Bilgi

PCR mutagenezi, ilgilenilen gene yakın kısıtlama bölgesini nasıl ekler?

PCR mutagenezi, ilgilenilen gene yakın kısıtlama bölgesini nasıl ekler?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Tek sarmallı kısıtlama bölgesi (ilk görüntü) ile iliştirilmiş bir primer kullanarak ilgili genin hemen yanına kısıtlama bölgesi eklemek için PCR mutajenezini öğreniyorum. Bunun nasıl çalıştığını daha iyi anlamak için kendi diyagramımı çizdim (ikinci resim), ancak soru işaretinde son adımda takıldım. DNA Polimeraz yeşil diziyi (kısıtlama bölgesini) nasıl 'ekliyor', böylece altta gösterilen genle sonuçlanıyorum?

Beklenen yanıt için teşekkürler.

[![buraya resim açıklamasını girin][3]][3]


Bunun yerine kısıtlama bölgelerindeki ve yeşil GGAGAA bölgesindeki gerçek nükleotidleri ilgi geninizle (GOI) birlikte kullansaydınız, bu diyagramı kavramsallaştırmanız daha kolay olurdu. Çeşitli uygulamalar için primer tasarımını öğrenirken DNA dizileriyle çalışmanızı tavsiye ederim. Kısıtlama sitesinin ne olduğu ve bu şemada neyin bulunmadığı konusunda kafanızın biraz karışmasına neden olduğuna inanıyorum, bu yüzden üzerinden geçeceğim.

Gösterilen ilk adımda, GOI'ye bağlanan ileri ve geri primerlerin tavlama bölgenize sahipsiniz. Her primer üzerindeki sarkan bölge, kısıtlama enzimi sindirimi gerçekleştirdiğinizde bu kısıtlama enzimlerinin "tutacak" bir diziye sahip olması için GGAGAA bölgesi ile çevrili olan kısıtlama bölgelerinizi içerir. Primerinizin tavlama bölgesinin, DNA dizisiyle homolojiye sahip olduğu için GOI'ye tavlandığını unutmayın. Kısıtlama siteleriniz ve yeşil "kenetleme" bölgeniz, DNA şablonunuzla homolojiye sahip değildir, bu nedenle sarkan bölgeler olarak kabul edilirler. Bunu tasarlarken her iki primerin de benzer tavlama sıcaklıklarına sahip tavlama bölgelerine sahip olmanız önemlidir, aksi takdirde verimli bir PCR reaksiyonunuz olmayabilir. Primerlerimin tavlama bölgelerini tasarlamak için genellikle NEB'den bu aracı kullanıyorum. https://tmcalculator.neb.com/#!/main

İleriye dönük olarak, bu primerlerin her ikisi de ayrı değil, tek bir PCR reaksiyonunda kullanılacaktır. Böylece, reaksiyon başladığında, çift sarmallı DNA şablonu denatüre olacak ve ileri ve geri primerlerinize bir PCR reaksiyonunun tavlama aşaması sırasında tavlama fırsatı verecektir. Uzama aşaması sırasında, DNA Polimerazınız primerlerinizin 3' yönünde tamamlayıcı nükleotidler ekleyecektir. Şimdi ilk döngüden sonra iki farklı ürününüz var. İleri astarın ürünü, 5' ucunda tek şeritli bir BamHI çıkıntısı olan GOI'ye sahipken, ters astarın ürünü, 5' ucunda tek şeritli bir NotI çıkıntısı olan GOI'ye sahiptir.

İkinci döngü sırasında, denatürasyondan sonra, bir NotI çıkıntısı olan ters primer, bir BamHI çıkıntısı ile ileri primerin önceki ürününe tavlanır. DNA polimeraz daha sonra primerin 3' yönünde nükleotidler ekler ve sonunda BamHI çıkıntısına tamamlayıcı bazlar ekler. Aynısı, ileri astar ve ters astarın önceki ürünü ile tersi yapılır.

Şimdi ikinci döngüden sonra, katlanarak büyütülecek istediğiniz ürünlere sahipsiniz. GOI'niz, her iki tarafta GGAGAA bölgesi olan NotI ve BamHI kısıtlama siteleri ile çevrilidir. Bu ürün bir kısıtlama enzimi sindirimi için hazırdır.


Elle çizilmiş figürünüzü beğendim. Ondan başlayarak resimli bir açıklama yapacağım. Primer bağlamada ve PCR adımının ilk aşamasında haklısınız. Ancak PCR1 ve PCR2 ve nihai ürün yanlıştır.

Bunu düşünme şekliniz budur - Her adımda primerler önceki adımlarda genişletilmiş ürünlere bağlanır (+ birkaç döngüden sonra karşılaştırıldığında çok küçük olan orijinal şablon DNA). Orijinal şablon DNA'ya bağlanmayan primerlerin kuyrukları, diğer primerden uzatma sırasında dahil edilir.


Bitki Moleküler Sistematiği

Kısıtlama Bölgesi Analizi (RFLP'ler)

Bir kısıtlama bölgesi, belirli bir kısıtlama enzimine bağlanan yaklaşık 6-8 baz DNA çifti dizisidir. Çok sayıda bulunan bu restriksiyon enzimleri bakterilerden izole edilmiştir. Doğal işlevleri, viral DNA'yı parçalayarak istilacı virüsleri etkisiz hale getirmektir. Tip II olarak bilinen kısıtlama enzimleri, kısıtlama bölgelerini tanır ve DNA'yı kısıtlama bölgesi içindeki veya yakınındaki belirli konumlarda parçalar. Bir örnek kısıtlama enzimidir ekoRI (adını E. koliŞekil 14.8'de görülen DNA dizisini tanıyan ve bu şekilde oklarla gösterilen bölgelerde DNA'yı ayıran, ilk izole edildiği) .

ŞEKİL 14.8. Kısıtlama bölgesi enzimi tarafından bölünen (oklarda) bir DNA kısıtlama bölgesi ekoRİ.

Kısıtlama parçası uzunluğu polimorfizmi, veya RFLP, kısıtlama bölgelerindeki taksonlar arasındaki farklılıkları ve dolayısıyla kısıtlama enzimleri ile bölünmeyi takiben DNA fragmanlarının uzunluklarını ifade eder. Örneğin, Şekil 14.9, iki varsayımsal tür için, restriksiyon enzimine ("sindirilen") tabi tutulan 10.000 baz çiftinin amplifiye DNA uzunluklarını gösterir. ekoRİ. Not, ile bir reaksiyondan sonra ekoRI enzimi, türlerin DNA'sı A ikiye tekabül eden üç parçaya bölünür. ekoRI kısıtlama siteleri, türlerinki ise B üçe karşılık gelen dört parçaya bölünür ekoRI kısıtlama siteleri. Bu kısıtlama bölgelerinin DNA üzerindeki nispi konumları haritalanabilir, bir olasılık Şekil 14.9'un alt kısmında görülmektedir. (Bu harita için başka olasılıklar olduğunu unutmayın, kesin haritalama ek çalışma gerektirir.) Ek kısıtlama enzimleri kullanılabilir. Şekil 14.10, DNA fragmanlarının her birinin ekoRI özetleri, iki tür için farklı fragmanlar veren BAM HI kısıtlama enzimi ile sindirilebilir. Bu veriler bir harita hazırlanırken orijinale eklenebilir (bir olası harita Şekil 14.10'un alt kısmında gösterilmiştir).

ŞEKİL 14.9. A ve B türlerinin kısıtlama bölgesi enzimi kullanılarak kısıtlama bölgesi analizi örneği ekoRİ. Parça uzunluklarındaki farklılıklara dikkat edin. A ve B türlerinin olası kısıtlama alanı haritaları, şeklin alt kısmında gösterilmektedir.

ŞEKİL 14.10. A ve B türlerinin kısıtlama bölgesi enzimi kullanılarak kısıtlama bölgesi analizi örneği ekoRI, ardından kısıtlama bölgesi enzimi BAM HI. A ve B türlerinin olası kısıtlama alanı haritaları, şeklin alt kısmında gösterilmektedir.

Kısıtlama bölgesi parçası verileri, filogenetik bir analizde karakterler ve karakter durumları olarak kodlanabilir. Örneğin, Şekil 14.10'daki kısıtlama site haritalarının doğru olduğu göz önüne alındığında, bu sitelerin varlığı veya yokluğu, Şekil 14.11'de görüldüğü gibi karakter olarak kodlanabilir. Kısıtlama bölgesi analizi, tam DNA dizilemesinden çok daha az veri içerir ve yalnızca 6-8 baz çifti uzunluğundaki sitelerin varlığını veya yokluğunu hesaba katar. Bununla birlikte, önemli ölçüde daha büyük DNA parçalarını araştırma avantajına sahiptir. Bununla birlikte, geliştirilmiş ve daha az pahalı dizileme teknikleri ile, geçmişte olduğundan daha az değerli ve daha az kullanılmaktadır.

ŞEKİL 14.11. Şekil 14.10'daki kısıtlama site haritası verilerinin karakter kodlaması, varlığı veya yokluğu ile türetilmiştir. ekoDNA boyunca belirli konumlarda RI veya BAM siteleri.


Arka plan

Rekombinant DNA moleküllerinin manipülasyonu, modern yüksek verimli protein kristalizasyon çalışmalarında vazgeçilmez bir adımdır [1]. Kısıtlama enzimi sindirimi ve ligasyonuna dayanan kısıtlama enzimi/ligaz klonlaması, bir çift sarmallı DNA fragmanını bir plazmitten diğerine taşımanın basit ve kolay bir yoludur [2]. Bununla birlikte, bu tekniğin iki sınırlaması vardır [3]: benzersiz kısıtlama bölgelerinin olmaması durumunda etkisizdir ve bazen istenmeyen ekstra dizilerin eklenmesine neden olur. Bu sınırlamaları aşmak için, son zamanlarda çeşitli restriksiyon endonükleaz bölünme bölgesinden bağımsız klonlama yöntemleri geliştirilmiştir [4-21]. Bu yöntemler, geleneksel kısıtlama bölgesi klonlamanın zor veya imkansız olduğu durumlarda klonlamayı daha erişilebilir hale getirmiştir. Alternatif klonlama stratejileri olarak daha fazla seçenek için hala gereklidir.

Literatürde kapsamlı bir şekilde açıklandığı gibi kısıtlamasız (RF) klonlama stratejisi, dairesel vektörlerde genleri yeniden oluşturmak için güçlü bir araç olarak geliştirilmiştir [3, 22]. RF klonlama, plazmitte veya ilgili gende herhangi bir değişiklik gerektirmediğinden, yüksek verimli klonlama için son derece uygundur. İlgilenilen gen, bir kez ilgili vektöre tavlandıktan sonra doğrusal bir amplifikasyon reaksiyonunda uzatılan bir primer çifti üreten düzenli bir polimeraz zincir reaksiyonunda (PCR) amplifiye edilir. Bu nedenle, bu yöntem, primer olarak işlev gören amplifiye genlere dayanır. Ancak bu yaklaşımın da sınırlamaları vardır. Birincisi, büyük DNA fragmanlarının hareketi ve ikincil yapıların oluşumu PCR'nin etkinliğini etkileyecektir. İkincisi, bu yöntem sindirime dayanır. dpnEbeveyn plazmitlerini çıkarmak için metillenmiş DNA'yı parçalayan I. verimliliği dpnI tedavisi birçok faktörden etkilenir ve Dam + suşlarında vektör yayılımını gerektirir [23].

Bu yazıda, modifiye kısıtlamasız (MRF) klonlama ile gen yeniden yapılandırmasını gerçekleştirmek için basit ve hızlı bir yöntemi açıklıyoruz. Bu yöntemde, iki tur PCR, uyumlu 5' veya 3' kohezif uçlara sahip iki DNA fragmanı üretir, bu nedenle birbirine bağlanabilmektedir. Bu yeni yöntem, kısıtlama sitelerinin varlığından bağımsızdır ve dpntedavi ediyorum. Bu yöntemi kullanarak, ortalama klonlama verimliliği %85'in üzerinde olan, değişken boyutlu ekler içeren 46 yapı yaptık. Verimlilik, 20 kb'ye kadar olan kesici uç uzunluğundan önemli ölçüde etkilenmedi.


Bölgeye yönelik mutagenez

Siteye yönelik mutajenez (SDM), çift sarmallı plazmit DNA'da spesifik, hedeflenmiş değişiklikler yaratmak için bir yöntemdir. Spesifik DNA değişiklikleri (eklemeler, silmeler ve ikameler) yapmak için aşağıdakiler dahil birçok neden vardır:

  • DNA manipülasyonunun bir sonucu olarak meydana gelen protein aktivitesindeki değişiklikleri incelemek.
  • İstenilen özelliğe sahip mutasyonları (DNA, RNA veya protein seviyesinde) seçmek veya taramak için
  • Kısıtlama endonükleaz sitelerini veya etiketlerini tanıtmak veya kaldırmak için


Yönteme Genel Bakış:

SDM bir laboratuvar ortamında çift ​​sarmallı bir DNA plazmitinde istenen bir mutasyonu sağlamak için özel olarak tasarlanmış oligonükleotit primerlerini kullanan prosedür. Daha önce, Kunkel'in öncülük ettiği (Kunkel, 1985) dUTPase ve urasil deglikosilaz eksikliği olan bir suştan yararlanan bir yöntem, böylece alıcı E. koli urasil içeren vahşi tip DNA'yı bozan yaygın olarak kullanılmıştır. Halihazırda, özel modifikasyon ve/veya benzersiz gerektiren ticari olarak temin edilebilen bir dizi kit bulunmaktadır. E. koli suşlar (örneğin, Thermo'dan Phusion Bölgesine Yönelik Mutajenez ® ve Life'dan GeneArt ® sistemi). En yaygın olarak kullanılan yöntemler, herhangi bir modifikasyon veya benzersiz suş gerektirmez ve standart primerler ile ters PCR ile mutasyonları plazmide dahil eder. Bu yöntemler için, primerler örtüşen (QuikChange ® , Agilent) veya arka arkaya oryantasyonda (Q5 ® Siteye Yönelik Mutajenez Kiti) tasarlanabilir (Şekil 1). Örtüşen astar tasarımı, çift çentikli bir plazmit oluşturmak için yeniden dairesel hale gelecek bir ürünle sonuçlanır. Bu çentiklerin varlığına rağmen, bu dairesel ürün doğrudan E. koliçentikli olmayan plazmitlerden daha düşük bir verimlilikte olsa da. Sırt sırta primer tasarım yöntemleri, yalnızca çentikli olmayan plazmitleri dönüştürme avantajına sahip olmakla kalmaz, aynı zamanda üstel amplifikasyonun istenen üründen önemli ölçüde daha fazlasını üretmesine izin verir (Şekil 2). Ek olarak, primerler birbiriyle örtüşmediğinden, silme boyutları sadece plazmit ile sınırlıdır ve insersiyonlar sadece modern primer sentezinin kısıtlamaları ile sınırlıdır. Şu anda, yerleştirmeyi iki primer arasında bölerek, bu yöntem kullanılarak tek adımda rutin olarak 100 bp'ye kadar eklemeler oluşturulabilir.

Primerler tasarlanmadan önce, hangi mutajenez iş akışının kullanılacağının belirlenmesi önemlidir. Burada piyasada bulunan üç kitin (Şekil 3) karşılaştırmasını ve önemli özelliklerin kısa bir açıklamasını sunuyoruz.

Bir sonraki SDM denemenizi planlamadan önce, önemli deneysel hususlar listemizi okuduğunuzdan emin olun.

Şekil 1: Bölgeye özgü mutajenez 2 saatten daha kısa sürede gerçekleşir

Bir ana karışımın, benzersiz bir çok enzimli KLD enzim karışımının ve hızlı bir polimerazın kullanılması, çoğu plazmit için mutajenez reaksiyonunun iki saatten daha kısa sürede tamamlanmasını sağlar.

Şekil 2: Q5 Sahaya Yönelik Mutajenez Kitine Genel Bakış

Bu kit, eklemelerin, silmelerin ve ikamelerin çift sarmallı plazmit DNA'ya hızlı ve verimli bir şekilde dahil edilmesi için tasarlanmıştır. İlk adım, standart primerler kullanılarak üstel bir amplifikasyon ve Q5 Hot Start High-Fidelity DNA Polimeraz'ın bir ana karışım formülasyonudur. İkinci adım, bir kinaz, bir ligaz ve DpnI içeren benzersiz bir enzim karışımı ile inkübasyonu içerir. Birlikte, bu enzimler, PCR ürününün hızlı daireselleşmesine ve şablon DNA'nın çıkarılmasına izin verir. Son adım, kimyasal olarak yetkin hücrelere (sağlanan) yüksek verimli bir dönüşümdür.

Şekil 3: Q5 Sahaya Yönelik Mutajenez Kiti için Primer Tasarımı

Yer değiştirmeler, silmeler ve eklemeler, özel olarak tasarlanmış ileri (siyah) ve ters (kırmızı) primerler kullanılarak plazmit DNA'ya dahil edilir. Lineer amplifikasyona dayanan kitlerin aksine, Q5 Sahaya Yönelik Mutajenez Kiti için tasarlanan primerler, üstel amplifikasyonun faydalarının gerçekleştirilmesini sağlamak için örtüşmemelidir. A) Yer değiştirmeler, mutasyon(lar)ın 3' akut tarafında en az 10 tamamlayıcı nükleotid dahil olmak üzere, istenen nükleotid değişikliğinin/değişikliklerinin (* ile gösterilir) ileri primerin merkezine dahil edilmesiyle oluşturulur. Ters primer, iki primerin 5' akut uçları arka arkaya tavlanacak şekilde tasarlanmıştır. B) Silme işlemleri, silinecek bölgeyi çevreleyen standart, mutajenik olmayan ileri ve geri primerler tasarlanarak yapılır. C) 6 nükleotide eşit veya daha az eklemeler, ileri primerin 5' akut ucuna dahil edilirken, ters primer, ileri primerin tamamlayıcı bölgesinin 5' akut ucu ile arka arkaya tavlanır. D) Her iki primerin 5' akut uçlarına istenen yerleştirmenin yarısı dahil edilerek daha büyük eklemeler oluşturulabilir. Eklemenin maksimum boyutu, büyük ölçüde oligonükleotid sentezi sınırlamaları tarafından belirlenir.

Erişim seçenekleri

1 yıl boyunca tam dergi erişimi elde edin

Tüm fiyatlar NET fiyatlardır.
KDV daha sonra ödeme sırasında eklenecektir.
Vergi hesaplaması ödeme sırasında kesinleşecektir.

ReadCube'de zaman sınırlı veya tam makale erişimi elde edin.

Tüm fiyatlar NET fiyatlardır.


Moleküler biyolojinin Laboratuvar Teknikleri: Gen Haritalama

1. İlgilendiğim belirli bir gene sahipsem ve onun hakkında bir şeyler biliyorsam, fiziksel olarak yayılmış genoma bakabilir ve ilgilendiğim geni, o diziye bağlanacak floresan bir işaretleyici kullanarak tanımlayabilirim. Bu, genin bir kromozom üzerinde hangi kromozomda ve hangi pozisyonda (yaklaşık bir konum) olduğunu belirleyebilir. Bu, iki nedenden dolayı o kadar sık ​​olmaz: zaten dizilenmiş bir genomla çalışıyorsunuz veya hakkında hiçbir şey bilmiyorsunuz. genom, böylece belirteçleri bilmiyorsunuz ve hangi kromozomun hangisi olduğunu bilmiyorsunuz. Bu yöntem, daha fazla genom dizilendikçe daha az yaygınlaşıyor. Bu, henüz üzerinde çalışılmaya ve yeni anlaşılmaya başlayan genomlar için hala kullanılmaktadır → F.I.S.H.

2. Diğer genetik belirteçler → örneğin: göz rengi, çillerin varlığı, vb. Bilinen herhangi bir genetik belirteç kullanabilir ve bunların ortak ayrışmayı arayarak ilgilendiğimiz genimize yakın olup olmadığını anlayabiliriz. Genetik belirteçler görülebilir ancak genomlarda değişiklikler de olabilir→ Polimorfizmler!

-marker ve mutasyonun bağlantılı olması, dölün mutasyona sahip olduğu çoğu zaman, mutasyona sahip ebeveynin sahip olduğu markörün orijinal versiyonuna sahip oldukları anlamına gelir.

- Haçların soyunda fenotip ile işaretleyicinin birlikte ayrılmasını arayın → birlikte ayrılmaya sahip bireyleri bulduktan sonra, işaretleyici ve mutasyonun bağlantılı olup olmadığını belirleyebilirsiniz.

-tekrarlar→ bilinen iki dizi arasında boşluk olacaktır. Bu dizi arasındaki tekrar sayısı, bir PCR yaptığınızda ürünün uzunluğunu belirleyecektir. Bu 3 temel tekrarın 20'ye 25 kopyasına sahipseniz, bu farklı boyutta ürünler verecektir.

-PCR primerleri→ PCR primeri geliştireceğiniz bir bölgede mutasyon varsa PCR çalışmaz veya farklı bir ürün verir.

**Sonuç olarak, genleri haritalamak için polimorfizmleri kullanarak, genellikle ürünleri bir jel üzerinde çalıştırarak bir bireyde hangi işaretçinin bulunduğunu test edeceksiniz. Kısıtlama bölgelerindeki farklılıklar, tekrar sayısı ve PCR primerleri, farklı boyutta bantlar üretecektir.

-birçok döle bakarız ve işaretleyici ile mutasyon arasında ne sıklıkla rekombinasyon meydana geldiğini belirleriz

- rekombinasyon ne kadar az sıklıkla gerçekleşirse, kromozom üzerindeki fiziksel mesafe o kadar yakın olacaktır.

-RF %50'den az ise genler birbirine bağlıdır. RF %50'ye eşitse, genler birbirine bağlı değildir.

İki ebeveyn olduğunu hayal edin: mutant bir ebeveyn ve vahşi tip ebeveyn. Bunlar aşıldığında F1 neslini üretirler. Çiftleşme normal ise, F1 nesli, işaretleyici konumunda heterozigot olacaktır. Her ebeveynden gelen işaret, farklı bir polimorfizmdir. Mutasyon, kromozom üzerindeki X'tir.
F1'in kendi kendine döllenmesine veya çaprazlamasına izin verin (iki farklı F1 alın ve bunları çaprazlayın). Bu, mayoz bölünme sırasında rekombinasyonun gerçekleşmesine izin verecektir. F2'de, neslin bir kısmı ebeveyn fenotipine sahip olacaktır. Kromozomlar üzerinde karışmaya ve eşleşmeye neden olacak rekombinasyon alabilirsiniz.

F1 gibi tamamen heterozigot olan bir F2 elde edebilirsiniz (her iki işaretçiye sahiptir ve sadece bir kromozom mutant fenotipe sahiptir).

Yeniden birleştirme seçenekleri:
1. Yabani tip ebeveynin yapıcısının mutasyona sahip olduğu yerde rekombinasyon elde edebilirsiniz (şimdi bu birey, iki farklı işaretçi mevcut olsa bile, mutasyon için homozigot olacaktır). Bu birey, mutasyon için homozigottur, ancak belirteç için heterozigottur.
2. Rekombinasyon, mutant genin tamamen kaybıyla sonuçlanabilir.Yani bu kromozomların farklı belirteçleri olacak, ancak hiçbiri mutasyona sahip olmayacak.

Örtüşen kozmitler, DNA parçalarını ekarte etmeye yardımcı olabilir. Kurtarma örtüşen bölgelere sahip iki kozmidde gerçekleşirse, genin örtüşen bölgede olması gerektiğini biliyoruz.

-Aynı fenotipe neden olan birkaç bağımsız mutasyon olabilir.
-Bu fenotipi kaç mutasyonun ürettiğini bulmak için mutagenez yapabiliriz.
- daha sonra mutasyonların aynı lokusta olup olmadığını belirlemek için bu mutasyonlarla (farklı mutantları çaprazlayarak) bir tamamlama testi yapabiliriz.
- aynı lokusun birden fazla alelini bulursak, o zaman genin iyi kopyası bu alellerden herhangi birini kurtarabilmelidir.

- polimorfik belirteçlerin ilk versiyonu
- bu, mutasyonlardan birinin kısıtlama olmayan bir bölgeden bir kısıtlama bölgesi oluşturması veya bu bölgedeki bir mutasyon nedeniyle bir kısıtlama bölgesini kaybetmesi nedeniyle kısıtlama parçası uzunluklarındaki farklılıklara karşılık gelen bir polimorfizmdir.
-DNA kısıtlanır, daha sonra bir Southern lekesi hangi ebeveyn alel(ler)inin mevcut olduğunu belirler → güney lekesi hangi DNA parçasının hangi ebeveynden geldiğini bulmak için yapılır

-RFLP'lerle ilgili sorun, uygun kısıtlama sitelerinde mutasyonlara sahip olmanız gerektiğidir. Bu siteleri başlangıçta bulmak gerçekten zor. RFLP'ler de nadirdir ve yenilerini izole etmek (bulmak) zordur

-Tüm genomu sindirmek yerine, polimorfik kısıtlama bölgesinin etrafındaki bir bölge önce amplifiye edilir, sonra bölünür→ tüm genomu kesmek, bir güney lekesi yapmak ve varlığına bağlı olarak farklı boyutlardaki belirli bir parçayı araştırmak yerine → bir mutasyon, bir PCR yapabilir (amplifikasyon PCR'yi gösterir) ve bir jel çalıştırabilirsiniz. Jele bakabilir ve nerede üretildiğini görebilirsiniz (ör. jelin üst kısmına yakın bir bant veya jelin altına yakın iki küçük bant, bu daha uzun parçanın kesilmiş versiyonuna karşılık gelir).

-kısıtlama bölgesi çevresinde primerler var. Bu primerler bu parçaları çoğaltacak ve sonra bir enzimle keseceksiniz. Kısıtlama bölgesi mevcutsa (örn: allelin anne kopyası, sağlam kısıtlama bölgesi olan normal olandı ve baba mutasyona sahipti ve artık bölgeye sahip değilse), enzim amplifiye fragmanı kesecek ve üzerinde iki bant görülecektir. jel. Kısıtlama bölgesi mevcut değilse (babadan mutasyona uğramış versiyon), enzim kesilmeyecektir, bu nedenle amplifiye fragman çok daha uzun olacaktır. Yeni neslin jeline bakabilir ve bu bireysel belirteci bulabilir ve belirtecin hangi ebeveynden geldiğini belirleyerek gen ile bağlantılı olup olmadığını sorabilirsiniz (işaretleyici orijinal olarak mutasyona sahip olan ebeveynden mi geldi yoksa rekombinasyondan mı kaynaklandı? ?).

-CAPS, RLFP'lere göre büyük bir avantaj olarak ortaya çıktı, ancak CAPS ile ilgili hala sorunlar var

- sorun şu ki, iki ebeveyn arasında polimorfik olacak şekilde değiştirilecek nispeten az kısıtlama bölgesi vardır.

-Kısıtlama bölgelerine bağlı olmak yerine, Mikrosatellitler adı verilen kısa tekrar dizileri kullanın→ bu tür polimorfizm, kısıtlama bölgesi mutasyonunun tipine bağlı değildir, ancak tekrar dizilerindeki farka odaklanır (ör: bir kopya 40 kopyaya sahip olabilir ve başka bir kopya olabilir). 47) vardır. Döllere bakıldığında, iki PCR primeri arasındaki tekrar dizilerinin uzunluğuna bağlı olarak, boyutun babadan, anneden veya her ikisinden (heterozigot) gelen DNA'ya karşılık gelip gelmediğini söylemek mümkündür. Böylece, PCR ürünlerinin boyutuna bağlı olarak, birlikte ayrılma olup olmadığını anlayabilirsiniz.

-SSLP'ler genomun her yerinde bulunur ve tanımlanması kolaydır çünkü tekrar dizisini alıp genomik bir kitaplık oluşturabilirsiniz. Bunu mikro uydu dizisiyle (kısa tekrar dizisi) araştırabilirsiniz ve prob iki farklı SSLP'ye bağlanacaktır. Ardından, mikro uydunun hemen dışındaki bölgeyi sıralayabilirsiniz. Bunu yaptığınızda, bu bireysel dizileri tanımlayabilirsiniz. Anne ve babaya ait mikro uyduları aynı primerle yükseltebilir ve tekrarın kaç kopyasının bulunduğunu belirleyebilirsiniz.

-bilinmeyen bir genom veya birkaç bilinen belirteç içeren bir genom boyunca birçok belirteç bulmak için kullanılır→ Bu durumda, yaptığınız şey, dizi hakkında herhangi bir bilginiz olmadan genom boyunca tek tek belirteçleri bulma olanağına izin vermektir.

Bu nasıl çalışır:
Bir genom alır ve kısıtlama bölgelerine bilinen diziliş bağdaştırıcıları eklersiniz. Kısıtlama enzimleri ile kesme (örn: BamHI ve EcoRI), bu kısıtlama alanları (örn: EcoRI ve BamHI siteleri) arasında farklı fragmanlar üretecektir. Sırası bilinen bağdaştırıcıları eklersiniz ve şimdi bu parçaları PCR kullanarak çoğaltabilirsiniz. Sadece bir parçayı büyütmüyorsunuz, kısıtlama özetinden yapılmış tüm parçaları çoğaltıyorsunuz. Böylece tüm bu farklı parçaları elde edersiniz. Parçalar bir sıralama jeli üzerinde ayrıldığından, ÇKUP farklı boyutlar gösterir.

-Genom boyunca dağılmış yüzlerce veya binlerce SNP → herhangi iki birey arasında birçok bireysel nokta mutasyonu (polimorfizm) vardır

Bulmakla ilgilendiğiniz genin konumunu, genom içindeki tam konumu bilmeden, genomdaki diğer belirteçlere göre nerede olduğuna dayanarak temellendiriyorsunuz.

Fiziksel İşaretleyici:
Fiziksel bir işaretleyici ile kesin konum bilinir (ör. bu işaretleyici, kromozom 5'in kısa uç telomerinden 45.327 bazda bulunur). Fiziksel bir belirteç, genomdaki kesin bir konumdur.

Bir konuma yaklaşmak için genetik belirteçlerin bir kombinasyonunu ve ardından mesafeyi tabanlar arasında gerçekten ölçebileceğiniz fiziksel belirteçleri kullanabilirsiniz.

Fiziksel belirteç, genin tam olarak nerede olduğunu anlamak için genetik bir belirteçten çok daha faydalıdır, ancak genin yaklaşık olarak nerede olduğunu anlamak için genetik teknikleri kullanana kadar fiziksel belirteçleri kullanmak çok zordur.

Her ebeveynden bir tane olmak üzere DNA parçaları vardır. Bir ebeveyn DNA, bir kısıtlama enzimi (ör: EcoRI) için 3 kısıtlama bölgesine sahiptir ve diğer ebeveyn, bölgelerden birinin (orta bölge) farklı olmasına neden olan bir mutasyona sahiptir, bu nedenle artık bir kısıtlama bölgesi değildir. Bu ebeveynde artık bir kısıtlama sitesi yok, bu nedenle yalnızca 2 kısıtlama sitesi var. Bir kısıtlama özeti yaparsınız ve ürünü bir jel üzerinde çalıştırırsınız. Bir güney lekesi yaparsınız ve tüm DNA bölgesini kapsayan bir sonda kullanırsınız. Güney lekesini yaptığınızda, sonda vahşi tip ebeveyn tarafından üretilen iki parçayı alacak ancak mutasyon ile ebeveyn tarafından üretilen parçayı almayacak (mutasyon, kısıtlama bölgesinin kaybına neden olan farklı bir dizidir. Çünkü sıra farklıdır, prob ona bağlanmaz).
Daha büyük bant, boyut olarak iki küçük bandın eklenmesine karşılık gelir.

Bu işaretleyici lokusundaki bu iki ebeveyn arasındaki polimorfizm, bunun, ilgilenilen mutasyonun yaklaşık olarak nerede olduğunu belirlemek için potansiyel bir rekombinasyon frekans işareti olarak kullanılmasına izin verir. Sonuç olarak, bunu alabilir ve farklı alelleri tanımlayabileceğimiz RFLP'ler yapabiliriz. Mutasyon sürekli olarak belirli bir alel ile birlikte ayrılıyorsa, ilgilendiğimiz mutasyonun o belirli RLFP ile ilişkili olduğunu yaklaşık olarak söyleyebiliriz.

-bireyler arasındaki bireysel baz çifti farklılıklarını bulabilirsiniz
-bu, DNA'nın kesilmesini, ancak yalnızca belirli bir dizilim mevcutsa kesilecek bir yöntemin kullanılmasını içerir.
-bu, o DNA'yı kesmek için bir kısıtlama enzimi yönteminin aksine kimyasal bir yöntemdir.
- iki farklı DNA parçanız var (bir normal ve bir mutant). Bunları bir uyumsuzluk yaratacak şekilde karıştırırsınız. Bu uyumsuzluk DNA'da bir baloncuk yaratacaktır. Bu, hidroksilamin veya osmiyum tetroksit ile modifikasyona izin verir (uyumsuzluğu değiştirmek için hidroksilamin veya osmiyum tetroksit ile muamele edin). Bu, karşı iplikle uyumsuz olan herhangi bir C veya T'yi değiştirecektir. Bu değiştirildikten sonra, değiştirilmiş Cs ve Ts'de kesecek olan bir kimyasal olan piperidin ile tedavi edebilirsiniz. Piperidinden sonra DNA'yı denatüre edici bir jele ve elektroforeze koyarsınız. Uyumsuz DNA en az 2 bant üretecek ve uyumsuz normal DNA sadece bir parça üretecektir.

Yani bir uyumsuzluk varsa, elde edeceğiniz şey farklı boyutta bir banttır çünkü o DNA'nın ucunu kesmiş olurdunuz. Uyumsuzluk yoksa, hidroksilamin tarafından herhangi bir değişiklik olmayacak ve ardından piperidin tarafından herhangi bir kesme olmayacak ve beklenen normal boyuttaki parça üretilecektir.
Yani normal ve potansiyel olarak mutant DNA arasında bir uyumsuzluk olup olmadığına bağlı olarak bir fark görüyorsunuz.

PCR için, özellikle primerin 3' ucunda primer ile şablon arasında tam bir eşleşmeye sahip olmanız gerekir (çünkü polimerazın gelmesi ve baz eklemeye başlaması için 3' ucunun şablon üzerinde oturması gerekir). ).

Multiplex PCR, bir aleli diğerine karşı sahip olduğunuzu belirlemenizi sağlar ve bir heterozigot olup olmadığını size söyler.

İki farklı alele sahip bir DNA parçanız olduğunu hayal edin: alel 1 ve alel 2. Alel 1'in bir konumunda bir G ve G'nin karşısında bir C vardır. Alel 2'nin aynı konumda bir A ve A'nın karşısında bir T vardır. Böylece, biri mutasyonun yukarı akışındaki ve bir sonraki akıştaki diziyle eşleşen dış primerler adı verilen 2 primer koydunuz. Sonra iki tane daha primer eklersiniz. Primerlerden biri (primer A) 3' ucunda G/C ile eşleşen baza sahip olacak ve diğer primer (primer B) dizinin bir A/T'si varsa eşleşecektir.
Dizide A/T (alel 2) varsa, primer B bağlanır, ancak primer A bağlanamaz ve ürün üretemez. Dizide G/C (alel 1) varsa, primer A bağlanacak, ancak primer B ürün üretmeyecektir.

4 primer ile bir PCR çalıştırırsanız, PCR reaksiyonlarının ürünleri farklı boyutlara sahip olacaktır.

Allel 1, allel 2 ve heterozigotların tümü büyük parçayı üretecektir çünkü hem allel 1 hem de allel 2 şablona bağlı dış primerlere sahiptir.

Alel 1 için, iki farklı boyutta PCR ürünü üretmek için her ikisi de ters primer ile etkileşime girecek iki ileri primer vardır. Alel 2 için iki ters primer vardır.

Alel 1 (G/C'ye sahiptir) primer A'yı bağlar. Böylece allel 1, Primer A ile dış primer arasındaki fragmanı temsil eden daha kısa bir ürün üretecektir. Primer A, alel 2'yi bağlamadığından, bu boyuttaki parça alel 2 için jel şeridinde eksik olacaktır.

Allel 2 (A/T'ye sahiptir), primer A'yı bağlamadığı için allel 1'de (primer A ve dış primerden) yapılan en küçük bandı üretmeyecektir. Allel 2, en büyük bandı ve orta büyüklükte bir bandı üretecektir. bu, primer B ile dış primer arasındaki mesafeyi temsil eder.

AFLP durumunda, DNA'dan kesilmiş parçalara bakıyorsunuz, ancak parçalar tüm genomdan. AFLP ile, bir sıralama jeli kullanırsınız ve bir ebeveyn hattında diğerinde olmayan bantların bulunduğu yerleri aramaya çalışırsınız. Ebeveyn çizgilerinden birinde bandın mevcut olduğu ancak diğerinde olmayan yerler polimorfizmleri gösterir.

Bantlar, genomu kısıtlama enzimleriyle keserek, bilinen bir diziye ve genomun kesildiği şeye bağlanmalarına izin veren tek sarmallı bir bölgeye sahip uçlara adaptörler koyarak oluşturuldu (ör. BamHI ve EcoRI, bu iki adaptöre sahip olacaksınız - biri BamHI ile eşleşen ve diğeri EcoRI ile eşleşen) ve ardından primerler için bu adaptörlerde bulunan diziyi kullanarak bir PCR yapacaksınız.

Bantlardan herhangi birinin nereden geldiğini (hangi kromozomda olduğunu) bilmiyorsunuz, sadece orada bir polimorfizm olup olmadığını biliyorsunuz.

Hangisinin baba veya anne soyuna karşılık geldiğini belirlemek için döle bakabilirsiniz. Soy bir satıra karşı diğerine bağlantı gösteriyorsa, işaretleyici ile gen arasında bağlantı olup olmadığını belirleyebilirsiniz (örneğin: baba soyunda mutasyon varsa ve mutasyona sahip çoğu soy, ÇKUP'un baba soyuna sahipse, o zaman mutasyon ve AFLP'nin bağlantılı olduğunu söyleyebiliriz)

Bu bilgiyi alabilir, bantları jelden kesebilir, klonlayabilir ve tek bir jelde birden fazla belirteç bulmak için sıralayabilirsiniz.


Metilasyon

Lokusa özgü metilasyonu araştırmak için PCR kullanılabilir. denilen bir yöntemde metilasyona özgü PCR(MSP), iki primer çifti, ilgili lokusun metilasyon durumunu ayırt etmek için tasarlanmıştır [7,8].

MSP'de, DNA örnekleri önce metillenmemiş sitozini (C) urasile (U) dönüştürmek için bisülfit ile işlenir. Metillenmiş sitozin ( m5 C), bisülfit işleminden etkilenmeden kalır. Metillenmiş bölgeleri saptamak için, bir çift primer, metillenmemiş bölgeleri saptamak için hedef dizideki m5 C ile eşleşmek üzere guanin (G) ile, bisülfitteki U ile eşleşmek için başka bir primer çifti adenin (A) ile tasarlanmıştır. -dönüştürülmüş moleküller (ve ardından sonraki PCR döngülerinde timin (T) ile eşleşir). Lokusun metilasyon durumunu belirlemek için primer bağlanmasından kaynaklanan pozitif PCR amplifikasyonu kullanılır (Şekil 7). (Ayrıca kısıtlama enzimleri ile metilasyon analizi hakkında bilgi edinin.)

Şekil 7. Metilasyona özgü PCR. İlk adımda, DNA örnekleri, metillenmemiş sitozini urasile dönüştürmek için bisülfit ile işlenir. İki set PCR primeri (metilasyon ve metilasyon olmayan), bisülfit ile muamele edilmiş DNA'nın amplifikasyonuna dayalı olarak bir lokusun metilasyon durumunu ayırt etmek için tasarlanmıştır. Metillenmemiş DNA, G-U uyumsuzlukları nedeniyle bisülfit muamelesinden sonra tek zincirler olarak mevcuttur ve basitleştirme için burada sadece bir DNA dizisi gösterilmiştir.

MSP büyük ölçüde primerin bisülfit-dönüştürülmüş diziye yönelik özgüllüğüne dayandığından, primer tasarımı deneysel başarıda kritik bir rol oynar. İlk olarak, primer bağlama bölgeleri metilasyona duyarlı kalıntılar içermelidir, böylece metillenmiş ve metillenmemiş diziler saptanabilir. İkincisi, metilasyon olmayan primerler tipik olarak AT bakımından zengindir ve bu nedenle T ile uzun (örneğin > gt30 nt) olmaları gerekir.m Belirli tavlamayı etkinleştirmek için ≥60°C. Ek olarak, yüksek AT dizileri sıklıkla primer-dimer oluşumunu, yanlış eşleşme hibridizasyonunu, DNA polimeraz kaymasını ve amplifikasyon yanlılığını destekler. Bu nedenle, seçilen DNA polimeraz, geniş bir AT/GC içeriği aralığında şablonları çoğaltabilmelidir. Üçüncüsü, yanlış pozitif sonuçları değerlendirmek için primer özgüllüğü bilinen ve bilinmeyen metilasyon durumlarının kontrol DNA'ları ile ampirik olarak test edilmelidir. Metilasyon durumlarını baz çifti uyumsuzlukları ile ayırt etmeye yardımcı olmak için, 3' uçlarında bir çift G-A veya T-C ile metilasyon ve metilasyon olmayan primerlerin tasarlanması tavsiye edilir (Şekil 7).

AT açısından zengin dizileri büyütmeye ek olarak, bir DNA polimeraz, bisülfit işleminden sonra DNA'daki U kalıntılarını okuyabilmelidir. Çoğu yüksek kaliteli DNA polimeraz, Archaean kökenlerinden gelen bir urasil bağlayıcı cebin varlığından dolayı (özel olarak modifiye edilmedikçe) MSP için uygun değildir. Benzer şekilde, şablon dizide U'nun varlığı, PCR bulaşma kontaminasyonunun önlenmesi için UDG tedavisine izin vermez.

Metilasyonun daha nicel analizi için uç nokta PCR yerine, MSP ile gerçek zamanlı PCR kullanılabilir. Gerçek zamanlı PCR ile, PCR amplikonlarının erime eğrisi analizi, ilgilenilen lokusun metilasyon durumunu saptamak için alternatif bir PCR tabanlı yaklaşımdır.


Organel ve Metabolik Süreçler

William Zerges , Charles Hauser , içinde Chlamydomonas Kaynak Kitabı , 2009

B. SD benzeri dizilerin işlevselliği

5′ UTR'lerinde mutasyona uğramış SD benzeri dizilere sahip gen yapılarını eksprese eden kloroplast transformantlarının analizleri, çeviride SD benzeri bir element için evrensel bir gereklilik olmadığını göstermektedir. Örneğin, birkaç mRNA'nın SD benzeri dizilerindeki bölgeye yönelik mutasyonlar ( evcil hayvan, atpB, atpE, rps4, ve rps7) çevirileri üzerinde çok az etkisi oldu veya hiç etkisi olmadı canlıda (Sakamoto ve diğerleri, 1994 Fargo ve diğerleri, 1998). SD benzeri bir dizinin silinmesi psbA 5' UTR, translasyonu ortadan kaldırdı, ancak aynı zamanda mRNA seviyesini de ciddi şekilde azalttı (Mayfield ve diğerleri, 1994). her ikisi için psbD ve psbC, SD benzeri bir dizinin mutagenezi, mRNA birikimini etkilemeden ekspresyonu vahşi tip seviyesinin yaklaşık %25'ine indirdi (Nickelsen ve diğerleri, 1999 Zerges ve diğerleri, 2003). Tütün kloroplastlarındaki SD sekanslarının hem aktivatör olarak hem de bir durumda baskılayıcı olarak işlevselliğine ilişkin kanıtlar da mevcuttur (Hirose ve diğerleri, 1998 Plader ve Sugiura, 2003 Kuroda ve diğerleri, 2007).


PCR mutagenezi, ilgilenilen gene yakın kısıtlama bölgesini nasıl ekler? - Biyoloji

Deney 1: Bölgeye Yönelik Mutajenez

genel bakış: Bu deneyde Strategene'nin QuickChange reaktiflerini ve protokolünü kullanacaksınız. Kılavuzun bir PDF dosyası sınıfın web sitesindedir. Oligonükleotid aracılı, bölgeye yönelik mutajenez gerçekleştirerek hücreye bir mutasyon yerleştireceksiniz. A. nidulans nimX gen dizisi. Değişiklik, pNIG6 plazmit dizisinde 6232 konumunda bir T'den C'ye geçiştir. Bu, Tyr (Y) condon # 306'nın His (H) olarak değişmesine neden olur. Bu tekniğin temeli, mutajenik oligonükleotitlerin, PCR'nin tüm plazmidi yüksek sadakatli termal kararlı bir polimeraz ile amplifiye etmek için primerler olarak kullanılmasıdır. Oligonükleotitler, 6232'nin her iki tarafındaki pNIG6 sekansı ile mükemmel bir şekilde eşleşecektir (bir uyarı ile), ancak TA yerine 6232'de bir CG baz çiftini kodlayacaktır. Primerler ve pNIG6 arasındaki dizi farkı "uyumsuzluk" olarak adlandırılır. Prosedür hem mutant hem de vahşi tip plazmitler verdiğinden, WT ve mutantları ayırt etmek için mutagenez sonuçlarının taranması gerekir. 6232'de T'den C'ye geçiş yalnızca DNA dizilimi ile saptanabildiğinden, mutantları tanımlamak için ek bir numara kullanacağız. Mutajenik oligonükleotitler, 6228'de (Y306H Nsil) bir Nsil bölgesini yok eden veya 6246'da bir SacI bölgesini ekleyen (Y306H SacI) ikinci bir uyumsuzluk içerecektir. Bu, mutajenezinizden kaynaklanan klonların vahşi tip mi yoksa basit bir kısıtlama sindirimi (ya SacI bölgesi kazanımı veya Nsil bölgesi kaybı) ile mutant olup olmadığını belirlemenize izin verecektir. Bir sonraki mantıklı adım, mutantınızın olup olmadığını test etmek olacaktır. nimX gen işlev görebilir A. nidulans. Bu alıştırmada bu testi yapmayacaksınız, ancak işlevini test edeceksiniz. nimX sonraki laboratuvar egzersizlerinde oluşturulan mutasyonlar.

Kronolojik Protokol:

1. Her grup bir QuickChange PCR reaksiyonu gerçekleştirir:

Tüm gruplar, pNIG6 plazmitini mutasyona uğratır

Grup 1-4, Y306H NsiI ve Y306H NsiI Comp = NsiI Kaybı Reaksiyon oligo kombinasyonunu kullanır

Grup 5-8, Y306H SacI ve Y306H SacI Komp = SacI Kazancı Reaksiyonu oligo kombinasyonunu kullanır

TA'lar, oligonükleotitler, pNIG6 DNA ve enzim dışında her şeyi içeren bir ana karışım hazırlayacaktır. Her grup 44.5 ul ana karışım alacaktır.

Ana karışım, tüm reaktifler ve reaksiyon buz üzerinde tutulur.

Tüm gruplar, her bir oligonükleotidin her birine 1.25 ul ekler (konsantrasyon = 100 ng/ul)

Grup 1 ve 5, 2 ul 2.5 ng/ul pNIG6 ekler

Grup 2 ve 6, 2 ul 5 ng/ul pNIG6 ekler

Grup 3 ve 7, 2 ul 10 ng/ul pNIG6 ekler

Grup 4 ve 8, 2 ul 25 ng/ul pNIG6 ekler

TA'lar, her reaksiyona 1 ul enzim ekleyecek ve PCR'yi başlatacaktır. Reaksiyonlara yağ eklenmeyecektir. PCR reaksiyon koşulları, QuickChange kılavuzunuzda açıklandığı gibi olacaktır, 2. döngünün 3. adımı 7.5 dakikadır (>gt1 dak/kb plazmid).

[TA'lara not: L-AMP plakaları ve L-AMP+XGAL+IPTG plakaları yapın. Kontrol reaksiyonunu, XL1-Mavi hücrelerin L-AMP Xgal+IPTG plakaları üzerinde dönüştürülmesi boyunca kılavuza göre gerçekleştirin]

2. Her grup, PCR reaksiyonunun 20 ul'sini 1.5 ml'lik bir tüpe çıkaracak, 1 ul DpnI ekleyecek ve 37 derecede 1 saat inkübe edecektir.

3. Her grup, DpnI sindirme reaksiyonlarının 2 ul'sini XL1-Mavi hücrelere dönüştürür

a) TA'lar size buz üzerinde tüplerde 50 ul XL1-Blue hücre, 42 derecelik su banyolarında tüplerde NZY+ besiyeri sağlayacaktır.

b) Buz üzerindeki hücrelere 2 ul DpnI ile sindirilmiş DNA ekleyin, buz üzerinde 10 dakika inkübe edin

c) Tüpü buzdan 42 derecelik su banyosuna 45 saniye boyunca hareket ettirerek şok hücrelerini ısıtın ve ardından tüpü 2 dakika buza geri döndürün

d) 0,5 ml önceden ısıtılmış NZY+ ortamı ekleyin ve tüpleri 37 derecede çalkalayarak 1 saat inkübe edin.

e) İnkübasyon sırasında 0,45 ml NZY+ ortamını 1,5 tüpe pipetleyin ve oda sıcaklığında saklayın. Kaplamadan önce dönüşüm karışımını seyreltmek için bunu kullanacaksınız.

f) Bir saatlik inkübasyondan sonra hücreleri vorteksleyin, transformasyon karışımının 1:10 seyreltmesini yapmak için .45 ml NZY+ içeren tüpe 50 ul hücre pipetleyin.

g) Bir L-AMP plakası üzerinde transformasyon karışımının 1:10 seyreltisinden 250 ul plaka.

h) Bir L-AMP plakası üzerine 250 ul seyreltilmiş transformasyon karışımı.

i ) Plakları 37 derecede inkübe edin. TA'lar, koloniler uygun bir boyuta ulaştıktan sonra plakaları 4 derecede saklayacaktır. Plakalar bir sonraki laboratuvar döneminin başında sizin için hazır olacak. [ TA'lara Not: Her grubun plakalarından 6 koloni seçin ve kültür tüplerine 2 ml L-AMP inoküle edin ve tüpleri bir sonraki laboratuvar periyodundan önceki gece 37 derecede çalkalayarak inkübe edin. Kültür tüplerini ve plakalarını laboratuvara getirin]

4. Her grup, Qiagen kit reaktiflerini (aşağıya eklenen Qiagen kılavuzundaki protokol) kullanarak QuickChange reaksiyonlarından klonlar üzerinde 6 miniprep DNA izolasyonu yapacaktır.

Her hücre kültüründen 1.5 ml, etiketli, 1.5 ml santrifüj tüplerine.

b) Bakteri hücrelerini, oda sıcaklığında (15-25°C) 1 dakika boyunca tam hızda bir mikrosantrifüjde santrifüjleyerek hasat edin.

c) 1. Peletlenmiş bakteri hücrelerini RNaz içeren 250 μl Tampon P1 içinde yeniden süspanse edin.

d) 250 μl Tampon P2 ekleyin ve tüpü 4,6 kez ters çevirerek iyice karıştırın. Tüpü ters çevirerek hafifçe karıştırın. Girdap yapmayın, çünkü bu, genomik DNA'nın kesilmesine neden olacaktır. Gerekirse, çözelti viskoz ve hafif berrak hale gelene kadar tüpü ters çevirmeye devam edin. Parçalama reaksiyonunun 5 dakikadan fazla sürmesine izin vermeyin.

e) 350 μl Tampon N3 ekleyin ve tüpü 4,6 kez ters çevirerek hemen ve iyice karıştırın. Lokalize çökelmeyi önlemek için, Tampon N3'ün eklenmesinden hemen sonra solüsyonu iyice karıştırın. Büyük kültür hacimleri (örn. 𕟷 ml), 10 kata kadar ters çevirme ve kuvvetli çalkalama gerektirebilir. Çözüm bulanık hale gelmelidir.

f) Masa üstü mikrosantrifüjde tam hızda 10 dakika santrifüjleyin. Kompakt beyaz bir pelet oluşacaktır.

g) Adım 4'teki süpernatanları pipetleyerek QIAprep döndürme kolonuna uygulayın . Döndürme sütunlarının üstlerini etiketleyin.

h) 30 60 s tam hızda santrifüjleyin. Akışı atın.

i ) QIAprep döndürme kolonunu 0,75 ml Tampon PE ekleyerek ve 30-60 s yüksek hızda santrifüjleyerek yıkayın.

j) Akışı atın ve kalan yıkama tamponunu çıkarmak için 1 dakika daha santrifüjleyin. Önemli: Bu ilave santrifüjlemeden önce akış atılmadığı sürece artık yıkama tamponu tamamen çıkarılmayacaktır. artık etanol

Tampon PE'den elde edilen ürünler sonraki enzimatik reaksiyonları inhibe edebilir.

h) QIAprep kolonunu, kapağı kesilmiş temiz bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüplerine yerleştirin (makas kullanın). DNA'yı ayrıştırmak için, her QIAprep döndürme kolonunun merkezine 50 μl EB Tamponu (10 mM Tris Cl , pH 8.5) ekleyin, 1 dakika bekletin ve yüksek hızda 1 dakika santrifüjleyin.

j) DNA solüsyonunu temiz, etiketli, 1.5 ml'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve buz üzerinde saklayın. NOT: EB'de EDTA yoktur, bu nedenle kontamine edici nükleazların etkilerini en aza indirmek için DNA'yı soğuk tutun.

PLAZMİDLERİN ADLANDIRILMASI HAKKINDA ÖĞRENCİLER İÇİN NOT: Plazmitleriniz aşağıdaki gibi adlandırılacaktır:

Grup numarası Deney Numarası Mini Ekran Numarası

Örnek: Grup 3 tarafından yukarıdaki adımda dördüncü mini ekran DNA'sında izole edilen plazmit, 3-1-4 (grup 3 Deney 1 plazmit 4) olarak adlandırılacaktır. Tüpün üzerine konması gereken tek şey bu. Tüm plazmitler kutunuzda -20 derecede (dondurucu) saklanmalıdır. Defteriniz, oluşturulan tüm plazmitlerin bir listesine ve kutunuzdaki konumlarına sahip olmalıdır. O zaman HER ZAMAN defterini kontrol edebilmeliyim, bir DNA'ya bakabilmeliyim, kutundaki tüpü bulabilmeliyim, defterindeki verileri bulabilmeliyim. Bu bilgilerin bir sonraki laboratuvar döneminin başında, sizden fazla yardım almadan anlayabileceğim şekilde defterinizde bulunmaması, derse katılım puanının olumsuz olmasına neden olacaktır. Bu, BIO 510'un yarısı boyunca oluşturulan tüm DNA'ları (plazmitler ve PCR ürünleri) içerir.

5. Her grup, her bir mutant klonu sindirir ve ayrıca bir pNIG6 kontrol özeti yapar. TA'lar size 0.2 ug/ul'de pNIG6 DNA ve sindiriminiz için tampon ve enzim içeren bir Ana Karışım içeren bir tüp sağlayacaktır.

Grup 1-4, NEB Tampon 3 artı BSA kullanarak NsiI artı PstI çift özetler yapar

Gruplar 5-8, NEB Tampon 1 artı BSA kullanarak SacI tekli özetler yapar

a) 7 adet 1.5 ml mikrofüj tüpünün her birine 35 ul ana karışım dağıtın.

b) Bir tüpe her miniprep DNA'sından 5 ul ekleyin.

c) Kontrol Reaksiyonu: 4 ul ddH ekleyin2Son tüpe 0 ve 1 ul pNIG6.

d) Reaksiyonları 37 derecede 1 saat inkübe edin.

6. Her grup, yedi (7) reaksiyonun tümünü, işaretleyicilerle birlikte %1'lik bir jel üzerinde çalıştırır ve sonucun fotoğrafını alır. Sonuçlarınızı laboratuvar defterinize kaydedin ve analiz edin. [TA'lara not: jeller hazırlayın, bu laboratuvar döneminin başlangıcında 10X tampon ve 10X BSA alikuotu hazırlayın.]

a) Her bir özete 4 ul 10X yükleme tamponu ekleyin.

b) Reaksiyonun 15 ul'sini bir jele yükleyin.

c) Bir şeritte 5 ul DNA MW Marker yükleyin.

d) Mavi boya jelin dibine yakın olana kadar çalıştırın ! 45 dakika.

7. Sonuçları Kaydet ve Tartış

Mutajenik Primer TM Hesaplaması: Her öğrenci, grubunun Quick Change PCR reaksiyonunda kullanacağı PCR primerinin TM'sini hesaplamalı ve bu değeri laboratuvar not defterine kaydetmelidir. Primer dizileri ve primerler ile pNIG6 şablonu arasındaki uyumsuzluklar Vector NTI kullanılarak belirlenebilir (bunu zaten yaptınız). Uyumsuz primerlerin TM'sini hesaplama denklemi QuickChange kullanım kılavuzundadır.

XL1-Mavi Dönüşüm: Her öğrenci kendi grubunun transformasyon verimliliğini (= hücrelere eklenen pNIG6 DNA'nın ug'si başına transformant sayısı) hesaplamalı ve bu bilgiyi not defterine kaydetmelidir. Bu hesaplamayı gerçekleştirmek için, XL1-Mavi hücrelere dönüştürdüğünüz 2ul DpnI özünde ne kadar pNIG6 DNA bulunduğunu hesaplamanız gerekir. Grubunuzun sonuçlarını tahtaya kaydedin ve TA'lar tarafından yapılan kontrol dönüşümü de dahil olmak üzere tüm grupların sonuçlarını kopyalayın. Sonuçlarınız, Stratagene tarafından ilan edilen dönüşüm verimliliğiyle nasıl kıyaslanıyor? Diğer gruplarla nasıl karşılaştırılır? Stratagene'in reklamı yapılan verimliliği ile hesaplanan verimliliğiniz arasındaki farklara katkıda bulunabilecek faktörler nelerdir? Verimliliğiniz ile diğer grupların verimliliği arasında mı?

Mutajenez Verimliliği: Her öğrenci ayrıca TA'lar tarafından yürütülen kontrol reaksiyonunun mutajenez verimliliğini de kaydetmelidir (verimlilik = mutant plazmit içeren E. coli transformantlarının yüzdesi). Bunu yapmak için QuickChange kılavuzuna başvurmanız ve kontrol reaksiyonunun ne olduğunu ve hangi kolonilerin mutant plazmit ve hangilerinin vahşi tip plazmit taşıdığını belirlemek için mavi/beyaz koloni renk testini nasıl kullanacağınızı öğrenmeniz gerekecektir. Ayrıca grubunuz ve diğer tüm gruplar tarafından elde edilen mutasyon verimliliğini de kaydedin (tahtaya ait bilgileri kaydedin). Bunu belirlemek için, pNIG6 ve yaratmaya çalıştığınız mutasyona uğramış pNIG6 formu için kısıtlama özetlerinin sonuçlarını tahmin etmek için Vector NTI kullanmalısınız.

Plazmitler: 0,2 ug/ul 25 ng/ul 10 ng/ul 5 ng/ul 2,5 ng/ul'de pNIG6

Oligonükleotidler (tümü 100 ng/ul'de): Y306H Nsil Y306H Nsil Komp. Y306H SacI Y306H SacI Komp.


PCR Mutajenezi, Klonlama, Ekspresyon, Hızlı Protein Saflaştırma Protokolleri ve Yabani Tip ve Triptofan Sentezinin Mutant Formlarının Kristalizasyonu

Triptofan sentaz (TS) bienzim kompleksi (α) ile yapısal çalışmalar2β2 TS) Salmonella typhimurium katalitik mekanizmasını, allosterik davranışını ve substratın PLP'ye bağımlı enzimlerde ürüne enzimatik dönüşümünün ayrıntılarını daha iyi anlamak için yapılmıştır. Bu çalışmada, izole edilmiş α- ve izole edilmiş ifadeleri üretmek için yeni bir ifade sistemi β-alt birim yüksek miktarlarda saf alt birimlerin saflaştırılmasına izin verdi ve α2β2 NS2 gün içinde izole edilmiş alt birimlerden TS kompleksi. Arıtma, afinite kromatografisi, ardından afinite etiketinin bölünmesi, amonyum sülfat çökeltmesi ve boyut dışlama kromatografisi (SEC) ile gerçekleştirildi. Enzim β-bölgesindeki anahtar kalıntıların rolünü daha iyi anlamak için, önceki yapısal çalışmalarda saha-doğrudan mutajenez gerçekleştirilmiştir. Vahşi türü ve mutant α'i saflaştırmak için başka bir protokol oluşturuldu.2β2 NSTS kompleksleri. Amonyum sülfat fraksiyonasyonu ve SEC kullanan basit, hızlı ve verimli bir protokol, α'in saflaştırılmasına izin verdi.2β2 NSTek bir günde TS kompleksi. Bu çalışmada açıklanan her iki saflaştırma protokolü de, aynı kompleksi PEG 8000 ve spermini kullanarak saflaştırmak için önceki protokollerle karşılaştırıldığında önemli avantajlara sahiptir.2β2 NSArıtma protokolü boyunca TS kompleksi. Yabani tip ve bazı mutant formların kristalizasyonu, biraz farklı koşullar altında meydana gelir ve bazı mutantların PEG 8000 ve spermin kullanılarak saflaştırılmasını bozar. X-ışını kristalografik çalışmalara uygun kristaller hazırlamak için kristalizasyon, kristal kalitesi ve kriyo korumayı optimize etmek için çeşitli çabalar sarf edildi.. Burada sunulan yöntemler, triptofan sentaz alt birimlerinin ve vahşi tip ve mutant α'in saflaştırılması için genel olarak uygulanabilir olmalıdır.2β2 NSTS kompleksleri.

Tanıtım

Triptofan sentaz (TS) bienzim kompleksi (α2β2) bakteri, bitkiler ve mantarlarda amino asit L-Triptofanın biyosentezindeki son iki adımı katalize eden allosterik bir enzimdir 1 , 2 , 3 . bakteri Salmonella enterika serovar Typhimurium (NS) insanlarda ve diğer hayvanlarda ciddi bir gastrointestinal enfeksiyona neden olur. İnsanlarda ve daha yüksek hayvanlarda TS (EC 4.2.1.20) bulunmadığından, inhibisyon S. typhimurium α2β2 TS kompleksi (α2β2 NSTS), kriptosporidiyoz ve tüberküloz 4, genital ve oküler enfeksiyonların 5 tedavisi ve tarımda 6 potansiyel herbisit kullanımı için potansiyel bir ilaç hedefi olarak araştırılmıştır. α-alt birimi, indol-3-gliserol-fosfatın (IGP) gliseraldehit-3-fosfata (GAP) ve indol'e aldolitik bölünmesini, bir indolenin tautomer ara ürünü ve ardından karbon-karbon bağı bölünmesini üretmek için katalize eder. GAP ve indol 3, 6. β-katalitik site, bir Schiff bazı yoluyla β-Lys87'ye bağlı bir piridoksal 5′-fosfat (PLP) kofaktör molekülü içerir ve bu, β enzimindeki reaksiyonlar sırasında bir elektron havuzu görevi görür. -alt birim 3 , 7 . β bölgesi, PLP'ye bağlı bir reaksiyonda L-Triptofan ve bir su molekülü vermek üzere L-Serin yan zincir hidroksilinin indol ile değiştirilmesini katalize eder. NSTS, çok enzim kompleksleri 2, 3 içinde substrat kanallama ve allosterik iletişimin araştırılması için uzun süredir devam eden bir model olarak hizmet vermektedir. TS'nin α- ve β-alt birimleri arasındaki çift yönlü allosterik iletişim, katalitik adımları senkronize etmek ve L-Triptofan sentezi sırasında indol salınımını önlemek için gereklidir 3 . Bu çabayı genişletmek için, enzim yapısı, mekanizması ve işlevi arasındaki ilişkinin daha ileri araştırmalarında kullanılmak üzere tek nokta mutasyonuyla birkaç mutant (β-Gln114Ala, β-Lys167Thr ve β-Ser377Ala) hazırladık. katalitik yerinde NSTS β-alt birimi.

α'in katalitik mekanizması hakkında detaylı araştırma2β2NSTS, Edith W. Miles'ın araştırma grubu tarafından başlatıldı. Yerli ile erken çalışmalar Escherichia koli α2β2 TS kompleksi, izole edilmiş α-alt birim 8 , 9 , izole edilmiş β-alt birim 10 , 11'in saflaştırılmasına ve karakterizasyonuna ve α alt biriminin yeniden oluşturulmasına odaklanmıştır.2β2 İzole edilmiş alt birimlerden TS kompleksi 12 . Saflaştırma, amonyum sülfat çökeltmesi, numune diyalizi, DEAE-Sephadex kromatografisi, diyaliz ve bir DEAE-Sephadex kolonu 12 üzerinde ikinci bir kromatografik tur ile gerçekleştirildi. Başka bir protokolde, aynı kompleksin saflaştırılması, bir DEAE-Sephadex kolonu üzerine berraklaştırılmış hücre lizatı yüklenerek, ardından bir Sepharose 4B kolonu üzerinde kromatografik bir adım, amonyum sülfat çökeltme ve diyaliz 13 ile geliştirildi. Her iki saflaştırma protokolü de 4-5 gün sürer. Escherichia koli α2β2 TS kompleksi kristallendi, ancak kristaller o sırada X-ışını kırınımı için uygun değildi.

Yeni bir çalışmada, rekombinant ve vahşi tip formları S. typhimurium α2β2 TS kompleksi saflaştırıldı ve kristalleştirildi 14,15. rekombinant α2β2 NSTS kompleksi aşırı ifade edildi E. koli pEBA-10 ekspresyon vektörünü taşıyan CB149 suşu. İlk kristalizasyon ve X-ışını kırınım verilerinin toplanması ve α'in analizi2β2 NSTS kompleksi 14 bildirildi. Ancak α gibi uzun ve ince iğne2β2 NSTS kristalleri yapısal çalışmaları bozdu. Daha iyi X-ışını kırınım verileri toplamak amacıyla, vahşi tip ve mutant formlarını saflaştırmak için başka bir saflaştırma protokolü tanımlandı.2β2 NSTS kompleksi 15 . Arıtma, berraklaştırılmış hücre lizatı içine spermin ve PEG 8000 kullanılarak bir ilk çökeltme ile gerçekleştirildi ve santrifüjleme ile büyük hacimli bir çökelti çıkarıldı. Yüksek miktarda α içeren süpernatant fraksiyonu2β2 NSTS kompleksi, sarı kristaller çökene kadar 16-48 saat 4°C'de saklandı. Kristaller yıkandı ve farklı tamponlara karşı yoğun şekilde diyaliz edildi. Protein kompleksi, amonyum sülfat içeren tampon içinde yeniden kristalleştirildi ve diyalize edildi 15. Protein kristalizasyonu, çözeltideki protein ve çökeltici konsantrasyonlarına bağlı olsa da, α'in diğer mutant formları için saflaştırmayı izlemek, tahmin etmek ve yeniden üretmek zordur.2β2 NSÇözeltide TS kompleksi. Bu protokolün herhangi bir kromatografik yöntem kullanmaması avantajı vardır, ancak dezavantajları kristalleştirme, diyaliz ve yeniden kristalleştirme için gerekli olan ve tipik olarak 5-7 gün gerektiren uzun saflaştırma süresidir. X-ışını veri toplamaya uygun kristaller elde etmek için, protein konsantrasyonu, sıcaklık, çökelticiler (PEG 4.000, 6.000 ve 8.000) ve katkı maddelerinin (CaCl) bir kombinasyonu ve varyasyonu kullanılarak 600'den fazla kristalizasyon koşulu değerlendirildi.2, MnCl2, ZnCl2, kadaverin, putresin, spermin veya spermidin) 15 . Kristaller daha iyi bir kristal forma sahipti ve %12 PEG 8000 ve 2 mM spermin içeren koşullarda daha hızlı büyüdü. Kristalleşme 4, 30 veya 42 °C yerine 25 °C'de daha elverişliydi ve 3 gün içinde maksimum boyutlara ulaştı15. Birkaç α2β2 NSTS kristal yapıları o zaman rapor edildi (1996-1999) 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 ve bugüne kadar birçok başka yapı yayınlandı.

Burada ana amaç, triptofan sentazı saflaştırmak ve protein kristalizasyonunu optimize etmek için alternatif protokoller sunmaktır. Mevcut çalışma, vahşi tip izole edilmiş α-alt birimini (αNSTS), izole β-alt birimi (βNSTS), yeniden yapılandırılmış α2β2 NSİzole alt birimlerden TS kompleksi ve α'in vahşi tip ve mutant formları2β2 NSTS kompleksi. Saflaştırma süresi önemli ölçüde azaltıldığından ve kristalizasyon ve kriyo koruma optimize edildiğinden, geçmiş protokollere göre avantajlar önemlidir. α'in mutant formları2β2 NSBu çalışmada tasarlanan TS kompleksi, vahşi tip form için kullanılanla aynı koşula yakın kristalize olmuştur. Ancak, yakın atomik çözünürlükte yapı tayini için yeterli kalitede büyük tek kristaller elde etmek için ince kristalizasyon optimizasyonu gerekliydi. Bugüne kadar, Protein Veri Bankasında (PDB) biriken 134 triptofan sentaz kristal yapısı vardır ve bunlar bakteri, arke ve ökaryot için sırasıyla 101, 31 ve 2 kristal yapıya sahiptir. Güzel, 73 yapıya ait S. enterika serovar Typhimurium ve α'in 5 kristal yapısı2β2 NSTS kompleksi, 1.50 Angstrom'dan daha yüksek çözünürlük sınırlarına sahiptir. Şaşırtıcı olmayan bir şekilde, araştırma grubumuzda 5 kişiden 4'ü hazırlandı (PDB ID'leri: 5CGQ 1.18 Å, 4HT3 1.30 Å, 4HPJ 1.45 Å, 6DZ4, 1.45 Å çözünürlükte). α mutant formunun rafine kristal yapıları2β2 NSTS kompleksinin, L-Triptofan sentezinde yer alan temel amino asit kalıntılarının oynadığı mekanizma ve roller hakkında yeni bilgiler sağlaması bekleniyor.

Abonelik Gerekli. Lütfen JoVE'u kütüphanecinize önerin.

Protokol

1. α- ve β-alt birimini ve yeniden birleştirilen α'i arındırmak için hızlı protokol2β2 NSTS kompleksi

  1. pETSUMO ekspresyon vektörüne DNA alt klonlama
    1. translasyonel olarak bağlanan geni (trpA ve trpB) elde edin. α- ve β- bakteriden triptofan sentazın alt birimleri Salmonella enterika serovar Typhimurium pEBA-10 ekspresyon vektörü 22'de klonlanmıştır. DNA şablonu olarak pEBA-10 vektörünü kullanın.
      NOT: Alternatif olarak, aşağıda listelenen primerler, her iki geni de genlerden yükseltmek için kullanılabilir. Salmonella enterika serovar Typhimurium genetik şifre. Tüm moleküler biyoloji adımları, Moleküler Klonlama: Bir Laboratuvar El Kitabı 23'te açıklandığı gibi takip edildi.
    2. Tam uzunluktaki polinükleotid dizisini tek tek büyütmek için polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) kullanın. α-alt birim (αNSTS) primerler ile αNSTS-FW-Bam ve αNSTS-Rev-Eco ve tam uzunlukta dizisi β-alt birim (βNSTS) primerleri β ileNSTS-FW-Bam ve βNSTS-Rev-Hind. Yaklaşık 55 °C'lik bir erime sıcaklığı ve 2 dakikalık bir polimeraz uzatma süresi kullanın.
      1. DNA dizilerini yükseltmek için yüksek kaliteli DNA polimerazı (örn., Phusion) ve üreticinin protokolünü kullanın. 50 µL PCR reaksiyonu için 34 µL nükleaz içermeyen su, 10 µL 5x reaksiyon tamponu, 1 µL 10 mM dNTP, 1 µL 10 µM ileri primer, 1 µL / 10 µM ters primer, 1 µL Şablon DNA (200 ng), 1,5 µL DMSO, 0,5 µL Phusion DNA polimeraz.
      2. PCR programı için, bir sıcak başlatma (98 °C'de 180 saniye) ve ardından 30 amplifikasyon döngüsü (98 °C'de 30 saniye, 55 °C'de 30 saniye ve 72 °C'de 120 saniye) kullanın ve son bir uzatma (72 °C'de 300 saniye).
        NOT: İtalik diziler, BamSELAM, ekoRİ, BamMerhaba ve ArkaSırasıyla III kısıtlama siteleri. PCR fragmanlarının uçlarına yakın enzim bölünme verimliliği, ekstra bazlar (küçük harf dizileri) eklenerek arttırıldı.
        αNSTS-FW-Bam: 5′-cgcGGATCCATGGAACCGCTACGAAAA-3′
        αNSTS-Rev-Eko: 5′-ccgGAATTCTTATGCGCGGCTGGC-3′
        βNSTS-FW-Bam: 5′-cgcGGATCCATGACAACACTTCTCAAC-3′
        βNSTS-Rev-Hind: 5′-cccAAGCTTTCAGATTTCCCCTC-3′
      1. Her DNA fragmanından en az 200 ng, 37 °C'de 2 saat boyunca üretici tarafından önerilen uygun kısıtlama enzimleri ve koşulları ile sindirin.
      2. 50 μL kısıtlama sindirim reaksiyonu oluşturmak için 34 µL nükleaz içermeyen su, 10 µL DNA (200 ng), 5 μL 10x reaksiyon tamponu, 0,5 µL kısıtlama enzimi 1 ekleyin ve 0,5 µL kısıtlama enzimi 2.
      3. Parçalama ürününü 6 V/cm'de 1x TAE üzerinde %0.8 agaroz jele yükleyin, jel özütü ve jel, sindirilmiş parçayı ticari bir kit kullanarak saflaştırın.
      1. taze aşılamak E. koli suş Rosetta (DE3) pLysS SUMO- barındıran hücrelerαNSTS veya SUMO-βNSTS, donmuş gliserol stokunun bir kısmını 35 μg/mL kanamisin ve kloramfenikol içeren 50 mL'lik bir LB kültürüne oluşturur veya sıyırır. Hücreleri gece boyunca 37 °C'de 200 rpm'de sallayarak büyütün.
      2. Ertesi sabah, %2 gliserol artı kanamisin ve kloramfenikol (2,8 L Fernbach şişesi) içeren taze ve steril 2x 1000 mL LB'ye 5 mL gece hücre kültürünü aşılayın. 37 °C'de 200 rpm'de sallayarak hücre kültürünü büyütün.
        NOT: SUMO- ifadesiαNSTS veya SUMO-βNSLB et suyunda TS, litre başına 125-150 mg etiketli protein verir. Belirli talepleri karşılamak için protokolü yukarı veya aşağı ölçeklendirmeyi düşünün.
      3. OD olduğunda rekombinant protein ekspresyonunu indükleyin600 0,4 mM nihai konsantrasyonda izopropil β-D-1 tiyogalaktopiranosid (IPTG) ilavesi ve ardından 200 rpm'de çalkalanarak 30 °C'de gece boyunca inkübasyon ile 0,6-0,8'e ulaşır.
      4. 4.000 x'te santrifüjleyerek hücreleri toplayın G 20 dakika boyunca 4 °C'de. Süpernatantı çıkarın ve hücre topaklarını soğuk lizis tamponu 1 (50 mM Tris-Cl, pH 8.0, 500 mM NaCl, %5 gliserol, 10 mM 2-merkaptoetanol ve 40 mM imidazol-Cl içeren) ile yeniden askıya alın. 60 mL'lik hacim.
        NOT: Hücreler -80 °C'de uzun süreli olarak saklanabilir veya protein saflaştırması için hemen kullanılabilir. Hücreleri depolamak için hücre süspansiyonunu 2 x 50 mL tek kullanımlık santrifüj konik tüplerine bölün ve hücre peletlerini protein saflaştırma adımına kadar -80 °C'de tutun.
      1. 1/2" Horn probu (veya benzer bir ekipman) ile dijital bir sonifier kullanarak sonikasyon yoluyla hücre peletini bozun. 10 s darbe ve 20 s dinlenme veya tam hücre bozulmasına kadar buzlu su banyosunda %80 genlik görev döngüsünde 20 döngü gerçekleştirin.
      2. Hücre lizatını 30.000 x'de santrifüjleyin G 30 dk. Peletin tüpten ayrılmadığından emin olarak süpernatantı aspire edin. Süpernatantı buz üzerinde 0.45 μm filtre ünitesiyle süzün ve lizis tamponu 1'de önceden dengelenmiş 15 mL Ni-NTA agaroz nikel yüklü afinite kolonundan akıtın.
        NOT: Her bir Ni-NTA agaroz kolonu, SUMO-'dan herhangi birini saflaştırmak için kullanılacaktır.αNSTS veya SUMO-βNSTS rekombinant proteini. Saflaştırma, hızlı protein sıvı kromatografi sistemine bağlı 2x 5 mL Ni-NiTA kolonunda gerçekleştirilebilir. Bir seferde bir proteini arındırın.
      3. Ni-NTA agaroz kolonunu 100 mL lizis tamponu 1'de yıkayın.
      4. Tampon E1 (25 mM Tris-Cl tamponu, pH 7.8, 200 mM NaCl, %5 gliserol ve 400 mM imidazol-Cl içeren) ile 80 mL'lik tek aşamalı elüsyon ile devam edin.
        NOT: SUMO-proteaz 300 mM'ye kadar imidazolü tolere eder ve santrifüj filtre cihazlarının zarı 100 mM'ye kadar imidazolü tolere eder. Yüksek miktarlarda imidazolü uzaklaştırmak ve saflaştırma süresini azaltmak için protein numunesini seyreltmek ve protein konsantrasyonu ile boşa zaman harcamak için bir amonyum sülfat çökeltme gerçekleştirmenizi öneririz.
      5. Süpernatant fraksiyonunun ilk hacmini değerlendirin. 25 °C'de %60 doygunluğa (39.48 g/ 100 mL) ulaşılana kadar bir seferde küçük miktarlarda amonyum sülfat yavaş yavaş ekleyin. Çözeltiyi 30 dakika boyunca hafifçe karıştırın ve kabarcıklardan kaçının. 10.000 x'te santrifüj G 15 dk.
      6. Süpernatant fraksiyonu dikkatlice aspire edin ve atın. Pelet fraksiyonunu 20 mL numune tamponunda (20 mM Tris-Cl, pH 8.0, 300 mM NaCl ve %5 gliserol) yeniden süspanse edin.
      7. SUMO-proteaz ile His-SUMO-etiketi bölünmesi için, Ubl-spesifik proteaz 1'in rekombinant fragmanını ekleyin. Saccharomyces cerevisiae 1:1000 oranında ve karışımı 2 saat 4 °C'de inkübe edin.
      8. 10.000 x'de sindirim ürününü santrifüjleyin G numuneyi bir afinite kromatografi kolonundan yüklemeden önce protein agregatlarını çıkarmak için 20 dakika boyunca 25 °C'de.
      9. Daha önce lizis tamponu 1'de dengelenmiş 15 mL Ni-NTA agaroz kolonunda 20 mL yeniden süspanse edilmiş numuneyi geçen His6-SUMO etiketinin izlerini kaldırın.
      10. Etiketlenmemiş olanı içeren doğrudan geçiş örneğini toplayın αNSTS veya βNSTS.
      11. Etiketlenmemiş artıkları toplamak için Ni-NTA sütununu 20 mL arabellek 1'de yıkayın. αNSTS veya βNSTS.
      12. 3.000 x'te döndürerek 15 mL 10 kDa cutoff santrifüj filtre ünitesi ile her alt birimi ayrı ayrı konsantre edin G 4 °C'de. Konsantre proteini taze 2,0 mL'lik bir tüpe ve agregaları uzaklaştırmak için mikrosantrifüje (10.000 x g, 10 dk, 4 °C) aktarın. Protein konsantrasyonunu 24 belirleyin, 20-25 mg mL -1'de 1 mL'lik alikuotlar hazırlayın, etiketleyin, sıvı nitrojen içinde flaş-dondurun ve -80 °C'de saklayın.
        NOT: Önceden saflaştırılmış protein numuneleri -80 °C'de uzun süreli olarak saklanabilir veya bir boyut dışlama kromatografisi sütununda (SEC) protein saflaştırması için hemen kullanılabilir.
      13. Bir protein alikotu (20 mg) alın ve 10.000 x'de mikrosantrifüjleyin G SEC'den önceki agregaları çıkarmak için 10 dakika boyunca.
      14. Hızlı bir proteine ​​bağlı bir boyut dışlama kromatografi sütununa (örn. HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR) numune yükleyin sıvı kromatografisi 0.5 mL dk-1 akış hızında, önceden SEC tamponunda (10 mM Tris-Cl, pH 7.8, 100 mM NaCl, %5 gliserol, 0.1 mM piridoksal fosfat) dengelendi.
        NOT: Daha yüksek miktarlarda izole edilmiş α'i saflaştırmak içinNSTS veya βNSTS alt birimi ve SEC turlarının sayısını azaltın, 5 mL'lik bir numuneyi 20-25 mg mL-1'de bir boyut dışlama kromatografi kolonuna 1.5 mL dk -1 akış hızında yükleyin.
      15. α kalitesini değerlendirinNSTS veya βNSSırasıyla %12 veya %15 sodyum dodesil sülfat-jel elektroforezi (SDS-PAGE) kullanılarak pik fraksiyonda TS, Coomassie parlak mavi leke 25 ile boyanmıştır.
      16. Proteini taze 15 mL 10 kDa cutoff santrifüj filtre üniteleri ile konsantre edin, protein konsantrasyonunu 24 belirleyin, 20-25 mg mL-1'de 0,5 mL'lik alikuotlar hazırlayın, etiketleyin, sıvı nitrojen içinde flaş-dondurun ve -80 °C'de saklayın.
      1. Vahşi türü α arındırmak için2β2NSTS kompleksi α- ve β-alt birimleri, çözülme konsantresi numuneleri αNSTS ve βNSTS alt birimleri 4 °C'de.
      2. Alikotları birleştirin (1.2 αNSTS: 1.0 βNSTS molar oranı) ve 4 °C'de 1 saat inkübe edildi.
        NOT: αStTS'nin aşılması, çoğu β'nın olduğundan emin olmak için gereklidir.NSTS, α'e dahil edilecek2β2NSTS kompleksi.
      3. Mikrosantrifüjleme ile protein agregatlarını çıkarın (10.000 x g, 10 dk, 4 °C).
      4. Berraklaştırılmış süpernatantı boyut dışlama sütununa yükleyin.
      5. α kalitesini değerlendirinNSTS veya βNSSırasıyla %12 veya %15 sodyum dodesil sülfat-jel elektroforezi (SDS-PAGE) kullanılarak pik fraksiyonda TS, Coomassie parlak mavi leke 25 ile boyanmıştır.
      6. Protein konsantrasyonunu 24 belirleyin, 15-20 mg mL -1'de 250-1000 μL alikuotlar hazırlayın, sıvı nitrojen içinde flaş-dondurun ve -80 °C'de saklayın.

      2. α'in vahşi tipinin veya mutant formunun saflaştırılması2β2 NSTS kompleksi

      1. Mutant β hazırlamak için bölgeye yönelik mutajenezNSTS
        1. Belirli nokta mutasyonlarını tanıtmak için iki aşamalı polimeraz zincir reaksiyonu sırasında DNA şablonu olarak yapı pEBA-10 ekspresyon vektörü 22'yi kullanın. β-zincirli TS polinükleotid dizisi.
          NOT: Bu protokol, her ikisinde de tek nokta mutasyonu tanıtmak için kullanılabilir. α-veya β-alt biriminden Salmonella typhimurium triptofan sentaz. İlave olarak, istenen mutasyonu içeren yeni oligonükleotid primerleri uygun şekilde tasarlanmalıdır. Bu çalışmada, mutasyonlar βQ114A, βK167T, βS377A listelenir.
        2. Sırasıyla A1, B1 ve C1 parçalarını oluşturmak için nükleotid primerleri TS-FW-NcoI/Q114A-Rev, TS-FW-NcoI/K167T-Rev ve TS-FW-NcoI/S377A-Rev çiftlerini kullanarak PCR reaksiyonları gerçekleştirin.
          NOT: Oligonükleotid TS-NcoI-FW ve TS-SacI-Rev sırasıyla αβ'nın yukarı ve aşağı akışlarını tavlar. NSpEBA-10 vektöründe klonlanmış TS polinükleotid dizisi.
          1. DNA dizilerini yükseltmek için yüksek kaliteli DNA polimerazı (örn., Phusion) ve üreticinin protokolünü kullanın. 50 µL PCR reaksiyonu için, 34 µL nükleaz içermeyen su, 10 µL 5x reaksiyon tamponu, 1 µL 10 mM dNTP, 1 µL 10 µM ileri primer, 1 µL 10 µM ters primer, 1 µL Şablon DNA (200 ng), 1,5 µL DMSO, 0,5 µL DNA polimeraz.
          2. PCR programı için, bir sıcak başlatma (98 °C'de 180 saniye) ve ardından 30 amplifikasyon döngüsü (98 °C'de 30 saniye, 55 °C'de 30 saniye ve 72 °C'de 120 saniye) kullanın ve son bir uzatma (72°C'de 300 saniye).
            NOT: Tüm moleküler biyoloji adımları, Moleküler Klonlama: Bir Laboratuvar Kılavuzu 23'te açıklandığı gibi takip edildi. Küçük harfli bir dizi bir kısıtlama bölgesine karşılık gelirken, kalın ve italik bir dizi bir mutasyona karşılık gelir.
            TS-FW-NcoI: 5’-CAA TTT CAC ACA GGA AAC AGA cca tgg-3’
            Q114A-Rev: 5’-C AGA GGC GAC GCC GTG CGK ACC GGC GCC GGT TTC-3’
            K167T-Rev: 5’-CTC GTT ACA GGC ATC TGT TAG CGT AGC GGA GCC-3’
            S377A-Rev: 5’-C TTT ATC TCC GCG GCC AGC GAG ATT GAC CAC CAG-3’
          1. A1/A2, B1/B2 ve C1/C2 parçalarını eşmolar miktarlarda ayrı ayrı karıştırın, karışımı 10 dakika 96 °C'de ısıyla denatüre edin ve 25 °C'de tavlayın. Üreticinin protokolüne göre yüksek kaliteli polimeraz ve deoksiribonükleotitler ile rekombinant iplikleri uzatın.
          1. Her DNA fragmanından en az 200 ng, 37 °C'de 2 saat boyunca üretici tarafından önerilen uygun kısıtlama enzimleri ve koşulları ile sindirin. 50 μL kısıtlama sindirim reaksiyonu oluşturmak için 34 µL nükleaz içermeyen su, 10 µL DNA (200 ng), 5 μL 10x reaksiyon tamponu, 0,5 µL kısıtlama enzimi 1 ekleyin ve 0.5 µL kısıtlama enzimi 2. Parçalama ürününü 6 V/cm 'da 1x TAE tamponu içinde %0.8 agaroz üzerine yükleyin ve sindirilmiş PCR fragmanını saflaştırın.
          1. Büyümek E. koli 50 μg/mL ampisilin içeren taze ve steril 50 mL LB ortamında arzu edilen yapıyı barındıran ekspresyon suşu. Hücreleri gece boyunca 37 °C'de 200 rpm'de sallayarak büyütün.
          2. %2 gliserol artı ampisilin (2,8 L Fernbach şişesi) içeren taze ve steril 2x 1000 mL LB'ye 5 mL gece hücre kültürü ekleyin. 37 °C'de 200 rpm'de sallayarak hücre kültürünü büyütün.
          3. OD olduğunda rekombinant protein ekspresyonunu indükleyin600 0.4 mM'lik bir nihai konsantrasyonda IPTG'nin eklenmesi ve ardından 200 rpm'de çalkalanarak 30 °C'de gece boyunca kuluçkalanmasıyla 0.6-0.8'e ulaşır.
          4. 4.000 x'te santrifüjleyerek hücreleri toplayın G 20 dakika boyunca 4 °C'de. Süpernatantı çıkarın ve hücre topaklarını soğuk lizis tamponu 2 (50 mM Tris-Cl, pH 7.80, 100 mM NaCl, 5 mM ditiyotreitol, 1 mM EDTA ve 1 mM PMSF içeren) ile 50 mL'lik bir son hacme yeniden askıya alın tampon.
            NOT: Hücreler -80 °C'de uzun süreli olarak saklanabilir veya protein saflaştırması için hemen kullanılabilir. Hücreleri depolamak için hücre süspansiyonunu 2 x 50 mL tek kullanımlık santrifüj konik tüplerine bölün ve hücre peletlerini protein saflaştırma adımına kadar -80 °C'de tutun. α mutant ve vahşi tip formunun ifadesi2β2NSLB et suyundaki TS kompleksi, litre başına 125-150 mg protein verir. Belirli talepleri karşılamak için protokolü yukarı veya aşağı ölçeklendirmeyi düşünün.
          1. 1/2" Horn probu (veya benzer bir ekipman) ile dijital bir sonifier kullanarak sonikasyon yoluyla hücre peletini bozun. 10 s darbe ve 20 s dinlenme veya tam hücre bozulmasına kadar buzlu su banyosunda %80 genlik görev döngüsünde 20 döngü gerçekleştirin.
          2. Hücre lizatını 30.000 x'de santrifüjleyin G 25 °C'de 30 dakika. Peletin tüpten ayrılmadığından emin olarak süpernatantı aspire edin. Arıtılmış süpernatan fraksiyonu 0.45 μm filtre ile oda sıcaklığında süzün.
          3. Berraklaştırılmış süpernatant fraksiyonunun ilk hacmini değerlendirin. %20 doygunluğa ulaşılana kadar (11.51 g / 100 mL) yavaş yavaş küçük miktarlarda amonyum sülfat ekleyin. Amonyum sülfat fraksiyonasyonunu 25 °C'de gerçekleştirin. Çözeltiyi 10 dakika boyunca hafifçe karıştırın ve kabarcıklardan kaçının.
          4. 30.000 x'te santrifüjleyin G 25 °C'de 10 dakika. %20 süpernatan fraksiyonu temiz bir şişeye aktarın. 20 mL numune tamponu 2'de (50 mM Tris-Cl, pH 7.80, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA ve 2 mM dithiothreitol içeren) %20 pelet fraksiyonunu nazikçe yeniden süspanse edin ve SDS-PAGE jeli çalıştırmak için bir numune hazırlayın. %20 pelet fraksiyonunu atın.
          5. %20 süpernatant fraksiyonunun ilk hacmini değerlendirin. %30 doygunluğa ulaşılana kadar (5.94 g / 100 mL) amonyum sülfat ekleyin, çözeltiyi karıştırın, kabarcıklardan kaçının ve daha önce olduğu gibi santrifüjleyin. %30 süpernatan fraksiyonu temiz bir şişeye aktarın. 20 mL numune tamponu 2'de %30 pelet fraksiyonunu nazikçe yeniden süspanse edin ve SDS-PAGE jelini çalıştırmak için bir numune hazırlayın. %30 pelet fraksiyonunu atın.
          6. %30 süpernatan fraksiyonunun ilk hacmini değerlendirin. %40 doygunluğa ulaşıldığında (6.14 g / 100 mL) amonyum sülfat ekleyin, çözeltiyi karıştırın, kabarcıklardan kaçının ve daha önce olduğu gibi santrifüjleyin. %40 süpernatan fraksiyonu temiz bir şişeye aktarın. 10 mL numune tamponu 2'de %40 pelet fraksiyonunu nazikçe yeniden süspanse edin ve SDS-PAGE jelini çalıştırmak için bir numune hazırlayın. %40 süpernatant fraksiyonu atın.
            NOT: αβ öğesinin kalitesini değerlendirinNS%12'lik bir SDS-PAGE jelinde %30 ve %40'lık süpernatant ve pelet fraksiyonlarının örnekleri kullanılarak TS kompleksi25. Başka bir mutantın αβ olduğunu doğrularsanızNSTS kompleksi %40 süpernatan fraksiyonundadır, %60 doygunluk amonyum sülfat (13.0 g / 100 mL) ile devam edin. Önceden saflaştırılmış α'in önceden saflaştırılmış protein alikotları2β2NSTS kompleksi -80 °C'de uzun süreli olarak saklanabilir veya bir boyut dışlama kromatografi kolonunda (SEC) protein saflaştırması için hemen kullanılabilir.
          7. Protein örneğini 10.000 x'de mikrosantrifüjleyin G, 20 dakika, 4 °C ve süpernatan fraksiyonu bir hızlı proteine ​​bağlı bir HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR kolonuna yükleyin sıvı kromatografisi 0.5 mL dk-1 akış hızında, önceden SEC tamponunda (10 mM Tris-Cl, pH 7.8, 100 mM NaCl, %5 gliserol, 0.1 mM piridoksal fosfat) dengelendi.
            NOT: Büyük miktarlarda kompleksi saflaştırmak için 5 mL numuneyi 20-25 mg mL-1'de HiLoad 26/600 Superdex 200 pg kolonuna 1,5 mL dk -1 akış hızında yükleyin.
          8. Coomassie parlak mavi leke 25 ile boyanmış bir %12 SDS-PAGE jeli üzerinde SEC kolonundan amonyum sülfat fraksiyonasyonu ve tepe fraksiyonları boyunca toplanan numuneleri değerlendirin.
          9. Konsantre vahşi tip veya mutant α2β2NS3.000 x'te döndürülerek 15 mL 100 kDa kesme santrifüjlü filtre ünitesine sahip TS kompleksi G 4 °C'de. Konsantre proteini taze 2,0 mL'lik bir tüpe ve agregaları gidermek için mikrosantrifüje (10.000 x g, 10 dk, 4 °C) aktarın.
          10. Protein konsantrasyonunu 24 belirleyin, 20-25 mg mL -1'de 0,5 mL'lik alikuotlar hazırlayın, etiketleyin, sıvı nitrojen içinde flaş-dondurun ve -80 °C'de saklayın.

          3. α'in vahşi tip ve mutant formu için optimize edilmiş kristalizasyon2β2 NSTS kompleksi

          NOT: α için ilk kristalleşme koşulu2β2 NSTS kompleksi daha önce %12 PEG 8000 ve 2 mM spermin 22 içeren koşullarda rapor edilmiştir.

          1. Daha iyi bir kristalizasyon tekrarlanabilirliği elde etmek için kristalizasyon deneylerinden önce stok çözeltileri hazırlayın. TS ile yapısal çalışmalar yapmak için proteini bienzim kompleksinin metal koordinasyon bölgesinde Na + veya Cs + iyonu ile kristalleştirin.
            1. Suda 200 mM sperminin 5 mL stok solüsyonunu hazırlayın ve 500 µL alikuotu -20 °C'de tutun.
            2. 50 mL stok solüsyonu %30 (w/v) PEG 8000'i suda hazırlayın ve 25 mL'lik alikuotları 50 mL'lik tek kullanımlık santrifüj konik şişelerde 25 °C'de tutun.
            3. Su içinde 25 mL'lik 1 M CsCl stok solüsyonu hazırlayın ve 25 °C'de tutun.
            4. Suda 25 mL 1 M NaCl stok solüsyonu hazırlayın ve 25 °C'de tutun.
            5. 3x 50 mL 1 M bisin stok solüsyonu hazırlayın ve pH 7.6, 7.8 ve 8.0'da tamponlu solüsyonlar elde etmek için CsOH veya NaOH ile titre edin. 25 mL'lik alikotları 4 °C'de tutun.

            4. X-ışını kırınım veri toplama ve α2β2 NSTS karmaşık yapı çözümü

            NOT: X-ışını kırınım veri toplamadan önce, her kristal için önceden kriyoprotektan solüsyonu hazırlayın. Artan konsantrasyonlarda d içeren 3 alikot hazırlamak için özel rezervuar çözeltisini kullanın.çözelti içinde imetil sülfoksit (10, 20 ve %30 v/v) ve spesifik ligand(lar). Dimetil sülfoksitin gliserol, etilen glikol ve PEG 200-300'den daha iyi bir kriyoprotektan olduğu bulundu.

            1. Stereoskopik mikroskop altında bir cryoloop kullanarak büyük bir tek kristal hasat edin.
            2. Çökeltme çözeltisi artı daha yüksek konsantrasyonlarda d içeren her bir kriyoprotektan çözeltisinden 2 μL pipetleyin.imetil sülfoksit ve ligand(lar) yeni bir kapak slaydına yerleştirin.
            3. Sırayla, ıslatın Cher damlada kristal ve kristalin kriyoprotektan solüsyonda 30 saniye dengelenmesine izin verin.
            4. Kriyo korumalı kristalin -173 °C (100 K) sıcaklıkta gaz halinde nitrojen akışı kullanılarak hızlı soğutulması veya diskler içinde uzun süreli depolama için sıvı nitrojene daldırılması.
              NOT: Bir köpük Dewar'ı sıvı nitrojenle doldurun, bir kristal diski önceden soğutun, kristalleri kriyojenik depolama Dewar'da saklayın ve kristalleri kuru bir gönderici kullanarak senkrotrona gönderin.
            5. -173 °C'de X-ışını kırınım veri toplama işlemine devam edin. X-ışını kırınım verilerini kaydedin 0,5-4,0 s maruz kalma süresi ve 0,5<176 salınım kullanarak. Kristali 180-360° döndürün.
            6. Uygun alan grubunda yansıma dosyası oluşturmak için X-ışını kırınım görüntülerini iMosflm 27 ile işleyin. Genellikle, α2β2NSTS kristalleri, C 121 (C2) uzay grubuna aittir.
            7. CCP4 paketinde 29 uygulanan Scala 28 ile yansımaların çoklu gözlemlerini birlikte ölçeklendirin.
            8. Yüksek çözünürlüklü α yapısını çözün2β2NSMolRep 30 ve uygun bir arama modeli kullanılarak moleküler değiştirme yoluyla TS kompleksi. Başarılı bir yapı çözümünden sonra Coot 31'deki modeli ve elektron yoğunluk haritasını inceleyin.
              NOT: Protein Veri Bankasında farklı ligand(lar)a sahip birçok TS kristal yapısı vardır. Daha iyi bir moleküler değiştirme adımı ve daha yeni kristal yapıya uyan daha kısa süre için, ilgilenilen ligand(lar)ı içeren en iyi arama modelini kullanın. CCP4 29, 30 veya Phenix 31'de kristal yapı iyileştirmesi ile devam edin.
            9. Coot 32'yi kullanarak modelde manuel ayarlamalar yapın, ardından Refmac 29, 33 veya phenix.refine 31, 34 ile otomatik olarak iyileştirme yapın. Coot 32 ve otomatik iyileştirmede yinelemeli model oluşturma turlarını çalıştırarak nihai modeli oluşturun ve iyileştirin.
            10. Protein Veri Bankası web sitesinde koordinat ve yapı faktörleri biriktirme ile devam edin.

            Abonelik Gerekli. Lütfen JoVE'u kütüphanecinize önerin.

            Temsili Sonuçlar

            saflaştırılması α- ve β-triptofan sentazın alt birimleri
            NS α-alt birim (αStTS) ve β-alt birimi (βNSTS) Salmonella typhimurium triptofan sentaz, modifiye edilmiş pET SUMO vektöründe alt klonlandı. Şekil 1A His6-SUMO-α'e karşılık gelen iki güçlü bandın temsili SDS-PAGE sonuçlarını gösterirNSTS (şerit αON) ve His6-SUMO-βNSTS (şerit βON) füzyon proteini. Bu çalışmada açıklanan saflaştırma protokolü, her iki alt birimin 2 gün içinde ayrı ayrı saflaştırılmasına izin verdi. İlk gün, her proteini Ni-NTA afinite kromatografisi, amonyum sülfat çökeltmesi, ardından His-SUMO-etiketi bölünmesi, His-SUMO-etiketi izlerinin çıkarılması ve protein konsantrasyonu ile saflaştırmak için kullanıldı. Şekil 1B ve 1C temsili SDS-PAGE sonuçlarını göster α-alt birimi ve β-alt birim saflaştırması, sırasıyla. İkinci gün, konsantre α-alt birim, β-alt birimi ve α2β2 NSTS kompleksi α- ve β-alt birimler, bir boyut dışlama kromatografisi kolonuna yüklendi. Şekil 1D tipik bir elüsyon profilini gösterir αStTS, βNSTS ve α2β2NSBir S-200 HR boyutu hariç tutma sütununda TS kompleksleri. Şekil 1E toplanan tepe fraksiyonlarının temsili bir SDS-PAGE sonucunu gösterir. En saf tepe fraksiyonları toplandı, konsantre edildi ve α2β2 NSProtein kristalizasyon çalışmaları için TS kompleksi kullanıldı.

            Vahşi türün ve mutant α'in saflaştırılması2β2 NSTS kompleksi
            α'in vahşi tipini ve mutant formunu saflaştırmak için başka bir hızlı ve etkili protokol2β2 S. typhimurium triptofan sentaz kompleksi bu çalışmada anlatılmıştır. şekil 2 için kodlayan vahşi tip translasyonel olarak eşleme genini (trpA ve trpB) içeren pEBA-10 yapısının bir temsilini gösterir. α- ve β-alt birimler 22 . α mutant formlarını oluşturmak için iki aşamalı PCR mutagenez protokolü2β2 NSTS kompleksi tasvir edilmiştir Figür 3.

            Mutant α'in kodlama bölgeleri2β2 NSpEBA10'daki TS kompleksi, DNA dizilimi ile doğrulandı ve dönüştürmek için kullanıldı E. koli soy CB149 hücreleri 26. α'in vahşi türü ve mutant formu2β2 NSTS kompleksi aşırı eksprese edildi ve rekombinant proteinler 1-2 gün içinde başarıyla saflaştırıldı. Amonyum sülfat oda sıcaklığında fraksiyonasyon kontaminant proteinlerin çoğunu heterolog ekspresyon sisteminden kolayca çıkardı (Şekil 4A, şeritler 20P, 30P ve 40S). Göreceli elüsyon konumu α olan temsili bir elüsyon profili2β2 NSBir HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR boyut dışlama kromatografisi kolonunda TS (143.06 kDa) kompleksi gösterilmektedir. Şekil 4B. Dışlananların saflığı tepe kesirler havuzlamadan önce SDS-PAGE analizi yapıldı (Şekil 4C).

            Vahşi tip ve mutant α optimizasyonu2β2 triptofan sentaz kompleksi kristalizasyonu
            Yabani tip ve mutant α alikotları2β2 NS15 mg ml-1'de TScomplex, 24 oyuklu oturan damla plakaları oluşturmak için kullanıldı. Tipik olarak, 5 µL protein solüsyonundan ve eşdeğer hacimde rezervuar solüsyonundan oluşan damlacıklar, 500 µL rezervuar solüsyonuna karşı dengelenmiştir (Şekil 5). Yabani türü ve mutant α'i kristalize etmek için sperm gereklidir2β2 NSTS kompleksi 22 . Yabani türü kristalize etmek için son spermin konsantrasyonu 2 mM iken, bu çalışmada mutant kompleksi kristalize etmek için spermin konsantrasyonunun biraz daha yüksek olduğu (4-8 mM) gösterilmiştir.

            Büyük tek kristaller, PEG 8000 (%6-11) ve bisin tampon pH'ı değiştirilerek ince bir kristalizasyon optimizasyonu yoluyla elde edildi. Farklı morfolojilere sahip kristaller 2-5 gün içinde ortaya çıktı ve kristaller iki hafta içinde tam boyuta ulaştı (Şekil 6). X-ışını kırınım verilerinin toplanmasından önce, kristaller kriyoprotektan solüsyona (%30'a kadar dimetil sülfoksit içeren rezervuar tamponu) batırılmıştır. Optimize edilmiş işlem, yakın atomik çözünürlükte X-ışını kırınım ölçümleri için uygun kaliteli kristallerle sonuçlandı.

            X-ışını kırınım veri analizi
            Vahşi türün kristal yapısı α2β2 NSTS kompleksi, bu makalede açıklanan yöntemlerle hazırlandı ve X-ışını kırınım verileri, atomik çözünürlükte toplandı. Kristal, F9 inhibitörü (2-(<[4-(Triflorometoksi)Fenil]Sülfonil>Amino)Etil Dihidrojen Fosfat) ve L-Triptofan içeren kriyokoruyucu solüsyona batırıldı.

            Gelişmiş Işık Kaynağında (Berkeley-CA) SIBYLS senkrotron ışın hattı 12.3.1 üzerinde tam bir X-ışını kırınım veri seti, kristalin 0,5'lik artışlarla 360'176 döndürülmesiyle toplandı. X-ışını kırınım yoğunlukları işlendi ve veri toplama istatistikleri şu şekilde özetlendi: tablo 1. Simetri analizi, kristalin monoklinik uzay grubu C2'ye ait olduğunu gösterir. Birim hücre parametreleri a = 182.55, B = 59.30, C = 67,37Å, α = 90,00, β = 94,82, γ = 90,00°. Matthews katsayısının hesaplanan değeri (Vm = 2.57 Å 3 Da -1 ) bir TS heterodimer molekülünün (αβ NSTS) %52,08 solvent içeriğine sahip kristalin asimetrik biriminde 35,36. Tüm X-ışını verileri, kırınım kalitesini iyileştirmek ve radyasyon bozulmasını azaltmak için düşük sıcaklıklarda (100 K) toplanmıştır. α2β2 NSKompleksteki TS kristal yapısı, vahşi tip αβ kullanılarak moleküler değiştirme yöntemiyle çözüldü. NSTS modeli, α yerinde F9 inhibitörü ve metal koordinasyon bölgesinde sezyum iyonu ile kompleks halinde (PDB ID kodu: 4HT3). Nihai koordinat dosyası ve yapı faktörleri, 5CGQ erişim koduyla PDB'de saklandı (Şekil 7A). Vahşi türün kristal yapısı α2β2 NSα-site enziminde F9 inhibitörü ile TS kompleksi (Şekil 7B), metal koordinasyon bölgesinde sezyum iyonu (Şekil 7C), kofaktör piridoksal 5'39-fosfat βLys87'ye kovalent olarak bağlı (Şekil 7D) ve enzim β-sitesindeki L-triptofan ürünü (Şekil 7E) 1.18 Angstrom çözünürlükte çözüldü. Model 5CGQ, en yüksek çözünürlük α'tir2β2 NSBugüne kadar PDB'de biriken TS kristal yapısı.


            Şekil 1: α- ve β-alt birimlerinin ve α'in saflaştırılması2β2NSTS kompleksi. (A) Rekombinant protein ifade. SUMO-α'in gece ekspresyon profilinin %12 SDS-PAGE jeliNSTS (αON) ve SUMO-βNSTS (βON) 30 °C'de IPTG indüksiyonundan sonra (#945/⓴ IPTG indüksiyonundan önce). (B, C) Ni-NTA afinite kromatografisini takiben amonyum sülfat çökeltmesi (%60 doygunluk), (S) berraklaştırılmış ham ekstrakt (FT1) Ni-NTA kolonu numuneden geçer (W) kolon yıkama numunesi (E) eluat numunesi (60S) ve (60P) ) sırasıyla yüksek hızlı santrifüjlemeden sonra süpernatan ve çökelti fraksiyonları, (D) SUMO-proteaz sindirim ürünü (FT2) Ni-NTA kolonu, etiketsiz α içeren numuneden geçerNSTS veya βNSTS alt birimi. (NS) α elüsyon profiliNSTS alt birimi (28.67 kDa), βNSTS alt birimi (42.86 kDa) ve α2β2 NSBir HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR boyut dışlama kromatografi kolonu ile TS kompleksi (143.06 kDa). Her çalıştırma ayrı ayrı gerçekleştirildi. (E) hariç tutulanların SDS-PAGE jelleri her bir kromatografiden elde edilen tepe fraksiyonları. %15 iken SDS-PAGE jelleri, α'i analiz etmek için hazırlandı.2β2 NSTS kompleksi ve αNSTS alt birimi, β'yı analiz etmek için bir %12 SDS-PAGE jeli hazırlandı.NSTS alt birimi. Şerit MW, kDa cinsinden moleküler ağırlık işaretleri. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.


            Şekil 2: pEBA-10.  yapısının temsili(A)'yi kodlayan vahşi tip translasyonel olarak bağlanan genin (trpA ve trpB) temsili α- ve β- bakteriden triptofan sentazın alt birimleri Salmonella enterika serovar Typhimurium (Yang, Ahmed ve diğerleri, 1996). (B) Vektör bir ampisilin direnci (amp) geni, bir replikasyon orijini (ori), IPTG indükleyicisi yokluğunda bir lac promotörünü daha iyi kapatmak için bir lacI q geni ve LacI-bastırılmış promotörü içerir.. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.


            Şekil 3: İki aşamalı PCR mutagenez protokolünün genel gösterimi. pEBA-10 vektörü, bir DNA şablonu olarak kullanıldı. İlk PCR turu, ilk fragmanı ve TS-Rev-SacI ve MUT-FW (bir mutasyon içeren bir ileri primer) primerlerini oluşturmak için TS-FW-NcoI ve MUT-REV (bir mutasyon içeren bir ters primer) primerleri ile hazırlandı. ikinci parçayı oluşturmak için). Parçalar jel ile saflaştırıldı ve eşmolar olarak birleştirildi, ısıyla denatüre edildi ve tavlandı. Rekombinant iplikler, polimeraz ve deoksiribonükleotitler ile uzatıldı. PCR'nin ikinci turu, TS-FW-NcoI ve TS-Rev-SacI primerleri ile hazırlandı. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.


            Şekil 4: α'in vahşi tip ve mutant formunun saflaştırılması2β2 NSTS kompleksi. (A) Oda sıcaklığında %20, 30, 40 ve %50 amonyum sülfat doygunluğu kullanılarak amonyum sülfat çökeltmesi boyunca toplanan numunelerin %12 SDS-PAGE jeli: (CE) ham özüt (S) ve (P) yüksek- hızlı santrifüj. (B) α'in elüsyon profili2β2 NSBir HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR boyut dışlama kromatografi kolonu ile TS (143.06 kDa) kompleksi. (C) Hariç tutulanların %12 SDS-PAGE jel resmi tepe kesirler. Şerit MW, kDa cinsinden moleküler ağırlık işaretleri (Precision Plus Protein Boyanmamış Standartlar, Bio-Rad). Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.


            Şekil 5: α'in vahşi tip ve mutant formu için kristalizasyon optimizasyonu2β2 NSTS kompleksi. Kristaller, 50 mM CsCl içeren 50 mM Bicine-CsOH tamponunda büyütüldü2. Polietilen glikol 8000 (%6-11) ve sperminin (2-8 mM) konsantrasyonu, X-ışını protein kristalografisi ile yapısal çalışmalar yapmak üzere tek büyük kristal formları elde etmek üzere değiştirildi. (A) Bisin-CsOH, pH 7.6. (B) Bisin-CsOH, pH 7.8. (C) Bisin-CsOH, pH 8.0. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.


            Şekil 6: Vahşi tipteki kristallerin ve α mutant formunun fotomikrografisi2β2 NSTS kompleksi. Kristaller morfolojide farklılık gösterir, ancak C2 uzay grubuna aittirler. Kristaller, iki hafta sonra nihai koşullarda tam boyutlarına ulaştı. Yaklaşık 0,20 x 0,15 x 0,10 mm boyutunda kristaller. (A-D) Yabani tip formun (sütun A) metal koordinasyon bölgesinde sezyum iyonu ile kompleks halindeki PLP holo-kristalleri, mutant form α2β2 βQ114A (sütun B), α2β2 βK167T (C sütunu) ve α2β2 βS377A (sütun D). Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.


            Şekil 7: Kristal yapının genel olarak görselleştirilmesi ve kristal yapı iyileştirmesinden sonra elde edilen elektron yoğunluk haritalarının doğrulanması.(A) vahşi türün kristal yapısı α2β2 NSEnzim yerinde F9 inhibitörü (sarı renkli), metal koordinasyon bölgesinde sezyum iyonu (mavi renkli), kofaktör ile TS kompleksi piridoksal 5'39-fosfat βLys87'ye (yeşil renkli) kovalent bağlı ve 1.18 Angstrom çözünürlükte enzim β-sitesinde (camgöbeği renkli) L-triptofan ürünü. α-alt birimi açık mavi renkteyken, β-alt birimi somon rengindedir. (OLMAK) 1.0 r.m.s.'de şekillendirilmiş elektron yoğunluğu haritaları. seviye etrafında (B) inhibitör F9 (C) sezyum iyonu (NS) piridoksal-5′-fosfat, ve (E) L-Triptofan. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

            Veri toplama ve işleme
            X-ışını kaynağı / Işın hattı ALS Işın Hattı 12.3.1
            Dalga boyu (Å) 10,000
            Çözünürlük (Å) 40.00 - 1.18 (1.24 - 1.18)
            Toplam yansıma sayısı 2151280 (252941)
            Toplam sayı benzersiz yansımalar 231646 (32187)
            İndeksleme, ölçekleme ve birleştirme için alan grubu C 1 2 1
            Hücre boyutları
            a, b, c (Å) 182.55, 59.30, 67.37
            α, β, γ (°) 90.00, 94.82, 90.00
            mozaiklik 0.61
            Matthews cilt VM (Å 3 Da -1 ) 2.57
            Değerler (%) 8.6 (93.0)
            <I/σ(I)> 14.7 (3.0)
            CC1/2 (%) 0.999 (0.778)
            Tamlık (%) 98.6 (94.2)
            çokluk 9.3 (7.9)
            İyileştirme istatistikleri
            Rwork/Rfree (%) 14.04 / 16.05
            RMSD bağ uzunluğu (Å) 0.0120
            RMSD bağ açısı (°) 14,059
            Ramachandran tercih etti 515 (96.44%)
            Ramachandran'a izin verildi 16 (3.00%)
            Ramachandran'a izin verilmedi 3 (0.56%)

            Tablo 1: Veri toplama ve işleme. Parantez içindeki değerler dış kabuk içindir.

            Abonelik Gerekli. Lütfen JoVE'u kütüphanecinize önerin.

            Tartışma

            Mutant formunu α başarıyla tasarladık2β2 βQ114A, α2β2 βK167T ve α2β2 βS377A NSYapı-fonksiyon korelasyon çalışmaları için TS kompleksleri. Başlangıçta, α gerektiren önceki bir saflaştırma protokolü 22 kullanarak mutantları saflaştırmaya çalıştık.2β2 NSSaflaştırma sırasında PEG 8000 ve spermin ile TS kompleks kristalizasyonu. Kristalleşme hızı, mutant forma ve çözeltideki kompleksin konsantrasyonuna bağlı olmasına rağmen, kristallerin büyük bir çözelti hacminde ne zaman ortaya çıktığını tahmin etmek zordur. Kristalizasyon ya uzun periyotlardan sonra (48-96 saat) ya da kristalizasyon başlangıcından 15 sonra ekstra miktarlarda PEG 8000 ilavesi gerekli olduğu için elde edilebilir.

            Ne yazık ki, α mutant biçimleri2β2 NSBu çalışmada sunulan TS kompleksi, protokolün ilk adımları sırasında kristalleşemedikleri ve kristalografik çalışmaları bozdukları için bu protokol kullanılarak başarıyla saflaştırılamadı. Bu nedenle, vahşi tip ve α mutant formunun yüksek verimlerini veren amonyum sülfat fraksiyonasyonu ve boyut dışlama kromatografisini içeren basit ve verimli bir saflaştırma protokolü oluşturduk.2β2 NSTS kompleksi. Bu protokol, önceki protokol (5-7 gün) ile karşılaştırıldığında daha hızlıdır (1-2 gün) ve yeniden üretilebilir, çünkü saflaştırma boyunca kristalleştirme gereksinimleri ve protokol sorun giderme yoktur. Ek olarak, yüksek miktarlarda α-alt birimi, β-alt birimi ve yeniden yapılandırılan α'i saflaştırmak için yeni ifade yapıları ve protokolü oluşturduk.2β2 NSİzolatlardan TS kompleksi.

            Gelecekteki uygulama, fonksiyonel ve yapısal çalışmalar gerçekleştirmek için vahşi tip ve mutant alt birimlerin rekombinasyonunu içerir. Mutant α2β2 βQ114A, α2β2 βK167T ve α2β2 βS377A kompleksi, vahşi tip forma (2 mM) kıyasla daha yüksek konsantrasyonlarda spermin (4-8 mM) içeren koşullarda kristalize oldu. Bu nedenle, çökelticilerin konsantrasyonunu ve tampon pH'ını değiştirerek protein kristallerinin kalitesini iyileştirmek için zaman harcamaya değer. Tek büyük kristal formlar, %6-11 PEG 8,000 içeren bisin tamponlu solüsyonda (pH 7.6-8.0) rastgele büyüdü. Bu çalışmada açıklanan yöntemler, vahşi tipteki kristal yapıları ve α'in mutant formlarını hazırlamak için kullanılacaktır.2β2 indol ve serinin triptofana dönüşümünde rol oynayan farklı ara maddeleri ve geçiş durumlarını taklit eden α- ve β-aktif siteler içindeki farklı ligandlarla kompleks. Bu mutantların kristal yapılarının, L-Triptofan sentezindeki anahtar kalıntıların oynadığı mekanizma ve roller hakkında yeni bilgiler sağlaması bekleniyor.

            Abonelik Gerekli. Lütfen JoVE'u kütüphanecinize önerin.

            Açıklamalar

            Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyleri yoktur ve hiçbir rekabet eden finansal çıkar beyan etmezler.

            Teşekkür

            Bu çalışma ABD Ulusal Sağlık Enstitüsü (GM097569) tarafından desteklenmiştir.



Yorumlar:

  1. Grisham

    Aferin, ne sözler ..., mükemmel bir fikir

  2. Ruodrik

    bunu kesinlikle fark ettin

  3. Worthington

    Hata yapmak. Tartışmayı öneriyorum. Bana PM'de yaz, konuş.

  4. Rowland

    İçinde bir şey de var, harika bir fikir nedir diye düşünüyorum.



Bir mesaj yaz