Bilgi

NpF2164g3 - Biyoloji

NpF2164g3 - Biyoloji


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Sınıf: Siyanobakteriyokrom

Aile: sistein eki

Menşei: Nostok nokta şeklinde

Kromofor(lar): PCB

Statik temel durum absorpsiyon spektrumları için gösterilmiştir. 15ZPv karanlık temel durum (mor eğri) ve 15EPÖ temel durum (turuncu eğri). Spektrumlar, 280 nm'de (gösterilmemiştir) pik absorpsiyona ölçeklendirilir.

Referanslar

  1. Foto-dönüşüm, mor/turuncu siyanobakteriokrom NpF2163g3'teki iki kromofor konjugasyonunu ve protein ikincil yapısını değiştirir. Lim S1, Rockwell NC, Martin SS, Dallas JL, Lagarias JC, Ames JB.
  2. Fitokromlarda ve siyanobakteriokromlarda çeşitli iki sistein fotosiklleri. Rockwell NC1, Martin SS, Feoktistova K, Lagarias JC.
  3. Mor/Turuncu Çift Sistein NpF2164g3 Siyanobakteriyokrom Alanının Birincil ve İkincil Fotodinamiği Nostoc Punctiforme, Sean M. Gottlieb, Peter W. Kim, Scott C. Corley, Dorte Madsen, Samuel J. Hanke, Che-Wei Chang, Nathan C. Rockwell, Shelley S. Martin, J. Clark Lagarias ve Delmar S. Larsen, Biyokimya, 53, 1029–1040 (2014).


Bilin Kromofor Bağlayıcı Cep Yakınındaki Hidrofobik Kalıntılar, Insert-Cys Alt Ailesi Siyanobakteriokromlarının Spektral Ayarını Modüle eder

Siyanobakteriokromlar (CBCR'ler), yalnızca fotosentetik siyanobakterilerde bulunan fitokrom fotoreseptörlerinin bir alt ailesidir. Ekleme bölgesinde (insert-Cys) ikinci bir Cys içeren dört CBCR, heterosistöz olmayan siyanobakteriden tanımlanmıştır. mikrokol B353 (Mbr3854g4 ve Mbl3738g2) ve nitrojen sabitleyici, heterosistöz siyanobakteri Nostok nokta (NpF2164g3 ve NpR1597g2). Bu insert-Cys CBCR'ler, UV'ye yakın ila turuncu aralığındaki ışığı algılayabilir, ancak renk hassasiyetlerinin ayarlanmasından sorumlu temel kalıntılar bildirilmemiştir. Bu çalışmada, yakın UV/Yeşil (UG) fotosensörleri Mbr3854g4 (UG1) ve Mbl3738g2 (UG2), spektral hassasiyetlerinin ve ayarlarının daha ileri spektroskopik analizi için seçilmiştir. Çoğu çift Cys CBCR ile uyumlu olarak, her iki UG, insert-Cys yoluyla fikosiyanobilin (PCB) kromoforuna ikinci bir tiyoeter bağlantısı oluşturdu. Bu bağ, ileri ve geri fotodönüşümler sırasında kırılmaya ve yeniden bağlanmaya tabidir. Kanonik kırmızı/yeşil CBCR'lerde PCB kromofor D-halkası ile yakın temas halinde olan Phe'ye eşdeğer kalıntılardaki varyasyonlar, hem karanlık hem de fotoürünlerin ışık absorpsiyon zirvelerinin ayarlanmasından sorumludur. Bu, insert-Cys ailesi CBCR'lerinde ışık absorpsiyonunu yöneten bu anahtar kalıntıların ilk kez tanımlanması ve karakterize edilmesidir.


Soyut

Siyanobakteriokromlar (CBCR'ler), yakın UV'den uzak kırmızıya (330 ila 760 nm) kadar geniş bir spektral aralığa sahip fitokrom süper ailesindeki foto-değiştirilebilir lineer tetrapirol (bilin) ​​tabanlı ışık sensörleridir. Uzak kırmızı soğurucu CBCR'lerin (frCBCR'ler) son keşfi, uzak kırmızı ışığın memeli dokusuna derin nüfuz etmesi ve CBCR protein iskelesinin küçük boyutu nedeniyle optogenetik ve görüntüleme topluluklarından büyük ilgi gördü. Mevcut çalışmalar, termofilik siyanobakteriden bir frCBCR olan JSC1_58120g3 tarafından uzak kırmızı absorpsiyonun yapısal temelini belirlemek için yapılmıştır. Leptolyngbya sp. Filogenetik olarak farklı bir sınıfın temsili üyesi olan JSC-1. Siyanobakterilerde doğal olarak bulunan bir fikobilin ve sadece birkaç ökaryotik fototrof olan fikosiyanobilini (PCB) bağlayan çoğu CBCR'nin aksine, JSC1_58120g3'ün uzak kırmızı absorpsiyonu, PCB biyosentetik ara ürünü 18 1 ,18 2 -dihidrobiliverdin'in (18 1 ,18) dahil edilmesinden kaynaklanır. 2-DHBV) yerine daha azaltılmış ve daha bol PCB. JSC1_58120g3 ayrıca daha yaygın lineer tetrapirol biliverdin IXα (BV) ile uzak kırmızı-emici bir katkı maddesi verebilir, böylece optogenetik hücre dizilerini PCB ile birlikte üretme veya tamamlama ihtiyacını ortadan kaldırır. JSC1_58120g3'ün 18 1,182-DHBV ve BV eklentilerinin yüksek çözünürlüklü X-ışını kristal yapılarını, yapı kılavuzlu mutajenez ile birlikte kullanarak, karar bağlama tercihi ve uzak kırmızı absorpsiyonu için kritik olan kalıntıları tanımladık. Uzak kırmızı algılama ve karar birleştirme, bu frCBCR soyunu, derin doku uygulamaları için sağlam optogenetik ve görüntüleme reaktifleri geliştirmek için çekici bir şablon haline getirir.

Neredeyse tüm organizmalar, ışık ortamını algılamak ve tepki vermek için fotosensör proteinleri kullanır. Birçok hayvanda, görme, bir retinal kromofor (1) kullanan tip II opsin fotoreseptörleri tarafından yönlendirilir. Tip I opsinler arkeler, bakteriler, yeşil algler ve mantarlardaki ışık kapılı proton ve iyon kanallarını içerir (2, 3). Sirkadiyen ritimlerin aydınlık/karanlık döngülerine katılması, retina bazlı opsinleri (4), flavin bazlı kriptokromları (5) veya ışık-oksijen-voltaj algılama (LOV) alanlarını (6, 7) içerebilir. LOV alanları, bitki fototropizmini kontrol eden fotoreseptörler olan fototropinlerde de bulunur (8). Lineer tetrapirol (bilin) ​​bazlı fitokrom fotoreseptörler bitkilerde, alglerde, mantarlarda, siyanobakterilerde ve diğer bakterilerde yaygındır (9, 10). Bitki fitokromları, karanlığa uyarlanmış arasında fotodönüştürmek için bil kromoforlarının 15,16 çift bağ fotoizomerizasyonunu kullanır. 15Z kırmızı emici fotostat (Pr) ve bir 15E uzak-kırmızı𠄾mici (Pfr) tohum çimlenmesi, kloroplast gelişimi, fide oluşumu, gölgeden kaçınma ve çiçeklenme dahil olmak üzere çeşitli gelişim süreçlerini düzenleyen fotoürün (9, 11, 12).

Fitokrom süper ailesinin üyeleri, optimal ışık penetrasyonu ve memeli dokusundaki hücresel bileşenlerden minimum müdahale sağlayan yakın kızılötesi pencerede güçlü absorpsiyonları nedeniyle optogenetik ve görüntüleme araçlarının geliştirilmesi için çekici hedeflerdir (13). Geri dönüşümlü kırmızı ve uzak kırmızı– aracılı bağlama Arabidopsis thaliana fitokrom B ila fitokrom etkileşim faktörleri, gen transkripsiyonunu, aktin düzeneğini ve ışık kullanarak GTP'ye bağlı sinyal modüllerini kontrol etmek için kullanılmıştır (14 �). Siyanobakteriyel fitokrom 1'in (Cph1) ışık girdi alanı kullanılarak bakterilerde foto-ters çevrilebilir transkripsiyonel kontrol de elde edildi. sinekosist sp. PCC 6803, OmpR'nin (17 �) alıcı çıkış alanına kaynaşmıştır. Bakteriyel fitokromların (BphP'ler) kapsamlı mühendisliği, kırmızıyı emen ve uzak kırmızı yayan floresan proteinler (20 �) vermiştir. BphP'ler, siyanobakteriler, algler, siyanobakteriler, algler tarafından kullanılan indirgenmiş fikobilinler, fikosiyanobilin (PCB) ve fitokromobilin (P'x003a6B) yerine daha kapsamlı bir şekilde konjuge edilmiş ve daha uzun dalga boyunu emen biliverdin IXα (BV) kromoforunu içerdikleri için bu tür uygulamalar için kullanışlı bir şablon sağlar. ve bitki fitokromları (SI Ek, Şekil S1A). PCB ve P㩫, oksijenli fotosentetik taksonlarla sınırlıdır, buna karşın BV, memeliler dahil olmak üzere daha geniş bir organizma yelpazesinde bulunur (9, 25).

BphP'leri ve bitki/siyanobakteriyel fitokromları içeren kanonik fitokromlar, çoğunlukla korunmuş, N-terminal PAS-GAF-PHY tridomain fotosensör çekirdek modülü � amino asit içeren dimerik proteinlerdir. BphP'lere dayalı daha küçük, monomerik floresan problar yaratma girişimleri başarılı olmuştur, ancak bunların en sağlamı büyük ölçüde maviye kaydırılmış spektrumlara sahiptir (26). Yakın UV'den uzak kırmızıya (27 �) kadar değişen ışığı algılayan, uzaktan ilişkili, çift-bağlamalı GAF-yalnızca fotoreseptörler olan siyanobakteriokromların (CBCR'ler) keşfi, daha küçük optogenetik raportörler ve kontrol elemanları tasarlamak için heyecan verici bir fırsat olduğunu kanıtladı. Yapı yönlendirmeli ve rastgele mutajenez yaklaşımlarını kullanan iki grup, uzak kırmızı spektral bölgede floresan uygulamaları için BV bağlayıcı CBCR'ler geliştirmiştir (37, 38). Bu tasarlanmış proteinler, tasarlanmış BV bağlayıcı fikobiliproteinlerden (39 �) daha düşük floresan kuantum verimlerine sahip olsa da, floresan CBCR'ler, foto-değiştirilebilir ve uzun süreli floresan kombinasyonundan dolayı süper çözünürlüklü mikroskopi için problar olarak henüz umut vaat edebilir (43). Mevcut uzak kırmızıyı algılayan CBCR'ler (frCBCR'ler) belki de optogenetik aktüatörler ve uzak kırmızı ışık altında ışıkla düzenlenmiş tepkiler vermek üzere foto-dönüştüren fotoakustik kontrast ajanları olarak daha fazla umut vaat ediyor. Gerçekten de, yeşil/kırmızı, UV/yeşil, mavi/ yeşil ve uzak-kırmızı/kırmızı fotosikller.

Son zamanlarda, doğal olarak oluşan frCBCR'lerin filogenetik olarak farklı iki kümesi tanımlandı. İlk frCBCR kümesinin üyeleri, yalnızca Acaryokloris marinası MBIC 11017. Bu frCBCR'ler, PCB'nin yokluğunda BV'yi dahil etme yetenekleri nedeniyle uzak kırmızı ışığı algılar (37, 46 �). Bu frCBCR dizisi, e X eğilimli Kırmızı/Yeşil (XRG) CBCR soyu içinde ortaya çıktı ve temsili üyeler, BV'ye bağlandıklarında tipik olarak uzak kırmızı/turuncu (FR/O) fotosiklleri sergilerler (15Z λmaksimum ∼ 697 - 702 nm) ve PCB'ye bağlandığında kırmızı/yeşil fotosikller (47 �). BV bağlanmasını (37) sağlamak için yeterli dört korunmuş kalıntıya dayanarak, bu frCBCR ailesine AmBV4 soyu olarak atıfta bulunacağız. İlginçtir, A. marina MBIC 11017, PCB biyosentezi için alışılmadık derecede karmaşık bir yola sahiptir. Bu siyanobakteri, BV'yi PCB'ye dönüştüren ferredoksin bağımlı çift redüktaz PcyA'yı çoğaltmıştır (46, 50, 51). Bu enzimlerden biri BV'yi hızla PCB'ye çevirir, diğeri ise AmBV4 CBCR'lerin de bağlayabildiği 18 1 ,18 2-dihidroBV (18 1 ,18 2-DHBV) ara ürününü biriktiren daha yavaş bir enzimdir (46). Bunun yerine ikinci frCBCR kümesi, XRG soyundan evrimsel olarak uzak olan daha büyük yeşil/kırmızı (GGR) soy içinde ortaya çıktı (52). Bu frCBCR'lere, BÜYÜK YEŞİL/KIRILDI (FRoGGR) CBCR'lerinin Uzak Uzaklığı olarak değineceğiz. FRoGGR'ler PCB içerir ve PCB'den türetilen kromoforlarla (λ) karanlık durumlarında bilinen en kırmızıya kaymalı absorpsiyon sergiler.maksimum 725 ila 755 nm) ancak BV'yi (35) bağlamayın.

Bu raporda, üçüncü bir frCBCR grubunu karakterize ediyoruz. Uzak-kırmızı/kırmızı (FR/R) CBCR JSC1_58120g3 ile belirtilir. Leptolyngbya sp. yakın zamanda uzak kırmızıya duyarlı bir cPAC (45) tasarlamak için kullanılan JSC-1 suşu, bu frCBCR soyunun üyeleri fikobilinleri hariç tutar ve uzak kırmızı absorpsiyon maksimumu olan sensörler (& #x003bbmaksimum 712 ila 728 nm). Bu monofiletik CBCR sınıfı da XRG soyu içinde ortaya çıktı, ancak AmBV4 frCBCR sınıfından filogenetik olarak farklıdır. JSC1_58120g3'ün yüksek çözünürlüklü kristal yapıları, azaltılmış A-halkalarına sahip fikobilinlerin dışlanması için gerekli olduğunu gösterdiğimiz bilin A-halkasının yakınında korunmuş bir prolin kalıntısını tanımlar. BV'yi bağlama konusundaki içsel yetenekleri ve AmBV4 proteinlerine göre kırmızıya kaydırılmış FR/R fotosiklleri nedeniyle, bu frCBCR'lerin uzak kırmızı optogenetik ve/veya uzak kırmızı görüntüleme uygulamaları için mükemmel adaylar olacağını öneriyoruz.


Sonuçlar

BV Kuruluşu için Önemli Kalıntıların Belirlenmesi.

AnPixJg2'nin BV'yi dahil edip edemeyeceğini kontrol etmek için His-tagged AnPixJg2, BV üretenden saflaştırıldı. Escherichia koli. AnPixJg2, BV'yi bağlayabilmesine ve 698 nm'de maksimum absorbanslı bir Pfr formu ile 614 nm'de maksimuma sahip bir Po formu arasında tersinir foto-dönüşüm göstermesine rağmen, AM1_C0023g2 (%70) ile karşılaştırıldığında bağlanma verimliliği oldukça düşüktü (%3.7 ± 1.9) ve AM1_1557g2 (%40) (Şek. 1 A ve B, Tablo 1 ve SI Ek, Şekil S2 A ve B) (25, 26). AM1_1870g3'ün BV bağlama etkinliğinin AnPixJg2'ninki kadar düşük olduğunu da bildirdik (27). Bu gerçekler, AnPixJg2 yapısına (24) dayanan bir dizi karşılaştırmasının, BV katılımının moleküler mekanizmasına dair ipuçları sağlayabileceğini düşündürmektedir. Bu karşılaştırmadan, kromoforun 6 A'sı içinde AM1_C0023g2 ve AM1_1557g2 arasında, yani AM1_C0023g2'de Val273, Gln307, Tyr310, Lys318, Thr325, Ser334, Tyr335, Asp337 ve Val353 arasında dokuz kalıntının spesifik olarak korunduğunu bulduk. Bunlar, AnPixJg2'de Ala256, Glu290, His293, Arg301, Phe308, Gly317, His318, Ser320 ve Ile336 kalıntılarına karşılık gelir (SI Ek, Şekil S1 C ve NS). Bunlar arasında, Ser334/Gly317 pozisyonunun AM1_C0023g2'de BV bağlanması için önemli olduğu zaten gösterilmiştir ve Ser334'ün Gly ile değiştirilmesi, BV bağlayıcı holoproteinin stabilitesini arttırır (25). Bu, AnPixJg2'deki Gly317'nin BV bağlama yeteneği için potansiyel olarak önemli olduğunu gösterir. Bu nedenle, AnPixJg2'deki diğer sekiz kalıntıya odaklandık (Gly/Ser pozisyonunun detayları, "Gly/Ser pozisyonu" bölümünde verilmiştir. SI Ek) ve AnPixJg2'de bireysel siteye yönelik mutajenezler gerçekleştirdi: A256V, E290S, H293Y, R301K, F308NS318Y, S320D ve ben336V. Hepsi E. koli Bu varyantları eksprese eden hücreler benzer renkler sergilediler ve vahşi tip proteini eksprese edenlerden görsel olarak ayırt edilemezdi (SI Ek, Şekil S1E).

BV birleşimi için AnPixJg2'nin protein mühendisliği. (A) İşlenmemiş AnPixJg2 vahşi türün fenotipleri. Gösterilenler E. koli hücre peleti (Sol üst), uzak kırmızı veya turuncu ışıkla ışınlama üzerine bir çözeltinin renk değişimi (Sağ üst), karanlık durumun normalize absorpsiyon spektrumları (Pfr formu, koyu kırmızı) ve fotoürün (Po formu, turuncu) (Daha düşük). (B) BV-bağlama verimleri (Üst, koyu pembe) ve göreli ifade geliştirmeleri (Daha düşük, açık mavi) AnPixJg2 ve türevleri. Verimlilik, protein ve kromofor konsantrasyonlarına (ortalama ± SD, n = 5). Geliştirmeler, kromatografi sırasında 700 nm'de absorbans pik alanına dayalı olarak tahmin edildi ve taze hücre ağırlığına normalleştirildi (ortalama ± SD, n = 4). Detaylar verildi Malzemeler ve yöntemler. AnPixJg2_BV4 ile karşılaştırıldığında önemli farklılıklar Öğrenci tarafından istatistiksel olarak gösterildi T Ölçek (*P < 0.05 ve **P < 0.01, sırasıyla). (C) Tasarlanmış AnPixJg2_BV4'ün fenotipleri. Gösterilenler E. koli hücre peleti (Sol üst), uzak kırmızı veya turuncu ışıkla ışınlama üzerine bir çözeltinin renk değişimi (Sağ üst) ve karanlık durum ve fotoürünün normalize absorpsiyon spektrumları (Daha düşük).

BV'ye bağlı AnPixJg2 ve varyantlarının biyokimyasal özellikleri

Böylece, sekiz AnPixJg2 tortusunun eşzamanlı olarak AM1_C0023g2 ve AM1_1557g2 arasında korunan karşılık gelen tortularla değiştirildiği bir mutant oluşturduk. Mutant, AnPixJg2_BV8 (A256V, E290S, H293Y, R301K, F308NS318Y, S320D ve ben336V), uzak-kırmızı/turuncu tersinir foto-dönüşümü koruyarak BV birleşmesinde önemli bir gelişme sergiledi. Varyant proteinlerin BV birleştirme kabiliyetini değerlendirmek için iki parametre belirledik: saflaştırılmış proteinin BV bağlama etkinliği ve vahşi tip proteine ​​göre holoproteinin ekspresyon geliştirmesi (hesaplama detayları şu şekilde tanımlanmıştır: Malzemeler ve yöntemler). AnPixJg2_BV8'in bağlanma verimliliği ve ekspresyon geliştirmesi sırasıyla %52.6 ± %9.1 ve 52.6 ± 19.5 kattı (Şekil 1B, Tablo 1 ve SI Ek, Şekil S2 A ve B).

PCB bağlayıcı AnPixJg2 yapısına dayanarak, Ala256, Glu290 ve Ser320 yan zincirlerinin kromofor bağlanmasına doğrudan dahil olma olasılığı düşüktür (SI Ek, Şekil S1C). Ayrıca, siyanobakteriden başka bir BV bağlayıcı CBCR GAF alanı olan AM1_6305g2 tanımladık. A. marina (SI Ek, Şekil S3 ve Tablo S1). Bu alan, AnPixJg2'de Arg301'e karşılık gelen konumda AM1_C0023g2 ve AM1_1557g2'deki Lys yerine bir His'e sahiptir (SI Ek, Şekil S1NS). Böylece, bir mutant oluşturduk, AnPixJg2_BV4 (H293Y, F308NS318ve ben336V), yukarıda bahsedilen dört kalıntının orijinallerine döndürüldüğü. Mutant BV'yi bağlayabildi, uzak-kırmızı/turuncu tersinir foto-dönüşüm sergiledi ve bağlanma etkinliği ve ekspresyon geliştirmesi sırasıyla AnPixJg2_BV8'inkinden önemli ölçüde daha yüksek olan sırasıyla %74.7 ± %13.0 ve 75,7 ± 8.6 kat idi (Şekil 1). B ve C, Tablo 1 ve SI Ek, Şekil S2 A ve B). Bu, yalnızca diğer dört kalıntının BV bağlanması için vazgeçilmez olduğunu değil, aynı zamanda bazılarının aslında inhibitör olduğunu gösterir.

Mutagenize edilmiş kalıntıların sayısını daha da azaltmak için, her mutasyona uğramış AnPixJg2_BV4 kalıntısının orijinaline geri döndürüldüğü dört tür mutant oluşturduk: AnPixJg2_BV3H293 (F308NS318ve ben336V), AnPixJg2_BV3F308 (H293Y, H318ve ben336V), AnPixJg2_BV3H318 (H293Y, F308T ve ben336V) ve AnPixJg2_BV3I336 (H293Y, F308T ve H318Y). Tüm mutantlar, uzak-kırmızı/turuncu tersinir foto-dönüşüm sergilemiştir (SI Ek, Şekil S2A). AnPixJg2_BV3'ün bağlama verimliliğiH293, AnPixJg2_BV3F308, AnPixJg2_BV3H318ve AnPixJg2_BV3I336 sırasıyla %54.2 ± %18.6, 4.0 ± %2.1, %41.4 ± %15.7 ve %38.5 ± %13.8 iken, ekspresyon artışları sırasıyla 44.7 ± 4.0, 1.3 ± 0.3, 49.0 ± 3.4 ve 22.5 ± 5.9 kat idi. (Şek. 1B, Tablo 1 ve SI Ek, Şekil S2B). Tüm AnPixJg2_BV3 varyantlarının bağlanma verimliliği ve ifade geliştirmesi, AnPixJg2_BV4'ünkinden önemli ölçüde düşüktü, ancak AnPixJg2_BV3F308 hem bağlanma verimliliğinde hem de ifade geliştirmede en büyük azalmaları sergiledi, bu da BV birleşmesinde en önemli rolü oynadığını öne sürdü. Ayrıca, AnPixJg2_BV3I336 ifade geliştirmede AnPixJg2_BV3'ten daha büyük bir kusur sergilediH293 ve AnPixJg2_BV3H318, öneren I336V değişimi H'den daha önemli bir rol oynayabilir293Y ve H318Y değiştirmeler. Bu düşünce bizi AnPixJg2_BV2 (F308T ve ben336V). AnPixJg2_BV2, BV'yi %37.8 ± %21.3 bağlama verimliliği ve 23.1 ± 7.4 kat ifade geliştirme ile bağladı ve uzak kırmızı/turuncu tersinir foto-dönüşüm sergiledi (Şekil 1B, Tablo 1 ve SI Ek, Şekil S2 A ve B). Bağlanma verimliliği ve ifade geliştirmesi, AnPixJg2_BV3'ünkinden biraz daha düşük olmasına rağmenH293 ve AnPixJg2_BV3H318, AnPixJg2_BV2, vahşi tip protein ile karşılaştırıldığında orta derecede yüksek bir BV-birleşme kabiliyetini korumuştur. Ayrıca, AnPixJg2_F'yi zaten kurmuştuk308T ve AnPixJg2_I336V ve BV-bağlanma verimlerinin (sırasıyla % 10.1 ± %10.1 ve %13.0 ± 6.7) ve ifade geliştirmelerinin (sırasıyla 3.5 ± 1.0 ve 5.5 ± 0.8 kat) AnPixJg2_BV2'ninkinden önemli ölçüde düşük olduğunu bulmuşlardır (Şek. 1B, Tablo 1 ve SI Ek, Şekil S2 A ve B). Toplu olarak, bu sonuçlar, Tyr293, Thr308, Tyr318 ve Val336 kalıntılarının BV dahil edilmesi için gerekli olduğunu, Thr308 ve Val336 ile Tyr293 ve Tyr318'den daha kritik olma ihtimalinin yüksek olduğunu gösterdi.Sonuç olarak, AnPixJg2_BV4, en verimli ve istikrarlı BV birleşimini sergileyen varyanttır. Bölüm "AnPixJg2 ve çeşitlerinin spektral karşılaştırması" içinde SI Ek bu varyant proteinlerin spektral özelliklerinin ayrıntılarını sunar (Tablo 1 ve SI Ek, Şekil S2 A, C, ve NS).

BV Incorporation'a Yapısal Öngörüler.

BV katılımının moleküler mekanizması hakkında doğrudan bilgi edinmek için, AnPixJg2_BV4'ün Pfr formunun kristal yapısını (1.6 Å çözünürlük) belirledik (SI Ek, Şekil S4 AC ve Tablo S2, bkz. "SI Ek, Kristal Yapı Tayini”, AnPixJg2 varyantları arasında en iyi BV birleşimini sergileyen). BV'ye bağlı AnPixJg2_BV4'ün genel yapısı, PCB'ye bağlı AnPixJg2'ninkine oldukça benzerdi (kök ortalama kare sapma, 233-388 tortularının Cα atomları için 0.908 A idi), ancak N-terminal α-sarmalının yönlendirilmiş olması dışında. kristal paketlemeden türetilen bir artefakt olabilen zıt yön (SI Ek, Şekil S4 NS ve E). Özellikle elektron yoğunluk haritaları (2|FÖ| − |FC|), AnPixJg2_BV4'ün kanonik Cys tortusunun (Cys321) BV'nin vinil grubunda C3 2 pozisyonuna bağlandığını, buna karşın AnPixJg2'ninkinin PCB'nin etiliden grubunda C3 1 pozisyonuna bağlandığını açıkça gösterdi (Şekil 2 A ve B ve SI Ek, Şekil S4 NS ve E). A halkasının C3'ü ve Cys321'in kükürt atomu arasındaki kovalent bağ bağlantısına ek karbon (C32) eklendiğinden, AnPixJg2_BV4'e dahil edilen BV, kaymanın şu şekilde hesaplandığı WT yapısının PCB'sine göre kaydırıldı. yaklaşık 0.75 Å. C halkasının, AnPixJg2'ye dahil edilen PCB ile karşılaştırıldığında kromofor bağlama cebinin β-tabakalarına doğru kaydığı not edilmelidir (Şekil 2).C). Bununla birlikte, kromofor stabilitesi için önemli olduğu bildirilen beş kalıntının (Trp289, Asp291, Arg301, His322 ve Tyr352) yapısal düzenlemeleri (24) bu iki yapı arasında yüksek oranda korunmuştur (Şekil 2). A ve B ve SI Ek, Şekil S4 F ve G, sırasıyla sarı yeşil ve koyu pembe olarak gösterilmiştir). Tyr352, β-tabakalarında yer almasına rağmen, etkileşim ortağı D halkası karbonil grubu, β-tabakalarına doğru neredeyse hiç kaymadı ve bu nedenle bu etkileşim, bu iki yapı arasında korunmalıdır. Arg301, iki proteinde farklı şekillerde kromofor bağlanmasına katıldı. AnPixJg2_BV4'te, bir su molekülü aracılığıyla hidrojen bağlayarak BV halka C propiyonatını stabilize ederken, AnPixJg2'de hidrojen bağları yoluyla aynı PCB propiyonatı ile doğrudan etkileşime girdi.

AnPixJg2_BV4'ün BV'ye bağlı Pfr formunun kristal yapısı (PDB ID kodu: 5ZOH), PCB'ye bağlı AnPixJg2'nin Pr formununkiyle (PDB ID kodu: 3W2Z) karşılaştırıldığında. (A ve B) AnPixJg2_BV4 (sırasıyla koyu pembe ve koyu kırmızı) ve AnPixJg2'de (sırasıyla sarı yeşil ve mavi yeşil) korunmuş ve BV4 kalıntılarının yapısal düzenlemeleri. (C) BV (açık yeşil) ve PCB (mavi) arasında standart Cys (Cys321) ile çubuk modeli olarak gösterilen ve β-tabakalarını şerit modeli olarak gösteren yapısal karşılaştırma. (NS) Phe/Thr308 ve Ile/Val336 kalıntılı kromoforların boşluk doldurma modelleri: AnPixJg2_BV4 (Üst) ve BV'nin AnPixJg2 üzerine bindirilmesi (Orta) ve AnPixJg2 (Daha düşük).

Özellikle, dört mutasyon bölgesinin (His293, Phe308, His318 ve Ile336) yan zincirleri her iki yapıdaki kromoforların C halkası etrafında konumlandırılmış olsa da, bu yan zincirlerin protein-kromofor etkileşimleri bu iki yapı arasında tamamen farklıydı ( İncir. 2 A ve B ve SI Ek, Şekil S4 F ve G, sırasıyla mavi yeşil ve koyu kırmızı olarak gösterilir). Phe/Thr308 ve Ile/Val336 pozisyonlarında, AnPixJg2'nin hacimli Phe308 ve Ile336 tortuları, hidrofobik etkileşimlerle C halkasını tuttu (Şekil 2).NS, Daha düşük). Bu tortular, C halkasının etrafındaki β-tabakalarında yer aldığından, bu tortular, kromofor kaymasından etkilenmelidir. AnPixJg2'nin BV'yi verimli bir şekilde bağlayamaması, bu hacimli kalıntıların, PCB'ye kıyasla büyük ölçüde β-tabakalarına doğru kaydırılan C halkasının sterik engellemesine neden olabileceği anlamına gelir (Şekil 2).C). Bu yorum, BV'nin AnPixJg2 yapısı üzerine bindirilmesiyle desteklenir (Şekil 2NS, Orta). Tersine, AnPixJg2_BV4'ün kompakt Thr308 ve Val336 kalıntıları, C halkası ile sterik engellemeden kaçındı (Şekil 2NS, Üst). BV'nin C halkası propiyonatının B-C düzlemine doğru dikey bir yönde olması dikkat çekicidir, oysa PCB'ninki düzleme paralel uzanmaktadır (Şekil 2). A ve B). Bu, sadece kompakt kalıntılarla yer değiştirmenin değil, aynı zamanda halka C propiyonatının esnek bir yeniden düzenlenmesinin de BV dahil edilmesi için önemli olduğunu göstermektedir (Şekil 2). A ve B). Bu bağlamda, His/Tyr293 ve His/Tyr318 konumlarındaki diğer değiştirmeler yeniden düzenlemeye katkıda bulunur (Şekil 2). A ve B ve SI Ek, Şekil S4 F ve G). AnPixJg2'nin His318'i, PCB'nin B halkası propiyonatı ile doğrudan bir hidrojen bağı ile etkileşime girerken, AnPixJg2_BV4'ün Tyr318'i, BV'nin C halkası propiyonatı ile doğrudan hidrojen bağlanmıştır. AnPixJg2'nin His293'ü, bir su molekülü aracılığıyla hidrojen bağlayarak PCB'nin halka C propiyonatını stabilize ederken, AnPixJg2_BV4'ün Tyr293'ü kromofor ile herhangi bir hidrojen bağı oluşturmadı. Bu ayırt edici etkileşim ağları, C halkası propiyonatının "paralel" ve "dikey" biçimlerini kolaylaştırmalıdır. Yani, His318'in Tyr ile değiştirilmesi, etkileşim ortağının halka B propiyonatından halka C propiyonatına geçmesine ve doğrudan dikey konformasyona katkıda bulunmasına neden olurken, His293'ün Tyr ile değiştirilmesi, katkıda bulunmak için halka C propiyonat ile hidrojen bağlarının çıkarılmasıyla sonuçlandı. paralel yapının istikrarsızlaştırılması. Ayrıca, Thr308'in hidroksi grubu, bir su molekülü aracılığıyla BV'nin C halkası propiyonatı ile dolaylı olarak hidrojen bağlanmıştır (Şekil 2A ve SI Ek, Şekil S4F), bu da dikey konformasyonu kolaylaştırdı. Bu, Phe308'in Thr ile değiştirilmesinin sadece sterik engellemenin azaltılması üzerinde değil, aynı zamanda F'nin gerçeğiyle tutarlı olan halka C propiyonatının yeniden düzenlenmesi üzerinde de etkileri olduğunu gösterir.308T replasmanı, verimli BV birleşmesi üzerinde en büyük katkıya sahipti (Şekil 1B ve Tablo 1). Sonuç olarak, AnPixJg2_BV4'teki bu dört kalıntı, kromofor kayması tarafından tetiklenen sorunları çözmek için işbirliği içinde çalışır ve kararlı BV katılımı ile sonuçlanır.

Diğer GAF Etki Alanlarının Protein Mühendisliği.

Stratejimizi XRG soyu içindeki diğer CBCR GAF alanlarına genişletmek için, atipik spektral özelliklere sahip bir PCB kromoforu olan birkaç alanı hedefledik: AnPixJg4 (Pg-to-Pr hızlı karanlık reversiyon) (28) AM1_1186g2 (kırmızı/mavi tersinir foto-dönüşüm) (29) AM1_1870g3 (kırmızıya kaydırılmış kırmızı/yeşil tersinir foto-dönüşüm) (27) NpF2164g3 (mor/turuncu tersinir foto-dönüşüm) (30) ve NpF2164g5 (foto-dönüşümsüz yoğun uzak kırmızı floresan) (31). Çünkü tüm bu vahşi tip proteinler çok az BV katılımı sergilemekte veya hiç içermemektedir (Şekil 3 AC ve SI Ek, Şekil S5 AJ ve Tablo S1), AnPixJg2_BV4 dizisine (SI Ek, Şekil S5K).

BV dahil edilmesi için diğer XRG CBCR GAF alanlarının protein mühendisliği. (A) AnPixJg4'ün (noktalı) koyu hallerinin (Pfr formu, koyu kırmızı) ve fotoürünlerinin (Po formu, turuncu) ve BV'ye (katı) bağlı BV4 varyantının normalleştirilmiş absorpsiyon spektrumları. (B) Karanlık durumların normalize absorpsiyon spektrumları ve AM1_1870g3 (noktalı) ve BV4 varyantının BV'ye (katı) bağlı fotoürünleri. (C) NpF2164g5'in (noktalı) karanlık durumlarının ve BV'ye bağlı BV4 varyantının (katı) normalleştirilmiş absorpsiyon spektrumları. (NS) Açıktan koyuya geçiş sırasında AnPixJg4_BV4 (sarı) ve AnPixJg2_BV4'ün (yeşil) normalleştirilmiş absorbans değişiklikleri. AnPixJg4_BV4 ve AnPixJg2_BV4'ün yarı ömürleri 2,8 s ± 0,1 ve 1,199 s ± 12.9 (ortalama ± SD, n = 3) sırasıyla 25 °C'de. (E) AM1_1870g3_BV4 (kırmızı) ve AnPixJg2_BV4'ün (yeşil) normalleştirilmiş fark absorpsiyon spektrumları (Pfr – Po). Pozitif tepe noktaları sırasıyla 718 nm ve 700 nm'deydi. (F) BV'ye (derin renkler) bağlı NpF2164g5_BV4'ün ve PCB'ye (açık renkler) bağlı NpF2164g5'in normalleştirilmiş floresan uyarımı (mavi) ve floresan emisyon spektrumları (kırmızı). BV'ye bağlı NpF2164g5_BV4'ün floresan uyarımı ve emisyon zirveleri sırasıyla 680 nm ve 700 nm'deyken, PCB'ye bağlı NpF2164g5'inkiler sırasıyla 637 nm ve 656 nm'deydi.

AnPixJg4, AM1_1870g3 ve NpF2164g5'e mutasyonların eklenmesi, sırasıyla %44, %82 ve %70 olan BV-bağlanma verimlerini önemli ölçüde iyileştirdi (Şekil 3 AC ve SI Ek, Şekil S5 AC ve FH ve Tablo S1). Buna karşılık, aynı mutasyonların, kromofora yakın dizileri, AnPixJg2 dahil olmak üzere tipik XRG CBCR GAF alanlarından büyük ölçüde farklı olan AM1_1186g2 ve NpF2164g3'e dahil edilmesi, BV-bağlanma verimlerini iyileştirmedi (SI Ek, Şekil S5 NS, E, ben, ve J ve Tablo S1). AnPixJg4_BV4, AnPixJg4_BV4 karanlık reversiyonunun yarı ömrünün 25 °C'de 2.8 s ± 0.1 olduğu Pfr-to-Po foto-dönüşüm ve hızlı Po-Pfr karanlık reversiyon sergiledi. Bu, AnPixJg2_BV4'ünkinden yaklaşık 400 kat daha hızlıdır (1,199 s ± 12.9, 25 °C'de) (Şekil 3 A ve NS ve SI Ek, Şekil S5A). Daha hızlı karanlığa dönüş, biyolojik aktivitelerin monokromatik uzak kırmızı ışık aydınlatması ile düzenlenmesini sağlar. AM1_1870g3_BV4, fark spektrumu (Pfr – Po) 718 nm'de pozitif bir tepeye sahip olan, AnPixJg2_BV4'ünkiyle karşılaştırıldığında 18 nm kırmızıya kaydırılan uzak-kırmızı/turuncu tersinir foto-dönüşüm sergiledi (Şekil 3 B ve E ve SI Ek, Şekil S5B). Bu kırmızıya kayma özelliği, memelilerde derin dokularda optogenetik kontrol için avantajlıdır. NpF2164g5_BV4, foto-dönüşüm olmadan uzak kırmızı ışığı kararlı bir şekilde emdi ve %4 kuantum verimiyle yakın kızılötesi (NIR) bölgeyi kaplayan floresan sergiledi. BV'ye bağlı NpF2164g5_BV4'ün uyarılma ve emisyon spektrumları sırasıyla 680 nm ve 700 nm'de zirve yaptı ve PCB'ye bağlı NpF2164g5'inkiyle karşılaştırıldığında kırmızıya kaydırıldı (Şekil 3 C ve F ve SI Ek, Şekil S5C). Floresan uyarma spektrumunun, heterojen popülasyonu yansıtabilecek 641 nm'de belirgin bir omuz gösterdiğine dikkat edilmelidir. Bu eşsiz floresan özelliğini anlamak için bu molekülün yapı tespiti gibi detaylı çalışmalara ihtiyaç vardır. Buna karşılık, AnPixJg2_BV2 ve AnPixJg2_BV3'e dayalı varyant proteinlerH293 diziler BV'yi verimli bir şekilde bağlayamadı (SI Ek, Şekil S5 AC). Bu sonuçlar, “BV4” değişiminin, BV bağlama yeteneği üretmek için sağlam bir mühendislik tasarımı olduğunu göstermektedir.

NpF2164g5_BV4 Kullanarak Canlı Farelerde Floresan Görüntüleme.

Kompakt NIR floresan proteini NpF2164g5_BV4'ün canlı farelerde in vivo görüntülemeye uygulanabilir olduğunu gösteriyoruz. Uygulanabilirliğini belirlemek için, önce canlı bir memeli hücresinde NpF2164g5_BV4'ün NIR floresansının gözlemlenip gözlemlenemediğini test ettik. COS-7 hücreleri, NpF2164g5_BV4 ile transfekte edildi. BV ile inkübasyondan sonra, hücreler bir konfokal floresan mikroskobu kullanılarak görüntülendi. NpF2164g5_BV4'ün NIR floresansını nicel olarak değerlendirmek için, onu yeşil floresan protein (GFP) ile kaynaştırdık ve NIR floresanını GFP floresanına bölerek ekspresyon seviyelerindeki varyasyonları normalleştirdik. NpF2164g5_BV4 ifade eden hücreler, negatif kontrol olarak GFP ifade edenlere kıyasla parlak NIR floresansı sergilediler (Şekil 4 A ve B). Daha sonra, NpF2164g5_BV4'ün NIR floresansının canlı farelerde in vivo olarak görüntülenip görüntülenemeyeceğini inceledik. Hidrodinamik kuyruk damarı (HTV) enjeksiyonu ile geçici olarak fare karaciğerini NpF2164g5_BV4 ile transfekte ettik. Transfekte edilmiş fareler, i.v. BV ile enjekte edildi ve ardından bir in vivo floresan görüntüleyici kullanılarak görüntülendi. NpF2164g5_BV4'ün NIR floresansı, transfekte edilmiş farelerin karaciğerinden gözlemlendi (Şekil 4 C ve NS). Ek olarak, transfekte edilmiş farelerden izole edilen karaciğerin, enjekte edilmemiş farelere kıyasla parlak NIR floresansı sergilediği doğrulandı (Şekil 4). E ve F). Bu sonuçlar, NpF2164g5_BV4'ün canlı farelerin derin dokularının in vivo floresan görüntülemesine uygulanabilir olduğunu gösterir.

NpF2164g5_BV4 kullanılarak canlı memeli hücrelerinde ve farelerde floresan görüntüleme. (A) GFP-NpF2164g5_BV4 ile transfekte edilmiş COS-7 hücrelerinin eş odaklı floresan görüntüleri (Sol), negatif kontrol olarak GFP (Merkez) veya GFP-iRFP (Doğru). 633 nm'de uyarma üzerine 640 nm'de NIR floresansı tespit edildi. GFP floresansı, 488 nm'de uyarma üzerine 500 nm'de tespit edildi. Her görüntünün altındaki renk çubuğu, floresan yoğunluğu (FI) aralığını gösterir. Üç bağımsız deneyden temsili görüntüler (n = 24). (B) GFP-NpF2164g5_BV4, negatif kontrol olarak GFP veya GFP-iRFP ile transfekte edilmiş COS-7 hücrelerinin NIR floresan yoğunlukları. Transfekte edilmiş hücreler arasında ekspresyon seviyelerindeki varyasyonları normalleştirmek için NIR floresansı, GFP floresanına bölündü. Veriler ortalama ± SD (n = 24, üç bağımsız deneyden). Çubukların üzerindeki sayılar ortalama değerleri gösterir. Veriler, iki kuyruklu Welch's tarafından istatistiksel olarak analiz edildi. T Ölçek (*P < 0.05). (C) Canlı farelerin ışık ve NIR floresan görüntülerinin kaplaması. GFP-NpF2164g5_BV4 (C, Sol) ve negatif kontrol olarak enjekte edilmemiş fare (Doğru). NIR floresan görüntüleri, 630 ± 6.5 nm'de eksitasyon ve 700 ± 37.5 nm'de emisyon ile elde edildi ve fare dokularının otofloresansından NIR floresanını çıkarmak için spektral olarak karıştırılmadı. Ayrıntılar şurada verilmiştir: Malzemeler ve yöntemler. Floresan yoğunlukları sözde renkte gösterilir. İki bağımsız deneyden temsili görüntüler (n = 3). (NS) GFP-NpF2164g5_BV4 ile transfekte edilmiş veya enjekte edilmemiş (ortalama ± SD, n = 3, iki bağımsız deneyden). Veriler, iki kuyruklu Welch's tarafından istatistiksel olarak analiz edildi. T Ölçek (*P < 0.05). (E) Transfekte edilmiş fareden izole edilen karaciğerin NIR floresan görüntüleri (Üst) ve enjekte edilmemiş fare (Daha düşük). Gösterilenler hafif görüntüdür (E, Sol) ve 630 ± 6.5 nm'de eksitasyon ve 700 ± 37.5 nm'de emisyon ile elde edilen NIR floresan görüntüsü (Doğru). Floresan yoğunlukları sözde renkte gösterilir. Temsili görüntüler iki bağımsız deneyden alınmıştır (n = 3). (F) GFP-NpF2164g5_BV4 ile transfekte edilmiş veya enjekte edilmemiş farelerden izole edilen karaciğerin floresan yoğunlukları (ortalama ± SD, n = 3, iki bağımsız deneyden). Veriler, iki kuyruklu Welch's tarafından istatistiksel olarak analiz edildi. T Ölçek (*P < 0.05). (Ölçek çubukları: A, 20 mikron E, 1cm.)

NpF2164g5_BV4'ü, in vivo floresan görüntüleme için yaygın olarak kullanılan yakın kızılötesi bir floresan protein olan iRFP ile karşılaştırdık (6). iRFP ile transfekte edilmiş COS-7 hücreleri, NpF2164g5_BV4 durumunda olduğu gibi görüntülemeden önce BV ile inkübe edildi. iRFP daha önce BV'ye bağlı bir bakteriyofitokromun kapsamlı mutagenezi ile tasarlanmıştı. RpD gibi BphP2202H mutasyonu, fotodönüşümünü inhibe eder ve floresansını büyük ölçüde artırmak için BV'nin D halkası etrafındakiler dahil olmak üzere ilave 13 mutasyon (6). Bununla birlikte, NpF2164g5_BV4, BV-bağlanma özelliği kazandırmak için B ve C halkaları çevresinde mutasyonlara sahiptir, ancak floresansını iyileştirmek için henüz BV'nin D halkası çevresinde mutageneze tabi tutulmamıştır. Bununla birlikte, NpF2164g5_BV4'ün NIR floresan yoğunluğu şimdiden iRFP'ninkinin %20'sine ulaşmıştır (Şekil 4 A ve B), NpF2164g5_BV4'ün in vivo floresan görüntüleme için güçlü, kompakt bir NIR floresan probu geliştirmek için bir platform olabileceğini düşündürmektedir.


NpF2164g3 - Biyoloji

Siyanobakteriokromlar (CBCR'ler), fitokromlarla uzaktan ilişkili siyanobakteriyel fotoreseptörlerdir. Fitokromlar gibi, CBCR'ler de bilin kromoforlarının fotoizomerizasyonuna eşlik eden iki fotostat arasında fotointerkonversiyon yapar. Fitokromlar tipik olarak kırmızı/uzak kırmızı fotosikller sergilerken, CBCR fotosiklleri çok daha çeşitlidir ve yakın-ultraviyole ve tüm görünür bölgeyi kapsar. Bugüne kadar tarif edilen tüm CBCR'ler, lineer tetrapirol (bilin) ​​kromoforuna kovalent olarak bağlı korunmuş bir Cys kalıntısına sahiptir, iki CBCR alt ailesi de yakın morötesi ila mavi ışığın saptanması için kromofora ikinci bir tiyoeter bağlantısını kullanır. Burada, ikinci sınıf iki sistein CBCR'nin bir temsilcisi olan insert-Cys CBCR NpF2164g3'ün fotodinamik analizini sunuyoruz. Geniş bantlı geçici absorpsiyon pompası-sonda spektroskopisini kullanarak, doksan yıllık bir süre boyunca fotodinamiği inceleyerek birincil (100 fs ila 10 ns) ve ikincil (10 ns ila 1 ms) fotodinamiği her iki yönde karakterize ediyoruz. Birincil izomerizasyon dinamikleri, hem ileri hem de geri reaksiyonlar için ∼10 ps zaman ölçeğinde meydana gelir. Diğer iki sistein CBCR sınıfının bir temsilcisi olan Tlr0924 ile ilgili önceki çalışmaların aksine, ikinci bağlantının oluşumu ve ortadan kaldırılması burada incelenen 1 ms'lik deneysel aralıktan daha yavaştır. Bu sonuçlar, fitokrom süper ailesindeki çift sistein CBCR fotosiklik anlayışımızı genişletiyor.


Belge: Photochemische und strukturelle Untersuchungen neuartiger Bilin-bindender Photorezeptoren

Diese Thesis Beinhaltet insbesondere die kinetische Untersuchung verchiedener Photozyklen in Bezug auf mögliche Intermediate und deren Lebenszeiten. Dabei werden klassische Fitokrom aus den Familien der siyanobakteriellen (Cph), der bakteriyofi-tokrom (BphP) ve pilzlichen (Fph) Fitokrom als auch die neuartigen Siyanobakteriokrom (CBCR'ler) untersucht. Die zeitaufgelösten kinetischen Absorpsiyonlar-messungen wurden mittels der Methode der Blitzlichtphotolyse durchgeführt.

i) Vergleich der Photozyklen klassischer Fitokrom
Der erste Teil dieser Phytochromen aus drei Phytochrom-Unterfamilien ile ilgili bir tez. Untersucht wurde SynCph2(1-2) aus Synechocystis sp. PCC 6803, GAF-GAF Bidomäne besitzt, welches wobei ne-ben der Charakterisierung des Wildtyp-Proteins insbesondere die stabilisierende Wirkung der GAF2-Domäne auf den Bilin-Chromophor mit Hilfe von Punktmutationsucht genauer. Daneben wurden zwei Bacteriophytochrome, PstBphP1 aus Pseudomo-nas syringae pv. domates ve PaBphP aus Pseudomonas aeruginosa, welches zu den bathy-Phytochromen zählt, sowie ein pilzliches Phytochrom, FphA aus Aspergillus nidulans, spektroskopisch charakterisiert.

Alanin-Mutanten S385A ve W389A, SynCph2(1-2) ile ilgili tüm araştırmalarda mevcuttur. Aminosäure (W389F) nicht auswirkt. Bathychrome Charakter von PaBphP wirkt sich nicht auf den Photozyklus aus ve ist sehr vergleichbar zu ve kanoni-schen Phytochromen wie CphA bzw. Cph1, wobei die Konversion aus dem Grundzustand in das Photoprodukt keine sichtbaren Intermediate aufzeigt. PstBphP1 ve FphA fehlt im Vergleich zu den kanonischen Phytochromen ein Intermediat beim Übergang in den Pfr-Zustand, auf einen unterschiedlichen Prozess bei der Bildung des Photoprodukts hin-deutet idi. Die Rückkonversiyon verläuft bei PstBphP1 ‚klassisch', wohingegen bei FphA keine Orta düzey tanımlayıcı werden können.

ii) Spektroskopische Untersuchung dreier GAF-Domänen der CBCR'ler
Im zweiten Teil der Arbeit werden drei Vertreter der Cyanobacteriochrome unter-sucht. CBCR'ler nehmen in der Classe der Phytochrome eine außergewöhnliche Stellung ein. Dies zeigt sich u.a. Fähigkeit, Hilfe'nin temelleri, GAF-Domäne den Chromophor kovalent ve tersine çevrilebilir, fotokrom Photozyklus zu durchlaufen. Untersucht wurde die GAF3-Domäne von Slr1393 aus Synechocystis sp. PCC 6803, kalıp einen Rot/Grün-Photozyklus zeigt, kalıp GAF1-Domäne aus AphC aus Nostoc sp. PCC 7120, welche einen klassischen Rot/Dunkelrot-Photozyklus aufweist, sowie die GAF3-Domäne aus demselben Organismus mit einem außergewöhnlichen Rot/Orange-Photozyklus, der durchweierstellung unt 87 wurde. Zusätzlich wurde bei 1393gaf3 der Einfluss der Chromophor-Bindung ve Zugabe in vivo als auch in vitro genauer untersucht. Genauere Informationen über Chromophor-Protein Wechselwirkungen (R508N, D531T ve N532Y) daha fazla bilgi için, daha fazla bilgi Einfluss auf die kararlı-durum Emilimi des Pg-Photoproduktes aufwei.

Die CbCr GAF-Domänen zeigen im Vergleich zu den klassischen Phytochromen einen deutlich vereinfachten Photozyklus, der vermutlich auf die geringe Proteingröße die und dadurch mögliche hohe Flexibilität zurückzuführen ist, die es leichter möglich macht, Chromophor-Isomerisierung erzwungenen Konfirmationsänderungen zu fol-gen die durch der . Das außergewöhnliche thermisch sehr instabile ve deutlich weniger hypsochrom verschobene Photoprodukt der GAF3-Domäne von AphC en son sich mit einem möglicher-weise gehinderten Intermediat ünilleri Photoprodukt der GAF3-Domäne von AphC. Grundzustand'da daha geniş kapsamlı değişikliklere gidin.

Fotoreseptörler, yoğunluğu, dalga boyunu, periyodikliği ve yönü algılayarak dış uyaran ışığını fizyolojik bir sinyale dönüştüren ışık algılayıcı sistemlerdir. Bu çalışmada odak, fitokrom fotoreseptörleri üzerindeydi. Fitokromlar, kromofor yapıları ve ilgili fotokimyaları için belirtilen, iyi tanımlanmış beş aileye ayrılabilir. Bu ailelerden biri olan "klasik" fitokromlar, bitkilerin fotomorfogenezinde önemli düzenleyici işlevlere uygundur. Işık algılayıcı kısımları, GAF alanındaki bir sisteine ​​kovalent olarak bağlı bir açık zincirli tetrapirol (bilin) ​​kromoforuna sahip bir PAS-GAF-PHY yapısından oluşur. Son yıllarda, bu tür alan mimarisine sahip kanonik fitokromlar, bakteri ve mantarlarda da tespit edilebilir.

Bu tez, özellikle potansiyel ara maddelerin ve bunların ömürlerinin tanımlanmasını amaçlayan çeşitli fotosikllerin kinetik çalışmalarına adanmıştır. Bu nedenle, siyanobakteri (Cph), bakteriyofitokrom (BphP) ve mantar (Fph) fitokromlarının ailelerinden klasik fitokromların yanı sıra yeni siyanobakteriokromlar (CBCR'ler) ex-amine edildi. Zaman çözümlü kinetik absorpsiyon ölçümleri, flaş fotoliz yöntemi kullanılarak yapıldı.

i) Klasik fitokromların fotosikllerinin karşılaştırılması
Bu tezin ilk bölümü, üç fitokrom alt familyasına ait dört fito-kromun karşılaştırmalı analizi ile ilgilidir. Synechocystis sp.'den SynCph2(1-2)'nin incelenmesi. Bir fotosensör GAF-GAF çift alanı taşıyan PCC 6803, vahşi tip proteinin karakterizasyonuna ve özellikle GAF2 alanının kromoforu üzerindeki stabilize edici etkinin mutasyonel analizine dayanır. Ek olarak, iki bakteri-okrom, Pseudomonas syringae pv'den PstBphP1. Pseudo-monas aeruginosa'dan (banyo-fitokromların üyesi) domates ve PaBphP'nin yanı sıra Aspergillus nidulans'tan bir mantar fitokromu olan FphA spektroskopik olarak karakterize edilmiştir.

Sonuçlar, SynCph2(1-2)'nin 385 ve 389 konumlarının fotosikl üzerinde önemli bir etkisini ortaya koymaktadır. Bu amino asitlerin alaninlere (S385A ve W389F) değişimi, özellikle Pfr-Photoprodukt oluşumunu etkilerken, 389 konumunda benzer şekilde büyük, aromatik bir amino aside (W389F) değişimin fark edilebilir bir etkisi yoktur. PaBphP'nin batokromik doğası, fotosikli önemli ölçüde değiştirmez. Işıkla yönlendirilen dönüşümleri, CphA veya Cph1 gibi kanonik fitokromlarınkiyle çok karşılaştırılabilir olmasına rağmen, ana durumdan foto ürüne fotodönüşüm, fark edilebilir ara-aracılar göstermez. Hem PstBphP1 hem de FphA, Pfr durumuna geçişte (kanonik fitokromlara kıyasla) fotoürünün oluşumunda farklı süreçler olduğunu düşündüren bir ara maddeden yoksundur. PstBphP1'den ters dönüşüm 'klasik' bir şekilde ilerlerken, FphA tanımlanabilir hiçbir ara ürün göstermez.

ii) CBCR'lerden üç GAF alanının spektroskopik incelenmesi
Bu çalışmanın ikinci bölümünde Siyanobakteriokromların üç temsilcisi incelenmiştir. CBCR'ler, fitokrom fotoreseptörleri içinde istisnai bir konuma sahiptir. Bu, diğer şeylerin yanı sıra, kromoforu kovalent olarak bağlama ve sadece bir GAF alanı yardımıyla tersinir bir fotokromik fotosiklden geçme yetenekleriyle belirgindir. Bu çalışma, Synechocystis sp.'nin Slr1393'ünden alınan GAF3 alanını içermektedir. Bir kırmızı/yeşil fotosikl gösteren PCC 6803, Nostoc sp.'nin AphC'sinden GAF1 alanı. PCC 7120, klasik bir kırmızı/koyu kırmızı fotosiklini ve ayrıca istisnai bir kırmızı/turuncu fotosikli ile aynı organizmadan GAF3 alanını gösterir. Bu CBCR-GAF alanı için ayrıca kromofora yakın konumlanmış iki nokta mutasyonu (S487R ve S487G) zaman çözümlü analize dahil edildi. AphC'den GAF3 alanının dikkate değer termal olarak çok kararsız ve önemli ölçüde daha az hipokromik olarak kaydırılmış foto ürünü, kırmızı/yeşil bir fotosiklin muhtemelen engellenmiş bir ara ürünü ile açıklanabilir. Üretilen mutasyonlar, ana duruma termal geri kazanım üzerinde dikkate değer ölçüde stabilize edici bir etkiye neden oldu.

Ek olarak, kromofor bağlanma modunun ya in vivo ya da in vitro ekleme ile etkisi 1393gaf3 için daha ayrıntılı olarak incelenmiştir. Kromofor-protein etkileşimleri ile ilgili daha fazla bilgi, Pg foto-ürünün kararlı durum absorpsiyonunda büyük etkisi olan üç mutant (R508N, D531T ve N532Y) kullanılarak elde edildi.


NpR3784, fotoürün ayarı için alternatif Phe kalıntıları kullanan ayırt edici bir kırmızı/yeşil siyanobakteriokrom grubunun prototipidir.

Siyanobakteriokromlar (CBCR'ler), siyanobakterilerde bulunan fotosensör proteinlerdir ve yaygın fitokromlarla uzaktan ilişkilidir. Bitki fitokromları kırmızı ve uzak kırmızı ışığa tepkiler sergilerken, CBCR'ler çok çeşitli renklere tepki vermek için doğrusal bir tetrapirol (bilin) ​​kromoforunun aynı fotoizomerizasyonunu kullanır. Nostoc punctiforme'dan NpR6012g4 ve Anabaena sp.'den AnPixJ. PCC 7120, fitokromunkine benzer kırmızı soğuran koyu bir durum sergileyen, ancak uzak kırmızı soğurucu yerine yeşil soğuran bir fotoürün sergileyen geniş bir kırmızı/yeşil CBCR alt ailesine aittir. Bu kanonik kırmızı/yeşil CBCR'lerde, fotoürün, doğal protein yapısının yokluğunda gözlenen turuncu absorpsiyona göre maviye kaydırılır. Foto-ürünün bu spektral ayarı, CBCR GAF alanının ikinci & beta zinciri üzerinde, bilinin fotoüründe sterik olarak sınırlandırıldığı bir kapana kısılmış büküm mekanizması ile tutarlı olarak, korunmuş bir Phe kalıntısı gerektirir. N. punctiforme ayrıca NpR6012g4'ünkine benzer bir kırmızı/yeşil fotosikl ile bir CBCR olan NpR3784'ü üretir. NpR3784, hem &beta2 Phe'den hem de kanonik kırmızı/yeşil CBCR'lerin karakteristik özelliği olan diğer kalıntılardan yoksundur. Mevcut çalışmada, diğer siyanobakterilerde kırmızı/yeşil fotosikllerle NpR3784 homologlarını tanımlıyoruz. Bu NpR3784 grubundaki spektral ayarlama, & beta1 üzerindeki karakteristik bir Phe kalıntısı dahil olmak üzere farklı bir korunmuş Phe kalıntısı seti ile gerçekleştirilir. Bu Phe kalıntıları seti, NpR6012g4 gibi standart kırmızı/yeşil CBCR'lerde bulunan Phe kalıntıları ile değiştirilemez. Sonuçlarımız, CBCR'ler tarafından dikkate değer spektral çeşitliliklerini oluşturmak için kullanılan esnek protein ve ndashchromophor etkileşimleri hakkında yeni bilgiler sağlar.

Günlük

Fotokimya ve Fotobiyolojik Bilimler &ndash Royal Society of Chemistry


NpF2164g3 - Biyoloji

Arch Microbiol (2014) 196:357–367 DOI 10.1007/s00203-014-0974-2

Nitrat varlığında ve yokluğunda Nostoc punctiforme'un (Siyanobakteriler) ekzo-proteomu ve ekzo-metabolomu Laura Vilhauer · Judith Jervis · W. Keith Ray · Richard F. Helm

Geliş Tarihi: 5 Şubat 2014 / Kabul Tarihi: 27 Şubat 2014 / Online Yayın Tarihi: 19 Mart 2014 © Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2014

Özet Azot sabitleyen filamentli Siyanobakterilerin çoklu ortamlara uyum sağlama yeteneği, kısmen hücre dışı ortamda başlatılan bir olay olan dış uyaranları değerlendirmek ve bunlara yanıt vermekten gelir. Bu organizmaların çok sayıda hücre dışı madde ürettiği bilinmekle birlikte, standart laboratuvar büyüme koşulları altında hem metabolitleri hem de proteinleri karakterize etmek için çok az çalışma yapılmıştır. Bir nitrojen kaynağının (nitrat) varlığında ve yokluğunda sıvı kültürde büyütüldüğünde Nostoc punctiforme'un hücre dışı ortamını değerlendirdik. Tanımlanan hücre dışı proteinler, türe özgü tanıma ve davranış süreçlerini modüle etmede hücre dışı proteinlerin rolünü destekleyen, N. punctiforme'a özgü dizilere sahip integrin β-itici etki alanlarında ve kalsiyum bağlama bölgelerinde zenginleştirildi. Hücre dışı proteazlar her iki koşulda da mevcuttur ve aktiftir, nitrat ile büyütülen hücreler klorofil seviyelerine normalleştirildiğinde daha yüksek aktiviteye sahiptir. Serbest bırakılan metabolitler, nitratsız ortamda daha yüksek seviyeler ile peptidoglikan türevli tetrasakaritlerde zenginleştirilmiştir. Anahtar Sözcükler Hücre Dışı · Metabolom · Nostoc punctiforme · Peptidoglikan · Proteaz · Proteom

Erko Stackebrandt tarafından iletildi. Elektronik ek materyal Bu makalenin çevrimiçi versiyonu (doi:10.1007/s00203-014-0974-2), yetkili kullanıcılara açık olan ek materyaller içermektedir. L. Vilhauer · J. Jervis · W. K. Ray · R. F. Helm (*) Department of Biochemistry, Virginia Tech, 143 Life Sciences 1, Blacksburg, VA 24061‑0910, ABD e-posta: [email protected]

Giriş Nostoc punctiforme, birden fazla fenotip yapabilen filamentli bir siyanobakteridir (fotosentetik prokaryot). Nitrojeni sınırlayan koşullar altında, tek bir filament boyunca kontrollü bir şekilde dağılan terminal olarak farklılaşmış heterosistler oluşur (Meeks ve Elhai 2002 Kumar ve ark. 2010). Düşük hücre yoğunluğu (medya değişimi), kırmızı ışığa maruz kalma veya simbiyotik bir ilişkinin kurulması, organizmanın hormogonya olarak adlandırılan daha küçük ve daha kısa hareketli filamentlere farklılaşmasına yol açabilir (Risser ve Meeks 2013). Bu hücre tipi, kısa filamentlerin terminal heterosistleri içerdiği bir "primordia" aşamasından geçerek normal vejetatif büyümeyi yeniden kurma yeteneğine sahiptir. Büyüme ve gelişme için gerekli besinlerin eksikliği de tek hücreli akinetler veya siyanobakteri sporlarının oluşumuna yol açabilir (Kaplan-Levy ve ark. 2010). Araştırmada kullanılan iki ana N. punctiforme suşu ATCC29133 ve PCC73102 olarak belirlenmiştir. Her iki hat için orijinal izolat, 1973'te bir sikadın (Macrozamia sp.) kök bölümünden elde edildi (Rippka ve diğerleri, 1979), iki kuruluş, PCC izolatlarının ATCC ile orijinal birikiminden bu yana ayrı hatları koruyor. Dizili suş (ATCC29133), bir kromozom ve beş plazmit içeren 9.06 Mb'lik bir genom boyutuna sahiptir ve şu anda yaklaşık 6.700 proteini kodlamak için açıklamalıdır (Meeks ve diğerleri 2001). Bu, bugüne kadar dizilmiş üçüncü en büyük siyanobakteriyel genomdur (Shih ve ark. 2013). Siyanobakteriyel genomik verilerin analizi, N. punctiforme tarafından sergilenen çok hücreli fenotipin, karbon fiksasyonunun ortaya çıkmasından bu yana günümüz öncüllerinin çok hücreliliği kazanmış, kaybetmiş ve yeniden kazanmış olduğu siyanobakteriyel filumun erken bir özelliği olduğunu göstermektedir (Schirrmeister et al. 2011, 2013). fenotipik

Siyanobakterilerin beş ayrı sınıfa yerleştirilmesi, Rippka ve arkadaşlarının mükemmel çalışmasına dayanmaktadır. (1979), bugün kullanılan anahtar sınıflandırma sistemi olarak kalan bir fenoloji. Genotipik karakterizasyonun ortaya çıkmasıyla birlikte, birden fazla siyanobakteri türünden "çekirdek proteinlerin" karşılaştırılması, günümüzün filamentli siyanobakterilerinin nitrojeni sabitleyebilen ve sabitleyemeyenlere açıkça ayrıldığını göstermektedir (Shi ve Falkowski 2008). Daha yakın zamanlardaki dizileme ve biyoinformatik çabalar, siyanobakterilerin monofiletik olduğu hipotezini daha da doğrulayarak, siyanobakteriyel çeşitlilik anlayışımızı çarpıcı biçimde genişletmiştir (Schirrmeister ve diğerleri, 2011 Shih ve diğerleri. 2013). Siyanobakterilerde ribozomal olmayan peptit sentaz (NRPS), poliketid sentaz (PKS) ve ribozoma dayalı yollar yoluyla ikincil metabolitlerin üretimi için gen setleri yaygın olsa da, şimdiye kadar elde edilen bilgilerin analizi, temel fenotipik yolunda çok az şey ortaya koymaktadır. belirleyiciler (Shih et al. 2013 Leao et al. 2012). Herhangi bir ortama mikrobiyal adaptasyon, yerel çevrenin sürekli olarak sorgulanmasını gerektiren değerlendirme ve yanıt aşamaları gerektirir. N. punctiforme dahil olmak üzere birçok filamentli siyanobakteri, göze çarpan bir hücre dışı matrisin (ECM) gelişimi yoluyla doğrudan dış zarın dışındaki alanı işgal eder (Helm ve Potts 2012). Bir siyanobakteri tarafından etkilenen veya kontrol edilen alan bölgesi, özellikle sürekli ajitasyona maruz kalan laboratuvar kültürleri için tam olarak tanımlanmamıştır. Malzemeler, doğal ortamdan farklı seviyelerde laboratuvar bazlı sıvı kültürlerden salınabilir ve bu nedenle laboratuvar kültür ortamı izolatları genellikle “şartlandırılmış” olarak tanımlanır. Filamentli siyanobakteriyel davranışı etkileyen hücre dışı faktörlerin örnekleri onlarca yıldır belgelenmiştir (Herdman ve Rippka 1988) ve son zamanlarda daha ayrıntılı olarak gösterilmiştir (Liaimer ve diğerleri 2011). Bununla birlikte, davranışsal süreçlerde yer alan siyanobakterilerden türetilen hücre dışı faktörlerin yapıları hakkında çok az bilgi mevcuttur. Sekonder metabolit gen setlerindeki çeşitlilik, yerel toplulukla iletişim kurmak ve belirli bir çevresel niş işgal etmek için her bir siyanobakteri türünün dış zarından ne gösterdiği veya saldığı ile doğrudan ilişkili olabilir. ECM kompozisyonu ve bunun siyanobakteriyel yaşam tarzı üzerindeki etkileri üzerine yapılan çalışmalar, amino asitler ve karbonhidratlar gibi metabolitlerin alımını ve salınımını (Mary ve ark. 2008 Mikkat ve ark. 1997 Zubkov ve ark. 2003) ve ayrıca fotoheterotrofik metabolizmayı ve/veya interferansiyelleri değerlendirmiştir. -tür iletişimi (Yang ve ark. 2011). Deniz siyanobakteri Synechococcus sp.'den metabolitlerin alımı ve salınımına yönelik son hedeflenmemiş yaklaşımlar PCC 7002, büyüme için kullanılan ortama bağlı olarak alım ve salıverme ile organizma tarafından çok çeşitli metabolitlerin tüketildiğini ve/veya salındığını belirlemiştir (Baran

Arch Microbiol (2014) 196:357–367

ve diğerleri 2010, 2011). Filamentli siyanobakterilerin hücre dışı alanıyla ilgili çalışmalar polisakkarit üretimini (Otero ve Vincenzini 2004 Read ve diğerleri 2007 Pereira ve diğerleri 2009) ve UV stres tepkisini (Bohm ve diğerleri 1995 Ehling-Schulz ve diğerleri 1997, 2002) ele almıştır. . N. commune hücre dışı proteomunun, ECM'nin yapısını ve işlevini modüle ederek küresel stres yanıtında merkezi bir rol oynayabilen bir protein olan WspA'nın baskın olduğu tespit edilmiştir (Morsy ve ark. 2008). Ancak, WspA iki farklı Nostoc türü (N. commune ve N. verrucosum) ile sınırlıdır (Sakamoto ve ark. 2011) ve N. punctiforme'da mevcut değildir. Biyolojik bir sistemin hücre dışı proteomunun ve metabolomunun karakterizasyonu, hücre içi fizyoloji ve fenotip gelişimi hakkında fikir verebilir. Filamentli siyanobakterilerden salınan proteinler ve metabolitler hakkında bilgi eksikliği nedeniyle, N. punctiforme PCC73102'den salınan proteinleri ve metabolitleri nitrat varlığında ve yokluğunda standart kültür koşulları altında basitçe değerlendirmeyi amaçlayan bir projeye başladık (BG-11). ve sırasıyla BG-110 ortamı) (Rippka ve diğerleri, 1979). Hücre dışı proteomda otuz üç protein tanımlandı ve birkaçının sadece bir durumda mevcut olduğu bulundu. Ayrıca hücresiz şartlandırılmış ortam kullanılarak zaman süreci deneylerinde sığır β-kazeinin kaderini izleyerek hücresiz süpernatanlardaki proteaz aktivitelerini değerlendirdik. Son olarak, salınan metabolitlerle ilgili olarak, değerlendirilen her iki koşulda da N. punctiforme'un bir peptit sapından yoksun önemli miktarlarda peptidoglikan fragmanları saldığını belirledik. Bu sonuçlar siyanobakteriyel fizyoloji ile ilgili olarak tartışılmıştır.

Malzemeler ve yöntemler Kültür koşulları ve genel yöntemler Hücre kültür ortamı, Pasteur Culture Collection of Cyanobacteria (PCC, CRBIP Medium 539) tavsiyelerine göre hazırlandı. Bu çalışma için kullanılan suş, ATCC suşuna göre daha kümelenmiş bir fenotip sergileyen PCC'den (N. punctiforme 73102) elde edilmiştir. PCC'den alınan orijinal numune, agar plakaları (BG-11) üzerinde büyütüldü ve daha sonra küçük konik şişelerden başlayarak ve hücreleri daha büyük olanlara aktararak sıvı kültüre aktarıldı, son deneyler 250 mL'de 30 mL ortam içinde gerçekleştirildi. şişeler. İlk sıvı kültür izolatından bir dizi birincil stok hazırlandı ve agar slantları olarak saklandı, bu birincil slantlar her altı ayda bir rutin olarak yeni slantlara aktarıldı. Tüm kültürler (sıvı ve katı), 12 saatlik bir ışık döngüsünde tutuldu ve tüm örnekleme, hücreler ışığa maruz kaldığında meydana geldi. sıvı kültürler

Arch Microbiol (2014) 196:357–367

100 devirde çalışan bir döndürücü ile gerçekleştirilen karıştırma ile 166 mikroeinstein/m2 s ışık sağlayan bir lamba seti kullanılarak nitratlı veya nitratsız ortamda (buradan sonra sırasıyla BG-11 ve BG-110 olarak anılacaktır) muhafaza edildi. Dakikada. Kültür ortamları, en az 4 hafta boyunca yalnızca bir ortama maruz bırakılan numuneler üzerinde toplanan deneysel verilerle (aksi belirtilmedikçe) her 2 haftada bir rutin olarak değiştirildi. Hemşire kültürleri, deney için yeterli biyokütle oluşturmak amacıyla her 2 haftada bir BG-11 ve BG-110 ortamı arasında döndürüldü. Birincil agar slantından sıvı kültürleri yeniden başlatmadan önce deneysel kültürler yaklaşık 6 ay boyunca muhafaza edildi. Klorofil seviyeleri (Chl a), 665 nm'de absorbansı ölçen standart yöntemlere göre belirlendi (bkz. Ek Yöntemler). Bu organizmaların sıvı kültürde toplanma yetenekleri nedeniyle biyokütle seviyelerinin değerlendirilmesi için optik yoğunluk yöntemleri rutin olarak kullanılmadı ve bu da optik yoğunluk ölçümlerini güvenilmez hale getirdi. Hücre dışı proteomun değerlendirilmesi Deneyler biyolojik kopyalarda yapıldı. Kültürler, taze sıvı kültürde 2 haftalık büyümeden sonra değerlendirildi. Kültürler daha sonra santrifüj tüplerine (50 mL) aktarıldı ve santrifüjlendi (4.000xg, 10 dakika) ve süpernatant toplandı. Hücreler, karşılık gelen büyüme ortamı (5 mL) ile bir kez daha yıkandı ve orijinal izolata eklenen nihai süpernatan ile tekrar santrifüjlendi. Hücre peletinin alikuotları, hem klorofil a belirlemeleri hem de mikroskobik değerlendirme için kullanıldı ve ardından atıldı. Süpernatanlar süzüldü (0.22 um) ve elde edilen hücresiz ortam numuneleri sıvı nitrojen içinde anında donduruldu ve dondurularak kurutuldu. Nihai katılar, su (1 mL) ile daha küçük santrifüj tüplerine (1.5 mL) aktarıldı ve dondurularak kurutuldu. Bu kurutulmuş numuneler daha sonra, ayrıntıları Ek Yöntemlerde bulunabilen bir çözelti içi sindirim protokolüne tabi tutulmuştur. Elde edilen peptitler, MALDI-TOF/TOF (AB Sciex 4800) ile analizden hemen önce eklenen matris (a-siyano4-hidroksisinnamik asit, CHCA) ile bir LC-MALDI plaka lekeleme cihazında (Eksigent nano2D-LC ve Ekspot) ayrıldı. MALDITOF/TOF). 800-4.000 m/z aralığı için bir MS taraması, reflektör pozitif iyon modunda 1.000 lazer atışından ortalama veri elde edildi. Minimum sinyal-gürültü oranının (>50) üzerindeki en bol 15 tepe noktası daha sonra sonraki MS/MS analizi için otomatik olarak seçildi. MS/MS taramaları, elde edilen 3.000 lazer atışının ortalamasıydı (1 kV, pozitif iyon modu). Kütle spektrometresinden elde edilen tepe listeleri, ters tuzak ve kirleticiler ile eklenen N. punctiforme FASTA veri tabanı kullanılarak MASCOT algoritması (Matrix Science) ile değerlendirildi.

veritabanları. Ortaya çıkan dosyalar, daha fazla değerlendirme için Scaffold'a (Proteome Yazılımı) aktarıldı. Hücre dışı metabolomun değerlendirilmesi Kültür preparasyonu, 1.5 mL'lik tüplerde dondurarak kurutma yoluyla proteomla aynıydı ve tipik olarak çiftler halinde hazırlandı (BG-11 ve BG-110 süpernatanları). Metabolit analizleri için, kurutulmuş numuneler 9:1:0.001'de (su/asetonitril/formik asit v/v/v) süspanse edildi, kısaca vortekslendi ve 10 dakika sonikasyona tabi tutuldu ve ardından 10 dakika (13,000xg) santrifüjlendi. Çözünmüş metabolitlerin alikotları (200 uL), her numunenin (BG-11 ve BG-110) eşit bir karışımını (1:1, v/v) içeren ek bir şişe ile LC-MS şişelerine aktarıldı. Numune seti daha sonra LC-MS ile üç kopya halinde analiz edildi. LC–MS sistemi, bir SynaptG2-S HDMS kütle spektrometresi ile arayüzlenmiş bir UPLC'den (Acquity I-Class) oluşuyordu. Ayırmalar için kullanılan kolon, 40 °C'de tutulan bir BEH C18 (50 x 2.1 mm) idi. Gradyan ayrımı (200 uL/dk), 2 dakika boyunca %95 Çözücü A (%0.1 formik asit) ve %5 Çözücü B'den (asetonitril) oluşan bir başlangıç ​​bileşimini ve ardından bir süre boyunca %5 Çözücü A'ya doğrusal bir gradyandan oluşuyordu. 10 dk. Kütle spektrometresi, kilit kütlesi olarak lösin enkefalin kullanılarak yüksek çözünürlüklü pozitif iyon modunda çalıştırıldı. Veri kümeleri, numune grupları arasında önemli ölçüde değişen iyonların bir listesinin yanı sıra numuneler arasındaki önemli farklılıkların istatistiksel bir profilini sağlayan MarkerLynx yazılımı (Waters Corp.) ile değerlendirildi. Hücre dışı proteaz aktivitesi P-kazeinin (sığır, Sigma) stok çözeltileri, 2 mg ortam (BG-11 veya BG-110, 10 mL) içinde ısı (65 °C) kullanılarak çözülerek ve karıştırılarak hazırlandı. Elde edilen numuneler santrifüjlendi (4.000 x g, 10 dakika) ve alikuotlar (her biri 1 mL) yeni tüplere aktarıldı. Hücre kültürleri, klorofil a belirlemeleri için kullanılan kalan hücrelerle (yıkama adımı dahil) yukarıda tarif edildiği gibi işlendi (bkz. Ek Yöntemler). Süpernatanlar daha sonra BG-11 numunesinin seyreltilmesini gerektiren eşdeğer klorofil konsantrasyonlarına normalleştirildi ve filtrelendi (0.22 um). Elde edilen süpernatanlar daha sonra 6 oyuklu plakalara (5 mL) bölündü, ardından p-kazein çözeltileri (1 mL) ilave edildi. Proteaz inhibisyon numuneleri, üreticinin talimatlarına göre hazırlanmış ek bir ticari inhibitör kokteyl hacmine (Sigma, P8465, 30 μL) sahipti. β-kazein içeren kontrol şeritleri, taze ortam ile desteklendi. Plakalar, 24 saate kadar bir süre boyunca alikuotlar çıkarılarak oda sıcaklığında inkübe edildi. Zaman süreci deneyinden alınan numuneler daha sonra sıvı nitrojen içinde donduruldu ve dondurularak kurutuldu. NS

örnekler daha sonra 1:1 SDSPAGE çalışma tamponu (Tris/Glisin/SDS, 50 uL) ve β-merkaptoetanol (50 uL) içeren Laemmli tamponu karışımı içinde çözüldü. Numuneler 95 °C'de 5 dakika ısıtıldı, ardından vortekslendi ve santrifüjlendi (13,000 x g, 2 dakika). Numuneler (45 uL) daha sonra %18 çapraz bağlı jele (Bio-Rad, Criterion) ilave edildi. Ayırmalar sabit voltajda (130 V) gerçekleştirildi ve sonuçtaki jeller Coomassie (ProtoBlue Safe, National Diagnostics) kullanılarak gece boyunca boyandı. Görüntülemeden önce fazla leke su ile çıkarıldı. Seçilen bantlar jellerden kesildi ve proteaz olarak Glu-C (Sigma) kullanılarak indirgeme ve alkilasyon olmaksızın bir jel içi sindirim protokolüne tabi tutuldu. Elde edilen peptitlerin tuzu giderildi (C18 Ziptips, Millipore) ve MALDITOF/TOF kütle spektrometrisi (CHCA matrisi) ile analiz edildi ve sonuçlar, enzim bölünme spesifikliği olmayan sadece β-kazein içeren bir veri tabanına karşı sorgulandı.

Sonuçlar Protein tanımlaması için alınan yaklaşım, süzme (0.22 um) ve dondurarak kurutma dışında herhangi bir ek adım olmaksızın, şartlandırılmış ortamın bir çözelti özetine dayanıyordu. Nihai çözeltiler daha sonra indirgendi, alkillendi ve tripsin ile sindirildi. Elde edilen peptitler daha sonra, kolon eluentinin doğrudan bir MALDI plakası üzerine lekelenmesiyle gradyan bazlı ters fazlı sıvı kromatografisiyle ayrıldı. Ortaya çıkan noktalar, öncü iyon ve parçalanma modelleri (MS/MS) için analiz edildi ve sonuçlar N. punctiforme proteomuna (ters tuzak ve standart kirletici veritabanları ile eklendi) karşı sorgulandı ve yarı triptik peptitlere izin verildi (bir bölünme bölgesi zorunlu değildir). triptik aktiviteden kaynaklanır). Protein tanımlaması için iki peptit gerekliydi, peptit ve protein eşikleri sırasıyla %95 ve %99'a ayarlandı (%0 tuzak yanlış keşif oranı). Deneyler, 2 haftalık büyümeden sonra gerçekleştirilen, protein sindirimlerini (BG11'e karşı BG110) klorofil bazında normalleştiren hücre toplama ile iki kopya halinde gerçekleştirildi. Tarif edilen prosedürler kullanılarak tanımlanmış 33 protein vardı ve Tablo 1'de listelenmiştir. Her iki besiyerinde de 23'ü tanımlanmıştır, 4'ü ağırlıklı olarak nitrat içeren ortamda ve 6'sı nitrat içermeyen ortamda bulunmuştur. Çok az protein, her bir proteinle ilişkili üçten fazla peptit içeriyordu ve her peptit için MS/MS spektrumlarının sayısı, spektral sayım yöntemleriyle nispi protein bolluğu sağlamak için çok düşüktü. Bununla birlikte, belirli bir büyüme ortamında varlığı veya yokluğunu değerlendirmek mümkün olmuştur. Tanımlanan tüm proteinlerin ve ilgili kütle spektrometrisi verilerinin bir listesi, Ek Malzemelerde (Tablo S1) bulunabilir. Birkaç Anabaena suşunun süpernatanlarının proteaz aktivitesine sahip olduğu bildirildiği gibi (Prasanna

Arch Microbiol (2014) 196:357–367

ve diğerleri 2008) ve hücre dışı bir S-tabaka proteininin Synechocystis sp. PCC 6803 (Trautner ve Vermaas 2013), bu aktiviteyi test ettik. Koşullu ortamdan (2 haftalık büyüme) hücre içermeyen süpernatanlar, 15 saate kadar bir süre boyunca ticari sığır β-kazeini ile inkübe edildi (Şekil 1). Aktiviteler eşdeğer klorofil seviyelerinde (hücre sayıları için bir vekil) karşılaştırıldığında, bozunma paternleri benzer olsa da, nitrat içeren numunelerin β-kazeini nitratsız ortama göre daha hızlı bozunduğu bulundu. Bu sonuçları hücre büyüme oranlarının bir yansıması olarak yorumluyoruz. Bir nitrojen kaynağının mevcudiyetinde, N. punctiforme daha hızlı bir şekilde farklılaşır ve yeniden şekillenme gerektiren daha büyük miktarda hücre dışı malzeme üretir, bu yeniden şekillenme proteaz aktivitesi gerektirir. Ne yazık ki, tanımlanan proteinlerin hiçbiri bilinen proteazlarla yakından eşleşmediğinden, aktiviteyi herhangi bir belirli proteine ​​bağlayamıyoruz. Birkaç proteinin gerçekten de serralisin motifleri olmasına rağmen, gerekli olan temel metal bağlama kalıntıları mevcut değildir. Bakteriyel proteaz inhibitörlerinin ticari kokteylinin proteaz aktivitesini azalttığı, ancak tamamen ortadan kaldırmadığı da açıktır. Hücresiz süpernatanlar, inhibitör etkilerini bozan veya azaltan bileşikler/proteinler içerebilir. BG-11 ve BG-110 ortamları arasındaki metabolit bazlı farklılıkların değerlendirilmesi, proteomik analizlerle (2 haftalık büyüme) aynı zaman noktasında bulunan metabolitlere vurgu yapılarak, ters fazlı kromatografi-kütle spektrometrisine dayanıyordu. Bir baz tepe iyon kromatografik karşılaştırması Şekil 2a'da gösterilmektedir. Veri setinin istatistiksel analizi, iki kültür ortamı örneğini temiz bir şekilde ayırdı ve sıkı örnek karşılaştırma yöntemleri kullanılarak, 89 iyon istatistiksel olarak farklı olarak tanımlandı (Şekil 2b ve Ek Tablo S2). Nitrat içermeyen ortamda nitrojen içeren ortama göre daha fazla iyon mevcuttu. Bunun, değişimle ilişkili heterosistlerden ve/veya hücresel kalıntılardan metabolitlerin salınmasından kaynaklanıp kaynaklanmadığı bu noktada tespit edilemez. Kütle spektrometrisi verilerinin değerlendirilmesi, iki ortam arasındaki farka ana katkıda bulunanların, BG-110 ortamındaki hücrelerden peptidoglikan oligomer salınımının sonucu olduğunu göstermiştir. İki numune arasında en büyük kat değişimini sergileyen iyonlar, kütle spektrometrik analizlerine dayalı olarak, bir peptit gövdesinden yoksun peptidoglikan tetrasakaritleri olarak tanımlanan ve indirgeyici ucun anomerik konumu 1-6 anhidro bağına sahip olan bileşiklerdi (Şekil 2c ve Ek Şekil S1). Bu atama, ana iyonun parçalanmasının yanı sıra kaynak içi bozunmanın gözlemlendiği MS1 taramasının analizinden elde edilen kütle spektrumlarının analizine dayanıyordu. İlginç bir şekilde, detaylı olarak analiz edilen her iki iyon da bir (915 m/z iyon) veya iki (873 m/z iyon) asetil grubundan yoksundu.

Arch Microbiol (2014) 196:357–367

Tablo 1 Nostoc punctiforme koşullu ortam Npun ID'de tanımlanan hücre dışı proteinler

F0770 F0888 F1457 F3469 F3639 F3787 F4195 F4306 F4555 F4679 F5213 F5289 F5290 F5395 F5938 R0415 R0421 R0716 R1349 R2605 R2608 R3259 R3508 R3701 R3806 R3807 R4059 R4084 R4842 R5387 R6491 R6614

B2IT19 B2IU54 B2IZM8 B2J126 B2J2W2 B2J460 B2J8T2 B2JA04 B2IVV3 B2IXX6 B2J393 B2J4C0 B2J4C1 B2J5H4 B2ITU1 B2J6Y6 B2J6Z2 B2J9G9 B2IYH3 B2ITC8 B2ITD1 B2IYW8 B2J1R2 B2J324 B2J478 B2J479 B2J7J2 B2J7L7 B2J037 B2J5G8 B2IZB2 B2J0I2

Varsayımsal protein Varsayımsal protein Varsayılan dış zar adezin benzeri protein PA14 alanı içeren protein Peptidil-prolil cis-trans izomeraz, siklofilin tipi Nakil ile ilişkili Ribuloz bifosfat karboksilaz, büyük zincir RbcL Varsayımsal protein Karbonhidrat seçici porin OprB Hemolizin tipi kalsiyum bağlayıcı bölge Fotosistem I demir-kükürt merkezi, PsaC Fikosiyanin, beta alt birimi Fikosiyanin, alfa alt birimi PcyA Sülfat ABC taşıyıcısı, periplazmik sülfat bağlayıcı protein Fosfogliserat kinaz, Pgk Nitrojenaz demir proteini NifH Glikoz/sorbozon dehidrojenaz benzeri proteini İşlevi bilinmeyen protein CP12 tekrarı protein içeren Varsayımsal protein Varsayımsal protein Düşük sıcaklığa bağlı protein Enolaz Hemolizin tipi kalsiyum bağlayıcı bölge Fikobilizom proteini CpeA Fikobilizom proteini CpeB Varsayımsal protein Varsayımsal protein Fikobilizom proteini ApcA Glutamin sentetaz GlnA Süperoksit dismutaz Varsayımsal protein

all3292 (%54) all4578 (%53) – – —c alr0804 (%69)alr1524 (%96) –alr4550 (%78) **d asr3463 (%99)alr0528 (%73)alr0529 (%72) all0322 ( %76) all4131 (%96) all1455 (%87) – asl2850 (%77)alr0267 (%63) ** ** all0459 (%69) all3538 (%91)alr3659 (%47)ealr0529 (%42) alr0528 (%48) – – alr0021 (%86) alr2328 (%91) alr2938 (%87) alr0199 (%70)

Protein güven sınırı, %99,0

Parantez içindeki sayılar yüzde kimliklerdir. Yüzde özdeşlik, protein c'nin tüm uzunluğu boyunca %40'tan azsa, PCC 7120'de (-) bir proteinin bulunmadığı kabul edildi.

PCC 7120, bir peptidil-prolil cis-trans izomerazını (tümü4287) kodlar, ancak F3639'dan önemli ölçüde daha küçüktür (137'ye 261 amino asit)

Yıldız işaretleri (**), aramanın hiçbir siyanobakteriyel protein eşleşmesi göstermediğini ima eder (N. punctiforme'a özgü)

Alr3659 (589 AA), 334 AA'ya göre %47 özdeştir (R3701 401 AA'dır)

Bu tür bileşiklerin salınması, amidaz, muramidaz ve ayrıca deasetilaz aktiviteleri gerektirir.

Tartışma Dört protein tanımlama eşiklerini aştı ve yalnızca nitrat içeren ortamda bulundu: Npun_F3639,

Npun_F4679, Npun_F5395 ve Npun_R0421. F3639, periplazmik sülfat olarak açıklamalı F5395 gibi, daha önce hücre lizat preparasyonlarından gözlemlenen bir protein olan siklofilin tipi bir peptidil-prolil cis-trans izomeraz olarak açıklanmıştır (Hunsucker ve diğerleri, 2004 Anderson ve diğerleri. 2006). taşıyıcı. Npun_F4679 daha önce tanımlanmamış gibi görünüyor ve bir RTX (toksin içinde tekrarlar) ve ilgili kalsiyum bağlayıcı protein olarak sınıflandırılıyor.

Arch Microbiol (2014) 196:357–367

BG-11 BG-110 βC T0 T2 T10T15 TPI βC T0 T2 T10T15 TPI

B RELEELNVPG PFAQTQSLVY AMAPKHKEMP LPPTVMFPPQ VRGPFPIIV

EIVESLSSSE PFPGPIPNSL FPKYPVEPFT SVLSLSQSKV

ESITRINKKI PQNIPPLTQT ESQSLTLTDV LPVPQKAVPY

EKFQSEEQQQ PVVVPPFLQP ENLHLLPPLLL PQRDMPIQAF

TEDELQDKIH EVMGVSKVKE QSWMHQPHQP LLYQEPVLGP

Şekil 1 Şartlandırılmış ortamın proteaz aktivitesi, klorofil seviyelerine normalleştirildiğinde nitrat içeren ortamlarda daha yüksektir. a Nitrat varlığında ve yokluğunda proteaz aktivitesi için bir zaman süreci analizinin SDS-PAGE analizi (sırasıyla BG-11 ve BG-110). 15 saatlik bir inkübasyondan sonra (kontrol) koşulsuz ortamda βC = β-kazein. T serisindeki sayısal alt simgeler şunları temsil eder:

kuluçka saatleri. PI alt simgesi, şartlandırılmış ortam ve proteaz inhibitörü ile 15 saat boyunca inkübe edilmiş bir örnektir. b Kanonik sığır birincil β-kazein dizisi (işlenmiş form). Serin (S) üzerindeki bilinen fosforilasyon bölgeleri kutuludur, Glu-C bölünme bölgeleri koyu renkle gösterilmiştir (C-terminal bölünmesi) ve MALDI bazlı tahlilde tanımlanan ana peptitler gri renkle gösterilmiştir.


"Ji Young Song" adlı yazarların yayınları

Dermatoloji Bölümü, Seul St. Mary Hastanesi, Tıp Fakültesi, Kore Katolik Üniversitesi, 222, Banpo-daero, Seocho-gu, Seul 06591, Kore.

Tam metin PDF'yi indirin

Bruksizm hastalarında implant komplikasyonları.

Yazarlar:

J Korean Assoc Oral Maxillofac Surg 2021 Nis47(2):149-150

Diş Hekimliği Anabilim Dalı, Tıp Fakültesi, Jeju Ulusal Üniversitesi, Jeju, Kore.

Tam metin PDF'yi indirin

Tip 2 insan papilloma virüsü E7, insan keratinositlerinde E-kadherin ekspresyonunu azaltır.

Yazarlar:

J Microbiol 2021 Haziran 2959(6):616-625. Epub 2021 29 Mart.

Biyolojik Bilimler ve Biyoteknoloji Bölümü, Yaşam Bilimleri ve Nanoteknoloji Koleji, Hannam Üniversitesi, Daejeon, 34054, Kore Cumhuriyeti.

Tam metin PDF'yi indirin

Epigallocatechin-3-gallate, Tip 2 İnsan Papilloma Virüsünün İnterferonla Uyarılmış Genleri Bastırmasını Önleyebilir.

Yazarlar:

Int J Mol Sci 2021 Şub 2822(5). Epub 2021 28 Şubat.

İmmünoloji ve Mikrobiyoloji Programı, Biyotıp ve Sağlık Bilimleri Bölümü, Enstitü, Kore Katolik Üniversitesi, 222, Banpo-daero, Seocho-gu, Seul 06591, Kore.

Tam metin PDF'yi indirin

TM4SF4 ve LRRK2, Outlier Analizi Yoluyla Akciğer ve Meme Kanserlerinde Potansiyel Terapötik Hedeflerdir.

Yazarlar:

Cancer Res Treat 2021 Ocak 1653(1):9-24. Epub 2020 16 Eylül.

Sağlık Bilimleri ve Teknolojisi Bölümü, SAIHST, Sungkyunkwan Üniversitesi, Seul, Kore.

Amaç: Hastalık için biyobelirteçler bulmak için, hastalık gruplarındakilerden farklı olan genleri araştırmak için sürekli girişimlerde bulunulmuştur. Bununla birlikte, bir dağılımın genel modelinin dışında kalan değerler, aykırı değerler, 'bir tür problem' olarak kabul edildikleri için geleneksel analitik yöntemlerde sıklıkla dışlanır. Bu tür aykırı değerler, hastalık grubunda biyolojik bir role sahip olabilir. Bu nedenle, bu çalışma aykırı değer analizi kullanarak yeni biyobelirteç araştırdı ve iki genin (TM4SF4 ve LRRK2) terapötik potansiyelinin uygunluğunu doğruladı.

Malzemeler ve yöntemler: Modifiye Tukey'nin çitler aykırı değer analizi, genel gen ifadesi veri kümelerini kullanarak yeni biyobelirteçleri belirlemek için yapıldı. Ve özelleştirilmiş gen ekspresyon panelleri ve doku mikrodizileri aracılığıyla diğer klinik örneklerde seçilen biyobelirteçlerin varlığını doğruladık. Ayrıca, biyobelirteçlerin onkojenik fenotipler üzerindeki etkisini değerlendirmek için siRNA tabanlı bir yıkım testi yapıldı.

Sonuçlar: Analizden türetilen genler arasından akciğer kanserinde TM4SF4 ve meme kanserinde LRRK2 aday olarak seçilmiştir. TM4SF4 ve LRRK2, sırasıyla akciğer kanserli (%4,20) ve meme kanserli (%2,42) az sayıda numunede aşırı eksprese edildi. TM4SF4 ve LRRK2'nin yıkılması, akciğer ve meme kanseri hücre dizilerinin büyümesini bastırdı. LRRK2 aşırı eksprese eden hücre çizgileri, LRRK2-IN-1'e, LRRK2'yi az eksprese eden hücre çizgilerinden daha duyarlıydı.

Çözüm: Değiştirilmiş aykırı değere dayalı analiz yöntemimizin, TM4SF4 ve LRRK2'nin sırasıyla akciğer ve meme kanseri için yeni hedef adaylar olduğunu gösteren geleneksel analizlerle daha önce gözden kaçan veya fark edilmeyen biyobelirteçleri kurtardığı kanıtlanmıştır.

Tam metin PDF'yi indirin

[Kore Ebelik Doğum Merkezlerinin Açılış Durumu ve Ebelik Uygulama Kılavuzunun Geliştirilmesi].

Yazarlar:

J Korean Acad Nurs 2020 Aug50(4):583-598

Hemşirelik Yüksekokulu, Kore Üniversitesi, Seul, Kore.

Amaç: Bu çalışma, ebelik doğum merkezlerinin (MBC'ler) ve ebelerin iş durumlarının (Aşama 1) operasyonel durumunu araştırmak ve Kore'de ebelik uygulama kılavuzları (MPG) (Aşama 2) geliştirmek içindi.

yöntemler: Birinci aşamada, Ağustos 2018 itibariyle açılan 14 MBC'den 11'ini işleten 15 ebe denektir. Anket, MBC'nin operasyonel durumunu ve ebelerin iş durumunu ölçen maddelerden oluşmuştur. İkinci aşamada, MPG literatür taraması, MBC'lerini açan beş ebe ile yapılan görüşmeler, 74 ebe ile yapılan anketler ve yedi uzman tarafından yürütülen bir geçerlilik değerlendirmesinden geliştirilmiştir.

Sonuçlar: Çalışan MBC'lerin dağılımı Gyunggi-do'da beş, Seul ve Incheon'da ikişer, Busan, Chungcheongbuk-do, Gyeongsangbuk-do, Gyeongsangnam-do ve Jeju-do'da birer taneydi. Ebelerin yaş ortalaması 54.3 idi ve hepsi kadındı. 2017 yılında ebeler tarafından 81 evde doğum olmak üzere toplam 762 doğum gerçekleştirilmiştir. İş performansı sırasıyla yenidoğan bakımı 3.81, doğum bakımı 3.56 ve doğum sonrası bakım 3.53'te en yüksekti. MPG, doğum öncesi bakım, doğum bakımı, doğum sonrası bakım, yenidoğan bakımı, birinci basamak sağlık hizmetleri, hukuk/etik ve idare olmak üzere yedi alanı, 56 görev ve 166 görev öğesi içeriyordu.

Çözüm: Bu çalışma, MBC'nin operasyonel durumu ve ebelerin iş durumu için geçerli temel verileri sağlar. MPG ebenin işini tanımlar ve Kore'de ebelik uygulamasının geliştirilmesine yönelik politikaların hazırlanmasında temel veri olarak kullanılabilir.

Tam metin PDF'yi indirin

Tandem sistein siyanobakteriyel fitokromların spektral ve fotokimyasal çeşitliliği.

Yazarlar:

J Biol Chem 2020 05 17295(19):6754-6766. Epub 2020 Mart 17.

Biyolojik Bilimler Bölümü, Chungnam Ulusal Üniversitesi, Daejeon 34134, Kore

Tam metin PDF'yi indirin

Küçük Hücreli Akciğer Kanserinde Ceritinib'e Yanıtta Öngörücü Bir Biyobelirteç Olarak Amplifikasyon.

Yazarlar:

Mol Ther Onkolitik 2020 Mart 1016:188-196. Epub 2020 Ocak 10.

Patoloji ve Translasyonel Genomik Anabilim Dalı, Samsung Tıp Merkezi, Sungkyunkwan Üniversitesi Tıp Fakültesi, Seul 06351, Kore.

Tam metin PDF'yi indirin

Peptit taşıyıcı2 (PTR2), Arabidopsis thaliana'da erken tohum çimlenmesi sırasında su alımını artırır.

Yazarlar:

Bitki Mol Biol 2020 Nisan 29102(6):615-624. Epub 2020 29 Ocak.

Biyolojik Bilimler Bölümü, Chungnam Ulusal Üniversitesi, Daejeon, 34134, Kore Cumhuriyeti.

Tam metin PDF'yi indirin

Halofilik Cyanobacterium Euhalothece sp. Z-M001.

Yazarlar:

Bilim Temsilcisi 2020 01 2010(1):676. Epub 2020 20 Ocak.

Biyolojik Bilimler Bölümü, Chungnam Ulusal Üniversitesi, Daejeon, 34134, Kore.

Tam metin PDF'yi indirin

Bir glukozil donörü olarak sakaroz ile dekstranükraz reaksiyonu ile izomaltooligosakkaritlerdeki diyet lifi içeriğinin arttırılması.

Yazarlar:

Carbohydr Polym 2020 Şubat 11230:115607. Epub 2019 Kasım 11

Gıda Bilimi ve Biyoteknoloji Bölümü ve Karbonhidrat Biyoürün Araştırma Merkezi, Sejong Üniversitesi, Seul 05006, Kore Cumhuriyeti. Elektronik adres:

Tam metin PDF'yi indirin

Eupatilinin İnsülin Benzeri Büyüme Faktörü 1-İndüklenen Lipogenez ve SZ95 Sebositlerin Enflamasyonu Üzerindeki Etkileri.

Yazarlar:

Ann Dermatol 2019 Ağustos 131(4):479-482. Epub 2019 1 Tem.

Dermatoloji Bölümü, Seul St. Mary Hastanesi, Tıp Fakültesi, Kore Katolik Üniversitesi, Seul, Kore.

Tam metin PDF'yi indirin

Soliter fibröz tümör ilerlemesinde moleküler değişiklikler.

Yazarlar:

J Mol Med (Berl) 2019 10 1897(10):1413-1425. Epub 2019 18 Temmuz.

Sağlık Bilimleri ve Teknolojisi Bölümü, SAIHST, Sungkyunkwan Üniversitesi, Seul, Güney Kore.

Tam metin PDF'yi indirin

Göbek kordonundan türetilen mezenkimal kök hücre, T hücre yanıtlarını azaltarak farelerde atopik dermatiti iyileştirir.

Yazarlar:

Bilim Temsilcisi 2019 04 299(1):6623. Epub 2019 29 Nisan.

Patoloji Anabilim Dalı, Ulsan Üniversitesi Tıp Fakültesi, Asan Tıp Merkezi, Seul, Kore.

Tam metin PDF'yi indirin

İntegrin β3 İnhibisyonu, Yeniden Düzenlenmiş NSCLC'de ALK İnhibitörünün Antitümör Aktivitesini Artırır.

Yazarlar:

Clin Cancer Res 2018 09 1824(17):4162-4174. Epub 2018 18 Mayıs.

Sağlık Bilimleri ve Teknolojisi Bölümü, SAIHST, Sungkyunkwan Üniversitesi, Seul, Kore.

Tam metin PDF'yi indirin

4-Heksilresorsinol İçeren Domuz Kemiği, Nükleer Faktör Kappa B Sinyal Yolunun Bastırılmasıyla Yeni Kemik Oluşumunu Artırır.

Yazarlar:

J Craniofac Surg 2018 Oct29(7):1983-1990

Biyokimya ve Hücre Biyolojisi Anabilim Dalı, BK21 Plus KNU Biyomedikal Yakınsama Programı, İskelet Hastalıkları Genom Araştırma Merkezi, Hücre ve Matriks Araştırma Enstitüsü, Tıp Fakültesi, Kyungpook Ulusal Üniversitesi, Daegu, Kore Cumhuriyeti.

Amaç: Bu çalışmanın amacı, osteoblastlarda tümör nekroz faktörü-α (TNF-α) tarafından aktive edilen 4-heksilresorsinol (4HR) ile nükleer faktör kappa B (NF-kB) yolunun baskılanması ve yeni Bir hayvan modelinde 4HR ile birleştirilmiş domuz kemiği ile kemik oluşumu.

Çalışma tasarımı: 4HR'nin domuz kemiğine başarılı bir şekilde dahil edildiğinin teyidi için taramalı elektron mikroskobu (SEM) ve Fourier transform-kızılötesi (FT-IR) analizi yapıldı. Domuz kemiğinden 4HR salım profilinin analizi için yüksek performanslı sıvı kromatografisi yapıldı. MC 3T3-E1 hücreleri, western blotlama ve gerçek zamanlı ters transkriptaz polimeraz zincir reaksiyonu ile NF-kB sinyal yolu aktivasyonunun analizi için kullanıldı. Yeni kemik oluşumu ve işaretleyici protein ekspresyonunun analizi, bir sıçan kalvarial kritik boyutlu kusur modelinde incelenmiştir.

Tam metin PDF'yi indirin

Güney Kore, Gumi'de Zehirli Kimyasal Dökülme Sonrası İşçilerde Travma Sonrası Stres Bozukluğu için Psikolojik Risk Faktörleri.

Yazarlar:

İşyeri Sağlığı Saf 2018 Ağustos 1366(8):393-402. Epub 2018 13 Şubat.

2 Dongguk Üniversitesi Ilsan Hastanesi.

Tam metin PDF'yi indirin

Beşli negatif meme kanserinde potansiyel bir prognostik belirteç olarak 1 aşırı ekspresyon.

Yazarlar:

Kanser Biol Ther 2018 04 1319(4):335-345. Epub 2018 13 Şubat.

Bir Kanser Genomik ve Moleküler Patoloji Laboratuvarı, Samsung Tıp Merkezi, Sungkyunkwan Üniversitesi Tıp Fakültesi, Seul, Kore.

Tam metin PDF'yi indirin

Güney Kore'de kadın itfaiyecilerin yaralanmayla ilgili hastaneye kabulü.

Yazarlar:

Int J Occup Saf Ergon 2019 Aralık 525(4):575-582. Epub 2018 5 Şubat.

c Dongguk Üniversitesi Ilsan Hastanesi, Mesleki ve Çevre Tıbbı Bölümü, Kore Cumhuriyeti.

Tam metin PDF'yi indirin

Tekrarlayan ve metastatik dermatofibrosarkom protuberanslarında tümör hücresi popülasyonunun öngörülemeyen klonal evrimi.

Yazarlar:

PLoS One 2017 412(10):e0185826. Epub 2017 4 Ekim.

Moleküler Patoloji ve Kanser Genomik Laboratuvarı, Eczacılık Fakültesi, Seul Ulusal Üniversitesi, Seul, Kore.

Tam metin PDF'yi indirin

Göbek kordonundan türetilen mezenkimal kök hücre özleri, bağırsak makrofajlarını yeniden polarize ederek farelerde koliti azaltır.

Yazarlar:

Bilim Temsilcisi 2017 08 257(1):9412. Epub 2017 25 Ağustos.

Patoloji Anabilim Dalı, Ulsan Üniversitesi Tıp Fakültesi, Asan Tıp Merkezi, Seul, Kore.

Tam metin PDF'yi indirin

Eşzamanlı MET ve HER2 amplifikasyonu ile akciğer adenokarsinomuna hassas tıp yaklaşımları.

Yazarlar:

BMC Kanser 2017 Ağustos 1017(1):535. Epub 2017 10 Ağustos.

Patoloji ve Translasyonel Genomik Anabilim Dalı, Samsung Tıp Merkezi, Sungkyunkwan Üniversitesi Tıp Fakültesi, 81 Irwon-ro, Gangnam-gu, Seul, 06351, Güney Kore.

Arka plan: Hastadan türetilen ksenograft (PDX) modelleri, hassas tıpta ve kanser hastalarını tedavi etmek için hedefe yönelik tedavilerin geliştirilmesinde önemli araçlardır. Bu çalışma, PDX modellerini kullanarak kanser tedavilerini kişiselleştirmek için genomik profil oluşturma ve klinik öncesi ilaç tarama platformlarını entegre eden hassas tıp stratejimizi değerlendirmeyi amaçladı.

yöntemler: Onkojenik sürücü mutasyonlarını belirlemek için dizi karşılaştırmalı genomik hibridizasyon, mikroarray ve hedeflenen yeni nesil dizileme analizleri gerçekleştirdik. PDX hücreleri, PDX'lerden elde edildi ve ardından 17 hedefli ajanla in vitro olarak tarandı.

Sonuçlar: PDX tümörleri, hasta tümörlerinin histopatolojik ve genetik özelliklerini özetledi. Moleküler profilli akciğer kanseri hastalarından alınan numuneler arasında, kopya sayısı analizi, RTK/RAS/RAF onkogen mutasyonları olmayan bir numunede, 033 T'de benzersiz fokal MET amplifikasyonu tanımladı. 033 T'de HER2 amplifikasyonu kanser panelinde saptanmamasına rağmen, PDX'lerde ve PDX hücrelerinde HER2 amplifiye klonların seçimi bulundu. Ek olarak, hasta tümörlerinde, PDX'lerde ve PDX hücrelerinde MET ve HER2 aşırı ekspresyonu bulundu. Crizotinib veya EGFR tirozin kinaz inhibitörü tedavileri, 033 T PDX hücrelerinde hücre büyümesini ve bozulmuş tümör küresi oluşumunu önemli ölçüde inhibe etti.

Sonuçlar: Akciğer kanseri hastalarından alınan cerrahi numuneleri kullanarak PDX hücre modelleri oluşturduk ve kişiselleştirilmiş hedefe yönelik tedavi için klinik öncesi ve klinik etkilerini araştırdık. Ek olarak, MET ve EGFR inhibitörü bazlı tedavinin, reseptör tirozin kinaz /RAS/RAF yolu değişiklikleri olmaksızın MET ve HER2'yi aşırı eksprese eden akciğer kanserlerini tedavi etmek için kullanılabileceğini öneriyoruz.

Tam metin PDF'yi indirin

Cerrahi Yoğun Bakım Ünitesinde qacA/B-Pozitif Metisiline Dirençli Staphylococcus aureus İzolatlarının Yaygınlığı ve Mikrobiyolojik Özellikleri.

Yazarlar:

Mikrop Uyuşturucu Direnci 2018 Nisan 1124(3):283-289. Epub 2017 Ağustos 11

1 Dahili Tıp Anabilim Dalı, Gyeongsang Ulusal Üniversite Hastanesi, Gyeongsang Ulusal Üniversitesi Tıp Fakültesi, Jinju, Kore Cumhuriyeti.

Tam metin PDF'yi indirin

Moleküler bozulma: anaplastik lenfoma kinaz (ALK) - yeniden düzenlenmiş küçük hücreli olmayan akciğer kanserinin kapsamlı bir görünümü.

Yazarlar:

J Pathol 2017 11 28243(3):307-319. Epub 2017 28 Eylül.

Sağlık Bilimleri ve Teknolojisi Bölümü, SAIHST, Sungkyunkwan Üniversitesi Tıp Fakültesi, Seul, Kore.

Tam metin PDF'yi indirin

MET Exon 14 Akciğer Adenokarsinomunda Mutasyonların Atlanması: Klinikopatolojik Etkiler ve Prognostik Değerler.

Yazarlar:

J Thorac Oncol 2017 08 1012(8):1233-1246. Epub 2017 10 Mayıs.

Asan Tıp Merkezi, Göğüs ve Kalp Damar Cerrahisi Anabilim Dalı, Ulsan Üniversitesi Tıp Fakültesi, Seul, Kore Cumhuriyeti.

Tanıtım: Mezenkimal-epitelyal geçiş geni (MET) ekson 14 atlama (METex14) ile NSCLC'de mezenkimal-epitelyal geçiş (MET) inhibitörlerine yanıt, moleküler tarama çabalarını ve optimal tedavi arayışlarını hızlandırdı. Bununla birlikte, METex14 atlamasının klinikopatolojik ve prognostik etkilerini iyileştirmek için daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır.

yöntemler: KHDAK için cerrahi prosedür uygulanan 795 Doğu Asyalı hasta arasında, beşli negatif (EGFR-negatif/KRAS-negatif/anaplastik lenfoma kinaz geni [ALK]-negatif/ROS1-negatif/ret proto-onkogen [] olan 45 hastayı taradık. RET]-negatif) akciğer adenokarsinomları ters transkriptaz polimeraz zincir reaksiyonu kullanılarak ve METex14 atlamalı 17 hastada (%37.8) bulundu. Ayrıca, METex14 atlamalı hücrelerde bağlantı atlamayı hedefleyen küçük enterferans yapan RNA'nın (siRNA) etkisini de araştırdık.

Sonuçlar: 17 hastanın ortanca yaşı 73 idi. Asiner alt tip baskındı (%52,9), bunu katı alt tip (%35,3) izledi. MET immünohistokimyası %100 duyarlılık ve %70.4 özgüllük göstermiştir. Çok değişkenli analizler, METex14 atlamalı hastaların, evre I ila IIIA hastalıkta ALK füzyonu (METex14 atlamasına karşı) (tehlike oranı = 0.283, %95 güven aralığı: 0.119-0.670) olanlara göre daha yüksek bir nüks oranına sahip olduğunu gösterdi, ancak genel olarak farklılıklar patolojik evre için düzeltme yapıldıktan sonra sağkalım anlamlı değildi (p = 0.669). Bu arada, siRNA, Hs746T hücrelerinde MET güdümlü sinyal yollarını azalttı ve siRNA ve krizotinib ile kombine tedavi, krizotinibe dirençli H596 hücrelerinde hücre proliferasyonunu inhibe etti.

Sonuçlar: Akciğer adenokarsinomlarında diğer sürücü mutasyonları olmayan Doğu Asyalı hastalarda METex14 atlama prevalansı oldukça yüksekti. METex14 atlama, yaşlılık, asiner veya katı histolojik alt tip ve yüksek MET immünohistokimyasal ekspresyonu ile ilişkilendirildi. METex14 atlamalı hastaların prognozu, majör sürücü mutasyonları olan hastalarınkine benzerdi. METex14 atlama birleşimini hedefleyen siRNA, METex14 atlamalı hücrelerde MET güdümlü sinyal yollarını inhibe edebilir.



Yorumlar:

  1. Frazier

    harika, çok değerli cevap

  2. Tojami

    Bizim arasında konuşarak, google.com'a bakmanızı tavsiye ederim

  3. Malar

    Please, in more detail

  4. Wahid

    Haklı değilsin. Kanıtlayabilirim. Bana PM'de e -posta gönderin, tartışacağız.



Bir mesaj yaz