayıcı proteinler için gözlemlenen profillerin toplamına eşit olduğu iddiasını detaylandıran denklem, karşılık gelen β katsayıları her bir bireysel profilin genel modele katkısını temsil eder (tümü anlamlıdır). P < 0,002). (NS) Doğrusal regresyon modellemesinden uygun model değerlerini ve karşılık gelen artıkları gösteren bir çizim. Özellikle, CAF20 ve EAP1 mRNA'lar, tahmin edilen eIF4E zenginleştirme değerlerinden artıkları çizilirken modelden önemli aykırı değerlerdir.

Burada β değerleri, eIF4E profilini başlığa bağlı başlatma için genel bir vekil olarak alarak, her eIF4E bağlayıcı proteinin eIF4E'nin bağlanma profiline nominal katkılarını temsil eden katsayılardır. Log için bir model oluşturmak için standart çoklu doğrusal regresyon kullanarak yukarıdaki denklemdeki β katsayılarının değerlerini tahmin edebiliriz.2günlükten oluşturulan eIF4E için (değişiklikleri katlayın (IP/Toplam))2(kat değişiklikleri (IP/Toplam)) diğer dört proteinin. Bu, R 2 = 0.75 ile iyi bir model üretir. Bu modelden eIF4E'nin mRNA bağlanma profiline eşit olan eIF4E bağlanma ortakları için β katsayıları Şekil 7C'de gösterilmektedir. Her protein, modele oldukça önemli bir katkı sağlar. P-her durumda 0.002'nin altında olduğu tahmin edilen değerler. eIF4G1 ve eIF4G2 için β katsayıları büyük ve pozitifken, Caf20p katsayısı düşük ve Eap1p'nin katsayısı negatiftir. Bunlar, eIF4E ile Şekil 3'te gösterilen diğer proteinler arasındaki ikili GLM korelasyon değerlerini ve Şekil 4'teki ısı haritasındaki benzerlikleri geniş ölçüde yansıtır. Örneğin, eIF4G1 ve eIF4G2'nin RNA bağlanma profilleri, eIF4E'ninkiyle çok yakından ilişkilidir, 4EBP'lerin, Caf20p ve Eap1p'nin RNA bağlanma profilleri, eIF4E'ler ile zayıf bir şekilde koreledir. Modeldeki β katsayılarının sadece kapalı döngü bileşenlerinin nispi bolluğu ile açıklanmadığını açıklığa kavuşturmak istiyoruz: PaxDb entegre nicel proteomik veri setinden [49] nispi protein bolluğu tahminlerini alarak, dört maya proteininin seviyeleri eIF4E = 1.011 ppm, eIF4G1 = 444 ppm, eIF4G2 = 118 ppm, Caf20p = 306 ppm, Eap1p = 57 ppm. Bunun gibi bir analiz, eIF4G1'den eIF4G2 veya Caf20p'den Eap1p ile mRNA bağlanma profillerini karşılaştırırken yüksek derecede ortak doğrusallık nedeniyle karmaşıklaşır. Bu ortak doğrusallık, protein bollukları eIF4G1'in daha belirgin bir rol oynaması gerektiğini önerse de, eIF4G2 için eIF4G1'e göre daha büyük katsayıyı açıklayabilir. Bununla birlikte, bu tür bir ortak doğrusallık, Caf20p'nin nispeten düşük katsayısını ve Eap1p'nin negatif katsayısını açıklayamaz. Sırasıyla Caf20p ve Eap1p için düşük ve negatif katsayıların, mRNA veya eIF4E ve mRNA kapak yapısına dayanmayan diğer RNA bağlayıcı proteinlerle daha karmaşık bir etkileşim ağının göstergesi olması muhtemeldir.

Modellemeden bugüne kadarki en çarpıcı gözlem, takılan değerlere karşı jackknife kalıntılarının grafiğinde gösterilmektedir (Şekil 7D). Bu, tek tek transkriptler için standartlaştırılmış artıkların iyi tanımlanmış bir model için ortalama 0'da merkezlenmesi gereken doğrusal regresyonda yaygın bir tanı grafiğidir. Bu nedenle, Şekil 7D'de görülebileceği gibi, verilerin neredeyse tamamı bu modele iyi uymaktadır. Bununla birlikte, bu modelin büyük ölçüde dışında kalan iki mRNA, 4E-BP'leri, Caf20p ve Eap1p'yi kodlayanlardır. Bu gözlem, kapalı döngü kompleksinin sınırları içinde, CAF20 ve EAP1 mRNA'lar bu modelin dışında yer alır ve farklı bir şekilde düzenlenir.

Caf20p tercihen kendi transkriptiyle etkileşime girer ve onu düzenler

Protein aşağı çekmeleri arasındaki doğrudan istatistiksel ikili karşılaştırma (Şekil 3) ayrıca, CAF20 ve EAP1 mRNA'lar. eIF4E ve eIF4G1'in mRNA bağlanma profilleri, eIF4E açılır listesinde tercihen zenginleştirilmiş yalnızca bir avuç transkript ile yüksek oranda ilişkilidir (Şekil 3B). Bununla birlikte, dikkate değer bir şekilde, istatistiksel olarak zenginleştirilmiş altı transkript arasında CAF20, EAP1 ve TIF4632 Sırasıyla 4E-BP'ler Caf20p ve Eap1p'yi ve eIF4G2'yi kodlayan mRNA'lar (Şekil 8A). Benzer şekilde, eIF4E ve eIF4G2 aşağı açılanları karşılaştırıldığında, eIF4G2 aşağı açılanına göre eIF4E aşağı açılan kısmında aşırı temsil edilen 24 transkript gözlemledik (Şekil 3B). Yine mRNA'lar için CAF20 ve EAP1, ve bu zaman TIF4631eIF4G1'i kodlayan , tercihen eIF4E ile ilişkilendirildi (Şekil 8A). Bu veriler göstermektedir ki, CAF20/EAP1 mRNA'lar eIF4E ile zenginleştirilmiştir, ancak eIF4G1 ile zenginleştirilmemiştir.

Caf20p kendi transkriptini kendi kendine düzenler. (A) Transkriptler, eIF4G1'e (açık mavi) veya eIF4G2'ye (pembe) göre eIF4E açılır listelerinde aşırı temsil edilir. Veriler, Şekil 3B'de sunulan GLM modelinden alınmıştır. (B) Üç boyutlu bir yüzey çizimi P- altı RIP-seq deneyi boyunca tek tek kapalı döngü/eIF4E-BP transkriptlerinin zenginleştirilmesi için önem düzeyini ayrıntılandıran değerler. (C) Şekilde gösterilen 1 ila 6 bölgelerine göre tasarlanmış primerler kullanılarak Caf20p proteininin kendi transkripti ile ilişkisinin yarı nicel bir RT-PCR doğrulaması (Ek dosya 6'da ayrıntılı olarak verilmiştir). Bu bölgelerdeki seviye CAF20 transkript, TAP afinitesi ile saflaştırılmış numunelerde belirlendi. CAF20-TAP vahşi tip (WT) suşlara göre suşlar. (NS) Caf20p'nin protein üretimini düzenlemek için kendi transkriptiyle etkileşime girebileceği iki olası modeli gösteren bir diyagram. (E) eIF4E'nin hem endojen Caf20p proteini hem de Bayrak etiketli vahşi tip Caf20p veya Bayrak etiketli Caf20 m2 p (eIF4E bağlama bölgesi mutasyona uğramış) ile ilişkisini araştıran eIF4E-TAP etiketli suşlardan TAP afinite saflaştırması ve western blot analizi. (F) RT-PCR primerlerinin özgüllüğünün, her iki endojen için de çubuk grafik altında gösterilen suşlardan toplam RNA kullanılarak doğrulanması CAF20 transkriptler veya Bayrak etiketli CAF20 transkriptler (Ek dosya 6). Hata çubukları, üç tekrarlı deneyden elde edilen ± standart hatadır. (G) endojen ve Bayrak etiketli için qRT-PCR CAF20 yukarıda doğrulanan primerler kullanılarak bir eIF4E-TAP afinite saflaştırmasından elde edilen transkriptler. NS CAF20 veya CAF20-fl transkriptler, listelenen suşlar için toplam RNA'ya göre IP örneklerinde ölçülür. Hata çubukları, üç tekrarlı deneyden elde edilen ± standart hatadır. (H) Özler kullanılarak Western blot analizi caf20 ya vahşi tip taşıyan sentromerik (düşük kopyalı) plazmitler ile transforme edilmiş delesyon suşları CAF20-fl geni veya m2 mutantı CAF20-fl. Her suş için üç farklı tek transformant analiz edilir ve kontrol anti-eIF4A antikorlarına göre Caf20-fl'yi saptamak için lekeler anti-Flag antikorları ile problanır.

Kapalı döngü sisteminin protein bileşenlerinin, sistemin diğer bileşenlerini kodlayan mRNA'ların düzenlenmesine dahil olma olasılığını daha fazla araştırmak için, RIP boyunca altı immüno-saflaştırılmış proteini kodlayan transkriptlerin her biri için herhangi bir zenginleştirmenin önemine dayanan istatistiksel bir analiz. -seq deneyleri yapıldı. Bu veriler Şekil 8B'de üç boyutlu bir yüzey grafiği olarak sunulur; burada tepeler (mor) belirli IP'lerde transkript zenginleştirmenin önemini gösterirken, çukurlar (mavi) herhangi bir eksik temsilin önemini temsil eder. Açık farkla bu arsa üzerindeki en çarpıcı ilişkiler, Caf20p ve eIF4E bağlanması ile ilişkilidir. CAF20 transkript (Şekil 8B). Aslında, CAF20 düzeltilmiş bir FDR <10-30 ile EdgeR GLM analizinden toplam mRNA'ya göre Caf20p immünopresipitasyonunda açık ara en fazla temsil edilen transkripttir.

Yukarıdaki sonuçlara dayanarak, Caf20p ve eIF4E'nin CAF20 transkript, bir oto-düzenleyici mekanizmayı temsil edebilir (Şekil 8D). Şaşırtıcı bir şekilde, bu bağlamda, önceki çalışmalar, Caf20p'nin genetik aşırı ekspresyonunda bir zorluğa dikkat çekmiştir: kapalı döngü kompleksinin diğer tüm bileşenlerinin mayadaki yüksek kopyalı plazmitlerden ekspresyonu, düzeyde iki ila beş kat artışa yol açar. protein, oysa yüksek kopya plazmitleri taşıyan CAF20 gen böyle bir aşırı ifade oluşturmaz. Bununla birlikte, böyle bir plazmit, bir ortamda vahşi tipte Caf20p seviyeleri üretir. caf20Δ zorlayın [52]. Caf20p'nin kendi transkripti ile etkileşime girdiği gözlemini doğrudan doğrulamak için, vahşi tipte ve Caf20p-TAP suşlarında TAP afinite saflaştırmaları yapıldı ve ilişkili RNA'lar, RNase III tedavisi ile parçalandı. Altı farklı bölgenin zenginleştirme verimliliğini değerlendirmek için bu numuneler üzerinde yarı niceliksel bir RT-PCR testi yapıldı. CAF20 transkript (Şekil 8C). RT-PCR ürünleri tüm dünyadan tanımlanmıştır. CAF20 İmmüno-çökeltilmiş numunelerde mRNA, etiketlenmemiş suşlardan alınan numunelerde ise hiçbir ürün bulunamadı CAF20. Açık okuma çerçevesinin 3' ucunu kaplayan primer çiftleri için özel bir zenginleşme gözlendi (Şekil 8C). Böylece, bağımsız bir tahlilin kullanılmasıyla bu veriler, Caf20p'nin CAF20 mRNA.

Yukarıdaki veriler, Caf20p'nin kendi transkriptinin çevirisini otomatik olarak düzenleme olasılığını vurgulasa da, yeni oluşan kısmen çevrilmiş Caf20p'nin, amino-terminal eIF4E bağlanma alanı yoluyla, eIF4E'ye bağlı eIF4E ile etkileşime girmesi de mümkündür. CAF20 mRNA 5' başlığı (Şekil 8D). Bu zenginleşmeyi açıklayabilir. CAF20 eIF4E ve Caf20p ile mRNA. Protein-protein komplekslerinin bu tür ortak çeviri etkileşimleri daha önce tanımlanmıştır ve belirli bir alt birimi kodlayan mRNA'ların aynı kompleksin diğer protein alt birimleriyle birlikte zenginleşmesini açıklayabilir [53].

Bu olasılığı daha fazla araştırmak için, zenginleşmenin olup olmadığını test ettik. CAF20 eIF4E ile mRNA, eIF4E ile Caf20p protein ilişkisine bağlıdır. Bayrak etiketli Caf20p veya Bayrak etiketli Caf20 m2 p'nin (eIF4E ile etkileşime giren Caf20p bölgesinin iki yanlış anlamlı mutasyon yoluyla bozulduğu), halihazırda vahşi türü barındıran bir eIF4E-TAP suşundaki plazmitlerden eksprese edildiği bir strateji kullandık. endojen genomik CAF20 alel. Bu, Bayrak etiketli mRNA'yı endojen mRNA ile rekabete sokar. CAF20 mRNA ve eIF4E bağlanma mutasyonunun bu rekabet üzerindeki etkisinin analiz edilmesini sağlar. Sistem için bir kontrol olarak, TAP afinitesi saflaştırılmış eIF4E'nin western lekelenmesi hem endojen Caf20p'yi hem de Bayrak etiketli Caf20p'yi yakaladı (Şekil 8E), oysa Flag-Caf20 m2 p mutant proteini endojen Caf20p ile rekabet halinde yerleştirildiğinde, eIF4E yalnızca etkileşime girdi endojen protein ile (Şekil 8E), m2 mutasyonlarının eIF4E bağlanmasını bozduğunu doğrular [52].

endojeni ayırt etmek için qRT-PCR kullanıldı. CAF20 Bayrak etiketli mRNA CAF20 mRNA. Toplam RNA örneklerinden elde edilen kontrol qRT-PCR reaksiyonları, primer çifti özgüllüğünü gösterdi (Şekil 8F). Yabani tip bir suşta sadece endojen CAF20 mRNA tespit edildi, ancak sadece Bayrak etiketli bir suşta mRNA'nın sadece etiketli formu tanımlandı. CAF20 gen (caf20Δ Bayrak-CAF20 Şekil 8F). Son olarak, hem endojen hem de CAF20 ve Bayrak etiketli CAF20 genler, her iki mRNA da tespit edildi (Şekil 8F). Bu nedenle bu sistemi hem Bayrak etiketli hem de endojen CAF20 immüno-çökeltilmiş eIF4E'li mRNA'lar ve her iki mRNA da eIF4E immünopresipitasyonlarında tespit edildi. Kritik olarak, Bayrak etiketli CAF20 Bu mRNA'nın protein ürününün eIF4E ile etkileşime girip giremeyeceğinden bağımsız olarak eIF4E ile ilişkili mRNA (p taşıyan suşlar için sonuçları karşılaştırın).CAF20-Fl p'ye karşıCAF20 m2 -Fl Şekil 8G). Bu nedenle, eIF4E ile etkileşimi CAF20 mRNA, Caf20p proteininin eIF4E ile etkileşime girme kapasitesine bağlı değildir. Bu verilerden yola çıkarak, seçici zenginleşmenin ana nedeninin çok düşük bir ihtimal olduğunu varsayıyoruz. CAF20 eIF4E veya Caf20p proteini ile mRNA, amino-terminal eIF4E bağlanma alanı aracılığıyla yeni oluşan Caf20p'nin 'ortak-dönüştürme etkileşimi'dir. Bunun yerine, olgun Caf20p proteininin seçici olarak içeriği zenginleştirdiği modeli tercih ediyoruz. CAF20 mRNA, muhtemelen, diğer RNA bağlayıcı proteinlerle Caf20p etkileşimleri ve bunun yanı sıra eIF4E ile etkileşimi yoluyla (Şekil 8D). Gerçekten de, Caf20p'nin hem Puf4p hem de Puf5p RNA bağlayıcı proteinlerle etkileşime sahip olduğu daha önce gösterilmişti [40].

Caf20p kendi kendini düzenleme modelinin bir öngörüsü, eIF4E bağlayıcı mutantın (Caf20 m2) Caf20p'nin tek kaynağı olduğu suşlarda, kendi kendini düzenlemenin kısa devre olacağı ve Caf20p'nin vahşi taşıyan suşlardan daha yüksek seviyelerde birikeceğidir. -tip Caf20p. Gerçekten de, Şekil 8H'de bu tahminin doğru olduğu bulunmuştur: caf20Δ p taşıyan mutantlarCAF20 m2 -Fl Caf20p, vahşi tip plazmidi taşıyan mutanttan 7.05 (±1.25) kat daha yüksek seviyelerde birikir. Toplu olarak alındığında, bu veriler, genel bir hücresel translasyonel baskılayıcının ifadesini modüle etmek için kendi kendini sınırlayan bir frenin uygulandığı bir negatif geri besleme döngüsünde Caf20p ifadesini kontrol eden bir oto-düzenleyici devreyi vurgular.


12.3 Evrimin Diğer Mekanizmaları

Zamanla bir organizma popülasyonunu değiştirecek en önemli dört evrimsel güç, doğal seleksiyon, mutasyon, genetik sürüklenme ve bir popülasyonun içine veya dışına göç veya gen akışıdır. Doğal seçilim, önceki bölümde ayrıntılı olarak açıklanmaktadır. Bu bölüm, evrim mekanizmalarının geri kalanını kapsayacaktır.

12.3.1 Mutasyon: tüm yeni varyasyonların kaynağı

Mutasyon, DNA dizisindeki bir değişikliktir. Kromozom düzeyinde büyük değişiklikler olsa da, bir baz çiftinin eklenmesi veya silinmesi gibi daha kapsamlı değişiklikler yoluyla tek bir baz çifti değişikliği gibi küçük bir değişiklik olabilir. Küçük değişiklikler bile, yukarıda orak hücreli anemi örneğinde görüldüğü gibi, DNA'nın kodladığı proteinde büyük farklılıklar yaratabilir.

Mutasyon, bir aleli yeni bir alele dönüştürür. Bu yeni alel, birinci nesil sırasında çok küçük bir frekansa sahiptir. Alel üzerinde başka hiçbir evrimsel kuvvet etki etmiyorsa, birkaç nesil boyunca, bir popülasyonda frekansı yavaş yavaş artacaktır. Doğal seçilim alel aleyhine hareket ederse, popülasyondan çıkarılacaktır. Bu, genetik hastalıkların insan popülasyonunda çok düşük sıklıkta kalmasının bir nedenidir. Alel seleksiyon tarafından tercih edilirse, frekansı artacaktır. Mutasyon nötr ise – üreme uygunluğunu ne artırır ne de azaltırsa – sıklığı bir popülasyonda nesiller boyunca statik kalacaktır.

12.3.2. Gen Akışı/Göç

Bir türün iki popülasyonu farklı alel frekanslarına sahipse, bireylerin bir popülasyondan diğerine göç etmesi her iki popülasyonda da frekans değişikliklerine neden olacaktır. Yeni popülasyonda belirli alellerde artış olurken, önceki popülasyonda belirli alellerde azalma olacaktır (Şekil 12.23).

Şekil 12.23 Bu örnekte, bir kahverengi böcek bir popülasyondan diğerine göç etmektedir. Kahverengi renk için alel frekansı böylece soldaki popülasyonda arttı. Kredi: “File:Gene flow.jpg” by Tsaneda CC BY 3.0 altında lisanslanmıştır.

Göç ettikten sonra, yeni birey(ler) yerel bireylerle çiftleşir ve yeni alel(ler) popülasyonun gen havuzunun bir parçası olur.

Bazı popülasyonlar oldukça kararlı iken, diğerleri daha fazla akış yaşar. Bazı hayvanlar yaşamları boyunca geniş seyahat etmezken, bazı türler oldukça göçmendir ve gen akışı çok yaygındır. Bitki türleri bulundukları yerde çok sabit görünebilir, ancak aynı zamanda gen akışı da yaşarlar. Birçok bitki tohumlarını rüzgarla ya da tohumları yemiş hayvanların bağırsaklarında uzaklara gönderebilir ve dışkı yaptıklarında onları farklı bir yere bırakabilir. Bu geniş çapta seyahat eden tohumlar, kaynak popülasyonda yaygın olan alelleri, nadir oldukları yeni bir popülasyona tanıtabilir.

12.3.3 Genetik Sürüklenme

Bir popülasyonun alel frekanslarının değişmesinin bir başka yolu da, sadece şansın etkisi olan genetik sürüklenmedir (Şekil 11.7). Genetik sürüklenme en çok küçük popülasyonlarda önemlidir. Sonsuz bireylere sahip bir popülasyonda sürüklenme tamamen yoktur, ancak elbette hiçbir popülasyon bu kadar büyük değildir. Genetik sürüklenme, yeni nesildeki aleller ebeveyn nesildeki alellerin rastgele bir örneği olduğu için oluşur. Aleller, bir bireyin ölüm oranı, eş bulmayı etkileyen olaylar ve hatta hangi gametlerin döllenme ile sonuçlandığını etkileyen olaylar dahil olmak üzere tesadüfi olaylar nedeniyle bir sonraki nesle geçebilir veya olmayabilir. On bireylik bir popülasyondaki bir birey, sonraki nesle herhangi bir yavru bırakmadan önce ölürse, popülasyonun gen havuzunun onda biri olan genlerinin tümü aniden kaybolacaktır. 100 kişilik bir popülasyonda, bu 1 birey genel gen havuzunun yalnızca yüzde 1'ini temsil eder, bu nedenle popülasyonun genetik yapısı üzerinde çok daha az etkiye sahiptir ve nispeten nadir bir alelin tüm kopyalarını bile kaldırması pek olası değildir.

Yarısı A alleli ve yarısı a alleli (bireyler haploid) olan on bireyden oluşan bir popülasyon hayal edin. İstikrarlı bir popülasyonda, bir sonraki neslin de on bireyi olacaktır. Bir madeni parayı on kez çevirerek bu nesli rastgele seçin ve tura A ve tura a olsun. Bir sonraki neslin her alelin tam olarak yarısına sahip olması olası değildir. Birinden altısı ve diğerinden dördü veya bazı farklı frekans grupları olabilir. Böylece alel frekansları değişmiş ve evrim gerçekleşmiştir. Bir jeton artık bir sonraki nesli seçmek için çalışmayacaktır (çünkü oranlar artık her alel için yarım değildir). Her nesildeki frekans, bir noktada ya tüm A ya da tüm a seçilene ve o noktadan sonra bu alel sabitlenene kadar rastgele yürüyüş olarak bilinen şey üzerinde yukarı ve aşağı sürüklenecektir. Bu, büyük bir nüfus için çok uzun zaman alabilir. Bu basitleştirme çok biyolojik değildir, ancak gerçek popülasyonların bu şekilde davrandığı gösterilebilir. Sürüklenmenin frekanslar üzerindeki etkisi, popülasyon ne kadar küçükse o kadar büyüktür. Etkisi, frekansı yarıdan çok uzakta olan bir alel üzerinde de daha fazladır. Sürüklenme, doğal olarak seçilenler de dahil olmak üzere tüm alelleri etkileyecektir.

Genetik sürüklenme, nüfusun büyük bir bölümünü rastgele öldüren bir felaket gibi doğal veya insan kaynaklı olaylar tarafından da büyütülebilir; bu, genomun büyük bir bölümünün aniden yok olmasına neden olan darboğaz etkisi olarak bilinir (Şekil 11.8). Tek bir hamlede, hayatta kalanların genetik yapısı, afet öncesi popülasyondan çok farklı olabilecek tüm popülasyonun genetik yapısı haline gelir. Felaket, kasırga veya lav akışı gibi organizmanın özellikleriyle ilgisi olmayan nedenlerle öldüren bir felaket olmalıdır. Geceleri alışılmadık derecede soğuk havaların neden olduğu toplu ölüm, soğuğa dayanıklılık kazandıran alellere bağlı olarak bireyleri farklı şekilde etkileyebilir.

Popülasyonların güçlü bir genetik sürüklenme etkisi yaşayabileceği başka bir senaryo, popülasyonun bir kısmının yeni bir yerde yeni bir popülasyon başlatmak için ayrılması veya bir popülasyonun bir tür fiziksel bariyerle bölünmesidir. Bu durumda, bu bireylerin kurucu etkisi ile sonuçlanan tüm popülasyonu temsil etmesi olası değildir. Kurucu etki, genetik yapı yeni popülasyonun kurucu babalarının ve annelerininkiyle eşleştiğinde ortaya çıkar. Kurucu etkisinin, Güney Afrika'daki Hollandalı yerleşimcilerin Afrikaner popülasyonunun genetik tarihinde, Afrikanerlerde yaygın olan ancak diğer popülasyonların çoğunda nadir görülen mutasyonların kanıtladığı gibi, kilit bir faktör olduğuna inanılmaktadır. Bu muhtemelen, orijinal popülasyonun küçük bir örneği olan kurucu kolonistlerin normalden yüksek oranda bu mutasyonları taşımasından kaynaklanmaktadır. Sonuç olarak, nüfus alışılmadık derecede yüksek Huntington hastalığı (HD) ve Fanconi anemisi (FA), kemik iliği ve doğuştan anormalliklere ve hatta kansere neden olduğu bilinen bir genetik bozukluk olduğunu ifade ediyor.


Videoyu izle: #biyoloji #genel biyoloji BÖLÜM 7: Hücre ve Organelleri-1 #genel biyoloji (Ağustos 2022).