Bilgi

Adenovirüsler, onları vektör virüsleri olarak kabul edilebilir kılan kas dokusu ile nasıl etkileşime girer?

Adenovirüsler, onları vektör virüsleri olarak kabul edilebilir kılan kas dokusu ile nasıl etkileşime girer?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Anladığım kadarıyla, belirli zayıflatılmış adenovirüsler bir vektör virüsü olarak popülerdir, yani hücreleri enfekte etmek ve yararlı bir bağışıklık tepkisini tetiklemek için bir aşıda aktif ajan olarak kullanılan bir virüs anlamına gelir.

Elbette bu kullanım, vektör virüsünün hücreleri gerçekten enfekte edebileceğini ve ilk etapta hedef proteini kopyalamalarına neden olabileceğini varsayar. Anlayabildiğim kadarıyla, adenovirüslerin hücrelere ve onların reseptörlerine nasıl bağlandıkları tam olarak anlaşılmamıştır ve ayrıca canlı adenovirüsler genellikle hücreleri kas dokusunda değil, organ dokusunda enfekte etmeyi tercih ediyor gibi görünmektedir. bir kas?


Çoğaltma yetkin adenovirüslerden kim korkar?

Rekombinant adenovirüsler (rAV), gen terapisi amaçları için en etkili vektörler arasındadır ve birçok insan gen terapisi protokolünde hızla tercih edilen vektör haline gelmiştir. rAV, terapötik bir genin taşınması için bir araç olarak kullanılır. Çoğu uygulama için vektörün replikasyonu arzu edilmez (örn. genetik bozuklukların tedavisi için). Bu nedenle, şu anda gen terapisinde kullanılan rAV'lerin çoğunluğu, viral genomun yeni genetik bilgilerin sunulabileceği erken bölge 1'de (E1) bir delesyona sahiptir. E1 silme, rekombinant virüs replikasyonunu kusurlu hale getirir ve böylece önemli bir güvenlik özelliği sağlar. Ancak belirli durumlarda, spesifik hücrelere (örneğin kanser tedavisi için tümör hücreleri) hedeflenen replikasyon yetkin bir rAV'nin kullanımı seçilebilir. E1 silinmiş rAV, E1 işlevlerini sağlayan özel hücreler olan özel yardımcı hücrelere yayılabilir trans halinde293 ve 911 hücre hatları gibi. Şimdiye kadar rAV ile cesaret verici sonuçlar elde edilmiş olsa da, rAV'lerin kullanımıyla ilgili iki büyük sorun vardır: yani. adenovirüs partiküllerine ve dönüştürülmüş hücrelere karşı konakçı bağışıklık tepkisi ve rAV lotlarının üretimi sırasında replikasyon yetkin adenovirüs (RCA) üretimi. RCA, yardımcı hücrelere entegre edilmiş E1 dizileri ile homolog rekombinasyonun bir sonucu olarak E1 bölgesini yeniden elde eden geri dönen vektörlerdir. Yakın zamanda, yeni bir yardımcı hücre hattı olan PER.C6'yı ve homolog rekombinasyon ile RCA oluşumunu ortadan kaldıran, eşleşen, örtüşmeyen E1-silinmiş vektörleri tanımladık.

Burada, RCA fenomeninin kendisine odaklanıyoruz. İlk olarak, RCA ile ilgili güncel bilgileri gözden geçireceğiz. Daha sonra, yardımcı hücreleri üzerinde farklı rAV'lerin yayılması sırasında rekombinasyonun bir sonucu olarak ortaya çıkan çeşitli replikasyon yetkin veya kusurlu rAV revertantlarının oluşumunu ve özelliklerini tartışacağız.

293 hücre dizisi, adenoviral vektörlerin üretimi için en sık kullanılan hücre dizisi olmuştur. Bu hücre dizisi, 1970'lerde, diploid insan embriyonik böbrek hücrelerinin, kesilmiş adenovirüs serotip 5 (Ad5) DNA'sı ile transfeksiyonu ile oluşturulmuştur. Adenovirüslerin E1 genlerinin dönüştürme potansiyeli üzerine bir çalışma sırasında yapılmıştır. 293 hücrenin genomundaki Ad5 dizilerinin haritalanması, genomun sol ucundan 4137.1 konumuna kadar bitişik Ad5 dizilerinin varlığını gösterdi. ve transgenin sol tarafında 450'ye kadar baz çiftine ve sağ tarafta yaklaşık 800 baz çiftine sahip yardımcı hücre DNA'sı.

Bu dizi çakışması nedeniyle, rAV'nin 293 hücre üzerinde replikasyonu, RCA'nın üretilmesiyle sonuçlanır. Bu ilk olarak, 293 hücrede birden çok kez geçirilmiş bir E1+E3 ile silinmiş rAV kullanan Lochmüller ve çalışma arkadaşları2 tarafından rapor edilmiştir. E1 içeren ancak E3 içermeyen RCA tespit ettiler. Bu, rAV'lerin küçük bir bölümünün, rAV DNA'sındaki örtüşen sekanslar ile 293 hücrede bulunan adenovirüs DNA'sı arasındaki homolog rekombinasyon yoluyla E1'i yeniden kazandığını ileri sürdü. Bu daha sonra Hehir ve meslektaşları3 tarafından Ad2 tabanlı rAV'nin Ad5 ile dönüştürülmüş 293 hücreler üzerinde yayılmasıyla doğrulandı: Ad5 E1 bölgesini taşıyan RCA'yı tespit ettiler. 293 hücrede Ad5 genomunun tüm sol ucunun varlığına rağmen, incelenen tüm RCA izolatlarının, transgenin yukarısında ve aşağısında iki homolog rekombinasyon olayı tarafından üretildiği ve bunun da transgen ve yeniden gen kaybıyla sonuçlandığı bulundu. E1 bölgesinin vektörü tarafından elde edilmesi.

RCA'nın rAV gruplarında ortaya çıkması tesadüfi bir olaydır ve bu nedenle öngörülemez ve kontrol edilmesi zordur. Bu, özellikle büyük ölçekli partilerin hazırlanması gerekiyorsa, GMP üretimi için önemli bir sorundur. rAV'lerin üretimi sırasında RCA oluşum sıklığı hakkında bir dizi rapor yayınlanmıştır (Tablo 1). Bu veriler, geleneksel E1-silinmiş Ad5 (ve Ad2) rAV'leri ile, RCA'nın, klinik lotların büyük ölçekli üretimini engelleyen frekanslarla üretildiğini göstermektedir.

Homolog rekombinasyonun RCA'nın tek kaynağı olmadığına dikkat edilmelidir. rAV üretimi sırasında, RCA'lar sisteme dışarıdan da dahil edilebilir. rAV yapımının klasik yöntemi, büyük KlaAd5'i, ilgilenilen geni yardımcı hücrelere taşıyan bir adaptör plazmit ile birlikte parçalıyorum. Adenovirüs DNA'sının eksik kısıtlama-enzim sindirimi (ayrıca) RCA üretiminden (yani bu örnekte vahşi tipte Ad5) sorumlu olabilir. Bakteriyel plazmitlerde klonlanmış Ad genomlarının kullanılması bu riski ortadan kaldırır. Ek olarak, replikasyon yetkin adenovirüslerin yayıldığı laboratuvarlarda yanlışlıkla çapraz kontaminasyon meydana gelebilir.

Halihazırda bilinen rAV'den türetilen replikasyon yetkin adenovirüsler, vahşi tip adenovirüslere benzerdir, ancak çoğu durumda, vahşi tip izolatlarda hiç gözlenmemiş olan E3 bölgesi silinir.2,3 tarih, insan adenovirüs serotip 5 veya 2'den türetilmiştir. Ad2 ve Ad5, esas olarak hafif solunum yolu enfeksiyonları ile ilişkilidir ve bu virüsler, esas olarak epitel hücreleri için bir tropizme sahiptir. Bu tür vektörlerden türetilen RCA'nın, vahşi tip Ad5 ve Ad2'nin neden olduğu hastalığa benzer bir hastalıkla sonuçlanması beklenebilir.

İnsan hastalarda kullanılacak rAV serilerinde RCA'nın varlığı açıkça istenmeyen bir durumdur. RCA hastada kontrolsüz bir şekilde çoğalabilir. RCA'nın replikasyonu alıcının bağışıklık sistemi tarafından sınırlandırılsa da, özellikle bağışıklığı baskılanmış hastalarda potansiyel bir tehlikedir. Ek olarak, RCA vektörü kurtarabilir ve hasta tarafından dökülen vektör miktarını artırabilir. Vektörün RCA tarafından kurtarıldığı, insan adenovirüs replikasyonuna izin veren bir kemirgen türü olan pamuk sıçanlarında gözlemlenmiştir.8 Ayrıca, RCA'nın varlığı inflamatuar yanıtlarla ilişkilidir.9 Bu tür inflamatuar yanıtlara bir yandan adenovirüsün çoğalmasının doku hasarına neden olması veya diğer yandan hücreler için toksik (örneğin hekson, penton) ve immünojenik olan büyük miktarlarda adenovirüs proteinlerinin sentezlenmesi gerçeği ile. Bu nedenle, klinik deneylerde kullanılacak rAV serilerinde RCA'nın varlığı, önemli patolojik yan etkilere neden olabileceğinden istenmeyen bir durumdur. Bu aynı zamanda Gıda ve İlaç Dairesi (FDA) gibi düzenleyici kurumlar tarafından da kabul edilmektedir. Bu nedenle, doku kültürü yöntemi, süpernatant kurtarma testi ve PCR testi gibi emek yoğun ve pahalı RCA tarama testleri gereklidir.10 RCA taraması, klinik rAV lotlarının üretim maliyetlerini önemli ölçüde artırdı ve gecikmelere yol açtı. klinik çalışmaların başlangıcı.

Şu anda, yoğun araştırma çabaları, değiştirilmiş bir doku tropizmi olan adenoviral vektörlerin geliştirilmesine odaklanmaktadır. Bu, fiber, hexon ve penton gibi kapsid proteinlerini kodlayan genlerin değiştirilmesiyle sağlanır. Bu durumlarda hedefler, vahşi tip Ad2 ve Ad5 tarafından enfeksiyona dirençli olan endotel veya düz kas hücreleri olabilir. Değişmiş tropizmi olan adenoviral vektörlerin preparatlarında RCA'nın varlığı potansiyel bir güvenlik riski oluşturur. Bu açıdan, endotel tropizmi olan adenovirüslerin, geyik ve farelerde ölümcül enfeksiyonlara neden olduğu gösterilmiş olması dikkate değerdir.11,12 Woods ve arkadaşları11, adenovirüs enfeksiyonu üzerine geyiklerde yüksek ölüm oranları bildirmiştir. Mortalite, virüsün hayvanın endotelinde replikasyonundan kaynaklanmış ve ciddi vaskülite neden olmuştur. Farelerde, MAV (fare adenovirüsü) beynin vasküler endotelini hedef alarak ölümcül enfeksiyonlara neden olabilir.12 Ayrıca, bağışıklık sistemi sağlam olan bebeklerde adenovirüs enfeksiyonları ciddi sağlık sorunlarına ve hatta ölüme neden olabilir.13 Bu nedenle, klinik deneylerde kullanılacak değiştirilmiş bir tropizm, kontamine RCA içermemelidir.

rAV'nin immünojenisitesini azaltmak ve ekleme kapasitesini artırmak için, birkaç grup, tüm Ad genlerinden silinen rAV'ler üretmek için stratejiler geliştirmektedir ('gutless' adenovirüsler olarak adlandırılır). Gutless rAV'ler bir yardımcı virüs kullanılarak yayılabilir. Bugüne kadarki en verimli sistemde, bakteriyofaj P1 loxP siteleri ("floxed") ile çevrili bir paketleme sinyaliyle birlikte E1 silinmiş bir yardımcı virüs kullanılır. Paketleme sinyali yardımcı virüsün DNA'sından silindiği için, Cre rekombinazını eksprese eden yardımcı hücrelerin, gutless virüs ile birlikte yardımcı virüs ile birlikte, flokslanmış bir paketleme sinyali ile enfeksiyonu, yalnızca gutless rAV vermelidir. Ancak 293 tabanlı yardımcı hücreler kullanılırsa yardımcı virüs DNA'sı, yardımcı hücre DNA'sına entegre olan Ad5 DNA'sı ile yeniden birleşebilir. Sonuç olarak, vahşi tipte bir paketleme sinyalinin yanı sıra E1 bölgesi de geri kazanılır. Bu nedenle, 293- (veya 911) bazlı yardımcı hücreler üzerinde gutless rAV üretimi de, E1-silinmiş bir yardımcı virüsün kullanılması durumunda RCA'nın oluşmasına neden olabilir.

Sorunun büyüklüğü göz önüne alındığında, RCA sorununu çözmek için çok çaba harcandığını söylemeye gerek yok. rAV üretimi sırasında RCA oluşumunu engellemeye yönelik stratejiler, vektör ve paketleme hücre hattı arasındaki dizi homolojisini azaltmaya veya ortadan kaldırmaya odaklanmıştır.3,5,7 homolog dizileri paylaşmak, homolog rekombinasyon yoluyla RCA oluşumunu ortadan kaldırır.7 Bu sistemde, PER.C6 hücre çizgisi klonlanmış bir adenovirüs E1 bölgesi ile transfeksiyon yoluyla oluşturulduğundan, homolojinin plazmitten türetilen diziler tarafından da sağlanabileceğini unutmayın. Hehir ve meslektaşları3, minör kapsid proteini IX'u kodlayan genin silinmesinin veya yerinin değiştirilmesinin, RCA oluşum sıklığında önemli bir azalma ile sonuçlandığını gösterdi.

RCA oluşumunu engelleyebilecek başka bir strateji, vektör omurgasından ek temel genleri silmektir. rAV'nin immünojenisitesini azaltmayı amaçlayan bu tür stratejilerin birçoğu geliştirilmiştir. Çoğu durumda, rAV'ler, adenoviral E2 veya E4 bölgesinde ek bir silme ile oluşturulur. Bu rAV'ler, hem E1'i hem de diğer geni tamamlayan hücre hatları üzerinde yayılır. Bu tür rAV'lerin uygun yardımcı hücre hatları üzerinde üretilmesinin, çoklu rekombinasyonlar gerekeceğinden, RCA üretme riskini azaltması veya ortadan kaldırması beklenir. Bununla birlikte, 293 bazlı hücre hatlarının kullanımı ile bağlantılı potansiyel bir problem, adenovirüsün E1 bölgesindeki homolog rekombinasyonun, E1 bölgesini yeniden edinmiş ancak yine de E2 veya E4 genlerinde kusurları olan adenovirüsler üretecek olmasıdır. Böyle bir adenovirüs revertantı, insan hücrelerinde bağımsız olarak replike olamadığı için tam anlamıyla bir RCA değildir. Bununla birlikte, bu tür E1 revertantlarında (REA: revertant E1 adenovirüsleri olarak adlandırılır) E1 bölgesinin varlığı başka bir risk oluşturur: Ad E1 bölgesi, kemirgen hücrelerini ve çok daha düşük sıklıkta da olsa bazı insan hücre tiplerini dönüştürme ve ölümsüzleştirme potansiyeline sahiptir. . E2A veya E4'te silinen E1 içeren adenovirüsler, birincil bebek sıçan böbrek (BRK) hücrelerini dönüştürebilir (Tablo 2). Buna karşılık, E1'de silinen vektörlerin hiçbiri bu tür birincil hücreleri dönüştüremedi (Tablo 2). Ölümcül silmeler taşıyan reklamların aslında hücreleri vahşi tipteki Ad5'ten daha verimli bir şekilde dönüştürdüğü gösterilmiştir. Örneğin, H5ts125, E2A bölgesindeki bir kusur nedeniyle sıcaklığa duyarlı DNA bağlayıcı proteinleri kodlar. Bu adenovirüs mutantı, izin vermeyen sıcaklıkta, izin verilen sıcaklıktan daha yüksek bir dönüşüm frekansı sergiler. Muhtemelen, E2- veya E4-silinmiş Reklamlar, vahşi tip Reklamın aksine, BRK hücreleri için toksik olan diziler içermez. E1 içeren Reklamlar ile enfeksiyon yoluyla elde edilen odakların sayısı, bir Ad5 E1 plazmidi ile transfeksiyon üzerine ortaya çıkan odakların sayısına kıyasla biraz daha düşük olmasına rağmen (Tablo 2), 5 x 107 virüs partikülünün yaklaşık olarak 2 ng DNA, transfeksiyon için 5 μg plazmit DNA kullandık.

REA'ların insanlarda tümörleri indükleyip indükleyemeyeceği bilinmemektedir. Bir yandan, E1A ve E1B proteinlerinin güçlü CTL epitopları içerdiği gerçeği göz önüne alındığında, risk sadece immüno-yetkin bireyler için teorik olabilir. Öte yandan, REA'lar bağışıklığı baskılanmış hastalar için zararlı olabilir. Bu bağlamda, Donahue ve meslektaşları14 rhesus maymunlarında replikasyon yetkin retrovirüsler tarafından indüklenen T hücre lenfomalarının gelişimini bildirene kadar, Moloney murin lösemi virüsünden türetilen retroviral vektörlerin primatlarda nispeten zararsız olarak kabul edildiğini unutmamalıyız.

293 ve 911 gibi geleneksel yardımcı hücre hatlarının ve bunların türevlerinin yeni nesil rAV'lerle birlikte kullanılması, RCA problemini daha karmaşık hale getirmiştir. Bir rAV revertantı, klasik RCA (yani, transgeni kaybetmiş, E1'i yeniden kazanmış ve replikasyon yetkinliği olan) veya REA (yani, E1'i yeniden kazanmış ancak yine de replikasyon-kusurlu) olabilir. İlk olarak, adenovirüs E1 dizilerinin mevcudiyeti için özellikle klinik kullanıma yönelik olanlar olmak üzere rAV lotlarını taramak faydalı olacaktır, çünkü bu RCA'ları olduğu kadar REA'ları da ortaya çıkaracaktır. Daha yeni yardımcı/vektör kombinasyonlarında üretilen geri dönüşleri karakterize etmek de faydalı olacaktır. İkinci olarak, RCA oluşumunu tamamen engelleyen vektör sistemleri kullanılmalıdır.

Şu anda, adenoviral vektörler, gen tedavisi uygulamaları için en etkili vektörlerdir. Adenoviral vektörler bu nedenle belirli uygulamalar için uygun hale getirilmeleri için kapsamlı bir şekilde manipüle edilmektedir. Bu tür gelişmelere, rAV'yi güvenli bir farmasötik ürün yapmak için prosedürlerin paralel gelişimi eşlik etmelidir: viral preparasyonların RCA veya replikasyon kusurlu revertantlarla kontaminasyonunu önleyen bir üretim süreci. Bildiğimiz kadarıyla, klinik deneylerde RCA ile kontamine rAV preparatları ile bugüne kadar herhangi bir kaza yaşanmamış olmasına rağmen, gen terapisi amaçları için Ad vektör sistemini iyileştirmeyi planlıyorsak, terapötik potansiyeli artırmaya odaklanmamız gerektiğini düşünüyoruz. , güvenlik özelliklerinin yanı sıra. Yardımcı hücrelerin ve örtüşmeyen vektörlerin kullanılması bu sorunu ortadan kaldırır ve güvenli, klinik dereceli rAV gruplarının üretilmesine izin verir. Yalnızca uygun test yöntemleriyle paralel olarak geliştirilen güvenli üretim sistemleri, rAV'lerin güvenli klinik uygulamasını garanti edecektir. Bu, yalnızca hasta üzerinde zararlı bir etkisi olmakla kalmayıp aynı zamanda gen tedavisi alanının itibarını da zedeleyebilecek kazaları önlemek için önemli bir ön koşuldur.


ViraPower™ Adenoviral Ekspresyon Sistemi

ViraPower™ Adenoviral Ekspresyon Sisteminin Bileşenleri

ViraPower™ Adenoviral Ekspresyon Sistemi, son derece verimli, laboratuvar ortamında veya bir hedef genin, replikasyon yetersiz bir adenovirüs kullanılarak bölünen ve bölünmeyen memeli hücrelerine in vivo teslimi. Bett ve diğerleri, 1994 tarafından geliştirilen ikinci nesil vektörlere dayanan ViraPower™ Adenoviral Ekspresyon Sistemi, yüksek titreli, rekombinant adenovirüs üretme verimliliğini basitleştirmek ve büyük ölçüde artırmak için Gateway® Teknolojisinden yararlanır.

  • Sistemin ilk ana bileşeni, içine ilgilenilen genin klonlanacağı bir E1 ve E3-silinmiş, pAd-DEST tabanlı ekspresyon vektörüdür. İlgili genin ekspresyonu, insan sitomegalovirüs (CMV) promotörü (pAd/CMV/V5-DEST'te) veya tercih edilen promotör (pAd/PL-DEST'de) tarafından kontrol edilir. Vektör ayrıca ekspresyon yapısının viryonlar halinde paketlenmesine izin vermek için gerekli unsurları da içerir (örneğin 5' ve 3' ITR'ler, enkapsidasyon sinyali, adenoviral geç genler). pAd-DEST ifade vektörleri hakkında daha fazla bilgi için pAd/CMV/V5-DEST ve pAd/PL-DEST Gateway® Vector kılavuzuna bakın.
  • Sistemin ikinci ana bileşeni, replikasyon yetersiz adenovirüsün ilk üretimini, amplifikasyonunu ve titre edilmesini kolaylaştırmak için kullanılacak optimize edilmiş bir 293A Hücre Hattıdır. 293A hücreleri, adenovirüs oluşturmak için gereken trans halinde E1 proteinlerini (E1a ve E1b) sağlayan, kararlı şekilde entegre edilmiş bir E1 kopyası içerir. 293A Hücre Hattı hakkında daha fazla bilgi için 293A Hücre Hattı kılavuzuna bakın.

Adenovirüs Nasıl Çalışır?

Adenovirüs, Coxsackie/Adenovirus Reseptörüne (CAR) bağlanarak hedef hücrelere girer (Bergelson ve diğerleri, 1997). CAR'a bağlandıktan sonra, adenovirüs, integrin aracılı endositoz yoluyla içselleştirilir (Russell, 2000), ardından çekirdeğe aktif taşıma yapılır. Çekirdeğe girdikten sonra, erken olaylar başlatılır (örneğin, E1 proteinlerinin transkripsiyonu ve translasyonu), ardından adenoviral geç genlerin ekspresyonu ve viral replikasyon. Geç genlerin ifadesinin E1'e bağlı olduğuna dikkat edin. ViraPower™ Adenoviral Ekspresyon Sisteminde E1, 293A üretici hücreler tarafından sağlanır. Viral yaşam döngüsü yaklaşık 3 gün sürer. Adenovirüs yaşam döngüsü ve adenovirüs biyolojisi hakkında daha fazla bilgi için yayınlanmış incelemelere bakın (Russell, 2000).

Rekombinant Protein İfadesi

Adenovirüs hedef hücreye aktarıldıktan ve çekirdeğe taşındıktan sonra konakçı genomuna entegre olmaz. Bu nedenle, ilgilendiğiniz rekombinant proteinin ifadesi:

  • Transdüksiyondan sonra tipik olarak 24 saat içinde saptanabilir.
  • Geçicidir ve yalnızca viral genom mevcut olduğu sürece devam edecektir.

Bu kılavuzdaki bazı prosedürlerde viral enfeksiyona ve diğer prosedürlerde viral transdüksiyona atıfta bulunduğumuzu unutmayın. Bu terimler aşağıda tanımlanmıştır.

  • Enfeksiyon: Viral replikasyonun meydana geldiği ve enfeksiyöz viral progeninin üretildiği durumlar için geçerlidir. Yalnızca E1'i kararlı bir şekilde eksprese eden hücre hatları enfekte olabilir.
  • Transdüksiyon: Viral replikasyonun olmadığı ve enfeksiyöz viral progeninin üretilmediği durumlar için geçerlidir. E1 ifade etmeyen memeli hücre çizgileri dönüştürülür. Bu durumda, bir gen dağıtım aracı olarak adenovirüs kullanıyorsunuz.

ViraPower™ Adenoviral Ekspresyon Sistemi, in vivo gen dağıtım uygulamaları için uygundur. Birçok grup, iskelet kası, akciğer, kalp ve beyin dahil olmak üzere çok sayıda dokuda bir hedef geni ifade etmek için adenoviral vektörleri başarıyla kullanmıştır. Adenoviral tabanlı vektörler kullanılarak in vivo olarak başarıyla eksprese edilen hedef genler hakkında daha fazla bilgi için yayınlanmış incelemelere bakın (Russell, 2000 Wang ve Huang, 2000 Wivel, 1999).


2. Gen Terapisi ve Onkolitik Virüsler için Vektör Olarak Adenovirüsler

Adenovirüsler popüler gen taşıyıcı vektörlerdir [43] . Hem bölünen hem de bölünmeyen hücreleri etkili bir şekilde enfekte edebilirler [44]. Çift sarmallı DNA genomları epizomal kalır ve nadiren konakçı genomuyla bütünleşir [45]. Ek olarak, adenovirüsler insanlar için çok yaygın patojenler olmakla birlikte, genellikle üst solunum yolu, karaciğer, idrar yolu, bademcikler, enterik, böbrek ve oküler dokularda sadece hafif semptomlara neden olurlar.

Adenovirüsler, ikosahedral, zarfsız virüslerin bir ailesidir. Seroloji ve genomik dizilere dayalı olarak AdV'ler, her biri birkaç tip/alt tip içeren yedi türe ayrılmıştır [46]. Kapsidleri, her biri konak hücre yüzeyi ile etkileşime katkıda bulunan dört yapısal proteinden (hexon, penton, fiber ve pIX) oluşur. Virüsün tipine bağlı olarak, hedef hücrelere girişi kolaylaştırmak için çeşitli hücre yüzeyi proteinlerine bağlanabilirler [47] [48] [49]. Fiberin topuz bölgesi, Coxsackievirus ve adenovirus reseptörüne (CAR), Vasküler hücre adezyon molekülü-1'e (VCAM), CD80, CD86, MHC1 ve Scavenger reseptörlerine (SR'ler) bağlanabilir [47]. Fiberin gövdesi, pentondaki heparan sülfat proteoglikanlarına (HSPG'ler) [48] ve RGD (Arginin(R)-Glisin(G)-Aspartat(D)) motifine bağlanabilir, integrinlere, CD46'ya ve sialik aside (SA) bağlanabilir. ) [47] . Bazı durumlarda, adenoviral protein etkileşimleri, bir köprü molekülünün aracılık ettiği dolaylı olabilir. Hexon, HSPG'ye bağlanmaya yardımcı olan pıhtılaşma faktörü X'e (FX) [49] bağlanabilir. Farklı serotipler, bu bağlayıcı ortaklar için geniş bir afinite aralığı gösterir. Belirli bir hücre tipindeki en önemli reseptörün belirlenmesinde bazı tutarsızlıklar vardır, ancak çoğu durumda birkaç reseptör önemli roller oynar. Viral proteinler ve konak alıcılar arasındaki etkileşimleri ve afiniteleri anlamak, gelişmiş virüs hedefleme (doğal hedeflere yönelik virüs afinitesini ortadan kaldırma) ve yeniden hedefleme (daha yeni proteinlere veya alanlara yönelik afinite oluşturma) stratejilerinin tasarlanmasına yardımcı olmuştur.

AdV'ler gen tedavisi vektörleri olarak popülerdir ve 100'ün üzerinde klinik araştırmanın konusudur [46]. Bunlar arasında, Ad2 ve Ad5, gen tedavisi için en yaygın olarak kullanılan ve en çok araştırılanlardır. Ancak, kullanımlarında bazı sınırlamalar vardır. (1) Önemli sayıda insan, yaygın adenovirüslere karşı antikorlara sahiptir, bu da geleneksel AdV'lerin sistemik enjeksiyon için kullanılmasını zorlaştırır. Ancak, son yıllarda, bu düşünce süreci değişti ve immün yanıt, AdV aracılı tedaviyi desteklemek için bir şekilde kullanıldı [50]. (2) AdV'ler, sistemik enjeksiyondan sonra karaciğer ve akciğerler gibi organlara hızla sekestre edilir. Yerleşik makrofajlar (örneğin Kupffer hücreleri) bu süreçte önemli bir rol oynar. Aşırı bir durumda, yüksek doz intravasküler enjeksiyon ölümcül bir sitokin fırtınasına neden oldu [51]. Eritrositler ve trombositler de intravenöz uygulama üzerine viral partiküllerin sekestrasyonuna katkıda bulunur [52] [53] [54]. Bu sınırlamalara rağmen, adenovirüs biyolojisinin artan bir şekilde anlaşılması, bu tür sınırlamaların üstesinden gelmek için yeni stratejiler tasarlamaya yol açmıştır ve önemli ilerleme kaydedilmiştir.

AdV'lerin doğal etkileşimlerinden uzaklaştırılması ve hedeflenen bir hücrede belirli bir hedefe yönelik AdV'lerin yeniden hedeflenmesi, kanser için hedefe yönelik bir tedavi geliştirmede çok önemli süreçlerdir. Burada, birkaç seçilmiş örnekle yeni terapötik moleküllerin hedefsizleştirilmesi, yeniden hedeflenmesi ve verilmesini sağlamak için kullanılan çeşitli stratejileri tartışacağız.


Gutless adenovirüs ve bağışıklık tepkisi

Birinci nesil adenoviral vektörlerin sistemik olarak verilmesinin, güçlü bir konakçının bağışıklık tepkisini indüklediği, vektör tarafından dönüştürülmüş hücrelerin hızlı bir şekilde elimine edilmesi ve transgen ürünlerine ve adenovirüs kapsidine karşı nötralize edici antikorların üretilmesine neden olduğu bilinmektedir. Birinci ve ikinci nesil adenoviral vektörler uygulandığında hem spesifik olmayan doğal hem de adaptif immün yanıtlar söz konusudur (bkz. ve diğerleri 33 kapsamlı bir inceleme için). Bu nedenle, doğuştan gelen bağışıklık tepkisi, inflamatuar gen ekspresyonunun indüklenmesi ve makrofajların, nötrofillerin ve doğal öldürücü hücrelerin daha fazla alınmasıyla virüs girişinden sonra hızla geliştirilir ve 24 saat içinde karaciğerden ilk nesil vektörün %80-90'ının çıkarılmasına yol açar. 34 Temel olarak, doğuştan gelen bağışıklık, adenovirüs partikülü tarafından tetiklenir, Ad-doza bağlıdır ve viral gen ekspresyonu gerektirmez. 35, 36, 37

İkinci adımda, doğumdan yaklaşık 4-7 gün sonra adaptif hücresel ve hümoral immün yanıtlar geliştirilir. Bu sırada, lenfositik sızıntılara ve adenovirüse özgü CTL'nin uyarılmasına yol açan sitokin ve kemokin gen ekspresyonu ve iltihabının ikinci bir zirvesi meydana gelir. 35 Başlangıçta, antijen sunan hücreler (APC'ler) adenovirüs partiküllerini aldığında, partikülleri küçük oligopeptitler halinde işlediğinde ve bunları hücre yüzeyindeki ana histo-uyumluluk kompleksi (MHC) sınıf I molekülleri aracılığıyla sunduğunda hücresel bağışıklık tepkisi aktive olur. CD8+ T hücrelerinin MHC sınıf-I/peptid kompleksine daha fazla bağlanması, Ad- veya transgen-ürüne özgü CTL'lerin oluşumunu indükler. bu yüzden yeni Süreci başlatmak için sentez gerekli görünmüyor. 33 Bununla birlikte, geç inflamasyon için, Ad vektörleri içinde kodlanan viral genlerin ekspresyonu önemli bir rol oynar. İmmünokompetan konaklarda bu yanıt, transgen ekspresyonunun süresini sınırlar ve uygulamanın birkaç haftası içinde adenovirüs vektörünün temizlenmesiyle sonuçlanır. 7, 34

Öte yandan, adaptif hümoral immün yanıt, adenovirüs partiküllerinin B hücrelerinin yüzey immünoglobuline bağlanmasıyla başlatılır. 33 İçselleştirme ve virüs işlemeden sonra, adenovirüsten türetilen epitoplar, MHC-II molekülleri tarafından B hücresinin yüzeyinde sunulur. Bu hücrelerin aktive edilmiş CD4+ -Th2 yardımcı hücrelerden sitokinlere maruz kalması, farklılaşmış plazma hücrelerinin adenoviral kapside karşı antikor salgılamasına neden olacaktır. 38 Kapsid proteinlerine karşı, doğal virüse daha önce maruz kalma nedeniyle önceden var olan veya vektör uygulamasının bir sonucu olarak oluşturulan yüksek titreli antikorlar, aynı vektörle sonraki dozlamayı engelleyebilir.

Doğuştan gelen ve adaptif bağışıklık tepkilerini atlatmak için farklı stratejiler geliştirilmiştir. Ancak bunların çoğu ikincil komplikasyonlara sahiptir ve/veya insan hastalarda kullanımları şüphelidir. Bu stratejiler arasında makrofaj tükenmesi, 39, 40 immünosupresif ajanların kullanımı (siklosporin A, siklofosfamid, deksametazon, FK506, Interleukin-12 ve deoksipergualin), 41, 42, 43, 44, 45, 46 CTL'leri tüketmek için antikor kullanımı, 47, 48 APC'ler, T ve B hücreleri arasındaki ortak uyarıcı etkileşimlerin blokajı, 49, 50, 51, 52 adenovirüsün intratimik uygulaması, 53 oral tolerizasyon, 54 çapraz reaksiyona girmeyen serotiplerden türetilen vektörlerin kullanımı, 55, 56 diğer türlerden adenovirüslerin kullanımı 57 , 58 ve polietilen glikol (PEG) gibi asal kimyasallarla kaplama vektörleri. 59, 60, 61

Türlü canlıda farelerde yapılan çalışmalar, bir bağışıklık tepkisinin yokluğunda, birinci nesil adenoviral vektör DNA'nın, konakçı hücrede stabil bir epizom olarak muhafaza edildiğini ileri sürdü. 41, 62, 63 Son nesil yardımcı bağımlı veya gutsuz adenovirüs vektörleri, immünolojik olarak saf hayvanların periferal organlarına uygulandıktan sonra birinci nesil vektörlere kıyasla daha düşük uzun vadeli toksisite ve uzun süreli transgen ekspresyonu sergiler. 56, 64, 65, 66, 67, 68

Kodlayıcı viral genlerin eksikliği, bağırsaksız vektörlerin sistemik verilmesinden sonra adaptif hücresel bağışıklık tepkisinin azalmasından sorumlu olabilir. Başlangıçta, gutless vektörler, viral gen transkripsiyonundan bağımsız olarak dendritik hücreleri dönüştürme ve Ad'a özgü T-hücre yanıtlarını uyarma yeteneğine sahiptir. 69 Bununla birlikte, viral genlerin ekspresyonu, T hücrelerinin efektör fonksiyonlarını karaciğerde sergilemesi için gereklidir, 70 bu, birinci nesil Ad vektörleri ile elde edilen sonuçlara kıyasla gutless vektörlerle transdüksiyonu takiben vektör kalıcılığını ve gelişmiş transgen ekspresyonunu muhtemelen açıklar.

Beklendiği gibi, gutless vektörlerin sistemik teslimi, birinci nesil Ad vektörlerinde olduğu gibi, vektör kapsidine karşı hala uyarlanabilir hümoral yanıtı indükler. Aslında, Ad'a özgü antikorların geliştirilmesi, Ad ile dönüştürülmüş hücrelerin ortadan kaldırılmasına katkıda bulunmaz ve bu nedenle transgen ekspresyonunun kalıcılığını etkilemez. Bununla birlikte, Ad'a özgü antikorlar, yeniden uygulanan Ad vektörünü bağlayacak ve böylece hücre girişini önleyecek ve makrofajlar tarafından opsonizasyonu teşvik edecektir.

Bağırsaksız adenoviral transfer tarafından indüklenen dolaşımdaki antijene karşı hümoral yanıt da geliştirilebilir. 70 APC'lerde transgen ekspresyonuna aracılık eden vektörler, APC'ler tarafından neoantijen sunumu olasılığını artırdıkları için antikor oluşumunu tetikler, 71 ve dolayısıyla dokuya özgü promotörlerin dikkatli seçimi, adenovirüs ile ilişkili toksisite profillerini önemli ölçüde iyileştirebilir ve APC transdüksiyonunu ve transgeni azaltabilir veya ortadan kaldırabilir. ifade. 72 Ek olarak, doğal bir enfeksiyonun bir sonucu olarak veya önceki vektör uygulamasının bir sonucu olarak aynı veya çapraz reaktif serotipe karşı dolaşımdaki nötralize edici antikorların varlığından dolayı, klinik ortamda gutless vektörlerin sistemik uygulaması verimsiz olabilir. İnsan popülasyonunun büyük bir kısmı adenovirüslere karşı önemli düzeyde antikorlara sahiptir 73, bu nedenle önceden var olan bir bağışıklığın üstesinden gelme kapasitesi temel bir sorundur. Alternatif gutless serotiplerin 15 kullanımı ve insan dışı gutless adenovirüs kullanımı gibi önceden var olan bağışıklığı atlatmak için farklı başarılı stratejiler uygulanmıştır. 58 Böylece, bağırsaksız CAV-2 vektörlerinin uygulanması, sıçan merkezi sinir sistemi (CNS) boyunca nöronlarda stabil, yüksek seviyeli ekspresyona izin verir. 20 60 gün içinde birinci nesil vektörlerden ekspresyonu tamamen ortadan kaldıran bir adenovirüs ile aktif bir periferik immünizasyonun varlığında bile, gutless vektörlerin beyinde uzun vadeli bir transgen ekspresyonunu koruyabilmeleri kayda değerdir 74, 75 önceden bağışıklanmış hayvanların beyinlerinde hem yoğunluk hem de süre bakımından azaltılmış iltihaplanma.

Doğuştan gelen bağışıklık tepkileri viral kapsid veya partiküle bağlı olduğundan, bağırsaksız vektörler tarafından uyarılan doğuştan gelen tepkiler, birinci nesil adenovirüs vektörleri tarafından uyarılanlara benzer. Bu nedenle, Brunetti-Pierri ve meslektaşları 76 tarafından insan dışı primatlarda yüksek doz gutless vektörlerin uygulanmasının ardından doza bağlı akut inflamasyon rapor edilmiştir. Bununla birlikte, son zamanlarda bildirilenler gibi doğuştan gelen tepki, muhtemelen Kupffer hücreleri tarafından daha düşük vektör alımı nedeniyle PEG modifikasyonu ile azaltılabilir. canlıda. 77, 78

Şaşırtıcı bir şekilde, gutless vektörlerin, aynı miktarda birinci nesil Ad vektörlerine kıyasla daha uzun ekspresyon süreleri, daha düşük antiviral reaktiviteleri ve dendritik hücrelerde daha yüksek transgen protein seviyeleri nedeniyle aşılamada çok verimli oldukları kanıtlanmıştır. 79


GENLER HEDEF HÜCRELERE NASIL EKLENİR?

Bir hastanın beynindeki yalnızca belirli hücreleri etkileyen genetik bir bozukluğa sahip olduğunu varsayalım. Terapötik genin yalnızca hastalıktan etkilenen hücreleri hedef alması için gen terapisi kullanılarak nasıl tedavi edilebilir? Bir çözüm, bir vektör. Bir vektör, hedef hücreye girmesine izin veren ve vektör tipine bağlı olarak yeni genlerin konak hücre genomuna entegre edilmesine neden olabilen genetik materyal için basitçe bir "taşıyıcı"dır. Vectors must be administered to target specific cell types.

There are three principal ways in which vectors can be administered to carry new genes into target cells. The first is called ex vivosomatic gene therapy, where the target cells are removed from the body, cultured in the laboratory with a vector, and re-inserted into the body. This process is usually carried out using blood cells because they are the easiest to remove and return.

The second option, yerinde somatic gene therapy, occurs when the vector is placed directly into the affected tissue. This process is being developed for the treatment of cystic fibrosis (by direct infusion of the vector into the bronchi of the lungs), to destroy tumours (eg: brain cancer), and for the treatment of muscular dystrophy.

The third option is canlıda somatic gene therapy, where the vector is injected into the bloodstream , and is able to find and insert new genes only into the cells for which it was specifically designed. Although there are presently no canlıda treatments available, a breakthrough in this area will make gene therapy a very attractive option for treatment.In this case the vector designed to treat our hypothetical patient could be injected into a blood vessel in her or his arm and would find its way to the affected brain cells!

Vectors used in gene therapy can be classified as either viral veya non-viral.


The limiting factors of oncolytic virus immunotherapy and the approaches to overcome them

Oncolytic virus (OV) immunotherapy is characterized by viruses which specifically target cancer cells and cause their cytolysis. They provide a unique and promising new tool for the eradication of cancer as they interact with and affect the tumor microenvironment (TME), vasculature, and immune system. Advancements of genetic engineering have allowed for these viruses to be armed in such a way to have enhanced targeting, strong immunomodulation properties, and an ability to modify the TME. However, there are still major limitations in their use, mostly due to difficulties in delivering the viral particles to the tumors and in ensuring that the immunomodulatory properties are able to stimulate the host immune response to mount a complete response. Using novel delivery systems and using OVs as a complementary therapy in a combinatorial treatment have shown some significant successes. In this review, we discuss the major issues and difficulties in using OVs as anti-tumor agents and some of the strategies put in place so far to overcome these limitations.

Anahtar noktaları

• Oncolytic viruses (OVs) infect cancer cells and cause their cytolysis.

• The major limitations in using OVs as anti-tumor therapy were discussed.

• The potential strategies to overcome these limitations were summarized.


Adenoviruses in Oncology

The feasibility of using adenoviruses for gene therapy has been under close scrutiny recently, as it has become clear that significant toxicity can result from the strong immune response created by intravenous administration of large doses of first generation adenovirus vectors. This suggests that other vectors could be more useful for treatment of metabolic and hereditary disease, where widespread transduction is often necessary for effective gene replacement, and the viability of target cells is important. However, promising recent results in human cancer trials have confirmed that adenoviruses can be very useful in oncology. For cancer treatment, the unparalleled transduction efficacy of adenovirus in dividing and dormant cells is a major benefit. As the goal in cancer gene therapy is to kill infected tumour cells, long-term transgene expression is not necessary. In addition, the immune response generated against infected cells could be useful for eradicating uninfected tumour. Importantly, more than 670 cancer patients have been treated with adenovirus intratumorally, intra-arterially, intraperitoneally and intravenously with very manageable adverse effects and no unexpected severe or lethal toxicity. Currently, the most promising approaches are based on replication-competent agents that allow efficient tumour penetration because of their capacity for tissue-specific replication. In addition to transcriptional control, it is becoming clear that targeting is necessary for efficient tumour transduction and less infection of normal tissues. Exciting results are anticipated when the first selectively replicating targeted adenoviruses go to clinical trials. In conclusion, intense gene therapy and virological research have suggested that while other vectors could be more useful for treatment of hereditary disease, adenoviruses are highly promising and safe agents for oncology, as suggested in a number of early phase clinical trials.


Tanıtım

Human adenoviruses as pathogens and therapeutics

Human Adenoviruses (HAdVs) are a family of non-enveloped double-stranded deoxyribonucleic acid (dsDNA) viruses with genomes of about 35 kilobases (kb) [1]. They are causative agents of a wide range of illnesses, such as conjunctivitis, gastroenteritis and respiratory infections [2]. Over 100 types of HAdVs, classified into seven groups (A–G), have been reported to the HAdV Working Group (http://hadvwg.gmu.edu/). Viruses among these groups vary in pathology and molecular characteristics, for instance receptor specificity and host cell tropism [3, 4].

Due to their large genome capacity and the ability to infect different cell types, HAdVs have been extensively studied as gene delivery vectors, and HAdV family members have been used in hundreds of clinical trials in oncology, gene therapy, and vaccinology [5, 6]. A detailed understanding of HAdV host cell attachment and entry mechanisms facilitates the design of vectors with a particular tropism, as well as the rational design of antiviral compounds. Structural biology techniques, in particular, can provide information on the molecular details of virus binding to host cell, and can identify strategies for the disruption of such interactions. So far, structural analyses of HAdV particles and their components have revealed symmetrical and asymmetrical binding modes to HAdV receptors, and these will be reviewed below.

HAdV attachment and entry

The HAdV capsid possesses T = 25 icosahedral symmetry, and consists of three major proteins: the hexon, the penton base and the fibre (see Fig. 1) [2, 7]. Both the fibre and penton base, forming the penton complex at the vertices of the icosahedron, can engage host cell receptors. The fibre can be divided into a C-terminal, globular structure, the “knob”, which protrudes away from the capsid and mediates the initial interaction with attachment receptors, and an N-terminal, elongated “shaft” that anchors the fibre into the viral capsid. Binding of the knob to attachment receptors is followed by the penton base binding to the integrin entry receptor.

A schematic drawing of Human Adenovirus, showing the major capsid proteins that interact with receptors. The fibre knob is in purple, the fibre shaft in yellow, the penton base in orange and the hexon in grey. The minor capsid proteins and non-structural proteins have been omitted for simplicity

The fibre is a homotrimeric structure of between 60–80 kDa per monomer and its globular knob can engage different receptors [8,9,10,11,12]. The monomeric C-terminal fibre knob contains an eight-stranded antiparallel β-sandwich fold, comprised of two β-sheets, with multiple loops. The trimeric propeller-like knob is formed by intertwining β-sheets and has a deep depression at the centre, which thins into narrowing channels, exposing around 65% residues to the solvent [8, 13]. The knob is mounted on the shaft, which consists of repeats of a hydrophobic 15-residue sequence assembled into a trimeric β-spiral [14]. The number of repeats, and hence the length of the shaft, varies between HAdV types. Residues at the very N-terminal region of the fibre knob form a tail that interacts non-covalently with the penton base [15].

Multiple HAdV attachment receptors have been identified: the cell surface proteins Coxsackie and Adenovirus Receptor (CAR) [16, 17], CD46 [10], and desmoglein-2 (DSG-2) [9], as well as the glycans GD1a [11] and polysialic acid [18]. The interactions of all five receptors with HAdV have been established using structural biology techniques and are the focus of this review. Other adenovirus receptors, such as heparan sulphate glycosaminoglycans [4], or factors IX [19] and X [20], have also been described, but we currently lack detailed structural information about their modes of binding to the virus.

Once HAdV has attached to the cell surface, the fibre starts disassociating from the capsid, exposing the penton base [21]. The penton base forms the vertex pentamer (see Fig. 1), which binds to the integrin entry receptor and exploits integrin-mediated signalling to enter the cell by endocytosis. HAdVs have been shown to use multiple types of integrins as their receptors, again highlighting their broad tropism [22].

The penton monomer consists of two domains: a jelly-roll domain proximal to the virion centre, and a distal insertion domain [23]. The latter contains the variable, highly mobile RGD loop, so named because it contains an arginine-glycine-aspartic acid tripeptide sequence motif. The integrin-binding RGD motif mediates binding between the integrin and the penton base, with the exception of group F HAdV-40 and -41, where the interaction is presumed to take place in another manner due to the lack of this motif [24]. The length of the RGD loop varies significantly between strains, ranging from 36 amino acids for HAdV-12 to 99 amino acids for HAdV-5.


TARTIŞMA

Attenuated MV-Edm has potent and selective antineoplastic activity, but the mechanism underlying its oncolytic specificity has not been previously understood (2 , 3) . Here, we demonstrate that the striking difference in CPEs between three tumor cell lines and two primary normal cells is not due to lack of virus infection or a large difference in viral gene expression levels. We therefore focused on CD46 because it is required for virus entry and cell fusion. We hypothesized that there may be a correlation between CD46 receptor density and the strikingly different CPEs observed in MV-Edm-infected tumor cells e karşı nontransformed cells. Mean fluorescence indices reflecting CD46 receptor density on the tumor cells were about 7–10-fold higher compared with the normal cells. This observation is in agreement with the vast literature showing that tumor cells generally express higher levels of complement regulatory proteins (Örneğin., CD46, CD55, and CD59) compared with their normal counterparts (3 , 24) . To define the role of CD46 receptor density in MV-Edm-induced CPEs, we used a panel of CHO cells expressing different levels of CD46 receptors and showed that MV-Edm selectively fuses cells that express a high density of CD46 receptors. Both virus entry and intercellular fusion induced by MV-H and MV-F proteins are dependent on CD46 density. However, syncytium formation is affected much more significantly by the same change in CD46 receptor density. Cell fusion also amplifies the spread of the initial infection event by recruiting neighboring uninfected cells into the syncytium and usurping their host cell machinery for production of viral proteins and virus progeny. Indeed, viral gene expression was at least 5-fold higher in high CD46-expressing clones if syncytia were allowed to form. The syncytia remain viable for some time, producing viral proteins and expanding in size, but they eventually die by apoptosis (4 , 32) . Discrimination between high and low densities of CD46 receptors on target cells provides a novel strategy for tumor selectivity, in addition to the targeting mechanisms used by other oncolytic agents, for example, adenovirus discrimination of p53 status, IFN sensitivity of vesicular stomatitis virus, or exploitation of the ras-activated pathways by reovirus and herpes simplex virus (8 , 33) .

It is well established that CD46 is expressed abundantly on tumor cells, and this has been interpreted as a possible mechanism by which they resist lysis by complement. In particular, CD46 expression levels were found to be considerably higher in malignant ovarian cancer, cervical cancer, breast cancer, endometrial cancer, lung cancer, hepatoma, and leukemia than in corresponding normal tissues (3 , 24) . However, CD46 has not been previously exploited as a cancer target. In 2001, Durrant and Spendlove (25) proposed using cancer vaccines to target CD46 and other membrane regulatory proteins overexpressed on tumor cells. They reasoned that the remaining CD46-dim tumor cells would be more highly susceptible to complement-mediated lysis and therefore easy to eliminate with monoclonal antibody therapy. Anti-idiotypic vaccination or bispecific antibodies that recognize both tumor antigens and CD55 or CD59 have been tested for cancer therapy, although none that recognize CD46 have yet been tested (24 , 25 , 34) . However, whatever the therapeutic agent may be, it must be able to discriminate the relative receptor density on tumor cells and normal cells and induce potent damage to the tumor cells (25) . Our study shows that MV-Edm efficiently discriminates between cells with higher and lower surface densities of CD46 and therefore qualifies as an appropriate agent to target CD46 on tumor cells. There remains a possibility that CD46 expression among the tumor cells may be heterogenous due to loss or down-modulation of the receptor on a minority of tumor cell surfaces. However, down-modulation of CD46 can potentially make these cells more susceptible to complement lysis and the effects of monoclonal antibody therapy.

CD46 is used as a receptor by other biological agents besides MV such as Streptococcus pyogenes (35) , Neisseria gonore, ve Neisseria menenjitleri (36) , human herpesvirus 6 (37) , and group B adenoviruses (31 , 38) . With the exception of the group B adenoviruses (39) , the oncolytic potential (if any) of these pathogens has not yet been tested. Adenoviruses based on the type 5 (Ad5) serotype (group C) have shown promising oncolytic activity and are being tested in the clinic for antitumor efficacy (40) . These group C adenoviruses do not use CD46 but interact with the coxsackie adenovirus receptor for attachment and entry into host cells. Coxsackie adenovirus receptor is often down-regulated and expressed at very low levels on tumor cells, and various strategies are therefore currently under investigation to enhance Ad5 infection of tumor cells by redirecting virus entry through cancer-associated receptors such as integrins and epidermal growth factor receptor (41 , 42) . In contrast to coxsackie adenovirus receptor, CD46 is frequently expressed at high levels on human tumor cells, and pseudotyping the Ad5 capsid with fibers from group B adenoviruses (Örneğin., with Ad35) can redirect virus entry through CD46 and enhance infectivity of the chimeric virus on tumor cells. Indeed, we found that Ad5/35 infectivity on the panel of CHO-CD46 cells increased progressively with CD46 receptor density. However, in contrast to Ad35, which exploits CD46 for entry only, MV-Edm uses CD46 to mediate both entry and cell-to-cell fusion, leading to destruction of the MV-H/F-expressing cells if they express high levels of CD46 receptors. This unique relationship between the CPE of cell-to-cell fusion (which greatly enhances bystander killing of the infected cells) and CD46 expression levels makes MV-Edm or the fusogenic MV-H/F proteins appealing for use in cytoreductive cancer therapy.

There are likely to be additional factors contributing to the tumor specificity of attenuated MV besides differences in CD46 receptor density between tumor cells and normal cells (for example, intrinsic fusogenicity). This difference in membrane fusogenicity would mean that different levels of CD46 would be required to trigger efficient fusion in different cell types. In our model, the CHO clones have similar fusogenicity, and the only difference was the density of CD46 receptors. The “threshold” receptor density required for extensive fusion will not necessarily be at the same level for human cells. Clearly, additional studies are needed to investigate a wider panel of human cells, preferably derived from primary sources, to precisely evaluate the range of CD46 expression levels. The primary innate response of a virally infected cell serves to inhibit viral protein synthesis and is coordinated through IFN-α/β, double-stranded RNA-dependent protein kinase, 2′,5′-oligoadenylate synthetase, and the Mx proteins (9, 10, 11) . The IFN-α/β or RNA-dependent protein kinase response pathways are often impaired in tumor cells, but not in normal cells, and this is the mechanism underlying the tumor selectivity of a number of RNA viruses currently being tested for cancer therapy, for example, vesicular stomatitis virus (43 , 44) , reovirus (45 , 46) , and certain herpes simplex virus mutants (47 , 48) . If these antiviral mechanisms are induced by MV-Edm infection, they will serve to amplify the difference in selectivity conferred by the role of CD46 density in regulating CPEs. However, MV-Edm encodes V and C viral proteins that can respond to the host defense by antagonizing IFN-α/β production and signaling (11, 12, 13, 14, 15) . We also determined that viral protein synthesis in infected normal cells was only 2–4-fold lower compared with infected tumor cells, and the striking difference in CPEs cannot therefore be explained by a preferential shutdown of viral protein synthesis in these normal cells as part of their antiviral response.

In conclusion, we have shown that high CD46 receptor density on tumor cells is a key determinant of the oncolytic specificity of attenuated MV. Whereas virus entry increases progressively with CD46 density, there is a threshold number of CD46 receptors required for cell-to-cell fusion, which leads to death of all of the cells incorporated into synyctia. This study establishes attenuated MV-Edm as a targeted oncolytic agent that can discriminate between high CD46 receptor densities typical of tumor cells and low CD46 receptor densities typical of nontransformed cells.