Bilgi

Nanopor zenginleştirme için RNA'ları ve SNP'leri yönlendirin

Nanopor zenginleştirme için RNA'ları ve SNP'leri yönlendirin


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

SNP'leri almamak gRNA dizisinin hangi bölümünde en önemlidir? PAM sitesinin herhangi bir SNP'sine sahip olamayacağını biliyorum, peki ya diğerleri? İkincisi, gRNA dizisinde SNP'lere sahip olmanın kabul edilebilir olduğu herhangi bir pozisyon var mı?


Nanopore dizilimi ve CIRI uzunluğunda dairesel RNA'ların kapsamlı profili

Kısa RNA dizileme okumalarından dairesel RNA'ların (circRNA'lar) dizisini yeniden yapılandırmanın, circRNA'ların ve bunlara karşılık gelen lineer haberci RNA'ların benzerliği göz önüne alındığında zorlu olduğu kanıtlanmıştır. Önceki sıralama yöntemleri, tam uzunluktaki circRNA'ların yüksek verimli tespitini başaramadı. Burada, nanopore teknolojisini kullanarak circRNA izoformlarının zenginleştirilmesi ve tam uzunlukta sıralanması için bir protokol açıklıyoruz. Dairesel ters transkripsiyon ve boyut seçimi, önceki yöntemlere kıyasla toplam RNA'dan 20 kat daha fazla circRNA zenginleştirmesini sağlar. circRNA dizisini yeniden yapılandırmak için uzun okuma dizileme verilerini (CIRI-long) kullanan circRNA tanımlayıcısı adı verilen bir algoritma geliştirdik. İş akışı, simüle edilmiş verilerle ve Illumina sekanslamasının yanı sıra nicel gerçek zamanlı RT-PCR ile karşılaştırılarak doğrulandı. Yetişkin fare beyin örneklerini analiz etmek ve mitokondri türevli ve transkripsiyonel okuma circRNA'ları dahil olmak üzere circRNA'ları sistematik olarak profillemek için CIRI-long kullandık. Özel ekleme ve ifade modelleri sergileyen yeni bir tür intronik kendi kendine bağlanan circRNA tanımladık. Yöntemimiz, nanopore uzun okumalarından yararlanır ve tam uzunluktaki circRNA dizilerinin tarafsız bir şekilde yeniden yapılandırılmasını sağlar.


Wu, W., Ji, P. ve Zhao, F. Genom Biol. 21, 101 (2020).

Zheng, Y., Ji, P., Chen, S., Hou, L. & Zhao, F. Genom Med. 11, 2 (2019).

Xin, R. et al. Nat. Komün. 12, 266 (2021).

Chen, L.L. Nat. Rev. Mol. Hücre Biol. 21, 475–490 (2020).

Logsdon, G.A., Vollger, M.R. ve Eichler, E.E. Nat. Rev. Genet. 21, 597–614 (2020).

Gao, Y. et al. Nat. Komün. 7, 12060 (2016).

Zhao, Q. et al. Hücre 183, 76–93.e22 (2020).

Legnini, I. et al. Mol. Hücre 66, 22–37.e9 (2017).

Liu, C.-X. et al. Hücre 177, 865–880,e21 (2019).


Referanslar

Karamitros, T. & Magiorkinis, G. Oxford Nanopore MinION için çoklanmış hedefli dizileme: detaylı bir kütüphane hazırlama prosedürü. Yöntemler Mol. Biol. 1712, 43–51 (2018).

Leija-Salazar, M. et al. Oxford Nanopore MinION kullanılarak GBA hatalı mutasyonların ve diğer varyantların tespitinin değerlendirilmesi. Mol. Genet. Genom. Med. 7, e564 (2019).

Gabrieli, T. et al. İnsanın seçici nano gözenek dizilemesi BRCA1 kromozom segmentlerinin Cas9 destekli hedeflenmesiyle (CATCH). Nükleik Asitler Araş. 46, e87 (2018).

Giesselmann, P. ve ark. Kısa tandem tekrar açılımlarının analizi ve nanogözenek dizilimi ile metilasyon durumları. Nat. Biyoteknoloji. 37, 1478–1481 (2019).

Kozarewa, I., Armisen, J., Gardner, A.F., Slatko, B.E. & Hendrickson, C.L. Hedef zenginleştirme stratejilerine genel bakış. Kör. Protokol Mol. Biol. 112, 7.21.1–7.21.23 (2015).

Eberle, M.A. ve ark. Üç nesil 17 üyeli bir soyağacının dizilenmesinden elde edilen genetik kalıtımla doğrulanmış 5,4 milyon aşamalı insan varyantından oluşan bir referans veri seti. Genom Res. 27, 157–164 (2017).

ENCODE Projesi Konsorsiyumu. İnsan genomundaki DNA elemanlarının entegre bir ansiklopedisi. Doğa 489, 57–74 (2012).

Sternberg, S.H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E.C. & Doudna, J.A. CRISPR RNA-güdümlü endonükleaz Cas9 tarafından DNA sorgulaması. Doğa 507, 62–67 (2014).

Forbes, S.A. ve diğerleri. KOZMİK: yüksek çözünürlükte somatik kanser genetiği. Nükleik Asitler Araş. 45, D777–D783 (2017).

Lee, I. et al. Nanopore dizilimi ile insan hücre hatlarında kromatin erişilebilirliğinin ve metilasyonunun eşzamanlı profili Ön baskı bioRxiv https://doi.org/10.1101/504993 (2018).

Messier, T.L. ve ark. Histon H3 lisin 4 asetilasyon ve metilasyon dinamikleri meme kanseri alt tiplerini tanımlar. oncotarget 7, 5094–5109 (2016).

Welcsh, P.L. & King, M.C. BRCA1 ve BRCA2 ve meme ve yumurtalık kanserinin genetiği. Hımm. Mol. Genet. 10, 705–713 (2001).

Li, H. Sıralama verilerinden SNP çağrısı, mutasyon keşfi, ilişkilendirme eşlemesi ve popülasyon genetik parametre tahmini için istatistiksel bir çerçeve. biyoinformatik 27, 2987–2993 (2011).

Luo, R. et al. Clair: Germline varyant çağrısı için yığın verilerinde derin bir sinir ağı kullanmanın sınırını keşfetmek. Ön baskı bioRxiv https://doi.org/10.1101/865782 (2019).

Simpson, J.T. ve ark. Nanopore dizilimi kullanılarak DNA sitozin metilasyonunun saptanması. Nat. yöntemler 14, 407–410 (2017).

Martin, M. et al. WhatsHap: hızlı ve doğru okumaya dayalı fazlama. Ön baskı bioRxiv https://doi.org/0.1101/085050 (2016).

Tate, J.G. ve ark. KOZMİK: kanserdeki somatik mutasyonların kataloğu. Nükleik Asitler Araş. 47, D941–D947 (2019).

Martignano, F. ve ark. Prostat kanserinde GSTP1 metilasyonu ve protein ekspresyonu: tanısal çıkarımlar. Dis. işaretçiler 2016, 4358292 (2016).

Kabir, N.N., Rönnstrand, L. & Kazi, J. U. Keratin 19 ifadesi, meme kanserinde kötü prognoz ile ilişkilidir. Mol. Biol. Temsilci 41, 7729–7735 (2014).

Wang, X.-M., Zhang, Z., Pan, L.-H., Cao, X.-C. & Xiao, C. KRT19 ve CEACAM5 mRNA işaretli sirküle tümör hücreleri, meme kanseri hastalarının olumsuz prognozunu gösterir. Meme Kanseri Araş. Davranmak. 174, 375–385 (2019).

Noguchi, S. ve ark. Ters transkriptaz-polimeraz zincir reaksiyonu ile aksiller lenf düğümlerinde meme kanseri mikrometastazlarının tespiti. MUC1 mRNA ve keratin 19 mRNA amplifikasyonu arasındaki karşılaştırma. NS. J. Pathol. 148, 649–656 (1996).

Sedlazeck, F.J. ve ark. Tek molekül dizilimi kullanarak karmaşık yapısal varyasyonların doğru tespiti. Nat. yöntemler 15, 461–468 (2018).

Zook, J.M. ve diğerleri. Karşılaştırmalı referans materyallerini karakterize etmek için yedi insan genomunun kapsamlı dizilimi. bilim Veri 3, 160025 (2016).

Kolmogorov, M., Yuan, J., Lin, Y. & Pevzner, P. A. Tekrar grafiklerini kullanarak uzun, hataya açık okumaların montajı. Nat. Biyoteknoloji. 37, 540–546 (2019).

Vaser, R., Sović, I., Nagarajan, N. & Šikić, M. Düzeltilmemiş uzun okumalardan hızlı ve doğru de novo genom derlemesi. Genom Araş. 27, 737–746 (2017).

Li, H. Minimap2: nükleotid dizileri için ikili hizalama. biyoinformatik 34, 3094–3100 (2018).

Chaisson, M.J.P. et al. İnsan genomlarında haplotip çözümlü yapısal varyasyonun çok platformlu keşfi. Ön baskı bioRxiv https://doi.org/10.1101/193144 (2018).

Audano, P.A. ve ark. İnsan genomunun majör yapısal varyant alellerinin karakterize edilmesi. Hücre 176, 663–675.e19 (2019).

Dixon, J.R. ve ark. Kanser genomlarındaki yapısal varyasyonun bütünleştirici tespiti ve analizi. Nat. Genet. 50, 1388–1398 (2018).

Timp, W. & Feinberg, A.P. Kanser, konak pahasına hücresel büyüme avantajı sağlayan düzensiz bir epigenom olarak. Nat. Rev. Kanser 13, 497–510 (2013).

Jeffares, D.C. ve ark. Geçici yapısal varyasyonlar, fisyon mayasında kantitatif özellikler ve üreme izolasyonu üzerinde güçlü etkilere sahiptir. Nat. Komün. 8, 14061 (2017).

Krueger, F. & Andrews, S. R. Bismark: Bisulfite-Seq uygulamaları için esnek bir hizalayıcı ve metilasyon çağırıcı. biyoinformatik 27, 1571–1572 (2011).

Hansen, K.D., Langmead, B. & Irizarry, R.A. BSmooth: tüm genomdan bisülfit dizilimi, diferansiyel olarak metillenmiş bölgelere okur. Genom Biol. 13, R83 (2012).


Nanopor dizilimi 101 Soru-Cevap

Sınav sırasında sorulan tüm soru ve cevapları burada bulabilirsiniz. Nano gözenek dizileme 101 web semineri.

1. Bir akış hücresini kaç kez yeniden kullanabilirsiniz?

Bir örnek ve sonraki örnek(ler)in çalıştırılması arasında kullanabileceğiniz bir akış hücresi yıkama protokolü vardır. Akış hücresini ne kadar titizlikle yıkadığınıza bağlı olarak, akış hücresini beş kez beşe kadar kullanan müşterilerin, bir akış hücresini kaç kez yeniden kullanabileceğiniz konusunda ne bekleyebileceğiniz konusunda muhtemelen iyi bir başlangıç ​​noktası olduğunu gördük. Ayrıca, bir koşuya başlamadan önce kaç tane nanoporun sizin için uygun olduğunu değerlendirmek için bir çalışmadan önce bir platform QC'si çalıştırabilirsiniz. Bu nedenle, bir akış hücresini yeniden kullanmak istediğinizde, sıralama deneyine başlamadan önce yeterli aktif nanogözenek olup olmadığını değerlendirebilirsiniz. Yıkama setimiz Store'dan temin edilebilir.

2. Bir nanopor dizileme platformunun iyi bir hassasiyetle dizileyebileceği maksimum düşük kaliteli DNA konsantrasyonu nedir?

Bu tür soruları sıklıkla alıyoruz çünkü müşteriler bir nanoporun çok küçük olduğunu algılıyor ve bu nedenle nanoporları tıkayan kirleticilerle ilgili sorunlar yaşayabiliyorlar. Gerçekte, bir nanoporu engellemek zordur. Müşterilerimize, genellikle moleküler biyolojide kullanacağınız standart DNA ve RNA kalite kontrol teknikleri konusunda rehberlik ediyoruz, çünkü bunlar platformumuza uygulanabilir. Bu nedenle, A260/280 ve A260/A230 oranlarını ölçmek ve QC için Bioanalyzer'ı kullanmak, yüksek kaliteli numunelere sahip olmanızı sağlamaya yardımcı olur. Müşterilerimize "Bu dizileme için iyi bir örnek mi değil mi?" değerlendirmesini yapabilmeleri için önerdiğimiz başlıca protokollerdir.

3. Bir akış hücresinin yıkandıktan sonra nasıl saklanacağına dair özel talimatlar var mı? Ve yeniden kullanılmış bir akış hücresini ne kadar süre saklayabiliriz?

Akış hücrelerinin yıkanması ve saklanması için protokoller ve reaktifler sağlanır - daha fazla bilgi için lütfen Akış Hücresi Yıkama Kiti Mağazasına ve Topluluktaki Protokol kitaplığına bakın.

4. Bir Minion üzerinde kaç bakteri genomu dizileyebilirim?

Bir akış hücresinde çalıştırabileceğiniz örnek sayısı (MinION Akış Hücresi hakkında konuşalım) gerçekten deneysel tasarımınıza bağlıdır. Bu soruyu yanıtlayabilmek için, genomun/genlerin boyutuna ve bu genomlar için istediğiniz kapsama düzeyine bağlı olacaktır. Basitlik için, tek bir Minion Akış Hücresine baktığımızı ve yaklaşık 10 Gb veriyi sıraladığımızı ve ürettiğimizi varsayalım. Baktığınız genomun boyutuna ve hangi düzeyde kapsama istediğinize bağlı olarak, tek bir akış hücresinde işleyebileceğiniz örnek sayısının ne olduğunu belirleyebilmek için bunu 10 Gb'ye bölersiniz. . Akış hücrenizden 10 Gb'den fazla veri almak için sırada olabilirsiniz; bu, akış hücresini durdurmayı, yıkamayı ve başka bir zaman ek veri oluşturmak için yeniden kullanmayı seçebileceğiniz anlamına gelir. Örnek bir hesaplama için Kaynak Merkezi'ndeki Metagenomik Başlarken kılavuzuna bakmanızı öneririz.

5. Bir akış hücresinin tipik verimi nedir?

Girilen DNA'nın kalitesine büyük ölçüde bağlıdır. İyi kalitede DNA dizilimi yapılıyorsa, bir Minion Akış Hücresi 25 Gb'den fazla veri üretmelidir. Akış hücresi çıktıları hakkında daha fazla bilgi için lütfen Ürün karşılaştırma sayfasına bakın (https://nanoporetech.com/products/comparison)

6. DNA ekstraksiyon protokolleri için önerileriniz var mı?

Harika bir soru çünkü belli ki tek bir örnek türü yok! Nanopore Topluluğunun Bilgi bölümünde, farklı biyolojik numuneler için ekstraksiyon protokollerine ayrılmış tam bir bölüm vardır. Metagenomik yaparken, aynı zamanda çok "eşit" bir ekstraksiyon protokolüne sahip olduğunuza çok dikkat etmeniz gerektiğini özellikle belirteceğim, böylece sıralama numunenin içeriğini doğru bir şekilde yansıtır ve ekstraksiyon protokolü ile karıştırılmaz. kullanıyorlar.

7. VolTRAX ticari olarak mevcut mu?

Evet, VolTRAX Mağazada mevcuttur (https://store.nanoporetech.com).

8. VolTRAX cihazı ile DNA kütüphanesi hazırlamak için hangi kiti kullanmalıyım?

Mağazada (https://store.nanoporetech.com) farklı VolTRAX kitleri mevcuttur ve daha fazlası yakında piyasaya sürülecektir.

9. Akış hücresi R9.4 ile akış hücresi R10.3 arasındaki fark nedir?

Fark, her akış hücresinde bulunan nanogözeneklerdedir. Nanopor esasen biyolojik bir proteindir ve çevrede doğal olarak bulunur. Bu nano gözenekleri sistemimizde kullanım için optimize etmek için dahili olarak çok fazla mühendislik gerçekleştirerek daha fazla verim ve doğruluk sağlıyoruz. R9.4.1 nanopor, günümüzde yaygın olarak kullanılan nanopordur. DNA nano gözenek içinde hareket ederken, bir sıkışma noktası var - akımı ölçmemize ve böylece molekülün yer değiştirmesini gerçek zamanlı olarak yorumlamamıza izin veren deliğin daralması. R10 serisinde, daha uzun bir namlu ve iki sıkıştırma noktası vardır ve bu tür iki ölçümü mümkün kılar. Bu, homopolimerlerin dizilenmesi için faydalar sağlar - aynı bazın birden çok kez gerilmesi. Bu homopolimer uzantıları, yalnızca bizim platformumuz için değil, tüm sıralama platformları için zordur. Bu ikinci sıkıştırma noktasının tanıtılmasının, homopolimer dizileri için daha önce R9.4 serisinde görülenden daha iyi bir aslına uygunluk sağladığını bulduk, yaklaşık on bazlı homopolimer uzantılarının çok doğru dizilişini görmeye başlıyoruz. R10.3, bu serideki en yeni nanogözenektir ve artan verim ve yakalama ile birlikte R10 serisinin yüksek doğruluğunu sağlar.

10. Cas9 protokolünü kullanarak kütüphane kurulumu hakkında bilgi verir misiniz? Ve hangi uygulamalar için kullanılabilir?

Cas9 PCR'siz zenginleştirme protokolü yaklaşık bir yıldır mevcuttur ve protokol Topluluktaki Protokol Kitaplığında görüntülenebilir. Yaklaşık 2 saat süren oldukça basit bir protokoldür, ancak ihtiyacınız olan bazı üçüncü taraf reaktifleri birleştirerek bunu daha da basitleştiriyoruz - bu çok yakında tam bir kit olarak sunulacak. Kullanıcı topluluğumuzdan Cas9 zenginleştirmenin kullanımı hakkında Kaynak Merkezimizde çevrimiçi olarak bulunan birkaç yayınımız ve videomuz var.

11. Doğruluk çalışma boyunca nasıl değişir? Doğruluk sabit mi yoksa kısa okuma dizileme teknolojisinde olduğu gibi çalışma boyunca azalıyor mu?

Teknolojimiz, amplifikasyona, enzimatik işlemlere, flüoresansa veya başka herhangi bir şeye gerek kalmadan doğrudan doğal DNA'yı sıralayabilir. Moleküller gözeneklerden geçerken sadece iyonik akışı ölçüyoruz. Bu nedenle ve tek okumalarda çok uzun molekülleri sıralayabiliyor olmamız nedeniyle, sıralama kalitesi çalışma boyunca aynıdır, bir düşüş görmüyoruz. Bir DNA veya RNA molekülü bir nanoporeden geçerken, molekülün başında ve sonunda aynı aslına uygunluk ile bütünlüğü içinde dizilenir. Ayrıca, bir okumada dizileyebileceğimiz bir molekülün ne kadar süre ile üst sınırın ne olduğunu da bilmiyoruz, kayıt şu anda 2,44 Mb.

12. Nanopor dizileme ile SNP tespiti hakkında biraz bilgi verebilir misiniz?

Hem Topluluktan hem de veri analizi ekibimiz tarafından Metrichor aracılığıyla sağlananlar olmak üzere birçok farklı türde algoritma vardır. Bunlardan biri, müşterilerin farklı seviyelerde SNP analizi gerçekleştirmesini sağlayan Medaka yazılım paketidir. SNP saptaması gerçekleştirebiliyoruz - bunu tarif ettiğim fikir birliği stratejisiyle bağlantılı olarak yapmak, muhtemelen en yüksek düzeyde doğruluk ve baktığınız genomlar içindeki farklı SNP'leri tanımlama yeteneği verecektir. SARS-CoV-2 dizilimi üzerine bazı çok yeni yayınların diğer yöntemlerle mükemmel uyum gösterdiğini gösteren, son 18 ay içinde SNP'lerin tanımlanması için nanopor dizilemenin doğruluğunu gösteren epeyce yayın gördük. Bunlar web sitemizdeki Kaynak Merkezinde mevcuttur, ayrıca bize her zaman [email protected] adresinden ulaşabilirsiniz.

13. Bitki virüsleri (10 kb) gibi kısa genomlar için, tek bir akış hücresi kullanarak kaç örnek çoğaltabilirim?

Bir flongle Flow Cell yaklaşık 1 Gb veri üretecektir, bu nedenle 100.000 okuma 10 kb uzunluğunda eşdeğer olacaktır - genellikle "100.000 X kapsama" olarak adlandırılır. 24 adede kadar viral genomu barkodlayabileceğiniz tipik bir MinION Akış Hücresi, muhtemelen 20 Gb'nin üzerinde veya barkodlu numune başına kabaca 100.000 okuma sağlar.

14. Kanonik olmayan metilasyonları saptamak için araçların çoğu iyi bilinen metilasyonlara dayalı olarak eğitilmiştir. Araçlardan bazıları daha fazla esneklik sunar, ancak yine de kanonik olmayan metilasyonların tespiti için referans olarak özel bir metillenmiş numunenin kullanılmasını gerektirir. Bu anormal sinyallerin metilasyondan geldiğini varsayarak, anormal sinyalleri kolayca çıkarmak için herhangi bir aracımız var mı?

Ham elektrik sinyalindeki kanonik olmayan değişiklikleri tanımlamak için birden fazla araç mevcuttur. Kaynak Merkezinde, tanımladığınız gibi bir yaklaşımı kullanan bir dizi yayın ve araç bulunmaktadır. Ayrıca, özel gereksinimleriniz varsa iletişime geçmenizi öneririz.

15. Web sitenizdeki fiyat tüm başlangıç ​​paketinin fiyatı mı yoksa cihazı kiralamanın fiyatı mı?

MinION'dan bahsediyorsanız, fiyat Minion dahil Başlangıç ​​paketinin toplam fiyatı veya 1.000$'dır.

16. WIMP'de mikroorganizmaların taksonomisi için hangi veri tabanları kullanılmaktadır?

WIMP, Santrifüj sınıflandırma motorunu temel alır.

17. Platform taşınabilir ise bu cihazla seyahat ederken sıralama yapabileceğimiz anlamına mı geliyor?

Sıralayıcı uzayda, arabalarda, uçaklarda ve hatta bisiklette kullanıldı! Bakınız https://twitter.com/ReindertN/status/1235202393467428864

18. Flongle Akış Hücresi, Minion Akış Hücresine göre ne kadar kararlı?

Birkaç yıldır Minion Akış Hücreleri üretiyoruz. Teslimatta 4 C'de 3 ay veya oda sıcaklığında 1 ay garanti veriyoruz. Şu anda Flongle Akış Hücrelerinin teslimattan sonraki 4 hafta içinde kullanılması gerekmektedir: https://store.nanoporetech.com/flongle-flow-cell-pack.html

20. Tarlada bitkilerin doğrudan RNA dizilimini yapmak mümkün müdür? Hangi ekstraksiyon ve VolTRAX kitaplık kitlerini kullanmalıyım?

Evet, doğrudan sahada sıralama yapmak mümkündür. Ekstraksiyon üzerine bir takip Oxford Nanopore seminerimiz olacak. Bu arada, mevcut VolTRAX kitleri hakkında daha fazla bilgi için lütfen Mağazanın Numune Hazırlama bölümünü ziyaret edin (https://store.nanoporetech.com).

21. "Uyarlanabilir sıralama"nın nasıl çalıştığını açıklayabilir misiniz? Örneğin, bir gen ailesini sıralamak için kullanılabilir mi?

22. VolTRAX'a karşı Oxford Nanopore "uygulamalı" protokolleri ile ilgili olarak, aynı kalitede kitaplıklar (uzunluk, dağılım. ) ve aynı sıralama sonuçlarını üretiyorlar mı?

Dahili testlerimiz büyük uyum gösteriyor, ancak VolTRAX kitaplıklar arası tekrarlanabilirliği iyileştiriyor.


Yöntemler

Kök ucundan çekirdek izolasyonu Arabidopsis

vahşi tip Arabidopsis fideler (Col-0), hasattan 10 gün önce 22°C'de (16 saat aydınlık/8 saat karanlık) 1/2 MS plakaları üzerinde büyütüldü. Fidelerin kök ucu bölgesi (5 mm) kesildi ve hemen sıvı nitrojen içinde tutulan 1.5 ml'lik RNaz içermeyen Eppendorf tüpüne aktarıldı ve tüpteki 1000 ul'lik bir pipet ucu ile ince toz halinde öğütüldü. Toz daha sonra 300 ul buz soğukluğunda Ekstraksiyon Tamponu (EB)-0.4 M sakaroz, 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 10 mM MgCl içinde çözüldü2, %0,2 (a/h) Triton X-100, 1 mM dithiothreitol (DTT), 1 x proteaz inhibitörü (Roche), 0,4 U/µl RNase inhibitörü (RNaseOUT, Thermo Fisher Scientific). İyonik olmayan yüzey aktif madde Triton X-100, çekirdekleri serbest bırakmak ve FACS sırasında agregasyonu önlemek için kullanılır [62]. Nazik tepe noktası oluşturma ve ters çevirme işleminden sonra homojenat, 20 um'lik bir hücre süzgecinden yeni bir tüpe süzüldü. Kalan çekirdekleri yıkamak için süzgeçe 400 µl EB daha eklendi. 4 °C'de santrifüjden sonra, 2000G 5 dakika boyunca, sitoplazmik fraksiyondan RNA kontaminantlarını önlemek için süpernatan dikkatlice çıkarıldı. Pelet 4 °C'de iki kez yıkandı, 2000G, 1 ml EB ile 5 dakika ve sonra 500 ul EB içinde yeniden süspanse edildi. Ayıklama için, çekirdekler 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile boyandı ve 70 um'lik bir meme ile bir akış sitometresine yüklendi. Toplama tamponu olarak bir mililitre EB kullanıldı. DAPI sinyaline ve nükleer boyuta göre toplam 40.000 çekirdek sıralandı. Toplanmayı önlemek için, sınıflandırılan çekirdekler 4 °C, 2000'de peletlendiG, 5 dakika ve daha sonra 100 ul PBST tamponunda (1 x PBS, %0.025 Triton X-100 düşük konsantrasyonlu) yeniden süspanse edildi. Çekirdeklerin kalitesi kontrol edildikten ve DAPI kanalı kullanılarak mikroskop altında sayıldıktan sonra 5000 çekirdek, 500 µl PBST tamponlu yeni bir tüpe aktarıldı ve 4 °C'de santrifüjlendi, 2000G, 5 dakika. Daha sonra pelet, 20 µl PBST tamponunda yeniden süspanse edildi ve yaklaşık 1000 çekirdek/µl'ye seyreltildi.

Endosperm çekirdek izolasyonu

Endosperm daha önce bildirildiği gibi izole edilmiştir [63, 64]. Kısaca, embriyogenezin kalp aşamasındaki 5 DAP ovülü, bir diseksiyon mikroskobu altında bir slayt üzerine yerleştirildi. Endosperm çekirdekleri, bir iğne ile delindikten sonra hafif bir basınçla tohumdan lam üzerine serbest bırakıldı. Çekirdekler izolasyon tamponu (0.3 M sorbitol, 5 mM MES (pH 5.7), 0.4 U/ul RNaseOUT) içinde yeniden süspanse edildi ve 10 ul'lik bir pipetle düşük bağlı 1.5 ml'lik bir Eppendorf tüpüne aktarıldı. Daha sonra toplanan çekirdekler 20 µm hücre süzgeci ile yeni bir tüpe süzüldü ve ardından iki kez 4 °C'de yıkama tamponu (EB) ile yıkandı, 2000G, 5 dakika serbest RNA ve kirleticileri uzaklaştırmak için. Daha sonra, çekirdekler 100 ul PBST tamponunda yeniden süspanse edildi ve 1000 çekirdek/ul'ye seyreltildi.

Illumina ve Nanopore dizilimi için tek çekirdekli RNA dizilimi kitaplığı yapısı

Kütüphaneler, standart 10x Genomics protokolüne (Single Cell 3′ Reagent Kits v2 Kullanıcı Kılavuzu) göre, Nanopore uzun okuma dizilemesine uyum sağlamak için değişikliklerle oluşturuldu. Kök ucu için, önceki adımdan çekirdek süspansiyonu (

5000 çekirdek) 10x Genomics ChIP'ye yüklendi ve kütüphaneler 10x Chromium Single Cell 3′ Solution V2 kiti kullanılarak yapıldı. endosperm için,

10.000 çekirdek yüklendi ve kütüphane yapımına tabi tutuldu. Tam uzunlukta cDNA elde etmek için cDNA amplifikasyonu sırasında uzama süresini standart 1 dakikadan 2 dakikaya uzatıyoruz. CDNA şablonunun yarısı, üreticinin talimatına göre Illumina kitaplığını oluşturmak için kullanıldı ve Illumina NavoSeq (Read1:28 baz + Read2:150 baz) ile sıralandı, şablonun diğer yarısı, Oxford Nanopore LSK- kullanılarak Nanopore kitaplığı yapmak için kullanıldı. 109 kiti ve bir Minion akış hücresinde sıralanmıştır (R9.4.1).

Illumina tek çekirdekli veri analizi

Kökün ham okumaları, varsayılan parametreler kullanılarak Cell Ranger (v3.1.0) tarafından TAIR10 referans genomuyla eşleştirildi. Cell Ranger (v3.1.0), tek çekirdekli kitaplıklarımızda yüksek oranda intron içeren okumalara uyum sağlamak için yalnızca intronsuz okumaları sayar, her okumanın intron bölgelerini çıkardık ve okumaları Cell Ranger tarafından referans genoma yeniden hizaladık. çekirdek barkodunu, UMI'yi ve her okumanın karşılık gelen genini tanımlayın (Ek dosya 1: Şekil S1). Kalite kontrol amacıyla, üçten az çekirdekte ifade edilen genler atıldı ve gen sayısı 2300'den fazla veya 350'den az olan hücreler çıkarıldı. Illumina bolluk matrisi daha sonra normalizasyon, log dönüşümü ve ölçekleme için önerilen parametrelerle Scanpy paketi (v1.6.0) [65] kullanılarak analiz edildi. Daha sonra kümeleme için bu bolluk matrisi üzerinde temel bileşen analizi ve Louvain algoritması kullanılmıştır. Daha sonra, her kümenin hücre tipine açıklama eklemek için büyük bir tek hücreli kök verisinde [17] (Ek dosya 2: Tablo S1) tanımlanan farklı hücre tipleri için işaretleyici genleri kullandık. Önce, daha önce tarif edilen yöntem [66] gibi, belirli bir hücredeki belirli bir işaretleyici gen setinin zenginleştirme derecesine dayalı olarak tüm hücreler için her hücre tipinin hücre skorunu hesaplıyoruz. En yüksek puan sıfırı aşarsa hücre ilgili hücre tipine atanır, aksi halde bilinmeyen olarak atanır (Ek dosya 1: Şekil S3a). Daha sonra, her kümeye en yüksek orana sahip hücre tipi olarak açıklama yapıldı (Ek dosya 1: Şekil S3b) ve büyük tek hücreli kök verilerinde tanımlanan gelişim aşamasına özgü genleri kullandık [17] (Ek dosya 1: Tablo S1) tüysüz hücreleri ya olgun tüysüz ya da uzayan tüysüz hücreler olarak yeniden tanımlayan kümeleri daha fazla açıklamak için (Ek dosya 1: Şekil S3c).

Protoplastlanmış beş önceden yayınlanmış tek hücreli RNA-seq verisi Arabidopsis 10x Genomics platformunu kullanan kökler halka açık veri tabanlarından toplanmıştır [11, 12, 14,15,16]. Toplu efektleri kaldırmak ve farklı veri kümeleri arasındaki hizalama puanını hesaplamak için Scanorama [30] kullanıyoruz.

Endosperm verileri için, ham Illumina okumaları "--include-introns" parametresi kullanılarak Cell Ranger (v5.0.0) tarafından işlendi ve sonraki analiz için sadece gen sayısı 400 ile 3000 arasında olan çekirdekler kullanıldı. Kümelemeden sonra, hücre tiplerini atamak için lazer yakalama mikrodisseksiyon numunelerinin [50, 51] mikrodizi verilerinden tanımlanan, daha önce bildirilen kalp evresi doku bakımından zengin genleri kullandık (Ek dosya 2: Tablo S2). Wilcoxon testini gerçekleştirmek için scanpy'nin "rank_genes_groups" işlevini kullanıyoruz ve kümeyle zenginleştirilmiş genleri tanımlamak için "max_out_group_fraction = 0.25" ve "min_fold_change = 1.50" ile "filter_rank_genes_groups" işlevini kullandık. Ve GO zenginleştirme analizi için agriGO v2 [67] kullanıldı.


Yazar bilgileri

Bu yazarlar eşit katkıda bulunmuştur: Oğuzhan Begik, Morghan C. Lucas.

Bağlantılar

Genomik Düzenleme Merkezi (CRG), Barselona Bilim ve Teknoloji Enstitüsü, Barselona, ​​İspanya

Oguzhan Begik, Morghan C. Lucas, Leszek P. Pryszcz, Jose Miguel Ramirez, Rebeca Medina, Ivan Milenkoviç, Sonia Cruciani, Huanle Liu, Helaine Graziele Santos Vieira & Eva Maria Novoa

Garvan Tıbbi Araştırma Enstitüsü, Darlinghurst, NSW, Avustralya

UNSW Sidney, Kensington, NSW, Avustralya

Oğuzhan Begik & John S. Mattick

Universitat Pompeu Fabra (UPF), Barselona, ​​İspanya

Morghan C. Lucas, Ivan Milenkoviç, Sonia Cruciani ve Eva Maria Novoa

Uluslararası Moleküler ve Hücre Biyolojisi Enstitüsü, Varşova, Polonya

Weizmann Bilim Enstitüsü, Rehovot, İsrail

Aldema Sas-Chen & Schraga Schwartz

Bu yazarı PubMed Google Scholar'da da arayabilirsiniz.

Bu yazarı PubMed Google Scholar'da da arayabilirsiniz.

Bu yazarı PubMed Google Scholar'da da arayabilirsiniz.

Bu yazarı PubMed Google Scholar'da da arayabilirsiniz.

Bu yazarı PubMed Google Scholar'da da arayabilirsiniz.

Bu yazarı PubMed Google Scholar'da da arayabilirsiniz.

Bu yazarı PubMed Google Scholar'da da arayabilirsiniz.

Bu yazarı PubMed Google Scholar'da da arayabilirsiniz.

Bu yazarı PubMed Google Scholar'da da arayabilirsiniz.

Bu yazarı PubMed Google Scholar'da da arayabilirsiniz.

Bu yazarı PubMed Google Scholar'da da arayabilirsiniz.

Bu yazarı PubMed Google Scholar'da da arayabilirsiniz.

Bu yazarı PubMed Google Scholar'da da arayabilirsiniz.

Katkılar

O.B. ve M.C.L. RNA ekstraksiyonu ve nanopore kütüphane hazırlığı dahil olmak üzere çoğu ıslak laboratuvar deneylerini gerçekleştirdi. O.B. ve L.P.P. J.M.R. ile birlikte verilerin biyoinformatik analizini gerçekleştirdi. ve E.M.N. O.B. nanoCMC-seq deneyleri tasarladı ve gerçekleştirdi. M.C.L. modifikasyonlar ve bunlara karşılık gelen nanogözenek kitaplıkları ile in vitro kopyalanmış dizileri üretti. O.B. farklı psödoüridin stokiyometrileri ile in vitro kopyalanmış dizileri hazırladı ve dizdi. LPP O.B. ile birlikte nanoRMS kodunu karşılaştırdı ve yazdı. ve E.M.N. J.M.R. in vitro kopyalanmış yapılar üzerinde biyoinformatik analizler gerçekleştirdi ve temel arama ve haritalama algoritmalarını karşılaştırdı. IM, polisom gradyanları oluşturdu ve bunlara karşılık gelen nanogözenek kitaplıklarına yardımcı oldu. S.C. ve I.M. 2′- dizisini hazırladı ve sıraladı.Ö-metilasyon mutant suşları. R.M. ve H.G.S.V. kültürlü S. cerevisiae Farklı stres koşulları altında gerilmeler. H.L., mevcut yoğunluk değerlerinin analizi için kodla katkıda bulunmuştur. A.Ş. ve S.S., tüm snoRNA'sı tükenmiş maya mutant suşlarını kültürledi ve toplam RNA'larını çıkardı. E.M.N. projeyi tasarladı. E.M.N. J.S.M.'nin yardımıyla çalışmayı denetledi. M.C.L., O.B. ve E.M.N. figürleri oluşturdu. O.B., M.C.L. ve E.M.N. tüm yazarların katkılarıyla makaleyi yazdı.

Sorumlu yazar


CRISPR/Cas9 tabanlı hedef zenginleştirme ile birleştirilmiş nanopor dizilimi, SNV'lerin, SV'lerin, metilasyonun ve kanserle ilişkili anahtar genlerin alelik evrelemesinin profillenmesini sağladı.

Okuma uzunluğu

Nanoporlar kendilerine sunulan DNA veya RNA'nın uzunluğunu okur - kısadan ultra uzuna (en uzun > 4 Mb)

Boyutlar

Uygun uygulamalar şunları içerir:

  • Tüm genomlar/ekzomlar
  • metagenomik
  • Hedeflenen sıralama
  • Bütün transkriptom (cDNA)
  • Daha küçük transkriptomlar (doğrudan RNA)
  • Daha küçük örnekler için çoğullama

Yüksek verim

MinION Akış Hücresi başına 50 Gb'ye / Flongle Akış Hücresi başına 2,8 Gb'ye kadar*

* Sistem 72 saat (veya Flongle için 16 saat) 420 baz / saniyede çalıştırıldığında teorik maksimum çıkış. Çıktılar, kitaplık tipine, çalıştırma koşullarına vb. göre değişiklik gösterebilir.

Bağlantı

100 g'dan hafiftir ve yüksek hızlı bir USB 3.0 kablosu kullanarak bir PC veya dizüstü bilgisayara takılır

Düşük maliyetli

  • Sarf malzemeleri dahil 1.000 ABD Doları'ndan başlayan Başlangıç ​​Paketleri
  • Daha küçük testler ve analizler için Flongle Flow Cells ile uyumlu
  • Daha yüksek numune çıktısı için çoğullama kitleri

Okuma uzunluğu

Nanoporlar kendilerine sunulan DNA veya RNA'nın uzunluğunu okur - kısadan ultra uzuna (en uzun > 4 Mb)

Boyutlar

Uygun uygulamalar şunları içerir:

  • Tüm genomlar/ekzomlar
  • metagenomik
  • Hedeflenen sıralama
  • Bütün transkriptom (cDNA)
  • Daha küçük transkriptomlar (doğrudan RNA)
  • Daha küçük örnekler için çoğullama

Yüksek verim

MinION Akış Hücresi başına 50 Gb'ye kadar / Flongle Akış Hücresi başına 2,8 Gb*

* Sistem 72 saat (veya Flongle için 16 saat) 420 baz / saniyede çalıştırıldığında teorik maksimum çıkış. Çıktılar, kitaplık tipine, çalıştırma koşullarına vb. göre değişiklik gösterebilir.


Metilasyon, yapısal varyantlar ve mutasyon çalışmaları için Cas9 ile Hedeflenen Nanopore Dizileme

Nanopor dizileme teknolojisi, doğal DNA moleküllerini hızlı ve doğrudan sorgulayabilir. Genellikle sadece belirli alanları yüksek derinlikte sorgulamakla ilgileniyoruz, ancak geleneksel zenginleştirme yöntemlerinin şimdiye kadar uzun okumalar için uygun olmadığı kanıtlandı 1 . Mevcut stratejiler şu anda yüksek girdili DNA gereksinimleri, düşük verim, kısa (<5kb) okumalar, yoğun zaman alan protokoller ve/veya amplifikasyon veya klonlama (baz modifikasyon bilgilerini kaybetme) ile sınırlıdır. Bu yazıda, Cas9'un belirli konumlarda kesimler oluşturma ve nanogözenek dizileme adaptörlerini doğrudan bu sitelere bağlama yeteneğini kullanan bir teknik açıklıyoruz, bu yöntem 'nanopore Cas9 Hedefli Dizileme' (nCATS) olarak adlandırdığımız bir yöntem.

Bunu bir Oxford Nanopore MinION akış hücresi (Kapasite >10Gb+) kullanarak 10 genomik lokusta medyan uzunluğu 18 kb olan bir medyan 165X kapsama alanı oluşturmak için, zenginleştirme olmadan elde edilen 2-3X kapsamaya göre birkaç yüz kat iyileştirmeyi temsil eden gösterdik. Daha küçük Flongle akış hücresinde bir pilot çalıştırma gerçekleştirdik (Kapasite

1Gb), medyan uzunluğu 18 kb olan 11 genomik lokusta 30X'lik bir medyan kapsama alanı oluşturur. Kılavuz RNA panellerini kullanarak, bu yöntemden elde edilen yüksek kapsama verilerinin (1) kanser sürücü genlerinde DNA metilasyon paternlerinin profilini çıkarmamıza, (2) bilinen sıcak noktalarda yapısal varyasyonları tespit etmemize ve (3) mevcudiyet için araştırma yapmamıza olanak sağladığını gösteriyoruz. tek nükleotid mutasyonları. Birlikte, bu, hücresel DNA'yı doğrudan incelemek için düşük kaynak ayarlarında bile uygulanabilen düşük maliyetli bir yöntem sağlar. Bu teknik, tıbbi olarak ilgili genleri değerlendirmek için kapsamlı klinik uygulamalara sahiptir ve hızlı ve kapsamlı bir teşhis aracı olma çok yönlülüğüne sahiptir. Bu tekniğin uygulamalarını, kanser için bir model olarak değişen tümörijenik potansiyele sahip üç meme hücre çizgisinin (MCF-10A, MCF-7, MDA-MB-231) yanı sıra iyi karakterize edilmiş GM12878 hücre çizgisini inceleyerek gösteriyoruz.

Katkılar TG ve WT çalışmayı oluşturdu. TG deneyleri gerçekleştirdi. TG, IL ve FS verileri analiz etti. TG, JG, ER, RB ve AH yöntemini geliştirdiler. TG ve WT makaleyi yazdı


Ek dosya 1:

Şekil S1. Koyun ve sığırlarda klonalite pasta grafikleri. Şekil S2. Klon spesifik PCR ile SNP doğrulaması. Şekil S3. Gerçek SNP'ler ve teknik eserler arasında ayrım yapmak. Şekil S4. BLV provirüslerinde hipermutasyon. Şekil S5. Klon spesifik PCR ile BLV yapısal varyantlarının doğrulanması. Şekil S6. HIV-1 hücre hattı U1'de SNP'ler ve rekombinasyon. Şekil S7. PCIP-seq etkinliğinin tahmini. Şekil S8. Hasta 02006'dan HIV-1 provirüs örnekleri. Şekil S9. Holstein sığırlarında kolesterol eksikliğine neden olan ERV'nin yerleştirme bölgesi. Şekil S10. Doğrulanmış BERVK2, PCIP-seq. Şekil S11. ERV BTA3_115.3 LTR'ler APOB (BTA11_77.9) ERV ile eşleşiyor. Şekil S12. Doğrulanmış enJSRV. Tablo S1. PCIP-seq'in ligasyon aracılı PCR ve Illumina dizilimi ile karşılaştırılması. Tablo S2. Her numunede tanımlanan SNP'ler. Tablo S3. PCIP-seq ile tanımlanan BLV yapısal varyantları. Tablo S4. HIV-1 hastalarının klinik bilgileri. Tablo S5. Sığırlarda PCIP-seq ile tanımlanan BERVK2'ler. Tablo S6. Koyunlarda PCIP-seq ile tanımlanan enJSRV'ler. Tablo S7. HPV18_PX ve HPV18_PY hastalarında tanımlanan HPV entegrasyon siteleri. Tablo S8. BLV'de PCIP-seq verimlilik tahmini. Ek not 1. Dairesel DNA'yı parçalamak için CRISPR-cas9 kullanımının arkasındaki mantık. Ek not 2. Kapsamın SNP araması üzerindeki etkisi. Ek Yöntemler. Ek Referanslar.

Ek dosya 2:

Veri kümesi S1. 02006 ve 06042 hastalarında tanımlanan HIV-1 entegrasyon bölgeleri.


Videoyu izle: Detection of RNA modifications and structure using nanopore sequencing - William Stephenson (Haziran 2022).