Bilgi

Genomik kütüphane hazırlığı: Kısıtlama enzimi neden geni kesmiyor?

Genomik kütüphane hazırlığı: Kısıtlama enzimi neden geni kesmiyor?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Şu anda daha derinlemesine bir genomik kitaplık oluşturmayı anlamaya çalışıyorum. Okuduğum çoğu ders kitabında (wikipedia'da olduğu gibi), genomik kütüphanenin DNA'yı izole ederek ve onu genler kadar kesen belirli bir kısıtlama enzimi ile parçalayarak oluşturulduğundan bahsettiler. Ancak, bu gerçekten işe yaramaz, değil mi?

Diyelim ki E. coli var 4000 gen Birlikte 4.600.000 bps genetik şifre. Bu, teorik olarak 1150 bps'den fazla fragmanlar üretmem gerektiği anlamına gelir (eğer her gen aynı uzunluktaysa ve başka dizi yoksa). Bu, 1150bps'den fazla parça oluşturarak yaklaşık 4000 kat kesen bir kısıtlama enzimine ihtiyacım olduğu anlamına gelir. Bu yüzden, tabii ki sadece baz çiftleri rastgele ise, 5bps'lik (her 1024bps'de bir keser) veya 6bps'lik (her 4096'da bir keser) tanıma alanına sahip bir kısıtlama enzimi kullanırdım. Şimdi zaten görüyorsunuz, ilk kısıtlama enzimiyle (teoride bile) birçok geni keseceğim, ikincisiyle uygun büyüklükte genler elde edebilirim ama diğerlerini de parçalayacağım. Ayrıca genler, özellikle daha karmaşık organizmalarda eşit aralıklı değildir, ancak bazı alanlarda yoğunlaşmış olabilir, diğerlerinde ise sadece tekrarlayan diziler bulunur. Öyleyse neden her ders kitabı tek bir kısıtlama enzimiyle tam bir genomik kütüphane oluşturabileceğimden bahsediyor? Daha yüksek bir kapsama alanı elde etmek için, tıpkı pompalı tüfek dizilemesinde olduğu gibi, DNA'nın birçok kopyasını rastgele kesmek daha mantıklı olmaz mıydı? Öyleyse sorum şu, dizi hakkında hiçbir şey bilmeden GERÇEKTEN bir genomik kitaplık nasıl hazırlanır? Pek çok genin ortadan kesileceğini ve en iyisini umacağını hesaba katıyor musunuz? Tam genleri çoğaltmak çok garip bir strateji gibi görünüyor.

Teşekkürler! :)


Bir organizmanın tam genetik bileşenini kapsüllemek amacıyla bir genomik kütüphane oluşturulur.

Bunu, tanıma sekansında kesen kısıtlama enzimi ile genomu parçalayarak yaparsınız. Bu parçalar daha sonra alınır ve bir plazmide klonlanır, böylece daha sonra plazmitte bulunan ancak (genellikle) organizmanın kendisinde olmayan ortak diziler kullanılarak plazmit içinde dizilenebilirler. Sıralama, geleneksel olarak, bir sırayı bir kerede ne kadar süreyle yapabileceğinizle ilgili bir sınırı olan Sanger sekanslama ile gerçekleştirilecektir - gerçekten iyi sekanslama, yaklaşık 600 bp'den sonra sekans kalitesi sona erdiğinde size ~ 1000 bp sağlayacaktır.

Genomik kütüphane ifade için tasarlanmamıştır - genler tanımlandıktan sonra, ne yaptıklarını görmek için bir ifade plazmitine alt klonlanabilirler. Bu amaçla, bir geni parçalara ayırmak bir sorun değildir, çünkü geri kalanını başka bir plazmid üzerinde bulacaksınız ve iki parçayı alıp birleştirerek tam uzunluktaki geni yeniden oluşturabilirsiniz.

Kısıtlama enzimini kullanmanızın nedeni, kestiği dizinin aynı zamanda onu plazmide yerleştirmek için kullanılmasıdır.

Yani, bu noktada kendinize soruyor olabilirsiniz Hepsi aynı dizi tarafından kesildiğinde, genlerin uçlarını (veya bu konudaki herhangi bir diziyi) nasıl eşleştirirsiniz?

Cevap, farklı bölgelerde kesilen çeşitli fragmanlar oluşturmak için tek başına veya kombinasyon halinde birden fazla kısıtlama enzimi kullanmanızdır. Bu, bu farklı sindirimlerden kitaplıkları oluşturduğunuzda, farklı kitaplıklar arasında sıralama yapabileceğiniz ve parçaların nerede çakıştığını bulabileceğiniz ve ardından tüm dizileri orijinal dizide bir araya getirebileceğiniz anlamına gelir.

Örneğin aşağıdaki resme bakarsanız. Kara kutuların aynı gen olduğunu ve üsttekinin kısıtlama enzimi A ve alttakinin B ile kesildiğini hayal ederseniz, iki kısıtlama enziminin üst üste binen fragmanlar ürettiğini görebilirsiniz, yani her ikisinden de fragmanları sıralarsanız kısıtlama enzimleri, B'deki parçalara bakarak A'daki uçların A'daki diğerleriyle nerede eşleştiğini bulabilirsiniz.


Genomik Kütüphane ve cDNA Kütüphanesi Arasındaki Fark

Gen klonlamasında farklı DNA'ları izole etmek için genomik kütüphane ve CDNA kütüphanesi kullanılır. Bu iki kitaplık arasındaki temel fark, genomik kitaplığın bir organizmanın tüm genomunu ifade eden DNA parçalarını içermesi, cDNA kitaplığında ise mRNA'nın bir organizmanın belirli hücrelerinden alınması ve daha sonra bir reaksiyonda bu mRNA'dan cDNA'nın yapılmasıdır. bir enzim tarafından katalize edilir.

Karşılaştırma Tablosu

Genomik KütüphanecDNA Kitaplığı
TanımBir genomik kütüphane, tek bir organizmadan toplam genomik DNA'nın bir koleksiyonudur. DNA, her biri farklı bir DNA eki içeren benzer vektörlerden oluşan bir popülasyonda depolanır.Bir CDNA kütüphanesi, birlikte organizmanın transkriptomunun bir kısmını oluşturan bir konakçı hücre koleksiyonuna eklenen klonlanmış CDNA fragmanlarının bir kombinasyonudur.
İfadetüm genomSadece belirli genler.
Boydaha büyükdaha küçük
intronlarSunmakMevcut olmayan
VektörBüyük parçaların barınması için plazmitler, kozmid, lambda faj, YAC ve BAC kullanır.İntronları yoktur, bu nedenle küçük parçaları yerleştirmek için plazmitler, fajmidler, lambda faj kullanır.

Genomik Kütüphane nedir?

Gen klonlama işleminde, ilgili gen, bir organizmadan ayrılan DNA'dan kopyalanır. DNA bir organizmadan ayrıldığında, tüm genleri aynı anda çıkarılır. Organizmanın DNA'sı binlerce farklı gen içerir. Genetik mühendisi, ilgilenilen spesifik proteini kodlayan spesifik bir gen bulur. DNA'dan belirli bir genin bulunabileceği tek bir teknik yoktur, bu nedenle Bilim adamları organizmanın DNA'sını kataloglamak için gen kütüphaneleri yaparlar. Bilim adamları, daha sonra kütüphaneden istenen geni seçin. Gen kütüphanesi, istenen genin kaynağı olan organizmadan alınan farklı DNA parçaları ile transforme edilmiş canlı bakteri kolonilerinin bir koleksiyonudur. DNA, organize bir DNA formu olan bir kütüphane oluşturmak için organizmadan çıkarılır. Genomik kütüphane ve cDNA iki tip gen kütüphanesidir. Rekombinant teknolojide gen stratejileri olarak çeşitli gen klonlama teknikleri kullanılmıştır. DNA fragmanları, ana DNA'dan spesifik kısıtlama enzimleri ile kesilerek ayrılır. Bu fragmanlar vektör moleküllerine bağlanır ve toplanan moleküller, her hücrede bir molekül olacak şekilde konakçı hücrelere aktarılır. Genomik kütüphane intronlardan, hurda DNA'dan ve diğer birçok parçadan oluşur. Bu kütüphanede DNA, bir hücre içinde daha küçük parçalara bölünür. Bundan sonra, tüm küçük parçalar bir kütüphane oluşturmak için bir vektöre eklenir. Genomik kütüphane, tüm hücrenin tüm DNA'sını içerir ve genler, tüm intronlarından oluşur. Genomik DNA, tüm genomun çevirisidir. İntronların boyutu nedeniyle tüm parçayı tek bir kodon üzerine kodlamaz. Bir genomik kütüphanede, bu kütüphaneden alınan genlerin ifadesinde zorluğa neden olan bir ekleme mekanizması yoktur.

CDNA Kitaplığı nedir?

cDNA kütüphanesi, bir hücre veya doku tipi seçilerek oluşturulur. Daha sonra o hücre veya dokudan mRNA izole edilir. mRNA molekülünün bir DNA kopyası, spesifik enzim ters transkriptaz enzimi kullanılarak yapılır. Böylece cDNA kütüphanesi, mRNA'da bulunan belirli DNA'yı içerir. Bu kütüphanede intron ve DNA dizisi yoktur. Bu kitaplıkta, tüm klonlar tam uzunluktadır. Ayrıca, protein üretimi veya hücre bazlı analizler için hücreleri kesmek için bir cDNA klonu gereklidir.

Genomik Kütüphane ve cDNA Kütüphanesi

  • Genomik kütüphane, doğrudan genomik DNA'dan oluşturulmuştur.
  • cDNA Kitaplığı, şablon olarak mRNA kullanılarak oluşturulmuştur.
  • Genomik kütüphane, organizmanın tüm genomunu ifade eder.
  • cDNA kitaplığı yalnızca belirli koşulların genlerini temsil eder.
  • İki enzim, kısıtlama endonükleazları ve ligazlar, genomik kütüphane yapımı için önemlidir.
  • Ters transkriptaz enzimi, cDNA kütüphanesi yapımında önemli bir rol oynar.
  • Genomik kütüphane, hem prokaryotik hem de ökaryotik organizmaların DNA'sını ifade eder.
  • cDNA kütüphanesi sadece ökaryotik organizmaların DNA'sını temsil eder.
  • Bir genomik kütüphane, intronlara sahip oldukları ve prokaryotik organizmanın intronları işlemek için hiçbir mekanizması olmadığı için prokaryotik organizmada ifade yeteneğine sahip değildir.
  • cDNA kütüphanesi, intronları olmadığı için prokaryotik olan bakterilerde genom ekspresyonu yapabilir.
Janet Beyaz

Janet White, 2015'ten beri Difference Wiki için yazar ve blog yazarıdır. Boston Üniversitesi'nden bilim ve tıp gazeteciliği alanında yüksek lisans derecesine sahiptir. İş dışında spor yapmaktan, kitap okumaktan ve arkadaşları ve ailesiyle vakit geçirmekten hoşlanıyor. Onunla Twitter'da bağlantı kurun @Janet__White


MRNA izolasyonu:

cDNA sadece hücremizin veya ilgilendiğimiz genin mRNA transkriptini tamamlayan kodlama dizileridir, bundan sonra cDNA sentezi için önce mRNA'yı izole etmemiz gerekir.

mRNA, kullanıma hazır mRNA izolasyon kiti kullanılarak izole edilebilir. mRNA'yı RNA'nın geri kalanından izole etmek için, izolasyon işleminde oligo dT içeren kolon kullanılır.

MRNA kopyalandıktan sonra, transkripsiyon sonrası modifikasyonlar adı verilen işlem sırasında poli-A kuyruğu eklenir. Bu da mRNA'yı diğer tek sarmallı RNA'lardan ayırır.

mRNA'nın poli-A kuyruğu, oligo dT içeren kolon ile sınırlı kalır. Her yıkama turundan sonra, tüm RNA'lar yıkanır ve kolonda sadece mRNA kalır.

Son adımda, elüsyon tamponu kullanılarak mRNA başka bir tüpte toplanır.

MRNA saflaştırma:

Saflaştırılmış mRNA'nın bir sonraki adım için gerektirmesi gerekir, bunun için mRNA, saflaştırma kiti kullanılarak saflaştırılır ve oligo-dT tamamlayıcı nükleotidler, hafifçe ısıtılarak poli-A kuyruğundan çıkarılır. Saflaştırılmış mRNA, ters transkriptaz PCR için kullanılır.

Enzim seçimi:

Normal bir polimeraz, RNA'dan DNA sentezleyemez. Bunun için başka bir polimeraz türüne ihtiyacımız var - bir ters transkriptaz polimeraz.

Bir ters transkriptaz enzimi, mRNA'dan cDNA sentezleme gücüne sahip retrovirüslerden izole edilen özel bir polimeraz türüdür.

Avian Myeloblastomis virüsü transkriptazı ters çevirir ve Moloney Murine Lösemi Virüsü ters transkriptazı, cDNA kitaplığı preparasyonunda yaygın olarak kullanılan ticari olarak mevcut iki RT'dir.

Ters transkripaz PCR:

Normal PCR, DNA'dan DNA sentezi için kullanılırken, ters transkriptaz PCR, ters transkriptaz enzimi kullanılarak RNA şablonundan DNA sentezi için uygulanabilir.

DNA, transkript veya mRNA'dan geri sentezlenir ancak RT-PCR'nin adımları, normal geleneksel PCR'ye neredeyse benzerdir.

Kütüphane inşaatı:

Şimdi bir cDNA'nın amplikonlarına sahibiz, cDNA şimdi restriksiyon sindirim yöntemi kullanılarak plazmide ekleniyor.

Yapışkan uçlar, cDNA'nın yapışkan uçlarına tamamlayıcı olarak bağlanan bir plazmit üzerinde üretilir, bu yapışkan uçlar, kısıtlama sindirim yöntemi kullanılarak üretilir.

cDNA'nın boyutuna ve tipine bağlı olarak, farklı cDNA kitaplıkları oluşturmak için farklı tipte plazmitler kullanılır. cDNA'lı plazmit şimdi bakterilere yerleştirilir ve aseptik koşullar altında besin ortamı kullanılarak büyütülür.

cDNA sentezi ve kütüphane hazırlama sürecinin grafiksel gösterimi.

BAC'mizde (bakteriyel yapay kromozom) şu anda sahip olduğumuz şey, ilgilendiğimiz tüm parçaları içeren bir cDNA kütüphanesi veya cDNA kütüphanesi olarak bilinir. Her an kullanabiliriz. Aşağı akış uygulamalarında kullanmak için, plazmid DNA ilk önce protokol başına izole edilir ve işlenir.


Genomik Kitaplık Oluşturma

Moleküler klonlama aynı zamanda bir genomik kütüphane. Kütüphane, benzersiz bakteri klonları halinde tasarlanmış rekombinant DNA plazmitleri olarak ihtiva edilen bir organizmanın genomunun tam (veya neredeyse tamamlanmış) bir kopyasıdır. Böyle bir kitaplığa sahip olmak, bir araştırmacının, o parça için bakteri konakçısını büyüterek her parçadan büyük miktarlarda oluşturmasını sağlar. Bu fragmanlar, DNA dizisini ve mevcut herhangi bir genin fonksiyonunu belirlemek için kullanılabilir.

Bir genomik kütüphane oluşturmak için bir yöntem, bireysel kısıtlama enzimi ile sindirilmiş genomik fragmanları, aynı kısıtlama enzimi ile kesilmiş plazmit vektörlerine bağlamaktır (Şekil 5). Bir bakteri konağına transformasyondan sonra, transforme edilmiş her bakteri hücresi tek bir rekombinant plazmit alır ve bir hücre kolonisi halinde büyür. Bu kolonideki tüm hücreler birbirinin aynıdır. klonlar ve aynı rekombinant plazmidi taşır. Ortaya çıkan kütüphane, her biri orijinal organizmanın genomunun bir parçasını içeren, her biri ayrı ve farklı olan ve her biri daha fazla çalışma için kullanılabilecek bir koloniler koleksiyonudur. Bu, araştırmacıların orijinal organizmanın genomundan ilgili bir geni içeren klonu keşfetmek için bu farklı klonları taramasını mümkün kılar.

Şekil 5. Bir genomik kütüphanenin oluşturulması, ilgilenilen bir geni içeren genomik DNA parçasının keşfedilmesini kolaylaştırır. (kredi “micrograph”: Çalışmanın Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından değiştirilmesi)

Daha büyük genomik DNA parçalarını kullanarak bir genomik kütüphane oluşturmak için, E. koli bakteriyofaj, örneğin lambda, ana bilgisayar olarak kullanılabilir (Şekil 6). Genomik DNA, kesilebilir veya enzimatik olarak sindirilebilir ve önceden sindirilmiş bir bakteriyofaj lambda DNA vektörüne bağlanabilir. Daha sonra, bu rekombinant faj DNA molekülleri, faj parçacıklarına paketlenebilir ve enfekte etmek için kullanılabilir. E. koli bir plaka üzerinde konak hücreler. Her hücre içindeki enfeksiyon sırasında, her rekombinant faj kendisinin birçok kopyasını oluşturacak ve E. koli çim, bir plak oluşturur. Bu nedenle, bir faj kitaplığındaki her plak, ayrı bir genomik DNA parçası içeren benzersiz bir rekombinant fajı temsil eder. Plaklar daha sonra ilgilenilen genleri aramak için daha fazla taranabilir. Plazmitler yerine fajlar kullanan bir kitaplık üretmenin bir avantajı, bir faj partikülünün, bir plazmit vektörü ile karşılaştırıldığında çok daha büyük bir yabancı DNA ekini tutması, dolayısıyla orijinal organizmanın tüm genomunu tam olarak temsil etmek için çok daha az sayıda kültür gerektirmesidir.

Şekil 6. Rekombinant faj DNA molekülleri, parçalanmış genomik DNA molekülleri ile sindirilmiş faj partiküllerinin bağlanmasıyla yapılır. Bu rekombinant faj DNA molekülleri, faj partikülleri halinde paketlenir ve bir bakteriyel çimi enfekte etmesine izin verilir. Her plak, ilgilenilen genler için daha fazla taranabilen benzersiz bir rekombinant DNA molekülünü temsil eder.

Bir organizmada veya hatta bir dokuda ifade edilen genlere odaklanmak için araştırmacılar, genomik DNA'sı yerine organizmanın haberci RNA'sını (mRNA) kullanarak kütüphaneler oluştururlar. Tek bir organizmadaki tüm hücreler aynı genomik DNA'ya sahip olurken, farklı dokular farklı genleri ifade eder ve farklı tamamlayıcılar üretir. mRNA. Örneğin, tüm insan hücrelerinin genomik DNA'sı insülin genini içerir, ancak yalnızca pankreastaki hücreler insülin üretimini yönlendiren mRNA'yı eksprese eder. MRNA doğrudan klonlanamadığı için laboratuvarda mRNA, retroviral enzim tarafından şablon olarak kullanılmalıdır. ters transkriptaz yapmak tamamlayıcı DNA (cDNA). Bir hücrenin tam mRNA tamamlayıcısı, çift sarmallı DNA kopyaları yapmak üzere DNA polimeraz için bir şablon olarak kullanılabilen cDNA moleküllerine ters kopyalanabilir. Bir cDNA kitaplığının yararı, yalnızca hücrede ifade edilen genlerden DNA içermesidir. Bu, intronların, promotörler gibi kontrol dizilerinin ve proteinlere çevrilmeye yönelik olmayan DNA'nın kütüphanede temsil edilmediği anlamına gelir. Çevrilmiş dizilere odaklanma, kitaplığın genomun dizisini ve yapısını bütünüyle incelemek için kullanılamayacağı anlamına gelir. Bir cDNA genomik kütüphanesinin yapımı Şekil 7'de gösterilmektedir.

Şekil 7. Tamamlayıcı DNA (cDNA), retroviral enzim revers transkriptaz tarafından mRNA'dan yapılır, çift sarmallı kopyalara dönüştürülür ve bir cDNA kütüphanesi üreterek plazmit vektörlerine veya bakteriyofajlara eklenir. (kredi “micrograph”: Çalışmanın Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından değiştirilmesi)

Bunu düşün


Bakteriler genetik mühendisliği icat etti - biz onu tartışmalı hale getirdik

Son 50 yılda, üç büyük keşif, genetik mühendisliği alanını ateşledi. Birlikte tıp ve tarımda devrim yaptılar. Bireysel olarak, tartışmalara yol açtılar.

Genetik mühendisliği: ilk büyük keşif

1960'ların sonu. Aşkın yazı ile son aya iniş arasında bir yerde, bilim adamları bakteriler hakkında olağanüstü bir şey keşfettiler. Bakteriler kendilerini virüslerden korumak için restriksiyon enzimleri adı verilen moleküler makaslar geliştirdiler.

Kısıtlama enzimleri, DNA dizilerinin belirli modellerini tanır ve keser. Bu modeller yaygındır, ancak bakterinin kendi genlerinde görünmezler. Bakteriye giren istilacı DNA, kısıtlama enzimleri tarafından kesilir ve silahsızlandırılır.

Bilim adamları, kısıtlama enzimlerini kullanarak farklı türlerden DNA'yı kesip yapıştırabilirler. Örneğin, insan insülini genini kesip bakterilere yapıştırarak, diyabet hastaları için insülin üretmek için bakterileri biyofabrikalar olarak kullanabiliriz.

Kısıtlama Enzimleri, belirli DNA dizilerini kesen moleküler makaslar gibidir. Bilim adamları, DNA'yı kesip yapıştırmak için kısıtlama enzimlerini kullanırlar.

Genetik mühendisliği: tarımdaki uygulamalar

1980'lerin başlarına doğru ileri sarın. Uyuşturucuya karşı savaştan veya Challenger felaketinden önce, bilim adamları bazı toprak bakterileri hakkında olağandışı bir şey keşfettiler. Bu Agrobakteriler bir bitkiyi enfekte ettiğinde, küçük bir DNA paketini kesip bitkinin genomuna yapıştırırlar. Paket, bitki hücrelerine bölünmelerini ve bakteriler için yiyecek yapmalarını söyler.

Bilim adamları, kendi paketlerini teslim etmek için Agrobacteria'yı kullanabilirler. Kısıtlama enzimlerini kullanarak, Agrobacterium'un kendi genlerinden bazılarını, böceklere veya patojenlere karşı direnç gibi yararlı bir özellik için bir genle değiştirirler. Agrobacterium daha sonra geni bir ekin bitkisine iletir.

Genetik mühendisliği yeniden icat edildi: CRISPR devrimi

Daha sonra 2011 yılında aynı yıl OMG ve LOL sözlüğe eklendi, CRISPR sahneye çıktı. Kısaltma bir ağız dolusu, ama asıl anlamı, bakterilerin öğrenebilen bir bağışıklık sistemine sahip olmasıdır.

Bakteriler, tekrar eden modellerde önceki istilacılardan kalan DNA kitaplığını depolar. Bu eski DNA, özel bir protein ile etkileşime giren RNA adı verilen moleküler bir mesaj üretir. Cas-9 adı verilen bu protein, RNA ile eşleşen istilacı DNA dizilerini keser. CRISPR-Cas9 adı verilen bu sistem, bakterilerin potansiyel tehditleri hatırlamasını ve etkisiz hale getirmesini sağlar.

Bilim adamları, her tür organizmadaki genleri çok hassas bir şekilde düzenlemek için CRISPR-Cas9'un kes ve yapıştır mekanizmalarını kullanabilirler.

Cas9 enzimi, RNA adı verilen moleküler bir haberci tarafından çok özel bir DNA dizisine yönlendirilen moleküler bir neşter gibidir. Bilim adamları, son derece hassas düzenlemeler yapmak için bu CRISPR-Cas9 sistemini kullanabilir.

Genetik mühendisliği: beklentiler ve protestolar

Bu keşiflerin her biri, kısıtlama enzimleri, agrobakteriler ve CRISPR, tesadüfen bir şekilde tökezledi. Bakterilerin kendilerini nasıl savunduklarını incelemek, kendimizi patojenlerden ve hastalıklardan korumamıza, gıda fiyatlarını düşük tutmamıza ve üstün ürünler geliştirmemize yardımcı oldu. Ancak bu araçlar çalıştırılmadan önce onları nasıl kullanacağımıza karar vermemiz gerekiyordu.

Kısıtlama enzimleri ilk keşfedildiğinde, bilim adamları genetik mühendisliğinin etiği hakkında dikkatlice düşündüler. 1975'te, uzmanlar, gazeteciler ve meslekten olmayan insanlardan oluşan küçük bir grup, bu teknolojiyle ne yapılacağını tartışmak için ünlü Asilomar konferansında toplandı. Dört gün süren hararetli tartışmaların ardından, katılımcılar tedbir ve güvenlik önlemleri öneren bir bildiri yayınladılar. Bu açıklama, daha sonra Ulusal Sağlık Enstitüsü tarafından yayınlanan resmi yönergeleri bilgilendirdi.

İnsülin üreten bakteriler kelimenin tam anlamıyla genetiği değiştirilmiş organizmalar olmasına rağmen, GDO terimi Asilomar konferansından sonraki yirmi yıla kadar geniş çapta dolaşıma girmedi. Bilim adamları yabancı genleri bitkilere sokmaya başladığında GDO çılgınlığı patlak verdi.

Özellikle mühendislik tesislerine karşı güçlü direnç çok şaşırtıcı. Çok az insan biyofabrikaları ilaç üretmek için kullanmayı protesto ediyor. Genetik mühendisliği yoluyla üretilen peynir gibi diğer gıdalar da çok az sürtünme ile karşılaştı. Yine de GDO'lu ürünleri protesto etmeye kararlı bütün örgütler var.

İnsanlar, CRISPR kullanılarak tasarlanmış bir bitki veya hayvanın GDO olarak kabul edilip edilmeyeceği konusunda hemfikir değiller. Tarihsel olarak, GDO statüsü sadece transgenik organizmalara uygulandı: geleneksel üreme yoluyla eklenmemiş bir gen içerenler.

CRISPR, tıpkı kısıtlama enzimleri ve Agrobakteriler gibi bütün bir geni kesip bir bitkiye yapıştırmak için kullanılabilir. Ortaya çıkan transgenik bitki kesinlikle bir GDO olarak kabul edilecektir.

Öte yandan, CRISPR, doğal olarak meydana gelip gelmediğini söylemek imkansız olacak kadar küçük ve ince değişiklikler yapmak için kullanılabilir. Örneğin, tek bir A'yı bir G ile değiştirmek için CRISPR kullanıldıysa, bu değişiklik doğal bir A'dan G'ye mutasyondan ayırt edilemez olacaktır.

Açıkçası, genetik mühendisliği karmaşık bir konudur. Bunu yapmanın birçok yolu vardır ve farklı yöntemler arasındaki çizgi bulanık olabilir. Genetik mühendisliğinin potansiyel uygulamaları daha da çeşitlidir.

Paydaşlar genetik mühendisliğini tartışmak için Asilomar'da ilk kez bir araya geldiklerinde, tartışmalar uygulamalara ve ortaya çıkan ürünlerin tehlikeli olup olmayacağına odaklandı. Çoğu bilim insanı, günümüzdeki tartışmaların, sürecin kendisine değil, genetik mühendisliğinin belirli uygulamalarına odaklanması gerektiği konusunda hemfikirdir.

Sonuçta süreç yeni değil. Bakteriler, yüzyıllardır kendilerini ve komşularını genetik olarak değiştiriyorlar. Sadece birkaç on yıl önce yakaladık.


Ligasyon Nasıl Çalışır?

Kaynak ve hedef DNA sindirilip temizlendikten sonra birbirine bağlanmaya hazırdır. Bu, uyumlu DNA uçlarının çift zincirli kırıklarını bir araya getiren T4 DNA ligaz enzimi kullanılarak gerçekleştirilir. Enzim hem kör hem de yapışkan uçları birleştirme yeteneğine sahiptir, ancak kör uçları birleştirme etkinliği çok daha düşüktür.

T4 ligaz kullanmak kolaydır. DNA, ligaz ve tamponu birlikte karıştırın ve inkübe edin. Bu noktada tüm bileşenlerin molar oranını dikkate almak önemlidir, ancak bunun gibi yardımcı olacak birçok araç vardır. Birçok ticari ligaz, oda sıcaklığında inkübasyona izin verir ve yapışkan ligasyonlar için yarım saatten daha kısa sürede tamamlanabilir. Ligasyon tamamlandıktan sonra, klonlama prosedürünü tamamlamak için karışımın küçük bir miktarı yetkin hücrelere dönüştürülebilir.

Kısıtlamalı klonlama, ilk tanıtıldığından beri moleküler biyolojide devrim yarattı. Bireysel adımlar oldukça basittir, ancak hepsini bir araya getirmek ve işe almak farklı bir hikaye olabilir. Neyse ki, yol boyunca size yardımcı olacak Bitesize Bio da dahil olmak üzere birçok kaynak mevcut. İyi şanlar!


Mikropipetörün kullanımı

  1. Pipet üzerinde ayarlanan miktarın doğru olduğundan emin olun.
  2. Yeni ucu mikropipet üzerine sıkıca yerleştirin.
  3. Pistonu bastırın ilk durakve bu konumu tutun. Bu adım, uçtaki havayı ortadan kaldırır.
  4. Ucu pipetlenecek solüsyona daldırın ve pistonu serbest bırakarak sıvıyı uca çekin. Ucuna yapışmış küçük bir miktarı çıkarmak için her zaman pipet ucunu tüpün kenarına dokundurun. Artık pipetinizin içinde bir numune var.
  5. Numuneyi çıkarmak için pipet ucunu numuneyi boşaltmak istediğiniz tüpün iç duvarına dokundurun. Bu, sıvının uçtan dışarı çekilmesine yardımcı olacak bir kılcal etki yaratır.
  6. Pistonu ilk durdurmaya kadar yavaşça bastırın ve ardından uçtaki son sıvı parçasını dışarı üflemek için ikinci durdurmaya kadar bastırın. Ucu tüpteki sıvıdan çıkarmadan önce pistonu ÇIKARMAYIN. Aksi takdirde, sıvıyı uca geri çekecektir.
  7. Numune alırken, her zaman ucunda hava olup olmadığını kontrol edin. Varsa, numuneyi geri koyun ve yeniden başlayın.

Kısıtlama endonükleazları ile DNA'yı sindirin (tüm enzimleri buz üzerinde tutun)

  1. Kısıtlama sindirimini gerçekleştireceğiniz dört adet 1,5 ml'lik tüpü etiketleyin: Pst1 enzim, "quotE" için EcoRI enzim, "quotH" için Hint III enzim ve "quotL" için Lambda DNA kesilmemiş.
  2. Aşağıdaki tabloyu kullanarak her tüpe reaktifleri şu sırayla ekleyin: DNA, kısıtlama tamponu, su ve enzimler en son (isteyin). Her farklı reaktif için yeni bir pipet ucu kullanın. Miktarlar mikrolitre (litrenin milyonda biri) olarak verilmiştir.
  3. Tüpün altını birkaç kez tezgaha vurarak reaktifleri toplayın ve karıştırın (veya bir mikrosantrifüj kullanın).
  4. Tüm reaksiyon tüplerini 37°C'de 30 dakika inkübe edin.
  5. Tüpler, elektroforezin yapılacağı bir sonraki döneme kadar dondurucuya gidecektir.

Agaroz jel döküm

  1. Jel döküm tepsisini tepsi aparatına yerleştirin, sıkıca vidalayın ve iyi şekillendirilmiş tarağı kırmızı çizgi ile işaretlenmiş alana yerleştirin. Tepsiyi hizalamak için kullanılabilecek bir tesviye balonu vardır (alttaki düğmeleri çevirerek).
  2. Tepsiyi DÜZ, agarozun dökülebileceği ve RAHATSIZ EDİLMEMESİ için izin verilen bir yere koyun.
  3. 40 ml agaroz solüsyonunu (60°C su banyosunda sıvılaştırılmış) dikkatlice döküm tepsisine dökün. Herhangi bir kabarcığı kenarlara taşımak için bir kürdan kullanın (bu, jel sertleşmeden ÖNCE yapılmalıdır).
  4. Jel 20 dakika içinde katılaşacaktır. Agaroz katılaşırken tepsiyi hareket ettirmeyin.
  5. Tarağı nazikçe çıkarın, dümdüz yukarı çekerek ve kuyuları yırtmamaya özen göstererek.
  6. Katılaştığında, jel tepsisini jel döküm tepsisinden çıkarın ve tarak negatif (SİYAH) katot ucunda olacak şekilde elektroforez kutusunun platformuna yerleştirin. - yüklü DNA parçaları + anot ucuna doğru göç edecektir.
  7. Kutuyu, tüm jel yüzeyini yaklaşık 2 mm kaplayacak seviyeye kadar TBE tamponu ile doldurun.
  8. Tarak tarafından bırakılan numune kuyularının tampon tarafından tamamen batırıldığından emin olun.
  9. Jel artık DNA ile yüklenmeye hazırdır.

DNA ile jel yükleme

  1. 4 tüpü buzdolabından çıkarın ve tüpleri bir santrifüjde puls döndürün veya tüm içerikleri tüpün dibine inecek şekilde tüpleri masanın üstüne sıkıca vurun.
  2. Her reaksiyon tüpüne 2 mikrol yükleme boyası ekleyin ve tüpün içeriğini masa üstüne dokunun.
  3. Her reaksiyon tüpünün içeriğini jel içinde ayrı bir kuyuya (toplam 4 kuyu) yüklemek için pipet kullanın. Mikropipetinizi 12 & mikrol olarak ayarlayın (bu, tüpteki toplam içerik olmalıdır).
  4. Jelin işaretlenmesinin HİÇBİR yolu olmadığından tüplerinizin sırasını hatırlamanız gerekecektir. Her farklı tüp için temiz bir pipet ucu kullanın.
    • 2 el kullanarak kuyu üzerinde sabit pipet.
    • Önce pipet ucundaki havayı boşaltın.
    • Pipet ucunu kuyunun üzerine yerleştirilmiş tampona daldırın ve karışımı yavaşça boşaltın (jelin altından delmeyin).
  5. Yükleme boyası, DNA'dan daha ağır olan sakaroz içerir. Karışımı ağırlaştırır, böylece kuyunun dibine batar.

Elektroforez

  1. Elektroforez haznesinin üst kısmı hazneye yerleştirilir, elektrotlar güç kaynağına bağlanır - anottan anoda (kırmızı-kırmızı) ve katottan katoda (siyah-siyah).
  2. Güç kaynağı açılır ve voltaj ayarlanır --- 120 V. Voltaj ne kadar yüksek olursa, elektroforez süresi o kadar hızlı olur. Birkaç dakika içinde, yükleme boyasının jel boyunca + kutba (anot) doğru hareket ettiğini fark etmeye başlamalısınız. Yaklaşık 1 saat kadar çalışmasına izin vereceğiz.
  3. NS yükleme boyası 2 renk bandında çözülecektir. Daha hızlı hareket eden morumsu bant boyadır. bromofenol mavisi, daha yavaş hareket eden su bandı ksilen siyanol . Bromofenol mavisi, jelden yaklaşık 300 baz çifti uzunluğunda bir DNA fragmanı ile aynı oranda göç eder. Ksilen siyanol, yaklaşık 2.000 baz çifti uzunluğunda eşdeğer bir oranda göç eder.
  4. 1 saat sonra bromofenol bandı jelin sonuna yaklaşmalıdır. Güç kaynağını kapatın, kabloları ayırın ve haznenin üst kısmını çıkarın.
  5. Döküm tepsisini dikkatlice çıkarın ve plastik kaba koymaya hazır olana kadar yatay tutun. Jeli grup adınızla etiketlenmiş boyama tepsisine kolayca kaydırın.
  6. Jeli kaplayacak kadar metilen mavisi DNA lekesi ekleyin ve üzerine örtü yerleştirin. Gece boyunca boyada oturacaklar.
  7. Jeller birkaç kez distile suda (10-20 dakika bekletilerek) yıkanacak ve bir sonraki laboratuvar dönemine bakacağımız zamana kadar buzdolabında kalacaktır.
  8. Jeller daha sonra, eğitmeniniz isterse, jeli bağlayan ve kurutan jel destek filmi üzerine yerleştirilebilir.

Bilim adamları yüzlerce farklı tipte kısıtlama enzimini tanımladı ve saflaştırdı. İzole edildikleri organizmanın cinsine ve türüne göre adlandırılırlar ve bulundukları sırayı belirtmek için bir numara verilir. Örneğin, EcoRI izole edilen ilk kısıtlama enzimidir. Escherichia coli Gerginlik rY13, oysa Hint III izole edilen üçüncü enzimdi Haemophilus influenzae soy R NS.

DNA, birbirinin etrafında çift sarmal halinde sarmal oluşturan iki tamamlayıcı nükleotit dizisinden oluşur. Kısıtlama enzimleri her iki nükleotid zincirini de keserek DNA'yı parçalara ayırır, ancak bunu her zaman aynı şekilde yapmazlar.

smaben DNA iplikçiklerini düz kesen, düz veya kör uç.

gibi diğer kısıtlama enzimleri ekori, birbirinin tam karşısında olmayan nükleotidlerdeki DNA zincirlerini kesin. Bu, sonunda sarkan bir nükleotid zincirine sahip DNA parçaları oluşturur. Bu sarkan nükleotid zincirine denir. yapışkan uç çünkü tamamlayıcı DNA parçalarıyla kolayca bağlanabilir.


Kısıtlama Enzim Özetleri

Kısıtlama enzimleri veya endonükleazlar, DNA'yı belirli bir dizide tanır ve keser. Bu enzimler, bakterilerde bakteriyofajlara (bakterileri enfekte eden virüslere) karşı bir savunma olarak doğal olarak bulunur. Bakteriyel kısıtlama enzimleri, istilacı bakteriyofaj DNA'sını keserken, metil gruplarının eklenmesi nedeniyle bakteri genomik DNA'sını zarar görmeden bırakır.

Bu video, restriksiyon enzimlerinin temel ilkelerini açıklar: restriksiyon enzimlerinin nasıl adlandırıldığı ve var olan tanıma bölgeleri ve çıkıntıların türleri. Ayrıca, gerekli bileşenleri, karışımın birleştirilmesi gereken sırayı ve tipik inkübasyon sıcaklığı ve süresini içeren bir kısıtlama sindiriminin nasıl kurulacağına ilişkin adım adım genelleştirilmiş bir prosedür sağlanmaktadır. Yıldız aktivitesini önlemek için restriksiyon enzimlerinin inaktive edilmesinin öneminden bahsedilmiştir. Birden fazla enzim sindirimi gerçekleştirmek ve sindirim reaksiyonlarında kontrolleri kullanmak için ipuçları da sağlanmaktadır.

Prosedür

Kısıtlama enzimleri veya kısıtlama endonükleazları, moleküler biyolojide çeşitli farklı uygulamalarda kullanılır. Bu enzimler, kısıtlama bölgesi olarak adlandırılan belirli bir DNA dizisini tanır ve parçalar. Birazdan izleyeceğiniz video, bu mucizevi moleküller hakkında bazı arka plan bilgileri sağlar ve bir kısıtlama enzimi sindiriminin nasıl kurulacağını gösterir.

Kısıtlama enzimleri nereden geliyor? Bu enzimler, bakteriyofajlar olarak bilinen virüslere karşı bir savunma mekanizması görevi gören bakterilerin bir adaptasyonudur. Bakteri DNA'sındaki restriksiyon enzim bölgelerine metil gruplarının eklenmesi sayesinde restriksiyon enzimleri sadece faj DNA'sını tanır ve keserek enfeksiyonu önler.

Kısıtlama enzimlerinin oldukça tuhaf isimleri vardır. Örneğin, HindIII, NotI, EcoRI ve BamHI. Bir kısıtlama enziminin adının ilk üç harfi, izole edildiği organizmayı belirtir. Örneğin, kısıtlama enzimi EcoRI, E. coli'den izole edildi. Dördüncü harf, gerekirse, enzimin izole edildiği bakteri suşuna atıfta bulunur. Romen rakamı, söz konusu organizmadan izole edilen birinci, ikinci, üçüncü enzim olup olmadığını gösterir.

Kısıtlama enzimleri, genellikle dört ila sekiz baz çifti uzunluğunda olan ve tanıma bölgesi olarak adlandırılan bir nükleotid dizisini tanır. At specific nucleotides within the sequence, the enzyme will break the phosphodiester bonds in the DNA backbone. The recognition sites are usually palindromic, meaning that the sequence reads the same forwards and backwards. When the palindrome is found on complementary strands of DNA molecule it is called an inverted-repeat palindrome.

Restriction enzymes can leave different types of ends once the DNA is cleaved: sticky ends and blunt ends. Sticky ends leave 3’ and 5’ overhangs while blunt ends leave no overhangs. The type of end dictates how the DNA fragment isolated by the restriction enzyme digest will be recombined with other DNA fragments in a process known as ligation.

A restriction enzyme digest should be carefully planned. A digestion reaction typically consists of the following: deionized water, the DNA that’s going to be cut, buffer specific to the enzyme you will use, and sometimes a protein called bovine serum albumin or BSA. BSA will stabilize the reaction by preventing enzyme from sticking to the side of the container that houses the digest. Each restriction enzyme can potentially have different buffer conditions, incubation temperatures, and requirements for BSA. Suppliers of restriction enzymes will have resources that one can check to obtain all of the necessary information.

To begin setting up the digest, retrieve the restriction enzyme from the freezer or fridge. Keep the restriction enzyme on ice or a thermal resistant container to make sure there is optimal activity for future reactions. To a microfuge tube reaction components should be added in the following order. First, a volume of sterile, nuclease-free water that will yield a final reaction volume of 20μL. Then 10x Restriction Enzyme Buffer, then BSA if needed, up to 1μg of DNA, and 2-10 units of enzyme. Units are defined as the amount of enzyme required to produce a complete digest of 1μg of control DNA in 60 minutes at 37°C in a 50μL reaction volume. After, mix by vortexing and then centrifuge briefly at 12,000xg in a microcentrifuge to collect the contents at the bottom of the tube. Then incubate at an optimal temperature for your restriction enzyme, usually 37°C in a heating block for 1 to 4 hours.

Once your digest has completed, it’s a good idea to incubate the reaction mixture at 65ⶬ to heat inactivate the restriction enzymes. While restriction enzymes cut site-specifically most of the time, prolonged incubation times can lead to star activity, which is cutting at sites that are similar, but distinct from their typical digestion sites.

Following inactivation, the DNA should be run on an agarose gel to ensure that the digest was successful.

Here are a couple of helpful hints for running your digests and ensuring success.

Sometimes you may find yourself in a situation where multiple enzymes need to be used to generate a specific DNA fragment. In this case you need to check that buffer conditions and incubation temperatures are compatible between the two enzymes, if so, then you can perform a double digest and have both enzymes cut in the same reaction. Sometimes, however, you’ll find incompatibility in the reaction conditions between the two enzymes, and in this case the workaround is to use the enzymes sequentially. For example, the digest can be performed with one enzyme first, and then the buffer composition, can be altered in order to be optimal for the second enzyme. Another way to overcome buffer incompatibility and perform a sequential digest is to purify the DNA following the initial digest and then perform the second digest.

Using controls are a good way to understand why a digest might go wrong. For example, a no enzyme control will allow you to check the integrity of DNA sample and determine if exonuclease activity is present. The use of control DNA with known restriction sites allows the activity of the enzyme to be tested.

Now that we have seen how digests are carried out, lets have a look at various ways restriction enzymes can be used.

Restriction enzymes can be used diagnostically, in order to identify particular samples. By loading a digest into a specialized chip and then placing that chip into a machine called a bioanalyzer. Researchers can examine DNA fragment sizes, produced by the digest, in order to determine the authenticity of fish samples. The different banding patterns of the same gene from a given species, or in this case different species, are called restriction fragment length polymorphisms.

Restriction enzymes can also be used in subcloning to isolate a fragment of DNA from one plasmid and insert into another, so the desired fragment can be replicated using bacteria.

By employing the polymerase chain reaction, or PCR to introduce restriction sites into genes at very specific locations, restriction enzymes can be used to determine the presence of single nucleotide differences in alternate forms of the same gene, or allele. These single nucleotide polymorphisms, or SNPs, are difficult to detect with PCR and gel electrophoresis alone. With the introduction of the restriction site within the SNP, a simple digest can distinguish between the alleles.

You’ve just watched JoVE’s video on restriction enzymes. You’ve learned where these enzymes come from, been taught some basics about how they work, seen how to set up a digest, and learned how restriction enzymes can be used in molecular biology. As always, thanks for watching!


Yaratılış Araştırmaları Enstitüsü

The March 1998 Impact article"Cloning - What is It and Where is It Taking Us?" discussed the procedure of cloning by somatic cell transfer. In that procedure, the nucleus from a cell derived from an embryo, a fetus, or tissue of an adult is inserted into an egg from which the nucleus has been removed. After the egg develops to the appropriate stage, the embryo is inserted into the uterus of a properly prepared female and allowed to develop to term. This produces an offspring essentially genetically identical to the animal that provided the nucleus that was inserted into the egg. This article will discuss the transfer of genes from one species to another in order to endow the recipient species with beneficial properties, or to enable the recipient to produce human proteins for injection into human patients who lack a vitally important protein.

Production of Therapeutic Proteins by Gene Transfer

There are many proteins essential to good health that some people cannot produce because of genetic defects. These proteins include various blood-clotting factors causing hemophilia, insulin (resulting in diabetes), growth hormone (resulting in lack of proper growth), and other proteins, the administration of which corrects pathological conditions or results in other therapeutic benefits. The early work in this field employed bacteria. Some bacteria in a bacterial culture may contain small circular DNA molecules called plasmids. These plasmids are not part of the chromosomal DNA that is possessed by all the bacteria of the culture. As these exceptional bacterial cells reproduce by binary fission or cell division, the plasmids are transmitted to the daughter cells. They can also be transmitted to other cells by conjugation. Scientists have learned how to utilize plasmids to transfer human genes to bacterial cells. If the gene inserted into the plasmid of bacteria is the human gene for insulin, for example, the bacteria into which this gene is inserted produces human insulin.

Insertion of a DNA section into a plasmid

Scientists have identified and isolated enzymes (called restriction enzymes, or restriction endonucleases) each of which cuts genes in very specific places. More than 100 of these enzymes have been isolated. After the position of the human gene that codes for the desired therapeutic protein has been located on the chromosome, the gene is cut out using the appropriate restriction enzymes and the gene is isolated. The same restriction enzymes are used to cut out a piece of the circular DNA plasmid. Thus, the two ends of the human gene will be those that will link up with the open ends of the plasmid. An enzyme called DNA ligase is used to couple each end of the gene to the open ends of the plasmid, restoring a circular DNA molecule with the human gene replacing the piece cut out of the plasmid. These plasmids, now including the human gene, are reinserted into bacteria. These bacteria are cultured, producing large quantities of identical bacteria carrying the human gene that is reproduced along with the bacterial DNA. Furthermore, these bacteria produce the human protein coded for by the spliced human gene. The protein is isolated from the bacterial culture, purified, and injected into those patients suffering from pathological conditions because their bodies cannot produce sufficient quantities of the protein.

Before genetic engineering, these proteins had to be painstakingly isolated from tissues or blood, but since they are produced in such minute quantities, the isolation of significant quantities required the processing of large quantities of material. As a result, they were very expensive. Relatively much larger quantities were obtained from genetically altered bacterial cultures, but the cost, although less, was still high. The bioreactors (that is, the machinery required to culture large quantities of the bacteria containing the human gene) are enormously expensive and must be operated by several scientists and technical assistants. Furthermore, the proper operation of the bioreactor is sensitive to small changes in temperature and composition of the culture broth.

Fortunately, an alternative method has been developed which promises to be much less expensive and much more efficient. This method utilizes an animal, such as a pig, as the bioreactor. It required years for scientists to design, develop, and build the very expensive, difficult to operate bioreactor devised by man. God had already devised a much more efficient, much cheaper bioreactor. Scientists finally realized that it would be possible by genetic manipulation to induce a female pig, cow, or other animal to produce the desired human proteins in its milk.

Genetic engineering of a milk protein

This procedure has now been successful in both pigs and cows. Among animals, the pig has a number of advantages. Its gestation period is only four months. At 12 months of age the pig is fertile and produces large litter sizes (usually 10 to 12 piglets). A lactating pig produces 300 liters (about 315 quarts) of milk in a year. The procedure is carried out as follows:

  1. The DNA fragment (gene) that codes for the needed human protein is isolated.
  2. The DNA fragment that promotes production of proteins in mammary glands is isolated and linked or combined to the human gene.
  3. Fertilized eggs from a donor pig are obtained.
  4. The human DNA is injected into an egg in the region of the male pronucleus (DNA from the sperm before it unites with DNA of the egg) using a very slim micro pipette. The human DNA is thus incorporated into the pig nuclear DNA.
  5. The egg is implanted in the uterus of another pig and develops into a newborn female pig.
  6. The desired protein is isolated from the milk of the female pig once grown.

This procedure was carried out successfully by American scientists and the results were published in 1994. 1 The human gene they used codes for Protein C that acts to control blood clotting. They obtained one gram of Protein C from each liter of milk produced by the pig. This is 200 times the concentration found in human blood plasma. Only about one third of the Protein C obtained was biologically active. The reason for this is that many modifications of a protein must be performed in a cell after the protein chain is formed. For example, sections are cut out of the protein complex sugar groups may be attached at certain places in the protein chain and cell wall anchor groups may be added. The scientists discovered that a key processing enzyme, called furin, was present in insufficient quantities, so they added to their gene complex the gene that codes for furin. This increased the yield of active Protein C. The human proteins produced in this way must be tested for safety and effectiveness. At this writing, an anti-clotting protein called anti-thrombin is now being tested in clinical trials.

Comparing this procedure to the use of bioreactor machines illustrates the fact that a generation of biochemical engineers failed to match the abilities of a tool for making proteins (the pig) that God had prepared. The mammary gland is optimized to maintain a high density of cells to deliver to them an ample supply of nutrients and to channel proteins that are produced in a form that can easily be isolated and purified. This procedure has proven to be successful and promises to provide a method for producing valuable therapeutic proteins at much lower cost.


Videoyu izle: Genetik 101: Gen Nedir? 1. Bölüm Biyoloji (Mayıs Ayı 2022).