Bilgi

8.5: Klonlama DNA - Plazmit Vektörleri - Biyoloji

8.5: Klonlama DNA - Plazmit Vektörleri - Biyoloji


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Plazmitler Bazı Bakterilerde Doğal Olarak Mevcuttur

Birçok bakteri ekstra kromozomal DNA elementleri içerir. plazmitler. Bunlar genellikle küçük (birkaç 1000 bp), dairesel, çift sarmallı moleküllerdir ve kromozomdan bağımsız olarak çoğalırlar ve bir hücre içinde yüksek kopya sayılarında bulunabilirler. Vahşi doğada, plazmitler bakteriyel çiftleşme sırasında bireyler arasında aktarılabilir ve hatta bazen farklı türler arasında aktarılır. Plazmitler tıpta özellikle önemlidir çünkü genellikle patojenite ve ilaca direnç genleri taşırlar. Laboratuarda plazmitler, transformasyon adı verilen bir işlemle bakterilere eklenebilir.

Plazmitleri Klonlama Vektörleri Olarak Kullanma

Bir plazmite bir DNA parçası eklemek için, hem parça hem de dairesel plazmit, uyumlu uçlar üreten bir kısıtlama enzimi kullanılarak kesilir (Şekil (PageIndex{1})). Halihazırda mevcut olan çok sayıda kısıtlama enzimi göz önüne alındığında, özellikle moleküler biyolojide kullanılan çoğu plazmit vektörü tasarlandığından, hem plazmid hem de DNA fragmanında karşılık gelen tanıma dizilerinin mevcut olduğu bir enzim bulmak genellikle çok zor değildir. çok sayıda kısıtlama endonükleazı için tanıma bölgeleri içermek.

Kısıtlama sindiriminden sonra, arzu edilen parçalar, onları birleştirmek için ligaz ile karıştırılmadan önce daha fazla saflaştırılabilir veya seçilebilir. Kısa bir inkübasyonun ardından, ilgilenilen geni içeren yeni bağlanmış plazmitler dönüştürülmüş içine E. koli. Dönüşüm, bağlanmış DNA ile karıştırılarak gerçekleştirilir. E. koli özel olarak hazırlanmış hücreler (yani yetkili) DNA'yı almak için. Yetkin hücreler, CaCl gibi bileşiklere maruz bırakılarak yapılabilir.2 veya elektrik alanlarına (elektroporasyon). DNA ile karıştırılan hücrelerin yalnızca küçük bir kısmı gerçekten dönüştürüleceğinden, bir seçilebilir işaretleyiciAntibiyotik direnci için bir gen gibi, genellikle plazmitte de bulunur. Dönüşümden sonra (DNA'yı yetkin hücrelerle birleştirerek), bakteriler uygun bir antibiyotik içeren bir bakteri agar plakasına yayılır, böylece sadece plazmidi fiilen dahil eden hücreler büyüyüp koloniler oluşturabilecektir. Bu daha sonra seçilebilir ve daha fazla çalışma için kullanılabilir.

Moleküler biyologlar plazmitleri şu şekilde kullanırlar: vektörler klonlanmış DNA'da bulunan ilgili genleri içerme, büyütme, aktarma ve bazen ifade etme. Genellikle moleküler biyoloji deneyindeki ilk adım, klon (yani, bir geni bir plazmide kopyalayın), ardından bu rekombinant plazmidi tekrar bakterilere dönüştürün, böylece bakteri çoğaldıkça genin (ve onu taşıyan plazmitin) esasen sınırsız kopyaları yapılabilir. Bu, DNA'nın daha fazla manipülasyonu için pratik bir gerekliliktir, çünkü moleküler biyolojinin çoğu tekniği aynı anda sadece tek bir molekülle çalışacak kadar hassas değildir. Bu nedenle birçok moleküler klonlama ve rekombinasyon deneyi, aşağıdakileri içeren yinelemeli işlemlerdir:

  1. bir DNA fragmanı (genellikle PCR ve/veya kısıtlama sindirimi ile izole edilir), uyumlu bir kısıtlama enzimi ile kesilmiş bir plazmit içine klonlanır
  2. rekombinant plazmit bakterilere dönüştürülür
  3. bakterilerin genellikle sıvı kültürde çoğalmasına izin verilir
  4. bakteri kültüründen büyük miktarda rekombinant plazmit DNA izole edilir
  5. başka manipülasyonlar (bölgeye yönelik mutajenez veya başka bir DNA parçasının eklenmesi gibi) rekombinant plazmit üzerinde gerçekleştirilir
  6. modifiye edilmiş plazmit, başka manipülasyonlardan önce veya ekspresyon için tekrar bakterilere dönüştürülür.

Moleküler Klonlamanın Bir Uygulaması: Rekombinant İnsülin Üretimi

Saflaştırılmış insülin proteini diyabet tedavisi için kritik öneme sahiptir. 1980'den önce, klinik kullanım için insülin, insan kadavralarından veya domuzlar gibi kesilmiş hayvanlardan izole edildi. İnsan kaynaklı insülin genellikle daha iyi farmakolojik özelliklere sahipti, ancak sınırlı tedarikteydi ve hastalık bulaşma riskleri taşıyordu. İnsan insülin genini klonlayarak ve onu ifade ederek E. koliFermentörlerde insan hormonuna özdeş büyük miktarlarda insülin güvenli ve verimli bir şekilde üretilebilir. Rekombinant insülin üretimi ayrıca proteinin özel varyantlarının üretilmesine de izin verir: örneğin, birkaç amino asit değiştirilerek hormonun daha uzun etkili formları yapılabilir. Aktif insülin hormonu, sırasıyla 21 ve 30 amino asitlik iki peptit parçası içerir. Bugün, esasen tüm insülin, rekombinant kaynaklardan (Şekil (PageIndex{2})), yani bakteri veya mayada ifade edilen insan genleri ve türevlerinden üretilmektedir.


DNA Hizmeti: Dereceli DNA'yı Klonlama

Addgene, koleksiyonumuzda 200'den fazla plazmit için Klonlama Dereceli DNA (cgDNA) sunmaktadır. Bu formatta mevcut olan plazmitler, yüksek klonlama potansiyeline sahip çeşitli popüler plazmitleri ve omurgaları içerir. Bu plazmitleri cgDNA olarak kullanıma sunarak, plazmitlerinin Addgene'den gelmesi üzerine hemen klonlamaya başlamak isteyen bilim insanlarına yardımcı olmayı umuyoruz - bakteri bıçaklarında plazmitler alındığında gerekli olan amplifikasyon ve ekstraksiyon adımlarını kaldırarak deneylere ayrılan süreyi azaltın.

Klonlama Dereceli DNA, bir Addgene Beta hizmetidir. Addgene'nin Beta Projeleri ve bu hizmet hakkında bize nasıl girdi ve geri bildirim sağlayabileceğiniz hakkında daha fazla bilgi edinin.


Moleküler Klonlama ve Rekombinant DNA Teknolojisi

Vektör Türleri

Klonlama vektörleri bakterilerde çoğaltılacak ve çoğaltılacak DNA eki için bir omurga sağlar, ancak bu vektörler yalnızca bir genetik diziyi depolamak için faydalıdır. Kendi başlarına, genin fonksiyonel bir protein ürününe transkripsiyonuna ve translasyonuna izin veremezler.

Bir genin bir protein ürününü meydana getirmesi için, ifade vektörü bir konakçı hücrenin geni kopyalaması ve tercüme etmesi için gerekli elementleri içeren kullanılmalıdır. Bir memeli hücresi durumunda, standart bir memeli ekspresyon vektörü, yukarıda tarif edildiği gibi bir replikasyon orijini, MCS ve seçilebilir markör içerecektir. Bununla birlikte, ekspresyon vektörü, memeli hücrelerinde bulunan ve genin ekspresyonunu yönlendirebilen bir promotöre de ihtiyaç duyacaktır. Kodlayan DNA'nın kopyalanması ve çevrilmesi için normalde kopyalanan ön mRNA'nın sonunda görünen poliadenilasyon kuyruğu ve çeviri için ribozomu çeken bir dizi gibi başka özelliklere ihtiyacı vardır.


Klonlama Vektörleri: Türler #038 Karakteristikler

Bir vektör, eksojen DNA'yı konakçı hücreye taşımak için kullanılan bir DNA molekülüdür. Bir vektör, konak hücre içinde kendi kendini kopyalama ve kararlı entegrasyon yeteneğine sahiptir.

DNA'nın moleküler analizi ancak vektörlerin keşfinden sonra mümkün olmuştur. Tüm moleküler klonlama süreci aşağıdaki adımları içerir:

  1. Hedef segmentin DNA fragmanlarının ve vektör DNA'nın restriksiyon enzimleri yardımıyla sindirilmesi,
  2. DNA ligazları yardımıyla hedef segmentin vektör DNA ile ligasyonu ve
  3. Yayılma için konak hücreye bağlanan segmentin tanıtılması.

Bir vektörün genel özellikleri:

  • Vektörün konak organizma içinde otonom replikasyon yapabilmesi için ori olarak bilinen bir Replikasyon Kökeni olmalıdır.
  • DNA molekülünün yerleştirilmesi için uyumlu bir kısıtlama bölgesine sahip olmalıdır.
  • Bir vektör, rekombinant organizmayı taramak için her zaman seçilebilir bir işaretçiye sahip olmalıdır. Bu seçilebilir işaret, bir antibiyotik direnç geni olabilir.
  • Ana makineye kolay dahil edilmesi için, bir vektörün kendisi küçük olmalı ve büyük boyutlu kesici ucu entegre edebilmelidir.

KLONLAMA VEKTÖR

Bir klonlama vektörü, aynı zamanda, konakçı organizma içinde kendi kendini kopyalayabilen ve stabil bakım yapabilen bir DNA parçasıdır. Bir virüsten, plazmitten veya daha yüksek bir organizmanın hücrelerinden ekstrakte edilebilir. Klonlama vektörlerinin çoğu genetik olarak tasarlanmıştır. Klonlanacak DNA segmentinin boyutuna ve türüne göre seçilir.

Klonlama vektörleri aşağıdaki genel özelliklere sahip olmalıdır:

  • Boyut olarak küçük olmalıdır.
  • Bir replikasyon kaynağına sahip olmalıdır.
  • Ayrıca konakçı organizma ile uyumlu olmalıdır.
  • Bir kısıtlama sitesine sahip olmalıdır.
  • Donör fragmanının eklenmesi, klonlama vektörünün kendi kendini kopyalama özelliğine müdahale etmemelidir.
  • Seçilebilir bir işaretleyici, muhtemelen bir antibiyotik direnç geni, rekombinant hücreleri taramak için mevcut olmalıdır.
  • Ökaryotik sistemin yanı sıra prokaryotik sistem altında da çalışabilmelidir.
  • Çoklu klonlama siteleri mevcut olmalıdır.

Vektörleri Klonlamanın Önemi

Klonlama Vektörleri, yabancı genetik materyalin başka bir hücreye taşınması için araç olarak kullanılır. DNA'nın bu yabancı parçası, konakçı organizmanın mekanizması kullanılarak çoğaltılır ve ifade edilir.

Bir klonlama vektörü, tek bir kopya DNA molekülünün birçok kopyaya amplifikasyonunu kolaylaştırır. Moleküler gen klonlaması, klonlama vektörleri kullanılmadan zordur.

Vektörlerin Klonlanmasının Tarihçesi

Herbert Boyer, Keiichi Itakura ve Arthur Riggs, Boyer'in California Üniversitesi'ndeki laboratuvarında çalışan ve genel bir klonlama vektörünü tanıdıkları üç bilim adamıydı. Bu klonlama vektörü, yabancı DNA'yı klonlamak için kısıtlama bölgelerine ve ayrıca rekombinant/dönüştürülmüş hücrelerin taranması için antibiyotik direnç genlerinin ekspresyonuna sahipti. Klonlama amacıyla kullanılan ilk vektör, bir plazmit olan pBR322 idi. Boyut olarak küçüktü, yaklaşık 4 kB ve seçilebilir iki işaretçisi vardı.

Klonlama Vektörlerinin Özellikleri

1. Replikasyonun Kökeni (ori)

  • Replikasyonun başladığı belirli bir nükleotid dizisi/dizisi.
  • Konak hücre içinde otonom replikasyon için.
  • Ori'ye bağlı yabancı DNA da çoğalmaya başlar.

2. Klonlama Sitesi

  • Genetik mühendisliği için giriş veya analiz noktası.
  • Bu bölgedeki vektör DNA sindirilir ve yabancı DNA, kısıtlama enzimleri yardımıyla eklenir.
  • Son çalışmalar, 20'ye kadar kısıtlama bölgesi barındıran çoklu klonlama bölgelerine (MCS) sahip plazmitleri keşfetti.

3. Seçilebilir İşaretleyici

  • Normal koşullar altında konakçı organizma için ölümcül olan belirli antibiyotiklere veya seçici ajana direnç kazandıran gen.
  • Konakçı hücreye, belirli antibiyotikleri içeren kültür ortamında hayatta kalma ve çoğalma özelliği verir.

4. İşaretleyici veya Raporlayıcı Gen

  • Başarılı klonların veya rekombinant hücrelerin taranmasına izin verir.
  • Mavi-beyaz seleksiyonda yaygın olarak kullanılır.

5. Konjugasyon Yoluyla Aktarılamama

  • Vektörler, rekombinant DNA'nın bakteri hücrelerinin doğal popülasyonuna kaçmasına izin vermemelidir.

Klonlama Vektörlerinin Türleri

E. Bakteriyel Yapay Kromozom (BAC)

F. Maya Yapay Kromozomu (YAC)

G. İnsan Yapay Kromozomu (HAC)

A. Plazmitler

  • Plazmitler, gen klonlamada kullanılan ilk vektörlerdi.
  • Doğal olarak meydana gelirler ve ekstra kromozomal çift sarmallı dairesel DNA moleküllerini otonom olarak kopyalarlar. Bununla birlikte, tüm plazmitler dairesel orijinli değildir.

  • Bakterilerde, arkelerde ve ökaryotlarda bulunurlar.
  • Plazmitlerin boyutu 1.0 kb ila 250 kb arasında değişmektedir.
  • 10 kb'ye kadar DNA eki, plazmitlerde klonlanabilir.
  • Plazmitler, sonraki deneyler için daha fazla rekombinant plazmit veriminin üretilmesi için faydalı olan yüksek kopya sayısına sahiptir.
  • Düşük kopya numaralı plazmitler, klonlanmış genin hücreler için toksik olan proteini üretmesi gibi belirli koşullar altında kullanılır.
  • Plazmitler sadece kendi replikasyonları için gerekli olan proteinleri kodlar. Bu protein kodlayan genler, ori'nin yakınında bulunur.

Örnekler: pBR322, pUC18, F plazmiti, Col plazmiti.

Plazmid klonlama vektörünün isimlendirilmesi: pBR322 klonlama vektörü aşağıdaki unsurlara sahiptir:


Vektör klonlama

Özel vektör klonlama iş akışımız tipik olarak üç bölümden oluşur: müşteri tarafından sağlanan malzemelerin QC'si (varsa), gerekli vektör bileşenlerinin tedarik edilmesi (varsa) ve gerçek vektör klonlama adımı. Fiyat ve geri dönüş dökümüne kısa bir genel bakış, aşağıdaki Tablo 1'de gösterilmektedir:

Tablo 1. Özel klonlama için fiyat ve geri dönüşe genel bakış.

a. shRNA, gRNA ve kısa parça ifadesi için (örneğin, geliştirici, destekleyici): 99 dolardan başlayan fiyatlarla

B. Protein ifadesi için: 159 dolardan başlayan fiyatlarla

* VectorBuilder'ın standart omurgalarından ve bileşenlerinden oluşturulan vektörler, aşağıdaki Tablo 2'ye göre sabit fiyat ve geri dönüşe sahiptir.

** Klonlama geri dönüşü, üretimin başlamasından tamamlanmasına kadar geçen süreyi ifade eder. Müşteri tarafından sağlanan malzemelerin nakliye süresini ve kalite kontrol süresini ve müşteriye nihai teslimatın nakliyesi için nakliye süresini içermez.

Tablo 2. Basit vektör klonlama için fiyat ve geri dönüş.

vektör türü Fiyat Arkanı dön
shRNA vektörü $99 7-12 gün
gRNA vektörü (tek-gRNA) $99 6-11 gün
gRNA vektörü (çift-gRNA) $299 10-17 gün
ifade vektörü $159 7-13 gün

Tablo 3. De novo gen sentezi için fiyat ve geri dönüş.

parça uzunluğu Fiyat (USD)* Arkanı dön
<1.5 kb .12/bp 6-10 gün
1.5-3 kb .14/bp 10-14 gün
3-5 kb .16/bp 10-16 gün
5-7 kb .18/bp 16-20 gün

*De novo gen sentez ücreti, 1) fragman, yüksek GC içeriği, basit tekrarlar veya segmental tekrarlar gibi sentezlenmesi zor bölgeler içerdiğinde 2) üçten az DNA fragmanı sentezlendiğinde daha yüksek olabilir.

Teslimat

Varsayılan teslim edilebilir format E. coli gliserol stokudur. Talep üzerine, varsa ek ücret ödemeden küçük miktarlarda plazmit DNA sağlanabilir. Ek olarak yüksek kaliteli plazmit DNA'nın çoklu ölçekleri satın alınabilir: Miniprep (> 10 ug), Midiprep (>100 ug), Maxiprep (> 300 ug), Megaprep (>1 mg) ve Gigaprep (>10 mg). Viral vektörler için, çeşitli ölçeklerde sunulan virüs paketleme, bir alt hizmet olarak mevcuttur.

Kalite kontrol

VectorBuilder tarafından klonlanan tüm vektörler %100 dizi garantisi ile gelir. Vektörlerimiz, tam olarak tasarlandığı gibi doğru diziyi içerdiklerinden emin olmak için sıkı kalite kontrolünden geçer. Ortak QC, DNA ölçümü, A260/280 ölçümü, sindirilmemiş ve kısıtlama enzimi ile sindirilmiş plazmit DNA'nın elektroforezi, Sanger dizilimi, gliserol stoklarından bakteri kurtarma ve yeniden dönüşümü içerir.

Müşteriler tarafından sağlanan malzemeler

Omurgalar veya gen şablonları gibi müşteri tarafından sağlanan materyallere ihtiyaç duyulursa, lütfen materyal bilgilerinizi "Destek" > "Materyal Gönderme Formu"na gönderin. Malzemelerin herhangi bir gecikmesini veya hasar görmesini önlemek için lütfen sevkiyatı ayarlamak için yönergelerimize kesinlikle uyun. Müşteri tarafından sağlanan tüm malzemeler, öğenin türüne ve kullanımına bağlı olarak öğe başına 120 dolardan başlayan ek bir KK ücretine tabi olabilecek VectorBuilder tarafından zorunlu KK'ye tabi tutulur. Müşteri tarafından sağlanan malzemeler QC'yi geçene kadar üretimin başlatılamayacağını lütfen unutmayın.

Nasıl Sipariş Verilir

VectorBuilder'da, müşteri ihtiyaçlarına göre özel vektörler oluşturmak için çeşitli moleküler biyoloji tekniklerinin bir kombinasyonu kullanılır. İfade vektörleri tipik olarak Ağ Geçidi klonlama veya Gibson birleştirme kullanılarak oluşturulurken, shRNA ve gRNA vektörleri, yüksek düzeyde optimize edilmiş yüksek verimli klonlama platformumuzu kullanarak istediğiniz vektörleri en düşük fiyatlarla ve en hızlı geri dönüş sürelerinde sağlamak için ligasyon tabanlı bir yaklaşım kullanılarak klonlanır. Ek olarak, proje bazında de novo gen sentezi ve gerektiğinde Golden Gate klonlaması dahil olmak üzere çeşitli diğer yöntemleri rutin olarak kullanıyoruz.

VectorBuilder'daki tüm vektörler, yüksek transformasyon verimliliği (>1x109 cfu/ug) elde etmek ve tekrarlanan diziler gibi kararsız elementlerle DNA plazmitlerini çoğaltmak için tasarlanmış tescilli konakçı soyumuz VB UltraStable &trade kullanılarak klonlanır. Bu nedenle, VectorBuilder'dan elde edilen plazmitlerinizi çoğaltmak için VB UltraStable &trade kimyasal olarak yetkin hücreler kullanmanızı şiddetle tavsiye ederiz. Ancak vektörlerimiz, DH5&alpha ve Stbl3 gibi yaygın olarak kullanılan diğer bakteriyel konakçı suşları ile uyumludur ve bunlarda çoğaltılabilir.

Plazmidinizdeki replikasyonun kaynağı, düşük kopyalı replikasyon içindir

Bakteri hücresi başına plazmit kopyalarının sayısı, plazmit üzerindeki replikasyonun kaynağına göre belirlenir. Bazı kökenlerin doğal olarak düşük kopya sayısı vardır. Plazmidinizdeki replikasyon kaynağının kopya numarasını kontrol edin. Düşük kopyalı plazmitler için, tatmin edici DNA verimi elde etmek için plazmit DNA hazırlığı için E. coli kültürü miktarını artırın.

Plazmit hazırlama kolonu için bakteri kültürü hacmi çok düşük

Lütfen plazmit hazırlama kolonunuzun bağlama kapasitesini ve plazmitinizin yüksek kopyalı veya düşük kopyalı plazmit olup olmadığını kontrol edin. Mini hazırlıklar için gece boyunca 1-5 ml bakteri kültürü toplamanızı öneririz. Maksi prepler için, plazmit yüksek kopyalı plazmit ise, plazmit düşük kopyalı plazmit ise 100-150 ml gecelik bakteri kültürü kullanmanızı öneririz, 300-500 ml gecelik bakteri kültürü kullanmanızı öneririz. Tipik olarak, yüksek kopyalı plazmit için,

Mini hazırlıkta her 1 ml kültürden 5 ug plazmit DNA ekstrakte edilebilir ve

Düşük kopyalı plazmit (örn. pET) için 150 ml kültürden 500 ug plazmit DNA elde edilebilir, mini hazırlıkta her 1 ml kültürden 1.5-2.5 ug plazmit DNA ve 150-200 ug plazmit DNA toplanabilir 150 ml kültürden elde edilebilir.

Sıvı kültürdeki bakterilerin sadece bir kısmı plazmit içerir.

Bazı antibiyotikler, özellikle ampisilin, sıvı kültürde hızla bozunur. Sonuç olarak, plazmit içermeyen bakteriler, kültürün önemli bir kısmına yayılabilir ve bu da plazmit hazırlığının zayıf verimine neden olur. Bunu önlemek için lütfen kullanmadan önce ampisilin içeren büyüme ortamını taze olarak hazırlayın ve yeterli ampisilin sağlandığından emin olun. Ayrıca, ampisiline dirençli bakterileri kültürlerken, hasattan önce sıvı kültürün çok uzun süre doymasına izin vermeyin. Kültürde yetersiz antibiyotiklerin yanı sıra, çok eski kültürden plazmit DNA ekstraksiyonu da düşük verimle sonuçlanabilir, çünkü birçok bakteri hücresi ölür ve içerdikleri plazmit DNA'sı bozulur. Bu nedenle, taze kültürden plazmid DNA'yı çıkarmaya çalışın. Plazmit hazırlığı hemen yapılamıyorsa, bakterileri döndürebilir ve peleti daha sonra plazmit hazırlığı için -80°C'lik dondurucuda saklayabilirsiniz.

Sıvı kültür, doğrudan E. coli bıçak kültüründen aşılanır.

VectorBuilder'dan aldığınız E. coli sıvı stokundan veya bıçak kültüründen bir sıvı kültürün doğrudan inokülasyonu çok nadiren düşük verimle sonuçlanabilir. Stoku önce uygun antibiyotiği içeren bir LB agar plakasına sürmeyi ve ardından bu plakadan büyüyen taze bir koloni ile sıvı bir kültürü inoküle etmenizi öneririz. Ayrıntılı kullanıcı talimatları, Öğrenim Merkezi > Dokümantasyon > Stab Culture menü öğesine giderek bulunabilir.

Plazmid hazırlık kitinin kılavuzunu dikkatli bir şekilde takip etmediniz.

Plazmid hazırlık kiti kullanıyorsanız, lütfen kullanmadan önce kılavuzu dikkatlice okuyun. Uygun olmayan işlemler genellikle kitin düşük performans göstermesine neden olabilir.

Mini/maksi hazırlık sütunu düşük kaliteli

Plazmid DNA hazırlama kolonlarının bazı markaları, DNA hazırlığı için yetersiz veya tutarsız performans gösterir.


Biyologlar yeni klonlama yöntemi geliştiriyor

Yeni klonlama yönteminde önemli adımlar. Kredi bilgileri: David Oliver Richter

Bir organizmanın genetik bilgisini içeren DNA, uzun nükleotid zincirlerinden oluşur. Bu yapı taşlarının dizilişine dayalı fonksiyonları incelemek için, DNA moleküllerinin çoğalacak taşıyıcı moleküllere (plazmit-vektörler) yerleştirilmesi gerekir. Bu klonlama işlemi için, Bayreuth Üniversitesi'nden bir araştırma ekibi, biyoloji, biyokimya ve biyoteknolojinin tüm alanlarında kullanılabilecek kadar çok yönlü, yüksek verimli, hızlı ve ucuz bir yöntem geliştirdi. Yöntemin önemli bir özelliği, bakteri kolonilerinin zahmetli bir şekilde taranmasını gereksiz hale getirmesidir. Bilim adamları yeniliklerini dergide sundu Bilimsel Raporlar.

Moleküler klonlama terimi altında toplanan tüm yöntemlerin ortak noktası, ilgili DNA fragmanlarının önce daha büyük taşıyıcı moleküllere, plazmit vektörlerine dahil edilmesidir. Bakteriler daha sonra DNA parçalarını taşıyan bu vektörleri almak için yapılır.

Bakteriler çoğalıp bakteri kolonileri oluşturdukça, DNA parçaları binlerce kez çoğalır. Ancak şimdiye kadar, bu yöntemlerin önemli bir dezavantajı vardı: DNA fragmanlarının taşıyıcı moleküle eklenmesi her zaman gerektiği kadar düzgün ve kusursuz ilerlemediği için, kolonilerin yalnızca bazıları, ama hiçbir şekilde hepsi değil, vektörlere sahip olur. kopyalanacak DNA parçaları ile. Bu "başarı öykülerini" belirlemek için zaman alıcı ve pahalı taramalar şimdiye kadar kaçınılmazdı.

Prof. Dr. Stefan Schuster liderliğindeki Bayreuth araştırmacıları artık bu taramayı gereksiz kılmayı başardılar. Kullandıkları vektör, toksik bir gen içeren bir plazmittir. DNA parçaları daha sonra bu genin yerini alacak şekilde plazmide dahil edilir. Bu başarılı olmazsa, plazmit toksik potansiyelini korur. Ve eğer bu plazmit bir E. coli bakterisi tarafından alınırsa, toksik etkisi başlar: Bakterinin hücre bölünmesine ve dolayısıyla koloniler oluşturma yeteneğine müdahale eder.

Bu şekilde, yalnızca aslında DNA parçalarını içeren E. coli bakterilerinin koloni oluşturacağı baştan garanti edilebilir. Daha sonra özenle seçilmeleri gerekmeyecek. "Yeni klonlama sistemimizin bu kadar verimli olmasının nedeni, klonlanmış DNA ile donatılmış bakterilerin seçiminin güvenilir bir şekilde ve tek başına gerçekleşmesidir. Çoğaltılmış plazmitler daha sonra bu bakterilerden izole edilebilir ve klonlanmış DNA'nın işlevini analiz etmek için kullanılabilir. veya duruma göre, proteinlerin biyoteknolojik üretiminde kullanılıyor" diyor Bayreuth biyoloğu Dr. David Richter, çalışmanın baş yazarı.

Ayrıca, sunulan yöntem Bilimsel Raporlar klonlama prosedürünü başka bir açıdan basitleştirir: Bilim adamları ayrıca, birkaç DNA parçasını bir araya getirmek için bir "yapıştırıcı" olarak özellikle uygun hale getirmek için E. coli-bakteri hücrelerinden türetilen bir özü (SLiCE) optimize ettiler. Sonuç olarak, artık her türlü DNA fragmanı kombinasyonunu plazmide eklemek mümkün ve bu, önceki yöntemlerden çok daha hızlı.

Bayreuth araştırma ekibi, çalışmalarında iki belirleyici faktör için bilimsel terimlerden türetilen kısaltmayı yeni klonlama sistemine "ZeBRα" olarak adlandırdı. Kullanılan plazmit bir "Sıfır-Arka Plan Vektörüdür". Bu şu anlama gelir: Kopyalanacak DNA fragmanlarını içermeyen bakteriler arka planda uygunsuz koloniler oluşturmazlar. Bu arada "Redα-Exonuclease", çeşitli DNA fragmanlarının birlikte dizilebildiği ve vektöre dahil edilebildiği E. coli özütünün bir bileşenidir.

Bilim adamları, şimdi yayınladıkları araştırma sonuçlarına dayanarak, klonlama vektörlerini gelecekte daha da kullanışlı hale getirmek için ek işlevlerle donatmayı planlıyorlar. Özellikle, belirli organizmaların veya hücre hatlarının dönüşümünü basitleştirebilmek için vektörü daha da optimize etmeyi planlıyorlar. Böyle bir transfer de nadir görülen bir olay olduğundan, vektörün transformasyon sürecini izlemek için floresan proteinlerin oluşumuna yol açan DNA dizilerini de taşıması avantajlıdır. Bu proteinler daha sonra plazmit taşıyan DNA fragmanlarının sırasıyla organizmalara veya hücrelere başarılı bir şekilde alındığını gösterecektir.


Temel prosedür

TOPO klonlaması için gereken adımları inceleyelim:

1. PCR Ürününüzü Oluşturun: Standart primerler tasarlayın (uçlara benzersiz kısıtlama bölgeleri eklemeye gerek yok) ve favori PCR protokolünüzü kullanarak Taq polimeraz ile ilgilendiğiniz diziyi yükseltin.

2. TOPO Klonlama Reaksiyonunu Ayarlayın: PCR ürünü ve TOPO Vector'u birlikte karıştırın.

3. Oda Sıcaklığında 5 Dakika İnkübe Edin: Hemen dönüşmeyi planlıyorsanız reaksiyonunuzu buz üzerine koyabilir veya reaksiyonu gece boyunca -20C'de saklayabilirsiniz.

4. TOPO Klonlama Reaksiyonunu Yetkili Hücrelere Dönüştürün: Bunun için standart laboratuvar protokolünüzü kullanabilirsiniz, ancak buz üzerinde inkübasyon sürenizi 5 dakikaya indirmelisiniz (30 dakikanın tamamını inkübe etmek dönüşüm verimliliğini önemli ölçüde iyileştirmeyecektir).

5. 10 Beyaz veya Açık Mavi Koloniyi Seçin ve Analiz Edin: Ekinizin varlığını PCR, kısıtlama özeti veya sıralama ile onaylayabilirsiniz.


Plazmit nedir?

En temel seviyelerinde, plazmitler, konağın kromozomal DNA'sından bağımsız olarak çoğalan küçük dairesel DNA parçalarıdır. Esas olarak bakterilerde bulunurlar, fakat aynı zamanda maya ve bitkiler gibi arke ve ökaryotlarda da doğal olarak bulunurlar. Doğada plazmitler, konakçıya antibiyotiklere direnç, parçalayıcı fonksiyonlar ve/veya virülans gibi bir veya daha fazla fonksiyonel fayda sağlar. Tüm doğal plazmitler bir replikasyon orijini (plazmitin konakçı aralığını ve kopya sayısını kontrol eder) içerir ve tipik olarak bir antibiyotik direnç geni gibi hayatta kalmak için avantajlı olan bir geni içerir.

Buna karşılık, laboratuarda kullanılan plazmitler genellikle yapaydır ve yabancı DNA'yı başka bir hücreye sokmak için tasarlanmıştır. Minimal olarak, laboratuarda oluşturulan plazmitler bir replikasyon kaynağına, seçim işaretçisine ve klonlama bölgesine sahiptir. Plazmitleri değiştirmenin kolaylığı ve plazmitlerin bir hücre içinde kendi kendini kopyalama yeteneği, onları yaşam bilimci veya biyomühendis için çekici araçlar haline getirir.

Şekil 1: Aşağıda açıklanan elementleriyle birlikte bir plazmit haritası.

vektör öğesi Açıklama
Replikasyonun Kökeni (ORI) Bir plazmit içinde replikasyon mekanizması proteinlerini işe alarak replikasyonun başlatılmasına izin veren DNA dizisi
Antibiyotik Direnç Geni Plazmit içeren bakterilerin seçimine izin verir.
Çoklu Klonlama Sitesi (MCS) DNA'nın kolayca yerleştirilmesine izin veren birkaç kısıtlama bölgesi içeren kısa DNA segmenti. Ekspresyon plazmitlerinde, MCS genellikle bir promotörden aşağı akıştadır.
Sokmak Daha fazla çalışma için MCS'ye klonlanmış gen, promotör veya diğer DNA fragmanı.
Destekleyici Bölge Hedef genin transkripsiyonunu yönlendirir. İfade vektörleri için hayati bileşen: genin hangi hücre tiplerinde ifade edildiğini ve elde edilen rekombinant protein miktarını belirler.
Seçilebilir İşaretleyici Antibiyotik direnç geni bakterilerde seçime izin verir. Bununla birlikte, birçok plazmit, diğer hücre tiplerinde kullanım için seçilebilir işaretlere de sahiptir.
Primer Bağlama Sitesi PCR amplifikasyonu veya dizilimi için bir başlangıç ​​noktası olarak kullanılan kısa tek iplikli DNA dizisi. Primerler, plazmitlerin dizi doğrulaması için kullanılabilir.


8.5: Klonlama DNA - Plazmit Vektörleri - Biyoloji

Konağın replikasyon makinesi kullanılarak plazmitin otomatik replikasyonu için gereklidir.
Hemen hemen tüm yaygın olarak kullanılan plazmitler, ColE1 replikasyon orijinine (ori) dayanır.

Bakteriyel replikasyon kökenlerinin sıkı bir şekilde düzenlendiğini belirtmekte fayda var.
R faktörleri konukçu genomundan daha küçük olsa da (5x106 bp'ye kıyasla 5 bp), bu faktörlerin konukçuda yüksek kopya sayısına replikasyonu, konukçu kopyalama makinesine önemli bir yük getirir. Bu nedenle, doğal olarak meydana gelen replikasyon kökenleri, kopya sayısını düşük tutmak için negatif olarak düzenlenir (tipik olarak hücre başına 5 ila 10 kopya).
Yüksek kopya sayısı doğal bir sistemde dezavantajlı olsa da, bir klonlama vektöründe arzu edilen bir özelliktir - çünkü bütün fikir belirli DNA dizilerinin önemli miktarlarını kolayca izole edebilmektir. Bu nedenle, epizom kopya sayısını sınırlayan negatif düzenleyici mekanizmaların devre dışı bırakılması için ColE1 ori'nin mühendisliğine yönelik önemli çalışmalar yapılmıştır. Modern plazmit vektörleri bu nedenle genellikle 'kaçak replikonlar' olarak adlandırılır ve hücre başına 100 ila 1000 kopyada bulunur.

Seçilebilir belirteçler, rekombinant plazmitleri içeren bakterilerin tanımlanması için gereklidir. Seçim iki türe ayrılabilir:

Pozitif seçim, bir plazmit içeren bakterileri tanımlamak için kullanılır. Pozitif seçim için kullanılan en yaygın belirteçler, orijinal R faktörleri tarafından taşınan antibiyotik direnç genleridir.
Birçok antibiyotik ve direnç geni mevcut olmakla birlikte, yaygın olarak kullanılanlar iki genel sınıfa ayrılır:

Yabancı DNA fragmanlarının plazmit vektörlerine bağlanması nispeten verimsiz bir işlemdir - ligasyon, ek içermeyen daireselleştirilmiş plazmit veya yabancı DNA eki içeren plazmitler üretebilir. Bu ürünler daha sonra, bir plazmit içeren bakterileri tanımlamak için uygulanan pozitif bir seçim olan, antibiyotiğe duyarlı bir bakteri konağına dönüştürülür. Yabancı bir DNA eki taşıyanlardan sadece yeniden çevrime giren plazmitleri ayırt etmek için ikinci bir seçim sistemi gereklidir.
Yabancı bir DNA fragmanı taşıyan bu plazmitleri tanımlamak için, yerleştirme bölgesi, yerleştirmenin seçilebilir bir işaretleyiciyi bozacağı şekilde seçilir - bu fenomene yerleştirme inaktivasyonu diyoruz.

Negatif seçim için iki tip seçilebilir işaretleyici kullanılır

Antibiyotik direncini hem negatif hem de pozitif bir seçim sistemi olarak kullanmak için, plazmit vektörünün iki farklı antibiyotik direnç geni taşıması gerekir. Böyle bir vektörün bir örneği pBR322'dir.

pBR322, hem ampisilin hem de tetrasiklin direnç geni taşır.
Bozulmamış plazmidi içeren bakterilerin fenotipi Amper r Tet r

Yabancı DNA'nın içine yerleştirilmesi
Amp r geninde bulunan Pst I bölgesi, Amp s Tet r fenotip.

Tersine, yabancı DNA'nın Tet r geninde bulunan EcoRI, Hind III veya Sal I bölgelerine eklenmesi, bir
Amper Tet s fenotip.

Pozitif olarak seçilen koloniler daha sonra pozitif seçici besiyerinde yeniden boyanır
(istediğimiz vektörü + ek parçayı kurtardığımız ana plaka)

ve negatif seçim medyasında.
(Sırasıyla Amp veya Tet ortamı)

Enzimatik Aktivitenin Ekleme İnaktivasyonu

Antibiyotik direncinin insersiyonel inaktivasyonu işe yarasa da, çok fazla manipülasyon gerektirir - pozitif olarak seçilmiş bakterileri toplamak ve negatif seçim ortamlarına tekrar yerleştirmek vb. Kolonileri toplamanın sıkıcılığına ek olarak, pBR322 gibi vektörler de uygun kısıtlama alanlarının azlığından muzdariptir. yabancı DNA parçalarının yerleştirileceği yer.

Bu sınırlamalar, bir plazmit taşıyan bakterileri pozitif olarak seçmenin ve aynı zamanda enzimatik aktivitenin insersiyonel inaktivasyonunu seçmenin mümkün olduğu bir dizi konak-vektör sisteminin geliştirilmesine yol açtı. Bu sistem eski dostumuz,
E coli lac operonunun beta-galaktosidaz geni.


Videoyu izle: DNA Arşivleri ve cDNA Oluşturma Biyoloji. Biyomoleküller (Haziran 2022).