Bilgi

D₂O'da (ağır su) E. coli büyümesinin optimizasyonu

D₂O'da (ağır su) E. coli büyümesinin optimizasyonu


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

D'min biyokütlesini arttırmanın bir yöntemini bulmak istiyorum.2O kültürleri çünkü mevcut yöntemim yeterli protein vermiyor. H miktarını da en aza indirmek istiyorum.2Ey benim kültürümde.

Mevcut metodolojim, %75 D ile 3 mL'lik küçük ölçekli bir büyümedir.2O ve LB yaklaşık 9 saat büyütüldü. Bu kültür daha sonra 20 mL %100 D tohumlamak için kullanılır.2O ve M9 kültürü gece boyunca ve bu kültürün tamamı 1 L D tohumlamak için kullanılır2O ve M9 kültürü.

Zaman ayırdığınız için teşekkürler.


Görünüşe göre $^1mathrm{H}$'dan çok katı bir şekilde kaçınıyorsunuz. Dönüşümlerinizi $mathrm{D}_2mathrm{O}$ plakalarına replika kaplamayı düşünebilirsiniz (daha önce $mathrm{D}_2mathrm{O}$ toleransını seçerek).

Protein NMR'si yaptığınızı ve "üçlü etiketleme" istediğinizi varsayıyorum. Karbon etiketlemenizin ne kadar spesifik olduğuna bağlı olarak, başlangıç ​​kültürlerinizi üçlü etiketli agal hidrolizatta ("Bioexpress" gibi bir şey) büyütmek isteyebilirsiniz. hisse senedi) ve başlangıçlarınız iyi büyürse, aynı miktarda $^2mathrm{H}$,$^{13}mathrm{C}$,$^{15}mathrm{N}$ için bahar yapabilirsiniz. yaklaşık $405.


D₂O'da (ağır su) E. coli büyümesinin optimizasyonu - Biyoloji

a Graz Üniversitesi, Moleküler Biyolojik Bilimler Enstitüsü, NAWI Graz, 8010 Graz, Avusturya, B BioTechMed Graz, 8010 Graz, Avusturya, C Mükemmellik Alanı BioHealth – Graz Üniversitesi, Graz, Avusturya, NS Institut Laue–Langevin, 38043 Grenoble, Fransa ve e Tennessee Üniversitesi, Çevresel Biyoteknoloji Merkezi, Knoxville, Tennessee, ABD
* Yazışma e-postası: [email protected], [email protected]

Canlı görüntülerin (ultra) küçük açılı X-ışını (USAXS/SAXS) ve (çok) küçük açılı nötron saçılımı (VSANS/SANS) için daha önce bildirilen çok ölçekli bir model. Escherichia koli bileşimsel/metabolomik ve ultrastrüktürel kısıtlamalar temelinde revize edilmiştir. Hücresel gövde, daha önce tarif edildiği gibi, çoklu kabukları olan bir elipsoid tarafından modellenir. Bununla birlikte, flagelladan kaynaklanan saçılma, hücresel gövde ile çapraz terimi dahil olmak üzere dış zarın lipopolisakarit broşürünün oligosakarit çekirdeklerini hesaba katan bir terimle değiştirildi. Bu, esas olarak, flagella veya fimbra varlığında ve yokluğunda bakteriler için ayırt edilemez saçılım gösteren (U)SAXS deneyleri tarafından motive edildi. Gözden geçirilmiş model, USAXS/SAXS ve farklı kontrastlı VSANS/SANS verilerini uydurmayı başardı. E. koli ATCC 25922, uzunluk ölçeğinde dört büyüklük sırası üzerinde. Spesifik olarak, bu yaklaşım, iç ve dış zarların mesafesinin yanı sıra tüm bakteri bölmelerinin saçılma uzunluğu yoğunlukları dahil olmak üzere, hücresel zarfın yapısal özellikleri hakkında ayrıntılı bilgi sağlar. Model ayrıca başarıyla uygulandı. E. koli K12, yazarların orijinal modellemesinin yanı sıra diğer iki E. koli suşlar. Bakteri boyutu, zarlar arası mesafe ve pozisyon dalgalanmaları açısından farklı suşlar arasında önemli farklılıklar tespit edildi. Bu bulgular, bakterisidal bileşiklerin Gram negatif bakterilerin ultrastrüktürel özellikleri üzerindeki etkisini herhangi bir istilacı boyama veya etiketleme maddesine başvurmaya gerek kalmadan nicel olarak incelemek için burada özetlenen yaklaşımın genel uygulanabilirliğini desteklemektedir.

1. Giriş

Escherichia koli yapısı ve bileşimi hakkında sayısız raporla yaşam bilimlerinde en çok çalışılan Gram-negatif bakteri suşları arasındadır (Breed & Dotterrer, 1916 Lieb ve diğerleri , 1955 Maclean & Munson, 1961 Neidhardt ve diğerleri , 1990 Seltmann & Holst, 2002 Silhavy ve diğerleri , 2010 ). İletim elektron mikroskobu (TEM), hücrenin üst yapısını türetmek için vazgeçilmez bir araç olmuştur. yani bakteri hücre duvarının birkaç on nanometre kalınlığındaki yapısı (Milne & Subramaniam, 2009 ). Bununla birlikte, tekniğin istilacı doğasından kaynaklanan sınırlamaları en aza indirmek için önemli çabalar gerekmiştir (Hobot ve diğerleri , 1984 Matias ve diğerleri , 2003 ). Ayrıca, TEM, fizyolojik ilgili koşullar altında hücresel üst yapının dinamik çalışmalarına ve dolayısıyla modifikasyon hakkında gerçek zamanlı içgörüye izin vermez. E. koli antimikrobiyal peptitler gibi bakterisidal bileşikler tarafından. Zaman çözümlü küçük açılı saçılma deneyleri (Huxley ve diğerleri , 1980), (alt)mikrometre ila nanometre altı uzunluk ölçeklerinde, hacimli etiketler veya istilacı boyama teknikleri kullanmaya gerek kalmadan yapısal heterojenlikleri araştırabilen, bu sorun için olası çözümlerdir [bkz. Örneğin. Zemb & Lindner (2002 ) saçılma tekniklerine genel bir bakış için]. Statik, denge deneyleri açısından, örneğin, canlı kloroplastlardaki tilakoid zarların dış uyaranlara (Liberton) tepkisini araştırmak için küçük açılı nötron saçılması (SANS) kullanılmıştır. ve diğerleri , 2013 ve diğerleri , 2014), küçük açılı X-ışını saçılımı (SAXS) verilerinin temel bileşen analizi uygulanırken, antibiyotiklerin vücut üzerindeki etkisi hakkında bazı nitel bilgiler elde etmek için uygulandı. E. koli (von Gundlach, Garamus, Gorniak ve diğerleri , 2016 von Gundlach, Garamus, Willey ve diğerleri , 2016 ).

Bununla birlikte, SAXS veya SANS kullanarak canlı bir hücrenin alt yapısı hakkında nicel içgörü elde etmek zordur. Bunun nedeni, her iki tekniğin de tüm hücresel içeriğin küresel bir ortalamasını sağlaması ve bireysel katkıda bulunanları seçmeyi çok zorlaştırmasıdır (Semeraro). ve diğerleri , 2020 ). Bu, SANS'ın kontrast varyasyon yeteneklerinin kapsamlı kullanımıyla ele alınabilir. Örneğin Nikeller ve diğerleri (2017) tamamen döteryumlu olarak büyüyebildi basil subtilis SANS kullanarak bakterinin sitoplazmik membranındaki nanoskopik alanları vurgulamalarına izin veren protiate ve döteryumlu yağ asitlerinin karışımlarıyla beslendi. Yine de, D'de bakteri yetiştirmeye gerek kalmadan hücresel üst yapı hakkında fikir edinmek de mümkündür. 2 O. Özellikle, son zamanlarda canlı yayın yoğunluğunun dağınık yoğunluklarını başarılı bir şekilde tanımlayan çok ölçekli bir model bildirdik. E. koli Beş D'de ultra-SAXS (USAXS), SAXS ve SANS deneylerinden kaynaklanan K12 2 AH 2 O oranları (Semeraro ve diğerleri , 2017 ). Spesifik olarak, model, elipsoidal bir sitoplazmik boşluk ve çok katmanlı bir hücre duvarından oluşan hücre gövdesinin bir çekirdek kabuğu açıklamasını uygular ve kendinden kaçınan polimer zincirleri açısından flagelladan gelen katkıları içerir (Doi 'Edwards, 1988). Son bileşenin, saçılma vektörünün orta ila yüksek büyüklüklerinde önemli ölçüde katkıda bulunduğu bulundu. Q .

Üst yapıdan yararlanmak için elastik saçılma tekniklerini kullanma çabalarımıza devam ediyoruz. E. koli üzerinde SAXS deneyleri yapmamıza yol açtı. E. koli ATCC 25922, normal veya kısa kamçılı ve ATCC kamçısız mutant Δ fliC temel olarak üst üste bindirilebilir saçılma modellerinin şaşırtıcı sonucu ile (destekleyici bilgilerde Şekil S1'e bakın). Bu, bakterilerin moleküler bileşimine ve yapısal entegrasyonlarına ilişkin sağlam tahminler temelinde analitik form faktörü modelimizi kapsamlı bir şekilde gözden geçirmemize neden oldu. Bu tahminler, tüm ana bakteri bileşenlerinin boyutlarını, hacimlerini, konsantrasyonlarını ve dağılımlarını içerir.

Kısaca, revize edilmiş bakteri modelimizin en önemli değişiklikleri aşağıdaki gibidir: (i) farklı hücre bölmelerinin ortalama saçılma uzunluğu yoğunlukları (SLD'ler) için kısıtlamalar, metabolomun SLD'lerinin tahminleri de dahil olmak üzere, ayrı gövdeler oluşturan makromoleküller dikkate alınarak türetilmiştir. ve zar (ii) kamçıdan gelen katkılar, aşılanmış polimerler olarak modellenen lipopolisakaritin (LPS) oligosakarit çekirdekleri ile değiştirildi ve (iii) zarlar arası mesafenin varyasyonları ile birlikte bir log-normal olasılık dağılım fonksiyonu (PDF) ile modellendi. modelden hücre yarıçapı üzerindeki ihmal edilebilir polidispersitenin çıkarılması.

Model, USAXS/SAXS ve çok küçük açılı nötron saçılımı (VSANS)/SANS verilerine karşı on farklı kontrastta test edildi. E. koli ATCC 25922, kaydedilen saçılma vektör büyüklüklerinin tüm aralığı üzerinde son derece tatmin edici uyumlar sağlar (3 ×󈇾 𕒷 < Q < 7 nm 𕒵 ). Bu testler ayrıca heterojen olarak yapılandırılmış bir sitozol düşünüldüğünde ve özellikle ribozomlardan kaynaklanan saçılmayı içeren daha karmaşık bir model içerir. Ancak analizimiz, genel saçılmaya ribozom katkısının hücre duvarınınki tarafından boğulduğunu gösterdi. Yeni model aynı zamanda USAXS/SAXS verilerine de başarıyla uygulandı. E. koli Daha önce çok ölçekli modelimizi tasarlamak için kullanılan K12 (Semeraro ve diğerleri , 2017 ) yanı sıra fimbra içermeyen JW4283 ve Nissle 1917 suşu, ultrastrüktürel özelliklerde belirgin farklılıklar ortaya koyuyor.

Kağıt aşağıdaki gibi yapılandırılmıştır. Destekleyici bilgilerde kapsamlı bir bileşimsel veri listesi de dahil olmak üzere Bölüm 3'teki revize edilmiş modellemeyi detaylandırmadan önce, öncelikle deneysel yöntemleri ve örnekleri kısaca özetliyoruz. Bölüm 4, ribozomları hesaba katan heterojen bir sitozolden saçılma için analitik bir modeli açıklar ve Bölüm 5, ilgili parametreleri ve uygulanan optimizasyon stratejisini özetler. Modellemenin beş farklı deneysel veriye uygulanmasının sonuçları E. koli suşlar Bölüm 7'de sonuca varmadan önce Bölüm 6'da açıklanmış ve tartışılmıştır.

2. Malzemeler ve yöntemler

2.1. bakteri örnekleri

bakteri kolonileri E. koli suşlar ATCC 25922, K12 5K, K12 JW4283 (Baba ve diğerleri , 2006 ) ve Nissle 1917 (Sonnenborn, 2016 ) lysogeny broth (LB)–agar (Carl Roth, Karlsruhe, Almanya) plakalarında 310 K'da büyütüldü. Bu kolonilerden gecelik kültürler (ONC'ler), steril polipropilen konik tüplerde (15x8197ml) 3'lük LB besiyerinde (Luria/Miller, Carl Roth) tek bir koloninin inoküle edilmesiyle elde edildi ve 12'si aerobik koşullar altında üremeye izin verildi. 821116 h, 310 K'da sallanan bir inkübatörde. Ana kültürler, ONC'lere uygulanan aynı koşullar altında üssel büyüme fazının ortasına kadar bakteri üremesine izin veren, 50'lik steril polipropilen konik tüplerde 10'8197ml LB ortamı içinde ONC'lerin bir kısmı süspanse edilerek hazırlandı. Hücreler daha sonra hemen iki kez yıkandı ve besin içermeyen ve izotonik fosfat tamponlu salin (PBS) solüsyonunda (fosfat tamponu 20 m) yeniden süspanse edildi. m , NaCl 130 m m ) pH 7.4'te (Sigma Aldrich, Viyana, Avusturya). Bakteri konsantrasyonunu kontrol etmek için bulanıklık ölçümleri kullanıldı. λ = 600 nm dalga boyunda optik yoğunluk değerleri (OD 600 ) spektrofotometre Thermo Spectronic Genesys 20 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ABD) [OD 600 = 1 ≃ 8 ×󈇾 Mililitre başına 8 koloni oluşturan birim (CFU)]. Bu örneklerde 1 CFU, tek bir hücreye karşılık gelir. D içeren numuneler söz konusu olduğunda 2 O, bakteri süspansiyonları iki kez ya PBS ya da ağırlıkça %90'ı %8197 D ile yıkandı. 2 O PBS solüsyonları, her iki tampon durumu için iki konsantre stok solüsyonu elde etmek için. Bu iki stok karıştırıldı ve gerekli bakteri konsantrasyonlarına kadar seyreltildi ve D 2 Deneysel ayarlara göre O içeriği.

ATCC numunelerinin hazırlanması, kamçının bütünlüğünü korumak için azami özenle gerçekleştirildi. Mekanik olarak parçalanmış kamçılı ATCC hücreleri, Turner tarafından tarif edildiği gibi, 22 gauge bir iğne ile donatılmış 3'lü 8197 ml'lik bir şırınga ile süspansiyon beş kez kesilerek hazırlandı. ve diğerleri (2012 ). Süspansiyon, süpernatandaki kamçı parçalarını ortadan kaldırmak için PBS içinde yıkandı.

ATCC 25922 Δ fliC soy, Silhavy tarafından tarif edildiği gibi faj transdüksiyonu ile oluşturulmuştur. ve diğerleri (1984). P1vir faj, YK4516 suşunda (Komeda ve diğerleri , 1980 ) plaka lizat yöntemini kullanarak. YK4516, içinde bir Tn10 eklemesi içerir fliC (fliC5303::Tn10) ve The Coli Genetic Stock Center'dan (Yale Üniversitesi, New Haven, CT, ABD) satın alındı. ATCC 25922 suşu alıcı olarak görev yaptı. Transdüktanlar tetrasiklin içeren plakalar (10 µg ml𕒵) üzerinde seçildi ve uçmak − fenotip, yarı katı agar plakaları (%0.3 agaroz) üzerinde lekelenerek doğrulandı.

2.2. Deneysel kurulum

2.2.1. USAXS

USAXS/SAXS ölçümleri ESRF, Grenoble, Fransa'da TRUSAXS ışın hattında (ID02) gerçekleştirilmiştir. Cihaz, bir iğne deliği konfigürasyonunda hizalanmış tek renkli bir ışın kullanır. Ölçümler 0.0995 nm dalga boyu ve 30,8, 3,0 ve 1,2 m numune-dedektör mesafeleri ile gerçekleştirilmiştir. Q aralığı 0,001𔃅 nm 𕒵 (Narayanan ve diğerleri , 2018 ). Ölçülen iki boyutlu saçılma desenleri, bir Rayonix MX170 dedektörü üzerinde elde edildi, mutlak ölçeğe göre normalleştirildi ve karşılık gelen tek boyutlu USAXS/SAXS profillerini elde etmek için azimut olarak ortalaması alındı. Tampondan, numune hücresinden ve cihazdan normalleştirilmiş kümülatif arka plan, nihai sonucu elde etmek için çıkarıldı. ben ( Q ). Bakteri konsantrasyonu 󕽺 10  hücre ml 𕒵 olan numuneler 310 K'da ölçüldü ve numunenin hassasiyetini en üst düzeye çıkarmak için bir akış düzeneğine monte edilmiş 2 mm çapında kuvars kılcal damarlarında bulundu. arka plan çıkarma.

2.2.2. VSANS

VSANS/SANS ölçümleri, Institut Laue–Langevin (ILL), Grenoble, Fransa'daki D11 cihazında 256 ×� piksel (3,75 ×𔀵.75&) çok telli 3 He dedektörü ile elde edildi. #8197mm). λ = 0,56 nm dalga boyunda dört farklı kurulum (sırasıyla 5,5, 8, 20.5 ve 40.5 m kolimasyonlarla 2, 8, 20.5 ve 39 m numuneden dedektöre mesafeler) ( Δ λ / λ = 9%), bir Q 0.014𔃁 nm 𕒵 aralığı. Çok düşük ulaşmak Q , büyük dalga boyunun ( λ = 2.1 nm) bir kombinasyonu, iki odaklama MgF 2 zararlı yerçekimi etkilerini (kolimasyondaki nötron kaybı ve dedektör üzerindeki yerçekimi bulaşması nedeniyle çözünürlük kaybı) iptal etmek için lensler ve bir ayna kullanıldı kurulum Cubitt tarafından tarif edildi ve diğerleri (2011). Numuneler (konsantrasyon 󕽺 10  hücreler ml 𕒵) 310 K'da ölçüldü ve 2 mm yollu kuvars Hellma 120-QS banjo şekilli küvetlerde bulundu. Bakterilerin çökmesini önleyen dönen bir numune tutucuya monte edildiler. Veriler azaltıldı Lamba ILL'den program, düz alan, katı açı, ölü zaman ve iletim düzeltmesi gerçekleştirir, gelen akı ile normalleştirir (bir monitör aracılığıyla) ve katkıyı boş bir hücreden çıkarır. Deneysel kurulum ve veriler https://doi.org/10.5291/ILL-DATA.8-03-910 adresinde mevcuttur.

2.2.3. Şirket içi SAX'ler

Laboratuvar SAXS deneyleri için bir Eiger R 1 M dedektör sistemi (Dectris, Baden-Daettwil, İsviçre) ile donatılmış bir SAXSpace kompakt kamera (Anton Paar, Graz, Avusturya) kullanıldı. Cu  K α ( λ = 1.54 Å) X ışınları, bir 30 W-Genix 3D mikro odaklı X-ışını jeneratörü (Xenocs, Sassenage, Fransa) tarafından sağlandı. Numuneler cam kapilerlere (çap: 1×8197 mm Anton Paar) alındı ​​ve Peltier kontrollü bir numune aşaması (TC 150, Anton Paar) kullanılarak ölçümden önce 310×8197K'da 10×8197 dakika dengelendi. Toplam pozlama süresi 30 dk (5 dk'lık 6 kare) idi ve numuneden dedektöre olan mesafe 308 mm olarak ayarlandı. Program kullanılarak sektörel veri entegrasyonu ve örnek iletimi ve arka plan saçılması için düzeltmeler dahil olmak üzere veri azaltma gerçekleştirildi. SAXSanaliz (Anton Paar).

2.2.4. Dinamik ışık saçılması

Ölçümler, bir Zetasizer Nano ZSP (Malvern Panalytical, Malvern, UK) kullanılarak yapıldı. ATCC 25922 ve K12 5K numuneleri (konsantrasyon 󕽺 7  hücreler ml 𕒵) 1 cm yol uzunluğundaki cam küvetlerde süspanse edildi ve 310 K'da dengelendi. Bu bakteri konsantrasyonu, optimal bir sinyal-gürültü oranı sağladı ve çoklu saçılma etkilerinden kaçındı. Veriler, standart bir kümülant analizi yoluyla hidrodinamik yarıçapın bir fonksiyonu olarak bakteri popülasyonunun monomodal olasılık dağılımını sağlayan sağlanan yazılım (Malvern) tarafından otomatik olarak analiz edildi. r H . Büyüme ve bölünme sırasında hücre uzunluklarının varyasyonları nedeniyle, her dağılımın ortalama polidispersite indeksi 𕙘.25 idi. Ortalama r H değerler ve ilgili hatalar 18 ölçümden (üç farklı numune hacminin altı çerçevesi) hesaplanmıştır. PBS'de enerji kaynaklarının yokluğu ve numunelerin kuvvetli girdaplanması (kamçıların parçalanması) hücre hareketliliğini en aza indirdi ve Brownian rastgele yürüyüşü bu numunenin baskın dinamikleri haline getirdi.

3. Genel saçılma katkıları ve bileşimsel modelleme

Kompleks Gram-negatif prokaryotik hücrelerden elastik saçılmanın bütünsel bir tanımı, öncelikle bunların her biri iyi tanımlanmış bir uzunluk, hacim ve yoğunluk aralığına sahip olan yaygın moleküler ve supramoleküler bileşenleri göz önünde bulundurularak elde edilebilir ve bunlar kapsamlı bir yapı oluşturmak için bir kılavuz görevi görür. saçılma biçim faktörü modeli. Burada uygulanan saçılma katkısı tahminleri, en son deneysel ve hesaplamalı raporlara dayanmaktadır. E. koli izole hücre bileşenleri dahil. Spesifik olarak, kompozisyon ve yapısal bilgileri kullandık. E. koli ve hücre duvarı (Neidhardt ve diğerleri , 1990 Seltmann & Holst, 2002 Schwarz-Linek ve diğerleri , 2016 ) sitoplazmik boşluk ve bileşenleri (Zimmerman & Trach, 1991 Tweeddale ve diğerleri , 1998 Prasad Maharjan & Ferenci, 2003 Bennett ve diğerleri , 2009 Guo ve diğerleri , 2012 Lebedev ve diğerleri , 2015 ) bakteriyel üst yapı (Hobot ve diğerleri , 1984 Beveridge, 1999 Matias ve diğerleri , 2003 ) lipid membran bileşimi ve yapısı (De Siervo, 1969 Oursel ve diğerleri , 2007 ve diğerleri , 2008 Pandit & Klauda, ​​2012 Kučerka ve diğerleri , 2012 , 2015 ve diğerleri , 2018 ) LPS özellikleri (Heinrichs ve diğerleri , 1998 M'252ller-Loennies ve diğerleri , 2003 Kučerka ve diğerleri , 2008 Kim ve diğerleri , 2016 Rodriguez-Loureiro ve diğerleri , 2018 Micciulla ve diğerleri , 2019 ) periplazmik boşluk (Burge ve diğerleri , 1977 Labischinski ve diğerleri , 1991 Pembe ve diğerleri , 2000 Gan ve diğerleri , 2008 ) ve dış bakteri bileşenleri (Yamashita ve diğerleri , 1998 Whitfield & Roberts, 1999 Stukalov ve diğerleri , 2008 Turner ve diğerleri , 2012 ). Tüm bu bilgiler, Şekil 1'de özetlenen SLD'ler ρ'de yoğunlaştırılmıştır. Ayrıntılı bir açıklama için destekleyici bilgilere (SI) bakın.


Şekil 1
şematik E. koli Tipik boyutların yanı sıra en ilgili bileşenlerin X-ışını ve nötron SLD'leri dahil olmak üzere yapı ve bileşim. Bakteri şekli, Semeraro tarafından detaylandırıldığı gibi, uygun bir şekilde bir elipsoid tarafından modellenmiştir. ve diğerleri (2017 ).

Bu ayrıntılı açıklamanın faydası, uygulanan H'ye bağlı olarak SANS'ın belirli bir moleküler varlık için kontrastı geçersiz kılma veya artırma yeteneği göz önüne alındığında netleşir. 2 O/D 2 O oranı. Seyreltik bir rejimde homojen saçıcılar için, yani hacim kesri, ileri saçılma yoğunluğu, ben (0), saçılma değişmezi ile ilgilidir, Q , olarak

nerede V saçılımın hacmidir ve 〈 Δ ρ 2 〉 ortalama kare saçılım kontrastıdır (Porod, 1982). Karmaşık canlı hücreler gibi homojen olmayan sistemler için ortalama kontrast, her hücre bölmesinin/türünün kontrastının hacim-kesir ağırlıklı ortalaması olarak hesaplanabilir; burada ϕ ben hacim oranıdır ben bileşen. Bu nedenle, tahminler ϕ ben ve Δ ρ ben yaklaşmamızı sağlar Q tüm bakteri bileşenleri için [Şek. 2 ayrıca bkz. Nikeller ve diğerleri (2017 )]. Bu yaklaşım, tüm hücrenin ağırlıkça yaklaşık %40'lık %8197'sinde bir "eşleşme" noktasına yol açar. 2 O. Daha yüksek D'de 2 O içeriği, toplam saçılma yoğunluğu, sudan yoksun oldukları için, membran lipidlerinin asil zincirleri tarafından giderek daha fazla domine edilir. Aşağı D'ye doğru 2 O içerikleri, ribozomlar ve proteinler gibi sitoplazmik bileşenler, sırayla baskın saçılma katkıda bulunanlardır.


şekil 2
Tahmini Porod değişmezinin karekökü Q D'nin bir fonksiyonu olarak 2 Ağırlıkça %O, denklem (1) kullanılarak her bileşen için hesaplanır ve hücre hacmi ile çarpılır. Ek, LPS oligosakarit çekirdeklerinin (koyu yeşil) ve flagella'nın (kesikli pembe) katkısı arasındaki farkları gösterir.

3.1. Çok ölçekli saçılma modeli

Daha önce bildirildiği gibi (Semeraro ve diğerleri , 2017 ), ana gövdesi E. koli çoklu kabuklu (çok çekirdekli–kabuk) bir elipsoidin saçılma genliği cinsinden tanımlanabilir:

nerede ρ ben kompozisyon tarafından verilen SLD'lerdir E. koli genişlik Δ her kabuğun ortalamaları ben ( ρ m +1 tamponun SLD'sidir) ψ, süspansiyondaki bir prolatın her olası oryantasyonu ile ilgili açıdır r 1 sitoplazmik çekirdeğin (CP) küçük yarıçapıdır ve ɛ > 1, majör, ɛ arasındaki orandır. r 1 , ve elipsoidin küçük yarıçapları. Üstelik,

elipsoidin hacminin ve normalleştirilmiş saçılma genliğinin ürünüdür (Pedersen, 1997), burada

Silindirlerin daha gerçekçi bakteriyel şekil modelleri olmasına rağmen, prolatlar yerleştirme sırasında kararsızlığa neden olmaz ve bir prolate veya silindir geometrileri arasındaki farklar karşılıklı uzayda ihmal edilebilir (Semeraro). ve diğerleri , 2017 ). Önceki modelden önemli bir fark (Semeraro ve diğerleri , 2017 ) ρ ile ilgilidir ben uydurma kısıtlamaları olarak kullanılan değerler. Burada, mevcut göz önüne alındığında, düşündük Q aralığı, her makromoleküler türden (proteinler, ribozomlar, DNA) saçılma katkıları vesaire .) ortalama SLD'leri hesaplamak için ayrı ayrı. Bu, daha önce kullandığımız değerlerimizle karşılaştırıldığında, özünde ρ değerini etkiler. ben sitoplazmanın tahminleri – artık metabolomik analize & – ve fosfolipid zarlara dayalıdır (Şekil 1). Yalnızca lipit taklitleri üzerindeki elastik saçılma deneylerinin aksine, her bir çift katmanın yapısal parametreleri, bir tam hücre analizi bağlamında çözülemez (Semeraro ve diğerleri , 2020 ). Bu nedenle, Δ ben ve ρ ben her iki zarın değerleri sabit parametreler olarak kabul edildi (bkz. ben ve ρ ben SI'da verilmiştir).

Bakteri süspansiyonlarının hacim oranı 𕟨,007 idi, bu nedenle hücreler arası bir etkileşim yapı faktörünün mevcudiyeti olası değildir.

Muhtemelen, önceki modele kıyasla en belirgin farklılıklar, saçılımı daha önce polimer benzeri bir yapı faktörü açısından eklenmiş olan flagella'dan kaynaklanmaktadır ve bu da önemli katkılar sağlamaktadır. ben ( Q ) için Q > 0.06 nm 𕒵 (Semeraro ve diğerleri , 2017 ). Bununla birlikte, şaşırtıcı bir şekilde, fiziksel olarak kırılmış, kısa kamçılı (Turner) doğal ATCC 25922, ATCC'nin SAXS verilerinin bir karşılaştırması ve diğerleri , 2012 ) ve kamçısız Δ fliC ATCC mutantı, içinde ayırt edilemez saçılma yoğunlukları gösterdi. Q daha önce flagella'nın hakim olduğu düşünülen aralık (Şekil S1). Sonuç olarak, flagella önemli ölçüde katkıda bulunmaz. E. koli saçılma sinyali. Aşırı santrifüjleme veya dikkatsiz numune manipülasyon adımları kolayca parçalanmalarına neden olduğundan, yaygın bakteri kültürlerinde flagellar filamentlerin bütünlüğünün garanti edilmediğine dikkat edin (Schwarz-Linek). ve diğerleri , 2016 ). Referans ATCC örneğinin tamamen bozulmamış flagellaya sahip olduğunu garanti edemesek bile, bu çalışmada kullanılan bakteri süspansiyonları büyük bir özenle hazırlanmıştır. Aynı numune hazırlama protokolü, hareketli bakteriler (Semeraro ve diğerleri , 2018 ), kamçı bütünlüğünün en azından bir dereceye kadar korunduğunu öne sürüyor.

Çok ölçekli modelimizde eksik saçılma yoğunluklarını düzeltmeye çalışmak, oligosakarit (OS) iç ve dış çekirdeklerinden kaynaklanan katkıları dikkate almamıza neden oldu. Başlangıçta, işlev, fiziksel olmayan sonuçlarla sonuçlanan işletim sistemi çekirdeklerini tanımlayan yeni bir kabuk tarafından değiştirildi (Şekil S2). Özellikle, ρ Röntgen OS katmanı için ≃ 15 ×󈇾 𕒸  nm 𕒶 , desteklenen LPS katmanları üzerinde nötron reflektometri deneyleri ile tutarsız olan suyun dışarı atıldığını öne sürdü, iç ve dış çekirdeklerin hidratasyonunu gösterdi. %40 ila %80  hacim arasında değişir (Clifton ve diğerleri , 2013 Rodriguez-Loureiro ve diğerleri , 2018 Micciulla ve diğerleri , 2019 ). Bu nedenle, işletim sistemi çekirdeklerini dış hücre yüzeyinde aşılanmış bloklar açısından modellemeye karar verdik. Her bir çekirdek, bir Gauss zincir polimeri tarafından yaklaştırıldı ve bu, polimer aşılı kolloid formalizminin uygulanmasını gerektirdi (Pedersen & Gerstenberg, 1996). Böyle bir sistemin saçılma form faktörü (Pedersen, 2000 ) tarafından verilmektedir.

nerede n işletim sistemi işletim sistemi çekirdeği sayısı ve β işletim sistemi = V işletim sistemi ( ρ işletim sistemi − ρ en iyi kadın ) her bir hacmin ürünüdür ve tamponla SLD kontrastıdır,

Gauss zincirinin yapı faktörüdür ve

onun saçılma genliği. x = ( qR G ) 2 , nerede r G OS çekirdeğinin dönme yarıçapıdır. Φ terimi ( Q (5) numaralı denklemdeki ,  ψ ), tek bir bakterinin (Pedersen, 2000 ) tüm elipsoidal yüzeyi boyunca OS çekirdeklerinin tek tip dağılımından kaynaklanan 'çapraz terim' ile ilgilidir ve şu şekilde verilir:

burada, (4)'e göre, + . Buraya, r dış = r 1 + Δ dış hücrenin dış yüzeyini tanımlayan yarıçaptır.

Canlı yayının askıya alınması için toplam saçılma yoğunluğu E. koli sayı yoğunluğu hücreleri n sonra okur

oryantasyon ortalaması nerededir ve periplazmik boşluğun kalınlığının polidispersitesini tanımlar. Spesifik olarak, bir log-normal dağılım fonksiyonu uyguladık. L ( r ). Denklem (9)'daki sabit, yüksekte saçılma arka planını hesaba katar. Q tanımlanamayan katkılardan kaynaklanmaktadır. Periplazmik kalınlığın log-normal dağılımı, hücre duvarı mimarisinin sonlu boyutu tarafından verilen, zarlar arası mesafe dalgalanmalarındaki alt kesme ile ilgilenir. Aslında aşırı parametrelendirme nedeniyle hücre boyutu varyasyonlarının dikkate alınmadığına dikkat edin, hücre yarıçapı üzerindeki çoklu dağılım, ortadan yükseğe önemsiz değişikliklere neden oldu. Q Aralık, yani Q ≥ 0.05 nm 𕒵 .

4. Heterojen yapılı bir sitozol düşünüldüğünde

İç sitozolik yapının en azından kısmen SAXS/SANS tarafından çözülüp çözülemeyeceğini sorgulamak meşrudur. Bu sorunu çözmek için deneysel verilere karşı test edilebilecek daha karmaşık bir analitik saçılma fonksiyonu türettik.

Bir kürenin genel durumunu ele alarak başlayalım (yarıçap: r 0 SLD: ρ 0 ) ρ ortamında askıya alındı m , kapsamak n daha küçük özdeş küresel boncuklar ( r 1 , ρ 1 ), burada iki boncuk arasındaki göreceli mesafe r ben < r 0r 1 . Bu sistemin saçılma genliği,

nerede β 0 = ( ρ 0 − ρ m ) V 0 ve β 1 = ( ρ 1 − ρ 0 ) V 1 , ve V 0 , V 1 , A 0 ve A 1 sırasıyla, kürenin ve tek bir boncukun hacimleri ve kürenin ve bir boncukun normalleştirilmiş saçılma genlikleridir. vektör r m iç boncuklar arasındaki tüm göreli mesafeleri tanımlar. Toplam form faktörü [ P ( Q ) = | A ( Q )| 2 ] sonra şöyle okur

birinci terim kürenin biçim faktörü olduğunda, ikinci terim kürenin toplam saçılma yoğunluğudur. n iç boncuklar ve üçüncüsü küre ve boncuklar arasındaki çapraz terimi tanımlar. Bir "bifazik" kopolimer sisteminin iç yapısını modellemek için benzer bir yaklaşım rapor edilmiştir (Keerl). ve diğerleri , 2009 ). Burada, varsayarak r1 << r0 ve n → ∞, bu kürenin içini yaklaşık olarak makroskopik bir kanonik sistem olarak tanımlayabiliriz. Bu, (11) denkleminin (Klein & D'Aguanno, 1996 ) toplamlarına kanonik topluluk ortalamasının uygulanmasını sağlar,

nerede S ss ( Q ) boncuklar arasındaki etkileşimlerin yapı faktörüne karşılık gelir. İntegral içindeki toplam, mikroskobik yoğunluğu tanımlar. n boncuklar. Topluluk ortalaması, homojen bir sistemin translasyonel değişmezliği nedeniyle ortalama boncuk yoğunluğuna eşit olan tek parçacık yoğunluğuna karşılık gelir. n / V 0 (Klein & D'Aguanno, 1996). Bu nedenle, tüm integral basitçe eşittir NA 0 ( Q ), küresel boncuk sistemi form faktörünün son formunu verir:

Çapraz terim böylece kürenin normalleştirilmiş saçılma genliği ile modüle edilir, A 0 ( Q ), yarıçaplı bir kürenin hacmi içinde boncukların homojen dağılımının bir kıvrımına eşdeğerdir. r 0 . Daha da önemlisi, çapraz terimin bu son biçimi, küçük küreleri barındıran kürenin orijinal hacmine bağlı değildir. Yani, boncuklar, esas olarak sitoplazmanın nükleoid olmayan bölgesine bölünen ribozomlar durumunda olduğu gibi, kürenin belirli bir bölgesi içinde sınırlandırılsa bile, bu çapraz terimin ölçeklenmesi, değişmez.

Bir sonraki adımda, küresel boncuk sistemini heterojen olarak yapılandırılmış bir bakteriyel sitozol durumuna çeviriyoruz. Bu birkaç yaklaşım gerektirir. Her şeyden önce, saçılma yoğunluğunun parçacık hacminin karesiyle orantılı olarak ölçeklenmesi gerçeğinden cesaret alarak, ribozomlardan kaynaklanan katkılara odaklanıyoruz. Daha spesifik olarak, bir hacme sahip ribozomlar V rb ≃ 2800 nm 3 , toplam sayı n rb ≃ (1 − 6) ×󈇾 4 ve r G = 8.77 nm (Zimmerman& Trach, 1991 Lebedev ve diğerleri , 2015 ) ağır su yokluğunda X-ışınları veya nötronlar durumunda baskın sitozolik saçılımcılar olmalıdır (sitoplazmik bileşim ve hacim fraksiyonları için Şekil 2 ve SI). İkinci olarak, ribozomların saçılımını çok düşük seviyede tahmin ediyoruz. Q , yani Guinier rejiminde, saçılma form faktörünün ilk minimumuna kadar, "etkili" bir kürenin saçılmasıyla V rb = 2800  nm 3 ile r rb = 11 nm. Üçüncü olarak, farklı boyut, şekil ve net yüke sahip makromoleküller (sitosolik proteinler) ile karışık etkileşimlerin genel olarak etkili bir sonuca yol açtığını varsayıyoruz. S ss ( Q ) ≃ 1. Ayrıca, çapraz terim modülasyonunu kompakt bir elipsoid ile basitleştiriyoruz, ribozomların nükleotit olmayan bölgeye sekestre olduğunu ihmal ediyoruz ve aşılanmış OS çekirdeklerini çapraz terime dahil etmiyoruz.

Daha sonra ribozomlardan gelen katkılar dikkate alınarak saçılan yoğunluğun son şekli şu şekilde verilir:

nerede β rb = V rb ( ρ rb − ρ sito ), A rb eşdeğer bir küre tarafından yaklaştırılan ribozomların normalleştirilmiş saçılma genliğidir ve A sito sitoplazmik boşluğu tanımlayan bir prolatın normalleştirilmiş saçılma genliğidir ( yani çekirdeğin yalnızca merkezi kısmı kabuk sistemi tarafından tanımlanır).

5. Parametreleştirme ve optimizasyon stratejisi

Elastik SAS'ı tanımlamak için gereken tüm parametreler E. koli Tablo 1'de özetlenmiştir. Genel olarak, bireysel deneye bağlı olan veya olmayan parametreler arasında ayrım yaparız ( Örneğin. numune konsantrasyonu, saçılma kontrastı). Deneye özgü parametreler "yerel" olarak adlandırılırken, diğerleri "genel" parametreler olarak adlandırılır.

tablo 1
Canlı yayın için revize edilmiş çok ölçekli modelin parametrelerine genel bakış E. koli saçılma ( bkz. . denklem 9 ve 14 )

Sitoplazmik zarın (CM) ve dış zarın (OM) yapısal ayrıntılarını açıklayan parametreler, zar mimik sistemleri üzerinde deneylerden ve simülasyonlardan bildirilen değerlere göre sabitlendi. E. koli hücre zarları (De Siervo, 1969 Oursel ve diğerleri , 2007 ve diğerleri , 2008 Pandit & Klauda, ​​2012 Kučerka ve diğerleri , 2012 , 2015 ve diğerleri , 2018), Tablo 2'de detaylandırıldığı gibi (ayrıca bkz. Şekil 1 ve SI). Bu karar, farklı saçılma özelliklerinin olmamasıyla rasyonalize edilebilir. Q > 0.27 nm 𕒵 , 󕾄 nm mesafelere karşılık gelir. Sonuç olarak, 󖼤 nm yapısal özellikleri, genel saçılmaya katkıda bulunsa da, uygun doğrulukla çözülmesi zordur. Membran proteinlerinin, saçılan yoğunluğa ayrı ayrı eklenen cisimler olarak diğer bölmelerdeki proteinlere benzer şekilde işlendiğine ve dolayısıyla iç ve dış zarların ortalama SLD'lerine katkıda bulunmadığına dikkat edin. Hücre gövdesinden kaynaklanan genel saçılma ile karşılaştırıldığında, genel katkılarının ihmal edilebilir olduğu gösterilebilir. Benzer şekilde, peptidoglikan tabakasının (PG) genişliği, W PG , ve işletim sistemi çekirdeğinin dönme yarıçapı, r g,işletim sistemi , katkıları analiz edildikten sonra Tablo 2'de bildirilen değerlere sabitlendi. W PG 𕙞 nm değerleri rapor edilmiştir (Matias ve diğerleri , 2003 ) ve 2.5𔃅.5 nm aralığındaki simülasyonlar (Labischinski ve diğerleri , 1991 ) önemsiz değişikliklere yol açtı ρ PG . Ayrıca, tahminlerimiz gösteriyor ki r g,işletim sistemi < 1 nm (bkz. SI). Ancak, bu kısıtlama dahilindeki değerindeki değişiklikler saçılma modelimizde önemli değişikliklere yol açmaz, çünkü r dışr g,işletim sistemi .

Tablo 2
Sabit parametre değerleri listesi

Son olarak, ATCC ve K12 suşları için majör ve minör elips yarıçapları arasındaki oran, ɛ sabitlendi. Bu seçim, mevcut en düşük Q bakteriyel saçılımın Guinier platosuna ulaşmayan ve dolayısıyla hücre uzunluğunun doğru bir şekilde belirlenmesine izin vermeyen aralık. Bu nedenle, ilk önce ortalama uzunluğu tahmin etmek için dinamik ışık saçılımını kullandık, L C , itibaren, kullanarak r G  ≃  r H ve bildirilen tipik değerler r dış literatürde. Bu,  nm ve  nm'ye yol açtı. Ortaya çıkan ɛ  = L C /(2 r dış ) değerleri daha sonra USAXS/SAXS verileri için optimizasyon prosedürünün bazı test çalışmalarında rafine edildi. r dış ayarlanabilir parametre olarak ve daha sonra ayrıntılı USAXS/SAXS ve VSANS/SANS analizi için sabitlenerek Tablo 2'de rapor edilen değerler elde edilir.

Sistemin karmaşıklığı ve çok sayıda parametre nedeniyle, ayarlanabilir parametrelerin optimizasyonu Monte Carlo genetik seçim algoritması (Banzhaf) ile gerçekleştirilmiştir. ve diğerleri , 1998 ). Kısacası, algoritma her döngüde tekrarlanan bir dizi adımda şematize edilmiştir ( nesil ). Sıfır adım olarak, her parametre için dokuz düşük tutarsızlık dizisi (yarı rastgele sayılar) oluşturuldu ( gen ) belirli sınırlar içinde, bileşimsel tahminlere dayalı olarak (bkz. SI). Dokuz parametre seti ( bireyler ) daha sonra eşit sayıda olası saçılma yoğunluğu eğrisini test etmek için girdi olarak kullanıldı (adım 1, değerlendirme ). Bu, dokuz standart ağırlıklı ki-kare değerinin hesaplanmasını içeriyordu.

nerede n Bedava serbest parametre sayısı ve σ ben ölçülen ile ilişkili hatadır ben veri, ben belirli bir zamanda Q ben . sadece dört bireyler ardından en düşük χ 2 değerleri seçildi (adım 2, seçim ) ilkini oluşturmak için yavru , sekiz yeni bireyler rastgele karıştırılarak oluşturulan genler seçilen dört ebeveynden (3. adım, rekombinasyon ). yeni dokuzuncu bireysel en düşük χ 2 değerine sahip ebeveynin bir kopyasıydı (kural 1: en iyinin mirası ). Sonra rekombinasyon , her biri gen sonlu bir değiştirilme olasılığı vardı (adım 4, mutasyon ). Ek olarak, bir bütünün değiştirilmesi için sonlu bir olasılık vardı. bireysel rastgele oluşturulmuş yepyeni bir setle genler (kural 2: yabancı ). Bu yapının yeni yavru ilk döngü sona erdi ve her biri bireysel tekrar χ 2 değerleri temelinde değerlendirildi (1. adıma geri atlayarak). İşlem, ardışık 25 için en düşükteki değişiklikler %0,5'ten az olana kadar tekrarlandı. nesiller .

NS mutasyon adım ve kural 2, algoritmanın χ 2 manzarasında olası yerel minimumları atlamasını sağlarken, kural 1 uydurmanın hızlı bir şekilde yakınsamasını sağlar. İlk setin oluşturulması dışında, şunu unutmayın: bireyler , karar verme süreçleri için tüm algoritmada sözde rasgele sayılar kullanılmıştır. rekombinasyon ve mutasyon adımlar ve kural 2 için daha büyük bir başlangıç ​​popülasyonunun (>9 bireyler ) hesaplama süresi kazancı ile sonuçlanmadı. Her yeni sözde rastgele gen sonuçların fiziksel anlamının korunmasını sağlamak için her zaman ilk sınırlar içinde sınırlandırılmıştır. Toplamda, her saçılma eğrisi 500 kez uyduruldu ve her parametre için ortalama değerleri ve standart sapmaları almak için yalnızca yakınsak bağlantı parçaları (yakınsama kriteri) kullanıldı.

SANS söz konusu olduğunda, Q -bağımlı enstrümantal smearing ayrıca dikkate alındı. Bu standart bir evrişim ile gerçekleştirildi

nerede G (Q) genişliği Δ olan normalleştirilmiş bir Gauss profilidir Q ( Q ). Δ Q ( Q ) fonksiyonu olarak değerler Q uydurma sırasında sabit parametrelerdi ve D11 birincil veri tedavisi tarafından sağlandı. Buna karşılık, araçsal bulaşmanın etkisi SAXS verileri için ihmal edilebilir düzeydeydi.

6. Sonuçlar ve tartışma

6.1. SAXS/SANS küresel analizi

Revize edilmiş çok ölçekli model, USAXS/SAXS ve VSANS/SANS verilerine karşı test edilmiştir. E. koli suşu ATCC 25922. Farklı kontrast koşullarına sahip on SANS veri seti toplandı, D 2 O - ağırlıkça %0'dan %90'8197'ye kadar (ağırlıkça %10'luk artışlarla). Birleşik SAXS/SANS veri analizinin sonuçları Şekil 3 ve Tablo 3 ve S1'de rapor edilmiştir. Şekil 3 ( a ), USAXS ve SAXS rejimlerinde çok çekirdekli kabuk modelinden, işletim sistemi çekirdeklerinden ve iki çapraz terimin toplamından [denklem (5)'e bakın] farklı katkıları vurgular. Çekirdeğin kabuk işlevinden saçılma katkısı, yani hücre gövdesi artı hücre duvarı, kütledeki büyük fark nedeniyle işletim sistemi çekirdeklerinden kaynaklanan saçılma yoğunluğuna hakimdir. Bununla birlikte, tüm hücre yüzeyinin bir fonksiyonu olan çapraz terim, esas olarak hücreler arasındaki saçılan yoğunlukların modüle edilmesinden sorumludur. Q ≃ 0.1 nm 𕒵 ve Q ≃ 0.3 nm 𕒵 . Bu, arasında ortalama bir eğime yol açar. Q 𕒵.5 ve Q aşılı sistemlerin tipik bir imzası olan bu rejimde 𕒶 'blob saçılması' olarak da adlandırılır (Pedersen, 2000). Daha önce, bu rejim, kendinden kaçınan bir yürüme polimer terimi (Semeraro) ile tanımlanan flagella tarafından domine ediliyordu. ve diğerleri , 2017 ). Ancak bu, eğimin görünürdeki değişimini açıklamaz. Q ≃ 0,04 nm 𕒵 ve saçılma özelliği Q ≃ 0.1 nm 𕒵 , ATCC suşuna (bkz. Şekil S3) özgü gibi görünen ancak K12'ye değil (aşağıya bakın). Bu nedenle, işletim sistemi çekirdeği çapraz terimi, aşağıdakilerin tam bir tanımını sağlar. Q 0,03 ile 0,2 nm 𕒵 arasında değişir.

Tablo 3
USAXS/SAXS ve VSANS/SANS'ı tanımlayan global parametreler için uygun sonuçlar E. koli ATCC 25922 suşu

Hatalar, birleştirilmiş bağlantı parçaları grubunun standart sapmalarından hesaplanmıştır. Yerel parametrelerle ilgili sonuçlar için Tablo S1'e bakın.


Figür 3
( a ) USAXS/SAXS veri analizi E. koli ATCC 25922, denklem (9) kullanılarak, farklı terimlerin katkıları vurgulanır (çapraz terimin negatif değerleri gösterilmemiştir). ( B ) Ribozomlardan katkıları gösteren denklem (14) kullanılarak aynı verilerin alternatif analizi. Denklem (9) (siyah kesikli çizgi) kullanılarak bir uyum ile karşılaştırma, ihmal edilebilir farklılıklar gösterir. ( C ) Aynı suşun seçilen D'deki VSANS/SANS verileri 2 O kontrastları (ek nötron verileri için Şekil S4'e bakın). Daha iyi görünürlük için saçılma eğrileri ölçeklendi.

Ribozomları hesaba katan daha karmaşık modelle aynı verileri uydurma girişimleri [denklem (14)], makromoleküllerden önemsiz saçılma katkıları gösterdi [Şek. 3 ( B )]. Özellikle, uyum iyiliği ve ortak ayarlanabilir için sonuçlar, analiz hatası içinde aynıydı. Bu nedenle ribozom terimi, ilgili çapraz terimiyle birlikte hücre duvarı katkısıyla karşılaştırıldığında ihmal edilebilir düzeydedir. Yalnızca D'nin en düşük ağırlık yüzdesine sahip SAXS veya SANS verilerinin 2 O, bu katkıyı test etmeye duyarlıdır. SANS verilerine, daha yüksek ağır su içeriğinde açil zinciri katkısı hakimdir (Şekil 2). Ayrıca ribozomlar, farklı şekilde eşleşecek olan amino asitler ve RNA'dan oluşur ve bu nedenle analize meydan okur. Bunu not et n rb bu analiz için tek ayarlanabilir parametreydi. V rb ve r rb değerler Bölüm 4'te detaylandırıldığı gibi sabitlenmiştir. İlginç bir şekilde, bu testin sonucu çok daha az sayıda ribozomla sonuçlandı ( n rb ≃ 500) tahminimize göre n rb ≃ 10 4 Zimmerman & Trach'ı (1991 ) takip ediyor (bkz. SI). Bu muhtemelen, bu moleküllerin yerel sitoplazmik ortamdaki düşük kontrastı ile ilgilidir. Ölçekleme ile orantılı olduğu için n rb ( ρ rb − ρ KP ) 2 , etkili kontrasttaki küçük farklılıklar, makromoleküllerin sayısının belirlenmesini kolayca çarpıtır.

Önemli olarak, bu analiz sadece ribozomlardan gelen etkili saçılma sinyalinin ihmal edilebilir olduğunu değil, aynı zamanda diğer sitoplazmik bileşenlere de benzer değerlendirmelerin uygulanabileceğini gösterir. Bununla birlikte, daha küçük boyutları (proteinler) veya daha küçük hacim fraksiyonları (DNA ve RNA) nedeniyle, genel saçılan yoğunluğa daha da az katkıda bulunacaklardır. Bu nedenle, elastik saçılma teknikleri, canlı bakteri hücrelerinde sitozol içinde farklı yapılandırılmış bölmeleri ayırt etmek için uygun değildir. Aynısı zar proteinleri (yukarıya bakın) veya periplazmik boşlukta ve peptidoglikan tabakasında bulunan proteinler için de geçerlidir.

Seçilen kontrastlarda seçilen VSANS/SANS verilerinin analizi Şekil 3'te sunulmuştur ( C ) (nötron saçılma verilerinin tamamı ve uyumu, Şekil S4'te sunulmuştur). Açıkça, denklemi (9) kullanarak uyuyor, değişen D üzerine saçılan yoğunluklardaki tüm değişiklikleri düzgün bir şekilde yakalar 2 O konsantrasyonları, modelleme yaklaşımımıza güçlü destek veriyor. Bakteri zarfının X-ışını ve nötron SLD profillerini oluşturan sonuçtaki parametreler, yine seçilen nötron kontrastlarında Şekil 4'te özetlenmiştir (tüm nötron SLD profilleri için Şekil S5'e bakınız). X-ışını ve nötron profillerindeki mesafeler ile global parametreler (Tablo 3) arasındaki küçük farklar, numunelerin biyolojik değişkenliğinden kaynaklanmaktadır, ancak aşağıdakiler hariçtir: n işletim sistemi , hala sonuçların güven aralığında. Ağırlıkça %10'luk D'de 2 O, farklı levhalar arasındaki kontrast farklılıkları, SAXS verilerinden elde edilenlerle karşılaştırılabilir. Bu durumlardaki saçılma yoğunlukları, aynı zamanda saçılma özellikleri açısından da karşılaştırılabilirdi. Q ≃ 0.1 ve 0.3 nm 𕒵 (Şek. 3 ). Sırayla, 40 D'de 2 Ağırlıkça %O  (ve benzer şekilde ağırlıkça %90 'ye kadar D 2 O), yüksek oranda hidratlı bakteri alt bölümlerinin kontrastı (PG katmanı vesaire .), iki zarın hidrofobik bölgelerinin ana kontrastından çok daha düşüktür [Şek. 4 ( B )]. Bu özellik, saçılma özelliğinde kaymaya yol açar. Q ≃ 0.27 nm 𕒵 için Q ≃ 0.2 nm 𕒵 [Şek. 3 ( C )], öncelikle zarlar arası mesafe ile ilgilidir. Bu, saçılma yoğunluğunun D için açil zincir bölgesinin katkısının baskın olduğunu gösteren değişmez tahminle (Şekil 2) iyi bir niteliksel uyum içindedir. 2 O ≥ %40 ağırlıkça.


Şekil 4
( a ) Şekil 3'te gösterilen uyuma karşılık gelen ATCC 25922 suşunun bakteriyel ultrastrüktürünün X-ışını SLD profili ( a ). Panel, hem sitoplazmik hem de dış zarın ve peptidoglikan tabakasının ortalama pozisyonlarını vurgular. Apsis, küçük yarıçap boyunca hücre merkezinden olan mesafeyi tanımlar. r . ( B ) Aynı suşun seçilmiş nötron SLD profilleri [ bkz. . Şekil 3 ( C )]. Ayrıca bkz. Tablo S1.

Modelleme stratejimizi test etmek için çeşitli SLD'lerin varyasyonunu D ile rapor ediyoruz. 2 O içerik. Çözücü sitoplazmik ve periplazmik boşluklara serbestçe eriştiğinden, bu tür çizimler doğrusal bir bağımlılık göstermelidir. Gerçekten de, trendler beklenen davranışı takip etti ve bu da bireysel bölümler için eşleşme puanlarını hesaplamamızı sağladı [Şek. 5 ( a )𔃃 ( C )]. Hidratlı fosfolipid baş gruplarının SLD değerlerinin sabitlendiğine dikkat edin (Tablo 2). β durumunda işletim sistemi , saçılma katkılarının yerini, D için zarlar arası mesafeden kaynaklanan sinyal alır. 2 % 60'lık %8197. β için doğrusal eğilim işletim sistemi bu nedenle ağırlıkça %0󔼺𔀹 aralığında belirlendi ve daha sonra daha yüksek D'ye tahmin edildi 2 Bir güven sınırı kullanarak O konsantrasyonları. Bu analizden elde edilen sonuçlar, ölçülen etkin değişmezi D'nin bir fonksiyonu olarak elde etmek için kullanıldı. 2 % O ağırlık [Şek. 5 ( NS )]. Tahmini ile karşılaştırma Q minimumda tahmini ağırlıkça %40'lık değerden ölçülen ağırlıkça %50'lik değere doğru bir kayma gösterir 2 O, muhtemelen D'de baskın olan bileşenlerin daha büyük katkısı nedeniyle 2 O ≤ %30 ağırlıkça (Şekil 2 ). Öte yandan, bu bileşenler ihmal edilebilir bir saçılma katkısına sahip oldukları kanıtlanmış makromoleküllerdir.


Şekil 5
( a ), ( B ) Sitoplazma (kırmızı daireler), periplazma (yeşil kareler) ve peptidoglikan (turuncu üçgenler) SLD'lerin çizimleri, lineer bağlantı parçaları ve eşleştirme noktaları ile birlikte. Fosfolipid baş grubu katmanlarının SLD'leri sabit parametrelerdi (mavi üçgenler). ( C ) β'nın Konusu işletim sistemi (mor daireler) değerleri, doğrusal uyumlar ve eşleşen noktalarla birlikte. ( NS ) Tahmini saçılma değişmezi ile tahmin edilen ileriye doğru saçılım arasındaki karşılaştırma.

Bu paradoksun cevabı, bireysel olarak dağılan ve SLD ortalamalarına dahil edilen makromoleküller arasında net bir boyut farkının yokluğunda bulunabilir. Sitosolik proteinlerin (Zimmerman & Trach, 1991 ) jel filtrasyonundan moleküler kütle dağılımını bir boyut olasılık dağılım fonksiyonuna çevirmek, deneylerimizde tespit edilen en küçük protein boyutunda maksimum bir değer verir (bakınız SI). Bu nedenle, en küçük bakteri proteinlerinin bir kısmının ρ parametresine dahil edilmesi gerekebilir. KP . ρ için uygun değerlerimiz KP aslında hem SAXS hem de SANS analizi durumunda metabolitlerin tahmini SLD'lerinden daha büyüktür (Şekil 1 ve Tablo S1'i karşılaştırın). Her durumda, tahmin edilen değişmez, modellememiz için yalnızca değerli bir kılavuz olarak kullanıldı. Açıkça, denklem (1), yoğun ve kalabalık süspansiyonlar durumunda geçerliliğini kaybeder ve daha iyi tahminler için her hacim fraksiyonunu hesaba katan yeni bir formül kullanılmalıdır (Porod, 1982).

6.2. ATCC ve K12 ile ilgili suşlar arasındaki karşılaştırma

Canlı için revize edilmiş çok ölçekli modelimizin başarılı bir şekilde doğrulanmasından sonra E. koli ATCC, yeni modelin diğerlerine de uygulanabilir olup olmadığını test ettik. E. koli suşlar. Şekil 6, ATCC'ye kıyasla K12 5K, JW4283 ve Nissle 1917 suşlarının USAXS/SAXS verilerini gösterir. Çarpıcı bir şekilde, K12 5K, JW4283 (fimbria içermez) ve Nissle 1917'nin saçılma desenleri, Q > 0.06 nm 𕒵 , bu suşlarda ana ultrastrüktürel özelliklerin korunduğunu düşündürür ve fimbria varlığının SAXS'ye katkıda bulunmadığını doğrular. Ayrıca önceki modelimizin tüm K12 suşlarına mükemmel şekilde uyacağını unutmayın. Altta saçılan yoğunlukların farklı minimum konumları Q değerler, bunun yerine farklı suşların farklı boyutları nedeniyledir.


Şekil 6
ATCC, K12, fimbria içermeyen K12 JW4283 ve Nissle 1917 suşlarının USAXS/SAXS verilerinin çok ölçekli analizi. Ek, Δ'nın log-normal PDF'sinin çizimlerini gösterir. OM ATCC (koyu kırmızı) ve K12 (kesikli yeşil) suşları için değerler. JW4283 ve Nissle 1917'nin PDF'leri K12 ile karşılaştırılabilir ve bu nedenle gösterilmemiştir.

Daha da önemlisi, yeni modelimiz, deneysel verilerle genel olarak mükemmel uyumla gösterildiği gibi, tüm suşlara uyma yeteneğine sahiptir (Şekil 6). Bu analizden kaynaklanan yapısal parametreler Tablo 4 ve S2'de rapor edilmiştir. Bu parametrelerin çoğu karşılaştırılabilir büyüklüktedir. Önemli farklılıklar hücre boyutuyla ilgilidir ( r , ɛ ) – saçılma minimumlarının farklı konumlarında gözlemlendiği gibi (Şekil 6 ), işletim sistemi çekirdek sayısı ( n işletim sistemi ) ve zarlar arası mesafe ( Δ OM , σ OM ). Sonuncusu, Δ aracılığıyla gerçek periplazmik boşluk kalınlığı ile ilgilidir. OM = (2 W BEN Mİ + NS SANTİMETRE + NS OM )/2 (X-ray SLD profilleri için Şekil S6'ya bakın). Hem periplazmik kalınlık hem de dalgalanması, K12 ile ilgili suşlar için ATCC'den daha küçüktür. Δ olduğunu unutmayın OM K12 5K için, benzer bir suş için daha önce bildirdiğimiz değerle tutarlıdır (Semeraro ve diğerleri , 2017 ). Farklı Δ olmasına rağmen OM ve σ OM ATCC ve K12 suşları için, bağıl dalgalanmaların büyüklüğü σ OM / Δ OM ≃ (0.16– 0.22) kabaca korunur.

Tablo 4
ATCC 25922, K12 5K, JW4283 ve Nissle 1917 suşlarının USAXS/SAXS analizi için yerel serbest parametre seti için uydurma sonuçları

Hücre boyutu farklılıkları göz önüne alındığında, hücre yüzeyine göre K12 5K (2.8 ×󈇾 6  nm 2 ) < Nissle 1917 (3.3 ×󈇾 6 & #8197nm 2 ) ≃ ATCC 25922 (3.4 ×󈇾 6  nm 2 ) < JW4283 (4.5 ×󈇾 6  nm 2 ). Hücre boyutundaki farklılıkların, hücresel zarfın dış broşürüne hakim olan LPS moleküllerinin sayısıyla bağlantılı olması beklenir. Aslında, n işletim sistemi kabaca bakteri dış yüzeyi için gözlemlenen sırayı takip eder (Tablo 4). normalleştirme n işletim sistemi bakteri dış yüzeyindeki değerler, 1,3𔂿.5 nm𕒶 değerinde bir LPS yüzey yoğunluğuna yol açar. Ancak, LPS başına kesit alanı 𕙙.6 nm 2 olduğu için (Clifton ve diğerleri , 2013 Micciulla ve diğerleri , 2019 Kim ve diğerleri , 2016 ), beklenen yüzey yoğunluğu 𕙘.6 nm 𕒶 . İki tahmin arasındaki tutarsızlık büyük olasılıkla prolate yaklaşımı dikkate alınarak bakteri yüzeyinin olduğundan az tahmin edilmesinden veya β tarafından getirilen belirsizliklerden kaynaklanmaktadır. işletim sistemi , hangi, gibi n işletim sistemi , oligosakkaritlerden ve bunların çapraz terimlerinden saçılma katkılarını ölçekler [denklem (5) ]. Ek bir faktör, bakteri yüzeyinin pürüzlülüğü ile ilgili olabilir (Alves ve diğerleri , 2010 ), bu, basit tahminimizde burada düşünülenden daha büyük bir etkili yüzeyle sonuçlanır.

Son olarak, PG katmanı ile OM Δ arasındaki merkezden merkeze mesafe PG ≃ 17 nm, X-ray SLD ρ ile PG ≃ 10.2 ×󈇾 𕒸  nm 𕒵 şu anda incelenen herkes için E. koli suşlar. Daha önce Δ bildirmiştik PG ≃ 11 nm (Semeraro ve diğerleri , 2017), peptidoglikan ipliklerini dış zara çapraz bağlayan lipoproteinlerin uzunluğu ile daha tutarlı görünüyor. Beklenen değerden bu sapma, Δ dalgalanma modlarından kaynaklanıyor olabilir. PG Δ'dakilerle tam olarak ilişkili olmayan OM , burada bir log-normal dağılım fonksiyonu ile modellenmiştir. Δ varyasyonları için ayrı/kısmen bağlı bir dağıtım işlevi tasarlama PG ancak, mevcut deneysel çözünürlüğün ötesindedir. Buna karşılık, (ve ayrıca ATCC için) için yeni değerimiz artık peptidoglikan tabakasının rapor edilen hidrasyon değerleriyle tutarlıdır, yani %80󈟆 hacimce (Labischinski ve diğerleri , 1991 Pembe ve diğerleri , 2000 ). Daha önce bildirilen değer olan 󕽻.6 ×󈇾 𕒸  nm 𕒵 , SLD ortalamasında makromoleküler türlerin varlığını içeriyordu.

7. Karar

Yerel ve flagellum/fimbria içermeyen SAXS verilerinin benzerliği E. koli suşlar, daha önce bildirilen saçılma biçim faktörü modelimizi gözden geçirmemize neden oldu (Semeraro ve diğerleri , 2017 ) Gram negatif bakterinin E. koli . Flagellar katkı, lipopolisakaritlerin oligosakarit iç ve dış çekirdeklerinden saçılma, aşılanmış bir polimer modeli açısından dikkate alınarak değiştirildi. Burada sunulan model, her bir hücresel bileşen için karakteristik uzunlukların, hacimlerin ve saçılma uzunluk yoğunluklarının ayrıntılı bileşimsel ve yapısal tahminlerine dayanmaktadır ve bu nedenle on yıllarca süren araştırmaları birleştirmektedir. E. koli ultrastrüktür ve moleküler bileşimi tek bir kapsamlı saçılma fonksiyonuna dönüştürür. Türetilmiş modelin X-ışını ve nötron saçılımı deneylerine uygulanabilirliği, spesifik bakteri kompartımanlarından gelen katkıları vurgulamak veya geçersiz kılmak için güçlü kontrast varyasyon tekniğinin kullanılmasını sağlar.

İlginç bir şekilde, birleştirilmiş (U)SAXS/(V)SANS deneylerinin sitoplazmanın yapısal heterojenliğine duyarlı olmadığını bulduk, çünkü onu oluşturan makromoleküllerin saçılma sinyali hücre zarının katkısıyla bastırılıyor. Benzer şekilde, birleşik analiz, nanometre altı aralığında, özellikle sitoplazmik veya dış membranlar için, örneğin kalınlık veya bileşim asimetrisi gibi farklılıkları rapor edemez, ancak bunlardan birkaçıdır. CM ve OM için altta yatan SLD varyasyonları, bu nedenle, peptidoglikan tabakasının genişliği ve etkili r G Her bir oligosakarit çekirdeğinin. Buna karşılık, tekniğimiz genel hücre boyutuna, sitoplazmik ve periplazmik boşluğun ortalama kontrastına ve hücresel zarfın yapısına oldukça duyarlıdır. Sonuncusu, sitoplazmik ve dış zarlar arasındaki mesafenin yanı sıra ortalama dalgalanmalarını ve peptidoglikan tabakası ile dış zar arasındaki mesafeyi içerir. Modelimizin olası bir uyarısı, β parametrelerinin işletim sistemi , n işletim sistemi ve Δ PG sadece niteliksel olarak belirlenebilir.Spesifik olarak, LPS moleküllerinin (oligosakkarit çekirdekleri) toplam sayısı, bakteri zarfının bir elipsoidal yüzey tarafından yaklaştırılmasından etkilenirken, peptidoglikan tabakası ile dış zar arasındaki mesafe, kullanılan zarlar arası mesafe dağılım fonksiyonuna bağlı gibi görünmektedir. Genel olarak, modelimizin sağlamlığı, türetilmiş parametrelerin mükemmel bir şekilde uyuşması ile ilgili geniş bir literatür gövdesi ile gösterilmiştir. E. koli üst yapı.

Sonuç olarak, canlı sistemlerde elastik saçılma deneyleri E. koli invaziv etiketlemeye ihtiyaç duymadan spesifik ultrastrüktürel bakteriyel özelliklerin topluluk ortalamalı değerlerini sağlar ve transmisyon elektron mikroskobu veya optik mikroskopi için tamamlayıcıdır. Burada beş arasındaki farkları rapor ediyoruz E. kol esas olarak toplam boyut ve zarlar arası mesafelerden kaynaklanan suşlar (Tablo 6). Gelecekteki araştırmalar, farklı örnek büyüme koşullarının etkilerini veya antibiyotikler gibi bakterisidal bileşiklerin etkilerini tespit etmek için bu platformdan yararlanabilir. Özellikle, analizimizin milisaniye zaman çözümlü (U)SAXS ile birleşimi, etkinliklerinin kinematografik olarak saptanmasını sağlar. Laboratuvarımız şu anda antimikrobiyal peptitler için böyle bir yaklaşımı araştırıyor. Ayrıca, farklı suşlar (Gram-pozitif bakteriler, diğer basit organizmalar ve hücreler dahil) için benzer modeller tasarlamanın, ayarlanabilir parametreler için uygun fiziksel kısıtlamaları ayarlamak için benzer kalitede tamamlayıcı bilgi gerektirdiğini not ediyoruz. Bununla birlikte, burada sunulan model, bu tür çabalara nasıl yaklaşılacağına dair yollar ve kılavuzlar sağlar.

Destek Bilgisi

Teşekkür

ESRF – European Synchrotron ve Institut Laue–Langevin (ILL), sırasıyla SAXS (teklif LS-2869) ve SANS (exp. 8-03-910) ışın sürelerinin sağlanması için kabul edilmektedir. Yazarlar ayrıca, SAXS ve SANS deneyleri sırasında bakteri numunesi hazırlama için laboratuvar ekipmanına erişim sağlayan EMBL Grenoble'daki ziyaretçilerin laboratuvar desteğine de teşekkür ediyor. Yazarlar, USAXS/SAXS ölçümleri için T. Narayanan'ın yanı sıra verimli tartışmalar ve tavsiyeler için ve bakteri kültürleri hakkındaki uzmanlığını paylaştığı için N. Malanovic'e minnettardır. Son olarak yazarlar, destek ve kullanılabilirlik için Mol's173ecular Biosciences Enstitüsü, ışın hattı ID02 ve D11 cihazı personeline teşekkür eder.

Finansman bilgileri

Bu çalışma, Avusturya Bilim Fonu (FWF) projesi No. P30921 (KL'ye verildi) çerçevesinde yürütülmüştür.

Referanslar

Alves, CS, Melo, MN, Franquelim, HG, Ferre, R., Planas, M., Feliu, L., Bardaj'237, E., Kowalczyk, W., Andreu, D., Santos, NC, Fernandes, MX & Castanho, MARB (2010). J. Biol. Kimya 285 , 27536�. Web of Science CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Baba, T., Ara, T., Hasegawa, M., Takai, Y., Okumura, Y., Baba, M., Datsenko, KA, Tomita, M., Wanner, BL & Mori, H. ( 2006). Mol. Sist. Biol. 2 , 1󈝷. Web of Science CrossRef Google Scholar
Banzhaf, W., Nordin, P., Keller, R.E. & Francone, F.D. (1998). Genetik Programlamaya Giriş , Cilt. 1. San Francisco: Elsevier. Google Akademik
Bennett, B.D., Kimball, E.H., Gao, M., Osterhout, R., Van Dien, S.J. & Rabinowitz, J.D. (2009). Nat. Kimya Biol. 5 , 593�. Web of Science CrossRef PubMed CAS Google Scholar
Beveridge, T.J. (1999). J. Bakteriyol. 181 , 4725�. Web of Science CrossRef PubMed CAS Google Scholar
Breed, R.S. & Dotterrer, W.D. (1916). J. Bakteriyol. 1 , 321�. CrossRef PubMed CAS Google'ın Bilgin
Burge, R.E., Fowler, A.G. & Reaveley, D.A. (1977). J. Mol. Biol. 117 , 927#8211953. CrossRef CAS PubMed Web of Science Google'ın Bilgin
Clifton, L.A., Skoda, M.W.A., Daultton, E.L., Hughes, A., Le Brun, A.P., Lakey, J.H. & Holt, S.A. (2013). J.R. Soc. Arayüz. 10 , 20130810. Web of Science CrossRef PubMed Google Scholar
Cubitt, R., Schweins, R. & Lindner, P. (2011). çekirdek Enstrüman. Yöntemler Fiz. Araş. A , 665 , 7󈝶. Web of Science CrossRef Google Scholar
De Siervo, A.J. (1969). J. Bakteriyol. 100 , 1342�. CrossRef CAS PubMed Web of Science Google'sScholar
Doi, M. & Edwards, S.F. (1988). Polimer Dinamiği Teorisi , Uluslararası Fizik Monografları Dizisi, Cilt. 73. Oxford University Press. Google Akademik
Gan, L., Chen, S. & Jensen, G. J. (2008). Proc. Natl Acad. bilim Amerika Birleşik Devletleri , 105 , 18953�. Web of Science CrossRef PubMed CAS Google Scholar
Gundlach, A.R. von, Garamus, V.M., Gorniak, T., Davies, H.A., Reischl, M., Mikut, R., Hilpert, K. & Rosenhahn, A. (2016). Biyokimya. Biyofiz. Acta , 1858 , 918�. Web of Science PubMed Google Scholar
Gundlach, A.R. von, Garamus, V.M., Willey, T.M., Ilavsky, J., Hilpert, K. & Rosenhahn, A. (2016). J. Uygulama kristal. 49 , 2210�. Web of Science CrossRef IUCr Dergileri Google Scholar
Guo, AC, Jewison, T., Wilson, M., Liu, Y., Knox, C., Djoumbou, Y., Lo, P., Mandal, R., Krishnamurthy, R. & Wishart, DS ( 2012). Nükleik Asitler Araş. 41 , D625–D630. Web of Science CrossRef PubMed Google Scholar
Heinrichs, D.E., Yethon, J.A. & Whitfield, C. (1998). Mol. Mikrobiyol. 30 , 221�. Web of Science CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Hobot, J.A., Carlemalm, E., Villiger, W. & Kellenberger, E. (1984). J. Bakteriyol. 160 , 143�. CrossRef CAS PubMed Web of Science Google'ın Bilgin
Huxley, H., Faruqi, A., Bordas, J., Koch, M. & Milch, J. (1980). Doğa , 284 , 140�. CrossRef CAS PubMed Web of Science Google'sScholar
Keerl, M., Pedersen, J.S. & Richtering, W. (2009). J. Am. Kimya Soc. 131 , 3093�. Web of Science CrossRef PubMed CAS Google Scholar
Kim, S., Patel, D.S., Park, S., Slusky, J., Klauda, ​​J.B., Widmalm, G. & Im, W. (2016). Biyofiz. J. 111 , 1750�. Web of Science CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Klein, R. & D'Aguanno, B. (1996). Işık Saçılımı: İlkeler ve Gelişim , W. Brown tarafından düzenlendi, ch. 2. Oxford: Clarendon Press. Google Akademik
Komeda, Y., Kutsukake, K. & Iino, T. (1980). Genetik , 94 , 277�. CAS PubMed Web of Science Google'ın Bilgin
Ku'269erka, N., Holland, B., Pan, J., Heberle, F.A., Gray, C.G., Tomberli, B. & Katsaras, J. (2012). Biyofiz. J. 102 , 504a�a. Google Akademik
Kučerka, N., van Oosten, B., Pan, J., Heberle, F.A., Harroun, T.A. & Katsaras, J. (2015). J. Fizik Kimya B , 119 , 1947�. Web of Science PubMed Google Scholar
Kučerka, N., Papp-Szabo, E., Nieh, M.-P., Harroun, TA, Schooling, SR, Pencer, J., Nicholson, EA, Beveridge, TJ & Katsaras, J. ( 2008). J. Fizik Kimya B , 112 , 8057�. Web of Science PubMed Google Scholar
Labischinski, H., Goodell, E.W., Goodell, A. & Hochberg, M.L. (1991). J. Bakteriyol. 173 , 751�. CrossRef PubMed CAS Web of Science Google'ın Bilgin
Lebedev, D., Paleskava, A., Shvetcov, A., Polyakova, M., Isaev-Ivanov, V. & Konevega, A. L. (2015). Deneysel Rapor LS 2406. ESRF – The European Synchrotron, Grenoble, Fransa. Google Akademik
Leber, R., Pachler, M., Kabelka, I., Svoboda, I., Enkoller, D., Vácha, R., Lohner, K. & Pabst, G. (2018). Biyofiz. J. 114 , 1945�. Web of Science CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Liberton, M., Page, L.E., O'Dell, W.B., O'Neill, H., Mamontov, E., Urban, V.S. & Pakrasi, H.B. (2013). J. Biol. Kimya 288 , 3632�. Web of Science CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Lieb, M., Weigle, J.J. & Kellenberger, E. (1955). J. Bakteriyol. 69 , 468�. CrossRef PubMed CAS Google'ın Bilgin
Lohner, K., Sevcsik, E. & Pabst, G. (2008). Düzlemsel Lipid Çift Katmanları ve Lipozomlardaki Gelişmeler , Cilt. 6, s. 103�. Amsterdam: Elsevier. Google Akademik
Maclean, F.I. & Munson, R.J. (1961). J. Gen. Microbiol. 25 , 17󈞇. CrossRef PubMed CAS Web of Science Google'ın Bilgin
Matias, V.R.F., Al-Amoudi, A., Dubochet, J. & Beveridge, T.J. (2003). J. Bakteriyol. 185 , 6112�. Web of Science CrossRef PubMed CAS Google Scholar
Micciulla, S., Gerelli, Y. & Schneck, E. (2019). Biyofiz. J. 116 , 1259�. Web of Science CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Milne, J. L. S. & Subramaniam, S. (2009). Nat. Rev. Mikrobiyol. 7 , 666�. Web of Science CrossRef PubMed CAS Google'ın Bilgin
M'252ller-Loennies, S., Lindner, B. 'Brade, H. (2003). J. Biol. Kimya 278 , 34090�. Web of Science PubMed Google Scholar
Nagy, G., Ünnep, R., Zsiros, O., Tokutsu, R., Takizawa, K., Porcar, L., Moyet, L., Petroutsos, D., Garab, G., Finazzi, G & Minagawa, J. (2014). Proc. Natl Acad. bilim Amerika Birleşik Devletleri , 111 , 5042�. Web of Science CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Narayanan, T., Sztucki, M., Van Vaerenbergh, P., L'233onardon, J., Gorini, J., Claustre, L., Sever, F., Morse, J. & Boesecke, P. ( 2018). J. Uygulama Kristal. 51 , 1511�. Web of Science CrossRef CAS IUCr Dergileri Google Scholar
Neidhardt, F.C., Ingraham, J.L. & Schaechter, M. (1990). Bakteri Hücresinin Fizyolojisi: Moleküler Bir Yaklaşım . Sunderland: Sinauer Ortakları. Google Akademik
Nickels, J.D., Chatterjee, S., Stanley, C.B., Qian, S., Cheng, X., Myles, D.A.A., Standaert, R.F., Elkins, J.G. & Katsaras, J. (2017). PLoS Biol. 15 , e2002214. Web of Science CrossRef PubMed Google Scholar
Oursel, D., Loutelier-Bourhis, C., Orange, N., Chevalier, S., Norris, V. & Lange, C.M. (2007). Hızlı Komün. Kütle Spektromu. 21 , 1721�. Web of Science CrossRef PubMed CAS Google'ın Bilgin
Pandit, K. R. & Klauda, ​​J. B. (2012). Biyokimya. Biyofiz. Acta , 1818 , 1205�. Web of Science CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Pedersen, J.S. (1997). reklam Kolloid Arayüz Sci. 70 , 171�. CrossRef CAS Web of Science Google Scholar
Pedersen, J.S. (2000). J. Uygulama Kristal. 33 , 637�. Web of Science CrossRef CAS IUCr Dergileri Google Scholar
Pedersen, J.S. & Gerstenberg, M.C. (1996). Makro moleküller , 29 , 1363�. CrossRef CAS Web of Science Google Scholar
Pink, D., Moeller, J., Quinn, B., Jericho, M. & Beveridge, T. (2000). J. Bakteriyol. 182 , 5925�. Web of Science CrossRef PubMed CAS Google'ın Bilgin
Porod, G. (1982). Küçük Açılı X-ışını Saçılımı , Düzenleyen O. Glatter & O. Kratky, ch. 2. Londra: Akademik Basın. Google Akademik
Prasad Maharjan, R. & Ferenci, T. (2003). Anal. Biyokimya. 313 , 145�. CrossRef PubMed CAS Google'ın Bilgin
Rodriguez-Loureiro, I., Latza, V.M., Fragneto, G. & Schneck, E. (2018). Biyofiz. J. 114 , 1624�. Web of Science CAS PubMed Google Scholar
Schwarz-Linek, J., Arlt, J., Jepson, A., Dawson, A., Vissers, T., Miroli, D., Pilizota, T., Martinez, V.A. & Poon, W.C.K. (2016). Kolloidler Sörf. B Biyoarayüzler , 137 , 2󈝼. Web of Science CAS PubMed Google Scholar
Seltmann, G. & Holst, O. (2002). Bakteriyel Hücre Duvarı , 1. baskı. Berlin, Heidelberg: Springer-Verlag. Google Akademik
Semeraro, E.F., Devos, J.M. & Narayanan, T. (2018). J. Chem. Fizik 148 , 204905. Web of Science CrossRef PubMed Google Scholar
Semeraro, E.F., Devos, J.M., Porcar, L., Forsyth, V.T. & Narayanan, T. (2017). IUCrJ , 4 , 751�. Web of Science CrossRef CAS PubMed IUCr Journals Google'ın 160Scholar
Semeraro, E.F., Marx, L., Frewein, M.P.K. & Pabst, G. (2020). yumuşak madde , 17 , 222�. Web of Science CrossRef Google Scholar
Silhavy, T.J., Berman, M.L. & Enquist, L.W. (1984). Gen Füzyonları ile Deneyler. Cold Spring Harbor Laboratuvarı. Google Akademik
Silhavy, T.J., Kahne, D. & Walker, S. (2010). Soğuk Bahar Harb. Perspektif. Biol. 2 , a000414. Web of Science CrossRef PubMed Google Scholar
Sonnenborn, U. (2016). FEMS Mikrobiyol. Lett. 363 , Fnw212. Google Akademik
Stukalov, O., Korenevsky, A., Beveridge, T.J. & Dutcher, J.R. (2008). Uygulama Çevre. Mikrobiyol. 74 , 5457�. Web of Science CrossRef PubMed CAS Google Scholar
Turner, L., Stern, A.S. & Berg, H.C. (2012). J. Bakteriyol. 194 , 2437#82112442. Web of Science CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Tweeddale, H., Notley-McRobb, L. & Ferenci, T. (1998). J. Bakteriyol. 180 , 5109�. Web of Science CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Whitfield, C. & 38 Roberts, I. S. (1999). Mol. Mikrobiyol. 31 , 1307�. Web of Science CrossRef PubMed CAS Google Scholar
Yamashita, I., Hasegawa, K., Suzuki, H., Vonderviszt, F., Mimori-Kiyosue, Y. Namba, K. (1998). Nat. Yapı. Biol. 5 , 125�. CrossRef CAS PubMed Google'ın Bilgin
Zemb, T. & Lindner, P. (2002). Nötronlar, X-ışınları ve Işık: Yumuşak Yoğun Maddeye Uygulanan Saçılma Yöntemleri. Kuzey Hollanda Delta Serisi. Amsterdam: Elsevier. Google Akademik
Zimmerman, S.B. & Trach, S.O. (1991). J. Mol. Biol. 222 , 599�. CrossRef PubMed CAS Web of Science Google'ın Bilgin

Bu, orijinal yazarların ve kaynağın belirtilmesi koşuluyla herhangi bir ortamda sınırsız kullanım, dağıtım ve çoğaltmaya izin veren Creative Commons Atıf (CC-BY) Lisansı koşulları altında dağıtılan açık erişimli bir makaledir.


Tanıtım

Protein fosforilasyonu, hücre sinyalleme olaylarında önemli bir rol oynar ve düzensizliğinin patolojik sonuçları olabilir. 1,2 Protein fosforilasyon bölgelerinin global analizine ve fosfosit işgalini kontrol eden enzimlere çok fazla çaba harcanmıştır. 3 En iyi çalışılmış fosforillenmiş amino asit kalıntıları serin, treonin ve tirozin iken, diğer amino asitlerin fosforilasyonu gözlemlenmiştir ve bazı durumlarda onlarca yıldır bilinmektedir. 4𢄦 Özellikle, fosfohistidin (pHis) ilk olarak 50 yıldan uzun bir süre önce sığır karaciğeri mitokondrilerinde 7 keşfedildi ve o zamandan beri diğer ökaryotik ve prokaryotik sistemlerde tespit edildi. Prokaryotlarda pHis, iki-/çok bileşenli sinyal sistemlerinde ve fosfoenolpiruvat fosfotransferaz sistemi (PTS) yoluyla şeker alımını kolaylaştırmada önemli roller oynar. 8,9 Ökaryotlarda pHis, kromatin, merkezi karbon metabolizması ve iyon kanalı aktivitesi bağlamında dinamik bir düzenleyici modifikasyon veya doğrudan enzimatik bir katılımcı olarak gözlenmiştir. 4 Bununla birlikte, fosfoserin (pSer), fosfotreonin (pThr) ve fosfotirozinin (pTyr) aksine, pHis modifikasyonu hakkında hala nispeten az şey bilinmektedir. pHis çalışmasındaki ilerleme, büyük ölçüde pHis fosforamidat kısmının kararsız doğasına bağlı olarak mevcut araştırma araçlarının 4 eksikliği nedeniyle önemli ölçüde engellenmiştir. Fosforamidatın pHis'te hidrolizi, pSer, pThr veya pTyr'nin (Δ) fosfoesterinin kabaca iki katı enerji açığa çıkarır.G° hidroliz � ila � kcal/mol vs 𢄦.5 ila 𢄩.5 kcal/mol). Buna göre, asidik koşullar altında pHis, 1 M HCl'de 㰰 s'lik bir yarılanma ömrü ile fosforik asit ve histidine hızla hidrolize olur. Bu nedenle, pHis'in kolay fosforilasyonu, pHis biyolojisi çalışmalarını son derece zorlaştırmıştır. 4

Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için laboratuvarımız yakın zamanda pH'ları tanıyabilen antikorlar geliştirmiştir. Başlangıçta, stabil analog, fosforiltriazolil alanin (pTza) ile sentetik bir histon H4 peptidi kullanarak fosforile edilmiş histon H4'e karşı diziye özgü bir tavşan poliklonal antikoru geliştirdik. 10 Daha yakın zamanda, hapten olarak küçük molekül, fosforiltriazolil etilamin (pTze) kullanarak diziden bağımsız (pan) bir pHis antikoru ürettik. 11 Bu pan-pHis antikorunu, kütle spektrometrik (MS) analizleri ile birlikte kullanarak, histidin fosforilasyonunu karakterize ettik. Escherichia koli PEP sentaz (PpsA) ve hücre durumunun bir fonksiyonu olarak bu modifikasyonun seviyelerindeki değişiklikler. 11 Bu çalışma sırasında, pHis peptit iyonlarının, çarpışma kaynaklı ayrışma (CID) tarafından parçalanma üzerine tutarlı bir şekilde bir dizi farklı nötr kayıp sergilediğini fark ettik.Spesifik olarak, diğerlerinin önceki gözlemleriyle tutarlı olarak, CID tarafından 98 Da'lık belirgin bir nötr kayıp gözlemledik, 12�, 80 ve 116 Da yardımcı kayıplarla. Aslında bu nötr kayıplar genellikle MS/MS spektrumlarındaki iyon akımına hükmederek, peptit omurga parçalanmasının etkinliğinin azalmasına ve veritabanı arama motorları tarafından aşağı akış tanımlamasına yol açtı.

CID tarafından fosforik asidin (𹒘 Da) nötr kaybı, uzun zamandır pSer ve pThr taşıyan peptitlerin ayırt edici özelliği olarak kabul edilmiştir. 16 Fosforik asit kaybı, pSer veya pThr kalıntı bölgesinde, β-eliminasyon veya fosfopeptid üzerindeki fosforilasyon bölgesini belirlemek için kullanılan yüke yönelik bir mekanizma ile meydana gelir. 17,18 pHis peptitleri için, CID kaynaklı 80 Da nötr kaybı şaşırtıcı değildir, çünkü bu HPO kaybını oluşturur3 pHis tortusundaki kararsız P#x02013N bağının parçalanması üzerine. Bununla birlikte, pHis peptitleri için en belirgin CID kaynaklı nötr kayıp olarak 𹒘 Da'nın gözlemlenmesi kafa karıştırıcıdır. HPO'yu kaybetmenin yanı sıra,3 (𹒀 Da) kararsız P–N bağında parçalanma yoluyla, ek bir su kısmı (𹐘 Da) bir şekilde histidin kalıntısından başka bir yerde peptitten bir şekilde kaybolur.

Bu muammayı çözmek için burada, CID koşulları altında izotopik etiketleme ve peptit parçalanmasını kullanarak pHis peptitinin Da nötr kaybının gaz fazı reaksiyon mekanizmasını araştırdık. Ayrıca, proteomik numunelerden pHis peptitlerini saptama ve karakterize etme yeteneğimizi geliştirmek için CID tarafından gözlemlediğimiz pHis peptit nötr kayıplarının modelinden (98 Da'lık baskın kayıp ve beraberindeki 80 ve 116 Da'lık kayıplar) yararlandık. Bu amaçla, pHis peptidlerinin karakteristik CID nötr kayıp üçlü modelini (𹒘, 𹒀 ve � Da) gösteren MS/MS spektrumlarını tanımlamak için TRIPLET adını verdiğimiz bir yazılım aracı geliştirdik. Ayrıca, bu yazılım aracını iki şekilde birleştiren MS tabanlı bir iş akışı tasarladık: (1) CID MS/MS spektrumlarının pHis peptitlerine veri tabanı arama atamasına yardımcı olmak ve (2) sonraki yeniden analiz için potansiyel pHis peptitlerini işaretlemek için. Alternatif parçalama teknikleri kullanan LC–MS. Son olarak, bu iş akışını, küresel bir MS tabanlı pHis proteomik analizini elde etmek için bir pan-pHis antikoru kullanarak immüno-çökeltme yoluyla pH'lerin ilk bildirilen peptit düzeyinde zenginleştirilmesi ile birlikte kullandık. E. koli hücreler.


Sonuçlar

Model İnşaat.

Burada, metalloproteinlere verilen ROS hasarının hesaplanabilir çok ölçekli açıklamamızın yeniden yapılandırılmasını tarif ediyoruz. Burada çoklu ölçek, daha önce açıklandığı gibi protein ekspresyonu (yavaş) ve metabolizma (hızlı) süreçlerinde yer alan reaksiyonları modellediğimiz anlamına gelir (9). Bu oranlar 15 büyüklük derecesini kapsayabilir, bu nedenle kararlı durum çözümlerini hesaplamak için özel (dört hassasiyetli) çözücüler kullanıyoruz (10). Yayınlanmış bir rekonstrüksiyonu ile başlıyoruz. E. kolientegre metabolik ve makromoleküler ifade (ME) ağları (11). Bu ME modeli, 1.678 gen, 7.031 metabolit ve 12.655 reaksiyondan sorumludur. Model, transkripsiyon, translasyon, kompleks oluşum ve prostetik grup engraftmanı (12 ⇓ –14) için ayrıntılı yol rekonstrüksiyonunu içerir. Model ayrıca, mononükleer demir veya demir-kükürt kümelerini içeren 43 kompleks dahil olmak üzere protein kompleksi-metal stokiyometrilerini de haritalar. Aşağıda açıklandığı gibi OxidizeME modelini (Şekil 1) vererek, bu metalloproteinler için ROS tabanlı hasar ve hücresel onarım süreçlerini yeniden yapılandırıyoruz.

OxidizeME: ROS'un makromoleküllere verdiği zararı açıklayan çok ölçekli bir metabolizma ve makromoleküler ekspresyon tanımı. (A) Mononükleer Fe(II) proteinleri ROS tarafından demetalize edilir ve alternatif iki değerlikli metal iyonları ile yanlış metalleştirilir. (B) Demir-kükürt kümeleri oksitlenir ve onarılır. (C) Birleşik olmayan Fe(II) H ile kendiliğinden reaksiyona girer2Fenton kimyası yoluyla O2, DNA'ya zarar veren hidroksil radikalleri üretirken, Dps proteini dahil edilmemiş demiri depolar ve DNA'yı hasardan korur. (NS) Protein yapısal özellikleri, ROS tarafından metal kofaktör hasarı olasılığını tahmin etmek için hesaplanır (RSA: bağıl çözücü erişilebilirliği). (E) Süreçler A–D OxidizeME adlı çok ölçekli bir oksidatif modele entegre edilmiştir. OxidizeME, makromoleküler hasarın kapsamını ve değişen hücre içi süperoksit, hidrojen peroksit ve iki değerlikli metal iyonları (Fe(II), Mn(II), Co(II), Zn(II)) konsantrasyonları için hücresel yanıtı hesaplamak için kullanılır, bkz. SI Ek detaylar için.

İlk olarak, süperoksit ve H 2 O 2 tarafından demir-kükürt (Fe–S) kümelerinin hasarını nicel olarak tanımlamak için matematiksel ifadeler tanımlıyoruz. Fe–S küme hasarı için net tepkiler (4) [ 4Fe - 4S ] 2 + + O 2 ⋅ − + 2 H + → [ 3Fe - 4S ] 1 + + Fe 2 + + H 2 O 2 , [ 4Fe - 4S ] 2 + + H 2 O 2 + 2 H + → [ 3Fe - 4S ] 1 + + Fe 3 + + 2 H 2 O . ROS konsantrasyonunun [ ROS ] ≪ KM olduğunu varsayarsak, Fe–S küme hasarı v dmg hızı [ ROS ] , hız sabiti kcat / KM dmg ve Fe–S protein konsantrasyonu E, v dmg = kcat'e bağlıdır KM dmg [ ROS ] ⋅ E = k cat KM dmg [ ROS ] ⋅ v dil / μ , [1] burada μ hücrenin h -1 cinsinden spesifik büyüme hızıdır ve v dil proteinin seyreltme hızıdır.

İkinci olarak, Fe-S küme onarımını tanımlıyoruz. varsayıyoruz ki yggX (15) veya ytfE (16) Fe–S kümelerini elektron donörü olarak NADH kullanarak onarır ve net onarım reaksiyonunu tanımlar: [ 3Fe - 4S ] 1 + + Fe 2 + + NADH → [ 4Fe - 4S ] 2 + + NAD + . Onarım hızı v onarım, onarım proteinleri kümesinin konsantrasyonları R = < YggX, YtfE > ve bunların Fe–S kümesi onarım hız sabitleri ile sınırlıdır k onarım : v onarım ≤ ∑ j ∈ R k onarım , j ⋅ E j = ∑ j ∈ R k onarımı , j ⋅ vj dil / μ . [2] Üçüncüsü, mononükleer demir metalloproteinlerin metalden arındırılmasını ve yanlış metallenmesini tanımlıyoruz. [ROS] ≪ KM varsayarsak, ROS k ∈ O = < O 2 ⋅ −, H 2 O 2 > tarafından protein j'nin demetalasyon oranı, vjk demet = kjk demet [ROS] vj dil / μ, [3] olarak tanımlanır. burada kjk demet demetalasyon hızı sabitidir. Daha sonra, rekabet eden metaller tarafından yanlış metalasyonu tanımlamak için metalasyonun hızlı bir şekilde gerçekleştiğini ve dengeye yakın olduğunu varsayıyoruz (17). Göreceli metal konsantrasyonları ( [ Metal i ] / [ Fe ( II ) ] ) ile birlikte β j Fe'ye göre metal i ( β j i ) metal-protein stabilite sabitini kullanırız. Daha sonra j proteininin metal i ile metalize olma oranını v j metal , i = β j i [ Metal i ] β j Fe [ Fe ( II ) ] ∑ k ∈ O v j k demet + v j dil olarak tanımlarız . [4] Alternatif metaller kümesini M = < Mn ( II ), Co ( II ) , Zn ( II ) > olarak ele alıyoruz. Daha sonra, yayınlanmış verilerden (18, 19) elde edilen tahminlere dayalı olarak alternatif olarak metallenmiş enzimlerin katalitik verimliliği k eff'i ölçeklendiririz.

Son olarak, metabolik ve proteomik durumu hesaplamak için bir optimizasyon problemi formüle ediyoruz. E. koli ROS stresi altında. Orijinal ME modelinde, büyüme hızını maksimize eden metabolik ve makromoleküler ifade reaksiyonları için akış durumu (v) (10, 11) max μ , v μ S ( μ ) ⋅ v = 0'a tabi olarak problem çözülerek hesaplanır. , l ≤ v ≤ u , [5] burada S ( μ ), μ'ye bağlı katsayıları içeren stokiyometrik bir matristir ve l, u alt ve üst akı sınırlarıdır. OxidizeME'de karşılık gelen sorun şudur: max μ , v μ S ( μ ) ⋅ v = 0 , l ≤ v ≤ u , vj dmg − vj onarım − vj dil = 0 , ∀ j ∈ D , vj dmg = k cat KM j dmg [ ROS ] vj dil / μ , ∀ j ∈ D , vj dil ≥ ∑ ben ∈ R μ k onarım ivij onarım , ∀ j ∈ D , ∑ j ∈ D vij onarım ≤ ∑ ben ∈ R k onarım , i ⋅ vi dil / μ , vjk demet = kjk demet [ ROS ] vj dil / μ , vj metal , i = β ji [ Metal i ] β j Fe [ Fe ( II ) ] ∑ k ∈ O vjk demet + vj dil , ∀ ben ∈ M , ∀ j ∈ D . [6] Ölçülen proteomik (20) ile simülasyonları karşılaştırdığımızda, OxidizeME'nin E. koli kütleye göre proteom (Veri Kümesi S1). OxidizeME için kod ve belgeler https://github.com/SBRG/oxidizeme adresinde mevcuttur.

Oksidatif Stres Altında Amino Asit Oksotrofisi.

ROS hasarına ayırt edici bir yanıt E. koli bu amino asitlerin eklenmesiyle hafifletilen dallı zincirli ve aromatik amino asit biyosentez yollarının deaktivasyonudur (4). 20 amino asidin tamamının eklenmesiyle karşılaştırıldığında, OxidizeME, Ile ve Val'in hariç tutulmasının büyüme hızı üzerinde Phe, Trp ve Tyr hariç tutulmasından daha büyük bir etkiye sahip olduğunu doğru bir şekilde tahmin etti (Şekil 2A). Bu yüzden E. koli dallı zincirli amino asitlerin takviyesi olmadan ROS stresi altında büyüyemez, dihidroksi asit dehidrataz ve izopropilmalat izomerazın demir-kükürt kümelerinin ROS tarafından inaktive edilmesi, böylece dallı zincirli amino asit biyosentetik yolunu zayıflatmasıdır (21). Aromatik amino asitler için oksotrofi, başlangıçta transketolaz reaksiyonunun (22) inaktivasyonuna atfedildi, ancak son zamanlarda 3-deoksi-D-arabinheptulozonat 7-fosfat (DAHP) sentazdaki (19) mononükleer demir kofaktörünün yanlış metallenmesine kadar takip edildi. OxidizeME, bu moleküler mekanizmaları ve bunların fenotipik sonuçlarını doğru bir şekilde öngördü (Şekil 2).

ROS stresinin sistemik sonuçları. (A) Farklı amino asit (AA'lar) takviyesi ile düşük ve yüksek süperoksit konsantrasyonları altında tahmin edilen optimal büyüme oranı. "Tüm AA'lar", 20 yaygın amino asidin tümünü ifade eder ve "–Ile & Val", Ile ve Val dışındaki tüm amino asitlerin eklendiği anlamına gelir. (B) Çeşitli sülfürlü amino asit takviye ortamlarında süperoksit konsantrasyonuna karşı tahmini optimal büyüme oranı. (C) İle aynı B ancak ROS tarafından CysI'ye zarar vermeden simüle edilmiştir. (NS) Glikolata karşı D-galaktoza karşı büyüme için simüle edilmiş hasar akışları. AROL: şikimat kinaz II. (E) MG1655'in 0 ila 0,6 μM PQ ile minimum glikolat ortamında, 50 μM shikimate takviyesi olsun veya olmasın büyüme oranı. (F) İle aynı E ancak D-galaktoz minimal ortamında büyüme için. *, büyüme oranının iki PQ konsantrasyonu (2-kuyruklu Welch's) arasında önemli ölçüde değiştiğini gösterir. T testi, P < 0.01).

Bu arada, kükürtlü amino asit oksotrofisinin temeli E. koli çoklu araştırmalara rağmen sonuçsuz kalmaktadır (23, 24). OxidizeME, ROS stresi altında kükürtlü amino asitler (sistein ve metionin) için oksotrofiyi doğru bir şekilde tahmin etti (Şekil 2A). Cys biyosentezinin sülfit redüktaz adımını katalize eden CysI'deki demir-kükürt kümesinin zarar görmesi için makul bir mekanizma izledik. Sülfit redüktaz dört kofaktörü bağlar: demir-kükürt, FAD, FMN ve siroheme. Önceki çalışmalarla (25) tutarlı olarak, yapısal modelimiz, esas olarak kofaktör bağlama kalıntısının derinliğinden (Veri Kümesi S2) dolayı, ROS tarafından ulaşılması zor olan sülfit redüktazın siroheme grubuna tahmin etmiştir. Önceki çalışmalar, çözücüye maruz kalmadığı için demir-kükürt kümesinin moleküler oksijen ile otooksidize edilmediğini göstermiştir (25). Bununla birlikte, yapısal modelimiz, hem çözücüye maruz kalma hem de çözücüyle erişilebilen yüzeyden (Veri Kümesi S2) küme bağlama kalıntısının derinliği göz önüne alındığında, demir-kükürt kümesine ROS tarafından ulaşıldığını öngörmüştür. Simülasyonlar, sülfit redüktaz hasarının hafifletilmesinin, gözlenen büyüme hızı kusurunu tersine çevirmek ve Cys ve Met yokluğunda daha yüksek ROS konsantrasyonlarında büyümeyi sağlamak için yeterli olduğunu doğruladı (Şekil 2 B ve C). Sülfit redüktazın ROS tarafından devre dışı bırakıldığı hipotezimiz, Salmonella enterika bu enzimin aktivitesinin gerçekten yüksek süperoksit tarafından azaldığını gösterir (26). Ayrıca, sülfit redüktazın deaktivasyonu, substratı sülfitin birikmesiyle tutarlıdır ve daha önce gözlenen sülfit birikimini açıklar (24). CysI inaktivasyonunun, süperoksitin ek olarak hücre zarı hasarına yol açarak küçük moleküllerin sızmasını kolaylaştırma olasılığını dışlamadığını not ediyoruz (27). Bu nedenle, OxidizeME, ROS'a karşı belirli makromoleküler güvenlik açıklarına sistemik bir yanıt olarak amino asit oksotrofilerinin temelini anlamak ve tahmin etmek için kullanılabilir.

ROS Toleransının Çevre Bağımlılığının Hesaplanması ve Açıklanması.

Çevresel bağlamın ROS toleransını nasıl etkilediğini araştırmak için 180 karbon kaynağında süperoksit stresi altında büyümeyi simüle ettik (SI Ek, Şekil S2). Daha sonra ROS tarafından en çok zarar gören kompleksler açısından karbon kaynağı çiftlerini karşılaştırdık. Özellikle, simülasyonlardan, ROS stresi altında D-galaktoz üzerinde büyümeye yönelik kilit bir darboğazın shikimate kinaz II, AroL'nin inaktivasyonu olduğunu tahmin ettik (Şekil 2NS). Buna karşılık, AroL'nin glikolat üzerinde büyümeye doğrudan bir darboğaz olmayacağı tahmin edildi (Şekil 2NS). Bu tahmini doğrulamak için büyümeyi ölçtük. E. koli MG1655, bu iki karbon kaynağında 0 ila 0,6 μM paraquat (PQ) içinde. PQ, fırsatçı bir şekilde, tipik olarak poliamin transmembran taşıyıcılar tarafından alınan ve daha sonra aşağıdakilerden herhangi biri tarafından katalize edilen indirgeme ve otoksidasyon döngülerine giren iki değerli bir katyondur. E. koli Süperoksit üretmek için PQ diaforazları (28). AroL'nin bir darboğaz olup olmadığını doğrudan test etmek için kültürlere 50 μM shikimate de ekledik. Tahmin edildiği gibi, shikimate, glikolat üzerinde büyüme sırasında PQ kaynaklı büyüme kusurlarını hafifletmedi (Şekil 2E). Bu arada, shikimate, D-galaktoz üzerinde büyüme sırasında PQ tarafından büyüme kusurlarını hafifletti (Şekil 2F). Bu sonuçlar, OxidizeME'nin farklı çevresel bağlamlarda ROS kaynaklı amino asit oksotrofilerini doğru bir şekilde tahmin edebildiğini doğrulamaktadır. Bu öngörü yeteneği, moleküler ve makromoleküler mekanizmaları hesaplama yeteneğinden kaynaklanmaktadır.

Daha sonra glikolat ve galaktoz üzerindeki büyümenin neden farklı ROS toleransları sergilediğini açıklamak için OxidizeME'yi kullandık. İlk olarak, ROS stresi, metalloprotein hasarından kaynaklanan düşük metabolik ve protein ekspresyon verimliliklerine karşı koymak için redoks dengeleme ve enerji üretim gereksinimlerini küresel olarak artırır. Böylece, aradaki fark E. koliFarklı karbon kaynakları altında bu metabolik kapasiteleri yenileme kapasitesi, ROS duyarlılığındaki farklılıkları açıklayabilir.

D-galaktoz üzerinde büyüme sırasında, birincil NADPH kaynağı, ROS stresi olan ve olmayan oksidatif pentoz fosfat yolu (Gnd ve Zwf) idi. Karbon kaynağı olarak D-galaktoz ile ROS stresi altında, simülasyonlar, PPP (pentoz fosfat yolu) tarafından NADPH üretimini desteklemek için artan metilentetrahidrofolat dehidrojenaz (FolD) aktivitesini gösterdi, ancak PPP hala NADPH'nin ana kaynağıydı. Bu arada, NADH üretimi büyük ölçüde ROS'lu glisin bölünme sistemine dayanırken, gliseraldehit-3-fosfat dehidrojenaz, ROS'suz NADH'nin birincil kaynağıydı. NADPH ve NADH'yi yenilemek için FolD ve glisin bölünme sistemi akışlarındaki artış, ROS stresi altında yeni bir metabolik darboğaz yaratan tetrahidrofolat ve türevlerine olan ihtiyacı artırdı. Buna karşılık, karbon kaynağı olarak glikolat ile, optimal NADPH üretiminin TCA döngüsünden (ROS yok) malik enzime (ROS'lu) geçeceği tahmin edildi. Bu nedenle, karbon kaynakları olarak galaktoz ve glikolat için ROS tolerans kapasiteleri arasındaki fark, galaktoz üzerinde büyüme sırasında katı NADPH üretimi ile glikolat üzerinde büyüme sırasında esnek NADPH üretimi ile açıklanabilir.

OxidizeME, Global İfade Değişikliklerinden Strese Özgü Diferansiyel Gen İfadesini Tanımlar.

Daha sonra, sistemik yanıtı değerlendirdik. E. koli ROS stresine. Transkriptomu ölçtük E. koli PQ tedavisi kullanılarak süperoksit stresi altında ve 501'i OxidizeME'de hesaba katılan 914 farklı şekilde eksprese edilmiş gen (DEG'ler) tanımladı (Şekil 3 ve SI Ek, Şekil S3). Özellikle, 87 gen yukarı regüle edildi. OxidizeME kullanarak, bu 87 genin, diğer proteinlere göre demir metaloproteinlere özgü hasar nedeniyle daha büyük olasılıkla aktive olduğunu belirledik (P < 0.001). Ayrıca, doğru bir şekilde tahmin edilen DEG'lerin büyük bir kısmı (%84), PQ tedavisinden kaynaklanan büyüme hızının azalması nedeniyle değişti, aktive genlerin %95'i strese spesifik tepkilerdi (Şekil 3). Gen ekspresyonunun ROS stresine doğrudan - örneğin ROS detoksifikasyon genlerini yukarı regüle ederek - ve dolaylı olarak - ROS hasarının neden olduğu azalmış metabolik hızlara yanıt olarak yanıt vermesi beklenir. Büyüme hızına değil, ROS'a özgü olarak tanımladığımız yanıtlar sekiz hücresel süreci kapsıyordu (Şekil 3): ROS detoksifikasyonu, merkezi metabolizma, anaerobik solunum, amino asit biyosentezi, kofaktör sentezi ve onarımı, translasyon, demir homeostazı ve transkripsiyonel tarafından düzenleme rpoS sigma faktörü.

Sonuçların ve ROS stresine verilen yanıtların doğrulanması. (A ve B) DEG'ler (|log2(kat değişimi)|> 0.9, FDR [yanlış keşif oranı] < 0.01) etkinleştirildi (A) ve bastırılmış (B). Doğru tahmin edilen DEG'ler, OxidizeME kullanılarak küresel büyümeyle ilişkili düzenlemeden ayırt edilir. (C) ROS tarafından demir metalloprotein hasarına sistemik bir yanıtta yer alan hücresel süreçler.

ROS ile evrimleşmiş hücreler Fe-S küme biyosentezini deregüle eder.

E. koli Fe-S kümelerini sentezlemek için iki alternatif sisteme sahiptir: ISC (demir-kükürt kümesi) ve SUF (kükürt asimilasyonu). Her sistem, diğerinin yokluğunda Fe-S kümelerini sentezleyebilir (29). Normal büyüme koşullarında ISC baskın iken, SUF aktive olur ve oksidatif veya demir sınırlama stresi altında birincil sistem haline gelebilir (4, 30). Bu SUF'ye geçişin bir nedeni, ROS'un IscU ve SufA iskele proteinleri üzerindeki kararsız demir-kükürt kümelerinin yanlış metalasyonunu artırarak ISC tabanlı Fe-S düzeneğinin verimliliğini düşürmesidir (31). Prensip olarak, ISC'den SUF'ye geçiş, ROS stresi altında Fe-S montajını sürdürmek için tek mekanizma değildir. Örneğin, Tüberküloz sadece ISC operonuna sahiptir, ancak bu patojen, muhtemelen ISC operonunu yukarı regüle ederek, makrofajların içi de dahil olmak üzere oksidatif stres altında büyüyebilir (32). Olası bir açıklama şudur M. tüberkülozISC iskele proteinleri, ROS'a karşı daha az duyarlıdır. E. koli veya tamir edilir. Yine de, E. koli ayrıca birkaç varsayılan Fe-S küme onarım genine sahiptir. ygfZ (33), yggX (15) ve ytfE (16). Genel olarak, ROS stresi altında ISC ve SUF arasındaki maliyet-fayda dengesine ilişkin anlayışımızda boşluklar bulunmaktadır. Burada, OxidizeME ve deneysel doğrulama kullanarak bu sorunu araştırıyoruz.

İlk olarak, vahşi tipte DEG'leri tespit ettik E. koli MG1655, minimum glikoz ortamında RNA-Seq kullanılarak 0.25 mM PQ'ya yanıt olarak. baskılandığını tespit ettik iscRSUA (ortalama l o g 2 (kat değişimi) = − 1.53 , FDR-ayarlı P < 0.001). Daha sonra bu deneyi bir E. koli glikoz üzerinde hızla büyümek üzere evrimleşmiş olan suşu (BOP1000 olarak adlandırılır) (34). MG1655'te olduğu gibi, baskılanmış BOP1000 suşu iscRSUA (ortalama l o g 2 (kat değişimi) = − 1.32 , FDR-ayarlı P < 0.053 ) (Veri kümesi S3).

Son olarak, laboratuvarda geliştirilmiş bir suşu elde ettik. E. koli (PQ3 olarak adlandırılır), 0,8 mM PQ (SI Ek, SI Materyalleri ve Yöntemleri). PQ3 için başlangıç ​​suşu, glikozla gelişen BOP1000'dir. PQ3'ü 0.2 ve 0.6 mM PQ'da kültürledik ve RNA-Seq kullanarak DEG'leri belirledik. 0,6 mM PQ altında, PQ3 suşu aşağı regüle etti sufABCDSE transkripsiyon birimi (ortalama l o g 2 (kat değişimi) = − 2.01, FDR-adjusted P < 0.034 ) (Veri Kümesi S3). Ayrıca, 0.2 mM PQ altında, PQ3 suşu, önceden geliştirilmiş BOP1000 suşu ile karşılaştırıldığında daha yüksek ISC ekspresyonunu sürdürdü. Spesifik olarak, transkripsiyon birimlerinin daha yüksek ifadesini gözlemledik iscRSUA (ortalama l o g 2 (kat değişimi) = 3.47 , FDR-ayarlı P < 0.001) ve hscBA-fdx-iscX (ortalama l o g 2 (kat değişimi) = 1.99, FDR-ayarlı P < 0.001) (Veri kümesi S3).

PQ ile evrimleşmiş suşun, glikozla gelişmiş ve vahşi tip suşlarınkinden zıt transkriptomik tepkisi, ROS adaptasyonu için genetik ve sistem düzeyinde mekanizmaları araştırmamızı sağladı.

Optimal Fe-S Kümesi Biyosentezinin Genetik ve Sistem Düzeyinde Mekanizmaları.

ISC ve SUF'nin PQ ile gelişen yanıtının genetik temeli, bir mutasyondu. iscR. IscR, Cys92, Cys98 ve Cys104 kalıntılarında 2Fe-2S koordinasyonuna dayalı olarak hem ISC hem de SUF'nin transkripsiyonunu düzenler (29, 35). Evrilen suş, C104S mutasyonuna sahipti. iscR. Bu mutasyon, IscR'nin 2Fe–2S'yi dahil etme ve ROS stresi altında ISC ve SUF sistemlerinin ekspresyonunu düzenleme yeteneğini engelleyebilir (35).

Daha sonra, ISC'yi artırmanın ve SUF'yi bastırmanın, sürekli ROS stresi altında zindeliği neden iyileştirdiğini araştırdık. Açıkça, IscU'daki Fe-S inaktivasyon oranı ile SUF kullanmanın uygunluk avantajı arasında bir ödünleşme bekliyoruz. Gerçekten de simülasyonlar, IscU'da ( ∼ 0.78 s -1 ) Fe-S inaktivasyonu eşik hızının altında, Fe-S montajı sırasında kükürt transferinin SufSE'den ziyade neredeyse sadece IscS tarafından gerçekleştiğini göstermektedir (SI Ek, Şekil S4). İlginç bir şekilde, IscU ifadesinin eşiğe kadar Fe-S inaktivasyon oranıyla orantılı olarak artacağı tahmin edilmektedir, bu da IscU'da düşük Fe-S montaj verimliliğine ilk telafi edici tepkiyi gösterir. Ancak eşiğin üzerinde, IscU ve IscS ifadesi keskin bir şekilde düşerken SufSE ve SufBCD ifadesi artar. ISC'nin SUF'ye göre uygunluk avantajının bir nedeni, her sistem için protein ekspresyonunun maliyetidir. Sadece kükürt transferi ve iskele kompleksleri göz önüne alındığında, IscS ve IscU, 118 kDa çevrilmiş protein gerektirirken SufSE ve S u f B C 2 D, 227 kDa gerektirir - ISC'den %93 daha fazla.

Bu nedenle, artan ISC ekspresyonu, PQ3 suşunun IscU'da düşük Fe-S inaktivasyonu yaşayabileceğini düşündürmektedir. Bu olasılığı araştırmak için şunu hatırlayın: E. koli dahil olmak üzere Fe-S kümelerinin onarım veya oksidasyon direnci ile ilişkili birkaç gene sahiptir. ygfZ (33), yggX (15) ve ytfE (16). RNA-Seq (Dataset S3), bu genlerin hiçbirinin PQ'ya yanıt olarak PQ3 suşu tarafından farklı şekilde eksprese edilmediğini gösterdi. PQ tedavisi altında BOP1000 suşu ile karşılaştırıldığında ekspresyon seviyesinde de bir fark yoktu. Bununla birlikte, DNA-Seq, bir mutasyon (T108P) ortaya çıkardı. ygfZ, Fe-S küme sentezine veya onarımına katkıda bulunduğu düşünülen bir gen (33). Alternatif olarak, ygfZ başka bir redoks döngüsü bileşiği olan plumbagini bozduğu gösterildiğinden, PQ'yu doğrudan bozabilir (36). Her iki uyarlanabilir işlev de genel olarak Fe-S kümelerine verilen hasarın azalmasıyla tutarlı olacaktır, ancak Fe-S kümelerini IscU'da korumanın, ISC ifadesinin (ve SUF'nin baskılanmasının) gözlemlenen artışını yeniden oluşturmak için yeterli olup olmadığı açık değildir.

Bu nedenle, IscU'daki Fe–S kümelerinin hasar oranını sıfıra ayarladığımız ve diğer tüm demir ve Fe-S kümesi içeren kompleksler için hasar süreçlerini koruduğumuz simülasyonlar gerçekleştirdik. Daha sonra büyümesini simüle ettik E. koli bazal (0.2 nM) ve yüksek (2 nM) hücre içi süperoksit konsantrasyonları altında ve siliko DEG'lerde tanımlanmıştır. Simüle edilmiş DEG'ler, PQ3'ün RNA-Seq ile tutarlıydı: hscBA-fdx-iscX ve iscRSUA operonlar yukarı regüle edildi ve sufABCDSE bastırıldı (Veri Kümesi S4). Bu sonuç, IscU'daki Fe-S kümelerini korumanın, ROS stresi altında ISC'yi SUF'den daha uygun hale getirmek için yeterli olduğunu gösterir. PQ'nun geliştirdiği tür, potansiyel olarak bu korumaya şu yollarla ulaşır: ygfZ ve sırayla mutasyonla daha avantajlı ISC'ye geçer. iscR.


Biyofilm karakterizasyonu için Raman mikrospektroskopisi, yüzeyi geliştirilmiş Raman saçılma mikrospektroskopisi ve kararlı izotop Raman mikrospektroskopisi

Biyofilmler, gezegenimizdeki baskın mikrobiyal yaşam biçimini temsil eder. Hücre dışı polimerik maddeler tarafından oluşturulan bir matris içine gömülü olan bu mikroorganizma kümeleri, neredeyse tüm arayüzleri kolonize edebilir. Biyofilmler içinde yer alan mikroorganizmaların yanı sıra karmaşık biyofilm matrisinin kimyasal bileşimi, yapısı ve işlevleri ve biyofilm oluşumunun farklı aşamalarında ve çeşitli fiziksel ve kimyasal koşullar altındaki değişimleri hakkında ayrıntılı bilgi, farklı alanlarla ilgilidir. Önemli araştırma konuları arasında antibiyotiklerin ve tıbbi cihazların geliştirilmesi ve iyileştirilmesi ile biyositlerin optimizasyonu, zehirli boya stratejileri ve biyolojik atık su arıtımı yer almaktadır. Raman mikrospektroskopisi, optik mikroskobun uzaysal çözünürlüğü ile ve sudan etkilenmeden biyofilm bileşenleri hakkında ayrıntılı iki boyutlu ve üç boyutlu kimyasal bilgi sağlayabilen yetenekli ve tahribatsız bir araçtır. Ancak Raman mikrospektroskopisinin duyarlılığı oldukça sınırlıdır, bu da özellikle düşük biyokütle konsantrasyonlarında Raman mikrospektroskopisinin uygulanabilirliğini engeller. Neyse ki, rezonans Raman etkisi ve ayrıca yüzeyle güçlendirilmiş Raman saçılması bu dezavantajın üstesinden gelmeye yardımcı olabilir. Ayrıca, Raman mikrospektroskopisinin diğer mikroskobik teknikler, kütle spektrometrisi teknikleri veya özellikle kararlı izotop teknikleri ile kombinasyonu, tek türlü ve çok türlü biyofilmler hakkında kapsamlı bilgi sağlayabilir. Burada, biyofilmlerin yerinde tespiti, görselleştirilmesi, tanımlanması ve kimyasal karakterizasyonu için rezonans Raman mikrospektroskopisi ve yüzeyi güçlendirilmiş Raman saçılma mikrospektroskopisi dahil olmak üzere farklı Raman mikrospektroskopik tekniklerine genel bir bakış ve bu tekniklerin biyofilmdeki ana fizibiliteleri ve sınırlamaları verilmektedir. araştırmalar sunulmuştur. Karmaşık biyofilm matrislerinin karakterizasyonu için tek başına ve diğer analitik tekniklerle kombinasyon halinde Raman mikrospektroskopisinin gelecekteki olasılıkları ve zorlukları eleştirel bir incelemede tartışılmaktadır.

Biyofilm analizi için Raman mikrospektroskopisinin uygulanabilirliği

Bu, abonelik içeriğinin bir önizlemesidir, kurumunuz aracılığıyla erişilir.


D₂O'da (ağır su) E. coli büyümesinin optimizasyonu - Biyoloji

Makaleleri Mendeley'e dışa aktar

Mendeley kitaplığınızdaki referanslara dayalı olarak ACS'den makale önerileri alın.

Makaleleri Mendeley'e dışa aktar

Mendeley kitaplığınızdaki referanslara dayalı olarak ACS'den makale önerileri alın.

ACS ve Mendeley ile araştırma sürecinizi güçlendirdiniz!

AŞAMA 1:
ADIM 2:

Lütfen unutmayın: Farklı bir cihaza geçerseniz, yalnızca ACS ID'nizle tekrar oturum açmanız istenebilir.

Lütfen dikkat: Farklı bir cihaza geçerseniz, yalnızca ACS ID'niz ile tekrar giriş yapmanız istenebilir.

Lütfen unutmayın: Farklı bir cihaza geçerseniz, yalnızca ACS ID'nizle tekrar oturum açmanız istenebilir.

Mendeley hesabınıza bağlanmadan önce lütfen ACS ID'nizle oturum açın.

Henüz herhangi bir makaleyi ziyaret etmediniz, lütfen buradaki içerikleri görmek için bazı makaleleri ziyaret edin.
İÇERİK TÜRLERİ
KONULAR

Kapak Hakkında:

Kapak, G-protein bağlı reseptörler (GPCR'ler) kullanılarak mayada kimyasal biyosensörlerin hızlı montajı için yeni bir yaklaşımı tasvir ediyor. Kullanıma hazır aktüatörlerin (transkripsiyon faktörleri) ve duyu birimlerinin (GPCR'ler) eşleştirilmesi, çok çeşitli kimyasallar için biyosensörlerin montajına olanak tanır. Temsil edilen, bir biyoyakıt öncüsü olan dekanoik asit sensörüdür. Jorge Luis Peralta-Yahya'nın DOI:10.1021/sb500365m'ye dayanan resmi.

Bu konuda:
Bu konuda
Bu konuda
Yazarlarımızı Tanıtıyoruz
Yazarlarımızı Tanıtıyoruz
Edebiyat
Orta Zincirli Yağ Asitleri için GPCR Tabanlı Kimyasal Biyosensörler
  • Kuntal Mukherjee'nin fotoğrafı.
  • Souryadeep Bhattacharyya ve
  • Pamela Peralta-Yahya*

Mikropları kimyasal üretim için tasarlamanın temel sınırlamalarından biri, kimyasal algılama için düşük verimli kromatografi tabanlı ekranlara güvenmektir. Kolorimetrik kimyasallar yüksek verimli elemelere uygun olsa da, birçok katma değerli kimyasal kolorimetrik değildir ve yüksek verimli tarama için sensörler gerektirir. Burada, mayada kimyasal sensörleri hızla oluşturmak için memeli hücrelerinde orta zincirli yağ asitlerini bağladığı bilinen G-proteinine bağlı reseptörler (GPCR'ler) kullanıyoruz. Orta zincirli yağ asitleri, gelişmiş biyoyakıt yağ asidi metil esterlerinin hemen öncüleridir ve bunlar D2 dizel için bir "düşürme" ikamesi olarak hizmet edebilir. Sensörlerden biri, aktivasyondan sonra sinyalde 250 μM'ye kadar lineer aralıklarda 13 ila 17 kat artışla çift zincirli C8–C12 yağ asitlerini algılar. Sentetik bir yanıt biriminin tanıtılması, hem dinamik hem de doğrusal aralığı değiştirerek, dekanoik aside sensör yanıtını, 500 μM'ye kadar doğrusal bir aralıkla, aktivasyondan sonra sinyalde 30 katlık bir artışa kadar iyileştirir. Bildiğimiz kadarıyla, bu, yağ asidi üreten mikropların evrimsel mühendisliğine uygulanabileceğini öngördüğümüz tam hücreli orta zincirli bir yağ asidi biyosensörünün ilk raporudur. GPCR'lerin çok çeşitli kimyasallar için afinitesi göz önüne alındığında, GPCR algılama ünitesini değiştirerek yeni biyosensörleri hızla birleştirmek mümkün olmalıdır. Bu sensörler, farklı yanıt birimlerini tanıtarak, farklı dinamik ve doğrusal aralıklar gerektiren çeşitli uygulamalara uygun olmalıdır.

Metabolik Mühendisliği sinekosist sp. Bitki Diterpenoid Manoil Oksit Üretimi için PCC 6803
  • Elias Englund,
  • Johan Andersen-Ranberg,
  • Rui Miao,
  • Björn Hamberger ve
  • Pia Lindberg*

Forskolin, doğal olarak Coleus forskohlii bitkisinin kök kabuğunda bulunan geniş bir farmasötik uygulama yelpazesine sahip yüksek değerli bir diterpenoiddir. Karmaşık moleküler yapısı nedeniyle forskolin'in kimyasal sentezi ticari olarak çekici değildir. Bu nedenle, C. forskohlii bitkilerinden emek ve kaynak yoğun ekstraksiyon ve saflaştırma, bileşiğin mevcut kaynağı olmaya devam etmektedir. Tek hücreli siyanobakteri Synechocystis sp'yi tasarladık. PCC 6803, forskolin öncüsü 13R-manoil oksiti (13R-MO) üreterek bu yüksek değerli bileşiğin ışıkla çalışan biyoteknolojik üretiminin yolunu açıyor. Bu çalışma sırasında, Synechocystis'te kullanılmak üzere yeni bir dizi bütünleştirici vektör geliştirildi ve C. forskohlii'de 13R-MO oluşumundan sorumlu enzimler olan kromozomal olarak entegre CfTPS2 ve CfTPS3'ü ifade eden kararlı çizgiler oluşturmak için kullanıldı. Tasarlanmış suşlar, 0.24 mg g–1 DCW 13R-MO'ya kadar üretim titreleri verdi. Verimi artırmak için, 13R-MO üreten suşlar, C. forskohlii'den seçilen enzimlerin eklenmesiyle daha da geliştirildi ve titreyi 0.45 mg g–1 DCW'ye yükseltti. Bu çalışma, siyanobakterilerde karmaşık bitki diterpenoidlerinin üretiminin daha da geliştirilmesi için bir temel oluşturur.

Bir BL21(DE3) Biyogüvenlik Suşu için Ligand-Bağımlı Temel Genlere sahip Sentetik Oksotroflar

Sentetik oksotroflar, canlılık için belirli bir molekülün varlığını gerektirecek şekilde tasarlanmış organizmalardır. Biyolojik koruma ve enzim mühendisliğinde potansiyel uygulamaları vardır. Bu organizmaların, ligand bağımlılığının temel genlere dönüştürülmesiyle üretilebileceğini gösteriyoruz. Test durumları olarak 5 temel gen kullanarak bir Ligand-Bağımlı Temel gene (SLiDE) dayalı bir Sentetik oksotrof oluşturmak için bir yöntem gösteriyoruz: pheS, dnaN, tyrS, metG ve adk. Tek bir SLiDE suşunun, ligand benzotiyazol ile kimyasal olarak tamamlandığında canlılıkta 1 x 108 kat artışa sahip olabileceğini gösterdik. Optimize edilmiş SLiDE gerinim mühendisliği protokolü, 1 haftadan az ve 100 USD gerektiriyordu. Endüstriyel Escherichia coli suşu BL21(DE3) içinde birden fazla SLiDE suşu alelini birleştirdik ve 3 × 10–11 saptama sınırının altında bir kaçış frekansıyla biyogüvenlik kriterlerini aşan bir organizma sağladık.

Nesne
Mühendislik Sentetik cis-Bakterilerde Üç Transkripsiyonel Faktörün Eş Zamanlı Tanınması için Düzenleyici Unsurlar
  • Gerardo Ruiz Amores,
  • María-Eugenia Guazzaroni ve
  • Rafael Silva-Rocha*

Hedef promotörlerde transkripsiyon faktörleri (TF) tarafından cis düzenleyici elementlerin tanınması, bakterilerde gen düzenlenmesi için çok önemlidir. Bu süreçte, TF'lerin aynı kökenli dizilerine bağlanması, bu proteinler ve operatör bölgesindeki spesifik nükleotitler arasındaki bir dizi fiziksel etkileşime bağlıdır. Daha önce, in silico optimizasyon algoritmalarının, Escherichia coli'nin iki farklı TF'si, yani CRP ve IHF tarafından tanınan kısa diziler üretebildiğini ve böylece bir AND mantık geçidi oluşturduğunu göstermiştik. Burada, birbiriyle alakasız üç TF (CRP, IHF ve Fis) tarafından aynı anda tanınabilen DNA dizilerini tasarlamak için bu yaklaşımı genişlettik. Silico optimizasyonu ve deneysel doğrulama stratejilerini kullanarak, AND mantığıyla yalnızca iki TF tarafından düzenlenen bir aday promotör (Plac-CFI1) elde edebildik, böylece tasarımda bir sınırlama ortaya çıktı. Daha sonra, genişletilmiş dizilerin optimizasyonuna izin vermek için algoritmayı değiştirdik ve in vivo olarak işlevsel olan iki sentetik promotör (PCFI20-1 ve PCFI22-5) tasarlayabildik. Her TF için E. coli mutant suşlarında ekspresyon deneyleri, CRP'nin promotör aktivitelerini pozitif olarak düzenlerken, IHF ve Fis'in her iki promotör varyantının güçlü baskılayıcıları olduğunu ortaya çıkardı. Birlikte ele alındığında, sonuçlarımız bakteriyel sentetik promotör mühendisliğinde in silico stratejilerinin potansiyelini göstermektedir. Ayrıca, çalışma aynı zamanda cis-düzenleyici unsurlardaki küçük değişikliklerin, ortaya çıkan promotörün nihai mantığını büyük ölçüde nasıl etkileyebileceğini de göstermektedir.

Modifiye Monoterpen İndol Alkaloidinin Mikrobiyal Sentezi için Pterin-Bağımlı Mono-oksidasyon

Monoterpen indol alkaloidleri (MIA'lar), antikanser ve antimalaryal ajanlar dahil olmak üzere önemli terapötik değere sahiptir. Kimyasal karmaşıklıkları nedeniyle, terapötik MIA'lar veya bunların gelişmiş ara ürünleri genellikle doğal bitkilerden izole edilir. MIA'ların mikrobiyal sentezi, terapötik kullanım için karmaşık MIA'ların ve MIA analoglarının hızlı ve ölçeklenebilir üretimine izin verecektir. Burada, glikozdan ve monoterpen secologanin'den modifiye edilmiş MIA hidroksistriktosidin'i pterine bağlı bir mono-oksidasyon stratejisi yoluyla üretiyoruz. Spesifik olarak, Saccharomyces cerevisiae mayasını, triptofanı 5-hidroksitriptofana mono-oksidize etmek için tetrahidrobiopterinin yüksek düzeyde sentezi için tasarladık; bu, serotonine dekarboksilasyondan sonra, sekiz enzim yolunda 10-hidroksistriktosidin üretmek için eksojen olarak beslenen sekologanin ile birleştirilir. . Sentetik hedefimiz olarak hidroksistriktosidin seçtik çünkü alkaloid çekirdek striktosidinin 10' pozisyonundaki hidroksilasyon, terapötiklerin gelecekteki kimyasal yarı sentezi için kimyasal bir tutuş sağlar. Tirozini, benzilizokinolin alkaloid (BIA) biyosentezinde önemli bir ara madde olan L-DOPA'ya hidroksile ederek ve daha sonra onu dopamine dönüştürerek alkaloid sentezi için pterine bağımlı mono-oksidasyon stratejisinin genelliğini gösteriyoruz. Birlikte, bu sonuçlar modifiye bir alkaloidin ilk mikrobiyal sentezini, mayada ilk tetrahidrobiopterin üretimini ve L-DOPA sentezi için pterine bağlı bir mono-oksidasyon stratejisinin ilk kullanımını sunar. Bu çalışma, MIA'ların ölçeklenebilir üretiminin yanı sıra, bilinen ve yeni terapötiklerin yarı sentezinde geç ara ürünler olarak hizmet edecek modifiye MIA'ların üretiminin kapısını açar. Ayrıca, bu çalışmadaki mikrobiyal suşlar, bilinen MIA biyosentetik yollarını aydınlatmak veya yeni MIA'lara yol açan yolları belirlemek için bitki yolu keşif araçları olarak kullanılabilir.

Sentetik Malonil-CoA Sensörünün Geliştirilmesi Saccharomyces cerevisiae Hücre İçi Metabolit İzleme ve Genetik Tarama için

Anahtar metabolit seviyelerini floresan sinyallerine dönüştürebilen genetik sensörler, canlı hücrelerdeki hücre içi bileşik konsantrasyonlarının izlenmesini sağlar ve yüksek verimli genetik taramada etkili bir araç olarak ortaya çıkar. Ancak mayalardaki genetik sensörlerin gelişimi, bakterilerdeki gelişimlerinin çok gerisinde kalmaktadır. Burada, hücre içi malonil-CoA seviyelerini ölçmek için uyarlanmış bir bakteriyel transkripsiyon faktörü FapR ve buna karşılık gelen operatör fapO kullanılarak Saccharomyces cerevisiae'de bir malonil-CoA sensörünün tasarımını rapor ediyoruz. Bu sensörü genom çapında bir aşırı ifade kitaplığı ile birleştirerek, hücre içi malonil-CoA konsantrasyonunu iyileştiren iki yeni gen hedefi belirledik. Ayrıca, malonil-CoA'dan değerli bir bileşik olan 3-hidroksipropiyonik asit üretmek için elde edilen rekombinant maya türünü kullandık ve titresini %120 oranında arttırdık. Böyle bir genetik sensör, genom çapında tarama için güçlü bir yaklaşım sağlar ve mayada malonil-CoA'dan türetilen çok çeşitli kimyasalların sentezini daha da geliştirebilir.

Viral Nanopartikül Üzerinde Polimeraz Zincir Reaksiyonu
  • James Carr-Smith,
  • Raul Pacheco-Gómez,
  • Haydn A. Küçük,
  • Matthew R.Hicks,
  • Sandeep Sandhu,
  • Nadja Steinke,
  • David J.Smith,
  • Alison Rodger,
  • Sarah A. Goodchild,
  • Roman A. Lukaszewski ,
  • James. H.R. Tucker* , ve
  • Timothy R.Dafforn*

Sentetik biyoloji alanı, biyomoleküllerden yeni materyaller ve cihazlar geliştirmeyi amaçlayan çalışmaları içerir. Son yıllarda, α-sarmal sarmallar, β-yapraklı amiloidler ve hatta viral partiküller dahil olmak üzere bir dizi biyomoleküler şasi kullanılarak pek çok çalışma yapılmıştır. Bu çalışmada, bir polimeraz zincir reaksiyonunu (PCR) şablonlayabilen DNA primerleri ile konjugasyon yoluyla viral bir M13 bakteriyofaj iskelesinden hibrit biyonanopartiküllerin nasıl üretilebileceğini gösteriyoruz. Bir virüs partikülü üzerindeki bu benzeri görülmemiş PCR örneği, DNA tespiti için yeni bir prototip metodolojisinin yanı sıra ürünün yapısı hakkında bilgi veren akış hizalı doğrusal dikroizm spektroskopisi ile incelenmiştir.Bir biyonanopartikülün yüzeyindeki bu PCR gösteriminin, sentetik biyoloji kullanılarak hibrit düzeneklerin oluşturulabileceği yollara faydalı bir ilave olduğunu öneriyoruz.

Gen İfadesinin Transkripsiyon Sonrası Kontrolü için Ayarlanabilir Riboregülatör Anahtarları
  • Malathy Krishnamurthy,
  • Scott P. Hennelly,
  • Taraka Vadisi,
  • Shawn R. Starkenburg,
  • Ricardo Martí-Arbona,
  • David T.Fox ,
  • Scott N.Twary,
  • Karissa Y. Sanbonmatsu* , ve
  • Clifford J. Unkefer*

Yakın zamana kadar, gen ekspresyonunu değiştirmek için mühendislik stratejileri, güçlü indüklenebilir promotörler veya savurgan genleri yıkmak için çeşitli yöntemlerden biri kullanılarak transkripsiyon kontrolüne odaklandı. Son zamanlarda, gen ekspresyonunun translasyonel regülasyonu için sentetik riboregülatörler geliştirilmiştir. Burada, protein ekspresyonunu hassas bir şekilde ayarlama ve tasarlanmış bir metabolik yolda her enzimin konsantrasyonunu bağımsız olarak kontrol etme potansiyeline sahip yeni bir modüler sentetik riboregülatör sınıfını rapor ediyoruz. Bu gelişme önemlidir, çünkü belirli bir metabolik adım boyunca akışı değiştirmeye yönelik en basit yaklaşım, enzim konsantrasyonunu arttırmak veya azaltmaktır. Tasarımımız, mRNA'nın 5' ucunda bir kök-ilmek sarmalı oluşturan, ribozomal bağlanma dizisini tıkayan ve translasyonu bloke eden bir cis-bastırıcı içerir. Trans-eksprese edilmiş bir aktive edici RNA, translasyonu açan ribozomal bağlama dizisini serbest bırakır. Riboregülatörlerin genel mimarisi, Watson-Crick temel eşleştirme kararlılığı kullanılarak tasarlanmıştır. Burada, antibiyotiğe dirençli raportörlerin çevirisini tamamen kapatabilen bir cis baskılayıcıyı ve çeviriyi geri yükleyen bir transaktivatörü tanımlıyoruz. Geniş bir dinamik aralıkta gen ekspresyonunun translasyonel kontrolünü sağlamak için bu riboregülatörleri kullanmanın mümkün olduğunu belirledik. Ayrıca, prensipte birçok genin translasyonunu bağımsız olarak düzenleyebilen riboregülatörleri geliştirmek için bir hedefleme dizisinin değiştirilebileceğini bulduk. Bir seçim deneyinde, transaktivatörün sırasını ustaca değiştirerek, bastırılmış ve aktive edilmiş durumların oranını değiştirmenin ve ara translasyon kontrolünü elde etmenin mümkün olduğunu gösterdik.

Lizin Üretiminin Metabolik Kontrolü için bir Lizin-ON Riboswitch Mühendisliği Corynebacterium glutamicum

Riboswitchler, bir ligandı bağlayarak gen ekspresyonunu düzenleyen doğal RNA elementleridir. Burada, doğal bir lizin-OFF riboswitch'i Eschericia coli'den (ECRS) sentetik bir lizin-ON riboswitch'e değiştirme ve bunu metabolik kontrol için kullanma olasılığını gösteriyoruz. Bu amaçla, tetA tabanlı ikili genetik seçim kullanılarak bir lizin-ON riboswitch kitaplığı oluşturulmuştur. Kitaplığın taranmasından sonra, seçilen lizin-ON ribosanahtarlarının işlevselliği, bir rapor geni olan lacZ kullanılarak incelendi. Seçilmiş lizin-ON ribosanahtarları, Corynebacterium glutamicum'un lysE genine (bir lizin taşıma proteinini kodlayan) dahil edildi ve rekombinant lizin üreten bir suş olan C. glutamicum LPECRS'de lizin taşınmasının dinamik kontrolünü sağlamak için kullanıldı. sitrat sentaz enziminin dinamik kontrolü için lizin-OFF riboswitch. Suşların toplu fermantasyon sonuçları, lysE'nin kontrolü için ek bir lizin-ON riboswitch'li C. glutamicum LPECRS suşunun, C. glutamicum LPECRS suşuna kıyasla lizin veriminde %21'lik bir artışa ve hatta 89'luk bir lizin verimine ulaştığını gösterdi. Düzensiz aspartokinazlı suşunkine kıyasla verimde % artış. Bu çalışma, C. glutamicum metabolik mühendisliği için lizin-ON ribosanahtarları üretmek için yararlı bir yaklaşım sağlar ve bu endüstriyel açıdan önemli mikroorganizmada lizin üretimini geliştirmek için lizin-ON ve -OFF ribosanahtarlarının sinerjik bir etkisini ilk kez gösterir. Yaklaşım, diğer genleri dinamik olarak kontrol etmek için kullanılabilir ve diğer mikroorganizmalara uygulanabilir.

Kalibre Edilmiş Heterolog Gen İfadesi için Tn7 Tabanlı Cihaz Pseudomonas putida
  • Sebastian Zobel'in fotoğrafı.
  • Ilaria Benedetti,
  • Lara Eisenbach,
  • Victor de Lorenzo* ,
  • Nick Wierckx ve
  • Lars M. Boş

Toprak bakterisi Pseudomonas putida, sentetik biyoloji yaklaşımları yoluyla ileri metabolik mühendislik için bir platform olarak giderek artan bir şekilde ilgi çekiyor. Bununla birlikte, genomik bağlam, gen kopya sayısı ve transkripsiyon/çeviri etkileşimi genellikle güvenilir genetik yapıların tasarımına önemli ölçüde belirsizlik getirir. Bu çalışmada, akışın kalan parametrelerinin sabit varsayılan değerlere sahip olduğu tek değişkenin promotör kuvveti olduğu standartlaştırılmış bir heterolog ifade cihazı kurduk. Bu amaçla, yapıları P. putida kromozomunun tek bir genomik lokusuna yerleştiren bir mini-Tn7 iletim transpozon vektörü uyarladık. Bu daha sonra bir promotör yerleştirme bölgesi, değişmeyen bir translasyon kuplörü ve ilgili gen(ler)i sabit montaj kuralları altında yerleştirmek için bir aşağı akış lokasyonu ile birleştirildi. Bu düzenleme, bu bakteriyel konakçıda düşük transkripsiyonel gürültüye sahip bir sentetik promotör koleksiyonunu karşılaştırmak için kullanıldı. Tek kopya promotör-GFP yapıları ile büyüme deneyleri ve akış sitometrisi, güçleri ve özellikleri sadık bir şekilde karşılaştırılabilen bu promotörlerin sağlam, yapıcı bir davranışını ortaya çıkardı. Bu standartlaştırılmış ifade cihazı, güvenilir metabolik mühendislik ve P. putida'nın diğer genetik geliştirmeleri için mevcut araçların repertuarını önemli ölçüde genişletir.

Kolinle İndüklenebilir ve Bastırılabilir T7 Tabanlı İndüksiyon Sistemlerinin Evrimsel Tasarımı
  • Kohei Ike,
  • Yusuke Arasawa'nın fotoğrafı.
  • Satoshi Koizumi,
  • Satoshi Mihashi,
  • Shigeko Kawai-Noma,
  • Kyoichi Saito ve
  • Daisuke Umeno*

Escherichia coli kromozomu üzerindeki bahis operonunun endojen bileşenlerinden yapılan T7-faj tabanlı transkripsiyonel anahtarların montajı ve evrimsel mühendisliği ile, güvenli ve ucuz bir bileşik olan kolin tarafından indüklenebilen genetik anahtarlar inşa edildi. BetI baskılayıcının fonksiyonel plastisitesi, bir BetI mutantları havuzundan yüksek katılık, yüksek maksimum ekspresyon seviyesi ve ters fenotipler dahil olmak üzere çeşitli özelliklere sahip fonksiyonel varyantların hızlı ve yüksek frekanslı tanımlanmasıyla ortaya çıkarılmıştır. BetI mutantlarının plazmit ekspresyonu, pT7/betO sekansı altındaki genlerin kolinle indüklenebilir (Bet-ON) veya kolinle baskılanabilir (Bet-OFF) geçişiyle sonuçlandı, bu arada indüklenmemiş koşullarda minimal sızıntılı ekspresyon korunur.

DNA Tersine Çevirmelerine Dayalı Bellek ve Kombinatoryal Mantık: Dinamikler ve Evrimsel Kararlılık
  • İsa Fernandez-Rodriguez,
  • Lei Yang,
  • Thomas E.Gorochowski,
  • D. Benjamin Gordon ve
  • Christopher A. Voigt*

Genetik bellek, her yönelimin bir "bit"e karşılık geldiği DNA inversiyonlarını katalize eden enzimler kullanılarak gerçekleştirilebilir. Burada, DNA'yı ters yönlü iki durum arasında geri dönüşümsüz olarak yeniden yönlendiren iki DNA invertazı (FimE ve HbiF) kullanıyoruz. İlk önce FimE tarafından ayarlanan ve HbiF tarafından sıfırlanan bellek oluşturuyoruz. Daha sonra, giriş promotörünün FimE'yi çalıştırdığı ve sinyalin yokluğunda ters durumun HbiF'nin kurucu ifadesi tarafından korunduğu bir NOT geçidi oluşturuyoruz. Kapının açılıp kapanması için ∼3 saat gerekir. Bu devrelerin evrimsel kararlılıkları, döngü işlevi sırasında hücrelerin geçişi ile ölçülür. Bellek anahtarı 400 saat (17 gün, 14 durum değişikliği) üzerinde kararlıdır, ancak kapı, sürekli invertaz ifadesi nedeniyle 54 saat (>2 gün) sonra kırılır. Genom dizilimi, devrenin bozulmadan kaldığını, ancak konakçı suşun invertaz ekspresyonunu azaltmak için geliştiğini ortaya koymaktadır. Bu çalışma, özellikle daha karmaşık çok kapılı devreler uygulandıkça, devre tasarımlarının evrimsel sağlamlığını ve arıza modlarını değerlendirme ihtiyacını vurgulamaktadır.


Şekil 4

Şekil 4. Toplam ve seçilen SIMS görüntüleri, TET sinyalinin bireysel olarak lokalizasyonunu gösterir. E. koli. Bakteriler Si üzerinde kültürlendi ve 20 µg/mL TET ile muamele edildi. (a, b)'deki toplam pozitif iyon görüntüleri, üst yüzeyden 800 nm derinliğe kadar ışın erozyonu geçiren bakterilerin ana hatlarını göstermektedir. Si'nin dağılımı (eşlenen m/z 167.9) ve TET (moleküler iyonu, m/z 410.1, 427.2 ve 445.2) yukarıdan 800 nm derinliğe kadar (c)–(f) arasındadır. (g) ve (h)'deki sinyal bindirme görüntüleri, TET'in (sarı) E. koli, Si (mavi) arka plan içindeki siyah bölgelerle temsil edilir.

TetA Efflux Pompasının TET Birikimine Etkisi

ilaç sinyali (m/z 410 + 427 + 445) sayı/piksel ± ağırlıklı STDEV
TET dozu (μg/mL)derinlik (nm)TetAvektör kontrolü
00–4008.8 ± 2.38.1 ± 6.0
400–8007.0 ± 2.57.9 ± 5.1
200–4009.1 ± 6.815.2 ± 6.3
400–8006.2 ± 6.67.0 ± 4.8
1800–40020.1 ± 7.626.4 ± 12.2
400–80014.8 ± 10.223.5 ± 9.8

Yazar bilgileri

Bağlantılar

Kimya ve Biyokimya Bölümü, Biyofilm Mühendisliği Merkezi ve Termal Biyoloji Enstitüsü, Montana Eyalet Üniversitesi, Bozeman, MT, ABD

Roland Hatzenpichler, Viola Krukenberg, Rachel L. Spietz ve Zackary J. Jay

Bu yazarı PubMed Google Scholar'da da arayabilirsiniz.

Bu yazarı PubMed Google Scholar'da da arayabilirsiniz.

Bu yazarı PubMed Google Scholar'da da arayabilirsiniz.

Bu yazarı PubMed Google Scholar'da da arayabilirsiniz.

Katkılar

R.H. bu İncelemenin konseptini tasarladı. Makaleyi tüm yazarlar yazdı.

Sorumlu yazar


Sponsorlu Projeler

Başlık: Biyosistemlere Uygulanan Gaz-Sıvı Direnci Olmadan Oksijenin Kütle Taşınması Üzerine Çalışmalar.

Hibe miktarı: Rs. 3.79 lakh

Dönem ve durum: 1995-1997, tamamlandı

Soyut:Gaz-sıvı kütle transferi yoluyla oksijenin kütle aktarımı, aerobik biyoreaktörler gibi endüstriyel açıdan önemli birçok sistemin optimal çalışması için sınırlayıcı bir faktördür. Bu proje, gaz-sıvı direnci içermeyen bir metodoloji aracılığıyla oksijen kütle taşınımını inceledi. Metodoloji sıvı faz içeriyordu yerinde hidrojen peroksitin oksijen ve suya parçalanması. Oksijen taşınmasına yönelik bu yeni metodoloji, biyoproseslerin spesifik üretkenliğini önemli ölçüde iyileştirdi.

Sponsor Ajans: Nükleer Bilimler Araştırma Kurulu (BRNS)

Başlık: Ağır Su Tesislerinden Amonyak Atıksularının Arıtılması.

Hibe miktarı: Rs. 10.25 lakh

Dönem ve durum: 1997-1999, tamamlandı

Yardımcı araştırmacılar: S.R.Asolekar, K.V.Venkatesh (IIT) R.R.Sonde (BARC)

Soyut:Reaktör sınıfı ağır su üretimi, kabul edilemez seviyelerde amonyak içeren büyük miktarlarda sıvı atık su ile sonuçlanır. Ağır su tesislerinde atık sudaki amonyak seviyelerini azaltmak için kullanılan süreç oldukça enerji yoğundu ve aynı zamanda sorunu tamamen çözmedi. Bu nedenle, amonyağın mikrobiyal dönüşümünü kullanan ve yukarıdaki yöntemin ortaya çıkardığı sorunların üstesinden gelen bir atık arıtma sistemi oldukça arzu edilirdi. Proje, zararsız nitrojen ve nitrata amonyak dönüşümünün mikrobiyal bir yöntemini ele aldı. Bu, farklı bakteri türlerinin kullanımını içeriyordu. nitrosomonas ve nitrobakter çeşitlilik. Bu yöntemin ek bir avantajı, üretilen nitratın çim ve ağaç büyümesi için 'gübre' olarak kullanılabilmesidir. Gerçek 'gübre' ihtiyacına dayalı olarak atık su arıtma tesisinden elde edilebilecek optimal nitrat seviyesi de ele alındı. Ek olarak, bu atık su arıtımında yer alan çeşitli biyolojik süreçler, kültürün enerji (metabolik) durumuna göre optimize edilmiştir.

Sponsor Ajans: Tüm Hindistan Teknik Eğitim Konseyi (AICTE)

Başlık: Viskoz Fermentasyonlarda Kültür Durumu Kullanılarak Biyoreaktör Verimlerinin İyileştirilmesi.

Hibe miktarı: Rs. 5 lakh

Dönem ve durum: 1997-2000, tamamlandı

Yardımcı araştırmacılar: A.K. Suresh

Soyut:Yukarıdaki DST projesinde bahsedilen yöntem optimize edilmiştir. Yöntemi optimize etmek için kültürdeki hücrelerin durumu, ürünü üreten gerçek fabrikalar hakkında bilgiye ihtiyacımız vardı. Bu tür bilgilere kültür durumu ölçümü yoluyla erişilebilir. Kültür durumu, kültürdeki NADH seviyesinin invazif olmayan bir ölçüsü olan kültür floresanı ile ölçülür.

Sponsor Ajans: Bilim ve Teknoloji Bölümü (DST)

Başlık: Kaymaya Duyarlı Aerobik Sistemlerden Enzim Verimliliklerinde İyileştirme

Hibe miktarı: Rs. 10.75 lakh

Dönem ve durum: 2000-2003, tamamlandı

Yardımcı araştırmacılar: A.K. Suresh

Soyut:Tüm kültivasyonun tanımlanmış kesme koşulları altında gerçekleştirilebildiği yeni bir couette akış biyoreaktörü (CFB) geliştirildi. Tanımlanmış kesme koşulları altında tüm kültürler için normal sınırlayıcı faktör olan oksijen beslemesi, CFB'nin iç silindirine sabitlenmiş bir teflon membrandan hava geçirilerek sağlandı. Daha da önemlisi, oksijen transfer yeteneklerinin yanı sıra kesme oranlarının analizleri, bu CFB'de, tanımlanmış kesme etkilerinin oksijen kaynağının etkilerinden etkilenmeden çalışılabileceğini göstermektedir. Spesifik hücre içi reaktif oksijen türleri (ROS) seviyesinin, CFB'de büyütüldüğünde durağan fazın başlangıcında maksimum olduğu bulundu ve hücre ölüm modunun apoptoz olduğundan şüpheleniliyor.

Sponsor Ajans: İnsan Kaynaklarını Geliştirme Bakanlığı (MHRD)

Başlık: Sıvı Faz Oksijen Temini (LPOS) Stratejisini Kullanan Rekombinant Organizmaları Kullanan Biyoreaktörlerin Performansında İyileştirme.

Hibe miktarı: Rs. 12 lakh

Dönem ve durum: 2003-2006, tamamlandı

Yardımcı araştırmacılar: S.B. Noronha, A.K. Suresh

Soyut: Hidrojen peroksitin (H) katalazik ayrışması yoluyla sıvı fazda oksijen oluşumu ile karakterize edilen sıvı faz oksijen tedarik stratejisi (LPOS).2Ö2) bakliyat, bir rekombinant sistemin kültivasyonu için kullanıldı - rekombinant Escherichia koli sıcaklıktaki bir değişiklikle streptokinaz üretmek için indüklenebilir. Toksisite çalışmaları, ilk H2Ö27.5 mM'lik konsantrasyon optimaldi. LPOS ile yetiştirmede spesifik streptokinaz verimi, havalandırma yoluyla oksijen beslemesine dayalı geleneksel yetiştirme ile elde edilen değerin 2 katıydı. İlginç bir şekilde, plazmit kaybı, geleneksel ekime kıyasla LPOS ile yaklaşık %10-15 daha düşüktü. H'nin optimal besleme profillerini elde etmek için2Ö2, bir süreç modeli geliştirildi. Model, optimal H'yi elde etmek için genetik algoritmaya dayalı sağlam bir stokastik optimizasyon çözücüsü kullanılarak optimize edildi.2Ö2besleme oranları. Model tahminli bir yaklaşım kullanılmış ve ayrıca bilinmeyen model parametreleri genetik algoritma kullanılarak tahmin edilmiştir. en uygun H2Ö2Deneysel olarak da doğrulanan ekleme profilleri, havalandırmalı kültürlerden elde edilene kıyasla 4 kat daha yüksek spesifik streptokinaz verimleri ve optimizasyon yapılmayan kültürlere kıyasla 2 kat daha yüksek spesifik verimlerle sonuçlandı.

Sponsor Ajans: Biyoteknoloji Anabilim Dalı (DBT)

Başlık: Paçuli Üretimi ve Yetiştiriciliğinde Biyoteknolojik Yaklaşımlar.

Hibe miktarı: Toplam: Rs. 85.14 lakh (çok kurumlu proje) HTE Bombay: Rs. 26.45 lakh

Dönem ve durum: 2003-2006, tamamlandı

Yardımcı araştırmacılar: Kelkar Education Trust's Bilimsel Araştırma Merkezi (Mumbai, Maharashtra), Keva Biotech. Limited (Mumbai, Maharashtra), Central Plantation Crops Research Institute (Kasargod, Kerala), Ulusal Tıbbi ve Aromatik Bitkiler Araştırma Merkezi (Boriavi, Gujarat), Tarım Bilimleri Üniversitesi (Dharwad, Karnataka), Dr. Balasaheb Sawant Konkan Krishi Vidyapeet ( Dapoli, Maharashtra)

Soyut: Bitkilerin doku kültürü ile klonal çoğaltılması daha sonra vejetatif olarak çoğaltılan bitkiler için ekim materyali elde etmenin en iyi yöntemi olarak belirlendi. Doku kültürü sistemiyle ilgili bir sorun, özel girdiler nedeniyle bitkilerin yüksek maliyetidir. Bitkilerin mikro çoğaltılması büyük ölçüde manuel bir işlemdir ve kalifiye operatörler tarafından kullanım kolaylığı ve katı sterilite koşulları ile sınırlıdır.

Biyoreaktör sistemleri, tesislerin operasyon ölçeğini ve üretim hızını artırmak için alternatif bir yöntemdir. Daha düşük maliyetlerle artan çıktı verimliliği göz önüne alındığında, bitkilerin büyük ölçekli mikro çoğaltılması biyoreaktör yöntemine değiştirilirse, bahçecilik endüstrisi doku kültürü yapılan bitkilerin ekim için kullanılmasının avantajlarını daha iyi anlayacaktır. Biyoreaktörler çok yaygın olmasına ve biyo-endüstride yaygın olarak kullanılmasına rağmen, bitki sürgün kültürü için biyoreaktörler nadirdir. Bu projenin bir parçası olarak yeni, yeniden kullanılabilir bir sürgün kültürü biyoreaktörü tasarlanmış, inşa edilmiş ve işletilmiştir.

Geliştirilen sürgün kültürü biyoreaktörü, sıvı yüzeyde bitkiciklerin büyümesini gerektirmedi. Böylece, geliştirilen biyoreaktör kullanıldığında, hiper-hidrasyon veya vitrifikasyonun ana dezavantajı tamamen ortadan kaldırılmıştır. Ayrıca, geliştirilen biyoreaktör yeniden kullanılabilirdi ve çözünmüş oksijen (ÇO), pH, sıcaklık, sürgün kütlesi ve sürecin optimizasyonu için gerekli olan diğerleri gibi birçok önemli biyoreaktör değişkeninin kolay, sürekli izlenmesine izin verdi. Ayrıca, geliştirilen biyoreaktörde, yüksek büyüme oranları, yaprak gibi bitki parçalarının arzu edilen içerikleri ve diğerleri gibi arzu edilen sonuçlara doğru atmosferi manipüle etmek mümkün oldu. Ek olarak, şu anda geliştirilen biyoreaktörde çekici ve patentlenebilir birçok özellik vardı.

Sponsor Ajans: Hint-ABD Forumu

Başlık: İçme Suyunda Reaktif Oksijen Türleri özellikleri

Hibe miktarı: 30.000 ABD Doları

Dönem ve durum: 2008-2010, tamamlandı

Ortak: Jeanne VanBriesen, Carnegie Mellon Üniversitesi

Soyut:İçme suyunun klorlanması birincil dezenfeksiyon yöntemidir. Bununla birlikte, ilgilenilen birçok organizma klorlamaya dirençlidir (örn. mikobakteri). Klor tarafından mikrobiyal inaktivasyon mekanizması iyi anlaşılmamıştır ve bu nedenle klor direnci mekanizmalarının anlaşılması da eksiktir. Klor bazlı mikrobiyal inaktivasyonun reaktif oksijen türlerinin (ROS) aracılık ettiğini varsaydık. Bu hipotezi değerlendirdik ve çalışma, klorun su üzerindeki etkisinin daha iyi anlaşılmasıyla sonuçlandı. mikobakteri, klor tarafından mikrobiyal inaktivasyon mekanizmasının daha iyi anlaşılmasının yanı sıra.

Sponsor Ajans: Biyoteknoloji Bölümü (DBT)

Başlık: Algal Biyoyakıtlar için Fotobiyoreaktör Geliştirme

Hibe miktarı: Rs. 1.3 crore

Dönem ve durum: 2009-2011, tamamlandı

Yardımcı araştırmacı: Shrikumar Suryanarayan

Soyut: Bu projenin kapsamı, bir fotobiyoreaktörün petrol (lipitler) üretmek için etkin bir şekilde büyütülmesi için bir tasarım parametresi geliştirmekti. klorella vulgaris. klorella vulgaris tuzlu koşullarda yetiştirme potansiyeline sahip diğer alglerle karşılaştırıldığında, üzerinde mevcut olan önemli arka plan bilgileri nedeniyle model alg sistemi olarak seçilmiştir.DBT tarafından deniz yönlerine konsantre olmamız istendiğinden, tuzlu su koşulları birinci derecede önemliydi. Çalışma için 15 litre kapasiteli büyük bir laboratuvar ölçekli fotobiyoreaktör tasarlanmış ve üretilmiştir. Sıcaklık, pH, tuzluluk ve ışık gibi parametrelerin klorella vulgarisçalışıldı. Ayrıca, bazı parametrelerin etkisi üzerine çalışmalar Dunaliella parva ve Chaetoceros mullieri da yapıldı. Daha sonra fotobiyoreaktör ölçek büyütme yönleri ayrıntılı olarak ele alındı.

Sponsor Ajans: Divaşri

Başlık: Alg biyoyakıtları

Hibe miktarı: Rs. 25 lakh+

Dönem ve durum: 2008-2013, tamamlandı

Soyut: Bu proje başlangıçta mikroalgler için alternatif yetiştirme sistemlerinin geliştirilmesine ve ardından mikroalglerin elektroflokülasyon gibi birçok yetiştirme yönünün iyileştirilmesine yönelik bazı çalışmalara değindi.

Sponsor Ajans: Bilim ve Teknoloji Bölümü (DST)

Başlık:Mikroalglerden Geliştirilmiş Biyo-yağ Verimleri için Reaktif Türler

Hibe miktarı: Rs. 32.83 lakh

Dönem ve durum:6 Şubat 2013 – 5 Şubat 2016, iş tamamlandı

Soyut:Alg bazlı biyo-yağ üretimindeki bir zorluk, aynı anda spesifik büyüme oranlarını ve spesifik lipit içeriğini arttırmaktır. Yukarıdakilerin her ikisinde de eşzamanlı artışlar gösterdik klorella vulgaris UVA ve UVB ışık tedavileri altında indüklenen reaktif türler aracılığıyla ve hacimsel lipid üretkenliğinde 8.8 kat artış sağladı.

Ayrıca, hidroksil radikalinin endojen, sözde kararlı durumlu, spesifik hücre içi seviyelerinin ultradian bir şekilde salındığını ilk kez bildirdik (model sistem: mikroalga, klorella vulgaris) ve ayrıca çeşitli ritim parametrelerini karakterize etti. UVA radyasyonu ile sürüklenme yoluyla endojen ritmi sıfırladık ve iki yeni ultradian ritim oluşturduk. Sıfırlama, ultradian ritimlerin başlamasıyla birlikte maksimum lipid birikimi penceresini 6 saatten 12 saate çıkardı.

Ek olarak, yeni bir uygulama bildirdik: Uygun fosfor sistemleri kullanılarak düşük enerjili radyasyonları daha yüksek enerjili radyasyonlara dönüştürme işlemi olan foton yukarı-dönüşüm, mikroalg büyümesini ve lipid üretkenliğini iyileştirmek için yeni bir strateji olarak kullanıldı.

Sponsor Ajans: Bilim ve Teknoloji Bölümü (DST)

Başlık: Gelişmiş Kanser Tedavisi için Ritimlerin Sürüklenmesi

Hibe miktarı: Rs. 38.3 lakh

Dönem ve durum:25 Ocak 2017 – Ocak 2020, devam ediyor


Soyut

Organik çözücüde protein çökeltme, MS analizinden önce sodyum dodesil sülfatı (SDS) tüketmek için etkili bir stratejidir. Burada kloroform/metanol/su veya aseton (%80) ile çökeltme yoluyla membran ve suda çözünür proteinlerin geri kazanımını değerlendiriyoruz. Her bir solvent sistemi ile, membran proteini geri kazanımı, genellikle sitozolik proteinlerinkinden daha yüksek olan %90'dan fazla olmuştur. Birkaç istisna dışında, MS tarafından tespit edilen tortusal süpernatan proteinler, pelet fraksiyonunda daha yüksek MS sinyal yoğunluğuna sahip olan çökeltme peletinde de tespit edildi. Çökeltmenin ardından, MS uyumlu bir çözücü sisteminde proteinlerin kantitatif yeniden çözündürülmesi için yeni bir strateji sunuyoruz. Pelet, -20 °C'de %80 formik asit/su içinde inkübe edilir ve daha sonra su ile 10 kat seyreltilir. Membran proteini geri kazanımı, peletin %1 SDS'deki sonikasyonuyla eşleşir. Yeniden çözündürülmüş proteinler, oda sıcaklığında formik asit içinde süspanse edilen proteinlerin tipik özelliği olan gözlenen herhangi bir formilasyon olmaksızın, oda sıcaklığında stabildir. Protokol, bir GELFrEE-fraksiyonlu numuneden membran proteinlerinin moleküler ağırlık tayinine uygulanır. Escherichia koli proteinler.


Videoyu izle: Awas Peredaran Telor Mengandung Bakteri E Coli Di Pasaran (Haziran 2022).