Bilgi

DsRNA bir hücreye tam olarak nasıl dahil edilebilir?

DsRNA bir hücreye tam olarak nasıl dahil edilebilir?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Sadece virüsler tarafından mı yoksa hücrelere girmesi için plazmit alımı gibi başka yollar var mı?


Viral enfeksiyonların yanı sıra, hücrelerin dsRNA'yı alması için farklı yollar vardır. Hücrelerin içinde bu dsRNA, bu RNA'ları gen aktivitesinin düzenlenmesinde önemli bir rol oynayan küçük enterferans yapan RNA'ya işleyen Dicer tarafından işlenir.

Bu yollar daha çok Drosophila ve C. elegans'ta araştırılmıştır, insanlarda bunlara ilişkin kanıtların nerede mevcut olduğunu belirtiyorum. Alım için farklı olasılıklar şunlardır:

  • Transmembran proteinler yoluyla alım: İçinde C. elegans dsRNA'yı pasif olarak hücrelere taşıyan iki farklı transmembran proteini keşfedilmiştir. Bunlara SID-1 ve SID-2 (sistemik RNA-girişim kusurlu protein) adı verilir, en azından SID-1 için insanlarda da bir homolog bulunur. Bu reseptörler, sistemik (kendi organizması tarafından üretilen) dsRNA'nın alımı için önemlidir. Ayrıntılar için referans 1-3'e bakın.
  • Endositoz yoluyla alım: Drosophila hücrelerinde aktif taşıma, çöpçü reseptörler SR-CI ve Eater aracılığıyla gerçekleşir. dsRNA'yı bağlarlar ve daha sonra içselleştirilirler. Bu genlerin yıkılması, dsRNA'nın içe aktarılmasını engelledi ve genlerin endositoz aracılı yıkılmasını engelledi. C. elegans'taki ortolog genlerin yıkılması benzer sonuçlara yol açtığından, bu süreç evrimsel olarak korunmuş görünüyor. Bu mekanizma, çevresel dsRNA'nın alımı için daha önemli görünmektedir. Daha fazla ayrıntı için referans 4 ve 5'e bakın.
  • Fagositoz yoluyla alım: En azından drosophila için endositozdan bağımsız fagositoz aracılı bir alım mekanizmasına dair kanıtlar vardır. Ayrıntılar için referans 6'ya bakın.

Referanslar

  1. SID-1, dsRNA seçici bir dsRNA kapılı kanaldır.
  2. SID-2 tarafından hücre dışı çift sarmallı RNA alımı
  3. RNA enterferansı: bir memeli SID-1 homologu, insan hücrelerinde siRNA alımını ve gen susturma etkinliğini arttırır.
  4. Endositik yol, RNAi susturmasını indüklemek için dsRNA'nın hücre girişine aracılık eder.
  5. Çift sarmallı RNA, Drosophila S2 Hücrelerinde Çöpçü Reseptör Aracılı Endositoz Tarafından İçselleştirilir
  6. RNAi'de çift sarmallı RNA alımı için fagositik bir yol

Gen susturucu RNA'nın doğrudan kalıtımını gözlemleyen ilk biyologlar

Bu yuvarlak solucan görüntüsünde (Caenorhabditis elegans), yakın zamanda döllenmiş bir yumurta hücresi (ok), belirli genleri susturma yeteneğine sahip çift sarmallı RNA (dsRNA, küçük eflatun noktalar) parçacıkları içerir. Maryland Üniversitesi'nde yapılan yeni bir araştırma, ilk kez, bu dsRNA moleküllerinin doğrudan ana solucanın dolaşım sisteminden yumurtaya geçtiğini ve genetik olmayan kalıtım için olası bir mekanizmayı ortaya çıkardığını gösteriyor. Kredi bilgileri: Antony Jose

Genetik kalıtımın temelleri iyi bilinmektedir: ebeveynlerin her biri, üreme sırasında DNA'larının yarısını yavrularına aktarır. Bu genetik tarifin, yeni bir organizmanın vücudunu inşa etmek ve işletmek için ihtiyaç duyduğu tüm bilgileri içerdiği düşünülmektedir.

Ancak son araştırmalar, bazı türlerde ebeveynlerin yaşam deneyimlerinin yavrularını değiştirebileceğini göstermiştir. Yetersiz beslenmek, toksinlere maruz kalmak veya hastalığa yakalanmak ebeveynin gen ekspresyon modellerinde değişikliklere neden olabilir ve bazı durumlarda bu değişiklikler bir sonraki nesle aktarılabilir. Ancak, genetik olmayan kalıtım olarak bilinen bu etkiye neden olan mekanizmalar bir sırdır.

Maryland Üniversitesi'nden yapılan yeni araştırma, şaşırtıcı bir olası açıklama sunuyor. Gelişimsel biyologlar, ilk kez, hücreler içindeki genleri susturabilen DNA'nın yakın bir kuzeni olan çift sarmallı RNA (dsRNA) moleküllerinin yuvarlak solucanda doğrudan ebeveynden yavruya geçtiğini gözlemlediler. Caenorhabditis elegans. Daha da önemlisi, dsRNA moleküllerinin ebeveynlerde yarattığı gen susturma etkisi onların yavrularında da devam etti.

Çalışma, 17 Ekim 2016'da çevrimiçi erken baskısında yayınlandı. Ulusal Bilimler Akademisi Bildiriler Kitabı, genetik olmayan kalıtım mekanizmalarının herkesin şüphelendiğinden daha basit olabileceğini öne sürüyor.

UMD Hücre Biyolojisi ve Moleküler Genetik Bölümü'nde yardımcı doçent ve çalışmanın kıdemli yazarı Antony Jose, "Bir dsRNA molekülünün bir nesilden diğerine geçtiğini ilk kez görüyoruz" dedi. "Varsayım, dsRNA'nın ebeveynin genetik materyalini değiştirdiği ve bu değiştirilmiş genetik materyalin bir sonraki nesle aktarıldığıydı. Ancak gözlemlerimiz, RNA'nın orta adamı kesip attığını gösteriyor."

Jose ve ekibi, yüksek lisans öğrencisi ve başyazar Julia Marré ve eski araştırma teknisyeni Edward Traver dahil, floresan etiketle işaretlenmiş dsRNA'yı kan dolaşımı sistemine tanıttı. C. elegans solucanlar. Daha sonra bu floresan RNA moleküllerinin ebeveynin dolaşım sisteminden fiziksel olarak döllenmeyi bekleyen bir yumurta hücresine geçişini izlediler.

Maryland Üniversitesi'nde çekilen bu mikroskobik görüntü dizisinde, yuvarlak solucandan olgunlaşmamış bir yumurta hücresi Caenorhabditis elegans gübrelemeye hazırlanır. Yumurta, yeni bir solucan yaratmak için gereken DNA'nın yarısını zaten içeriyor. Ancak yumurta, ebeveyninden besinleri alırken, burada küçük macenta noktaları olarak görülen çift sarmallı RNA parçacıklarını da alır. Bu, bilim adamlarının ilk kez doğrudan çift sarmallı RNA parçacıklarının yeni bir nesle aktarıldığını gözlemlediklerini ve genetik olmayan kalıtımla ilgili yeni ayrıntıları ortaya çıkardıklarını işaret ediyor. Kredi: Antony Jose / Maryland Üniversitesi Bilgisayar, Matematik ve Doğa Bilimleri Koleji

Şaşırtıcı bir şekilde, bazı dsRNA molekülleri ebeveyndeki genleri susturamadı çünkü dsRNA dizisi ebeveynin genlerinden hiçbiriyle eşleşmedi. Ancak, yeni solucan diğer ebeveyninden eşleşen genin bir kopyasını aldığında, dsRNA molekülleri yavrulardaki genleri susturdu. Bu, bazı durumlarda dsRNA tarafından gen susturulmasının tüm bir nesli atlayabileceğini düşündürmektedir.

Jose, "dsRNA'nın nesiller arası sınırları aştığını görmemiz şok edici. Sonuçlarımız, bir nesildeki çevrenin bir sonraki nesli nasıl etkileyebileceğine dair somut bir mekanizma sağlıyor" dedi. "Fakat bir ebeveynin, sahip olmadığı bir geni susturmak için bilgiyi iletebildiğini görmek iki kat şaşırtıcı."

Jose ve meslektaşları, dsRNA'nın nesiller arası bilgi aktarımında bu kadar doğrudan bir rol oynamasını beklemiyorlardı. Jose, dsRNA'nın birçok virüsün yaşam döngüsüne etki ettiği için, canlı bir hücrenin doğal savunmasının dsRNA'nın bir sonraki nesli istila etmesini engelleyeceğini varsaymanın mantıklı olduğunu açıkladı.

Jose, "Bu çok şaşırtıcı. Gelecek neslin korunacağını düşünebiliriz, ancak tüm bu dsRNA moleküllerinin bir sonraki nesle atıldığını görüyoruz," diye ekledi. "Yumurta hücreleri, döllenmeye hazırlanırken besinleri emmek için aynı mekanizmayı kullanır. Gelecek nesil sadece beslenmekle kalmıyor, aynı zamanda bilgi de alıyor."

Jose ve meslektaşları, dsRNA'nın genleri birden çok nesil boyunca susturduğu kesin mekanizmalar hakkında daha fazla şey öğrenmeyi umuyor.

"İnsanlarda da benzer şeylerin olabileceğine dair ipuçları var. RNA'nın insan kan dolaşımında var olduğunu biliyoruz. Ancak RNA moleküllerinin nereden geldiğini, nereye gittiklerini veya tam olarak ne yaptıklarını bilmiyoruz. "dedi José. "Çalışmamız heyecan verici bir olasılığı ortaya koyuyor - bunlar ebeveynlerden çocuklarına mesajlar olabilir."


Doğal olarak oluşan siRNA'lar, iki sarkan nükleotit ile fosforile 5' uçları ve hidroksile 3' uçları olan kısa (genellikle 20 ila 24 bp) çift sarmallı RNA (dsRNA) olan iyi tanımlanmış bir yapıya sahiptir. Dicer enzimi, uzun dsRNA'lardan ve küçük firkete RNA'larından siRNA'ların üretimini katalize eder. [2] siRNA'lar ayrıca hücrelere transfeksiyon yoluyla da dahil edilebilir. Prensipte herhangi bir gen, tamamlayıcı bir diziye sahip sentetik bir siRNA tarafından yıkılabileceğinden, siRNA'lar, gen fonksiyonunun doğrulanması ve genom sonrası çağda ilaç hedeflemesi için önemli bir araçtır.

1998'de Washington DC'deki Carnegie Bilim Enstitüsü'nden Andrew Fire ve Worcester'daki Massachusetts Üniversitesi'nden Craig Mello, nematoddaki gen ekspresyonu üzerinde çalışırken RNAi mekanizmasını keşfettiler, Caenorhabditis elegans. [3] 2006'da RNAi ile yaptıkları araştırma için Nobel ödülünü kazandılar. siRNA'lar ve transkripsiyon sonrası gen susturmadaki (PTGS) rolleri, David Baulcombe'un grubu tarafından Norwich, İngiltere'deki Sainsbury Laboratuvarı'nda bitkilerde keşfedildi ve rapor edildi. Bilim [4] Thomas Tuschl ve meslektaşları kısa süre sonra Doğa sentetik siRNA'ların memeli hücrelerinde RNAi'yi indükleyebileceğini. [5] 2001 yılında, kimyasal olarak sentezlenmiş siRNA'nın memeli hücrelerine eklenmesiyle belirli bir genin ifadesi başarıyla susturuldu (Tuschl ve diğerleri). Bu keşifler, biyomedikal araştırma ve ilaç geliştirme için RNAi'den yararlanmaya olan ilginin artmasına neden oldu. Hem organik (karbon bazlı) hem de inorganik (karbon bazlı olmayan) nanopartiküller ile siRNA terapilerinde önemli gelişmeler sağlandı ve bu nanopartiküller, beyne ilaç vermede başarılı oldu ve insan deneklere terapötikler iletmek için umut verici yöntemler sunuyor. Bununla birlikte, siRNA'nın insan uygulamaları, başarısı için önemli sınırlamalara sahiptir. Bunlardan biri hedef dışı olmak. Bu tedavilerin doğuştan gelen bağışıklığı tetikleme olasılığı da vardır. [3] Hayvan modelleri, insanlarda bu tepkinin kapsamını doğru bir şekilde temsil etmede başarılı olmamıştır. Bu nedenle, siRNA terapilerinin etkilerini incelemek zor olmuştur.

Son yıllarda siRNA terapileri onaylandı ve bu zorlukların üstesinden gelmek için yeni yöntemler oluşturuldu. Ticari kullanım için onaylanmış tedaviler vardır ve birkaçı şu anda onay almayı bekleyen boru hattındadır. [ kaynak belirtilmeli ] [6]

Doğal siRNA'nın translasyonun baskılanması yoluyla gen susturulmasına neden olduğu mekanizma şu şekilde gerçekleşir:

  1. Uzun dsRNA (saç tokası, tamamlayıcı RNA'lar ve RNA'ya bağlı RNA polimerazlardan gelebilir), Dicer adı verilen bir endo-ribonükleaz tarafından parçalanır. Dicer, kısa enterferans yapan RNA veya siRNA oluşturmak için uzun dsRNA'yı keser.
  2. siRNA hücreye girdiğinde, RISC'yi oluşturmak için diğer proteinlere dahil olur.
  3. siRNA, RISC kompleksinin bir parçası olduğunda, siRNA, tek sarmallı siRNA'yı oluşturmak üzere çözülür.
  4. 5' ucundaki baz eşleşmesi nedeniyle termodinamik olarak daha az kararlı olan iplik, RISC kompleksinin bir parçası olarak kalacak şekilde seçilmiştir.
  5. RISC kompleksinin bir parçası olan tek sarmallı siRNA artık tamamlayıcı bir mRNA tarayabilir ve bulabilir.
  6. Tek sarmallı siRNA (RISC kompleksinin bir parçası) hedef mRNA'sına bağlandığında, mRNA bölünmesini indükler.
  7. mRNA şimdi kesilir ve hücre tarafından anormal olarak tanınır. Bu, mRNA'nın bozulmasına ve dolayısıyla mRNA'nın amino asitlere ve ardından proteinlere çevrilmesine neden olmaz. Böylece o mRNA'yı kodlayan gen susturulur.

siRNA da miRNA'ya benzer, ancak miRNA'lar daha kısa stemloop RNA ürünlerinden türetilir, tipik olarak genleri translasyonu baskılayarak susturur ve daha geniş bir etki spesifikliğine sahipken, siRNA'lar tipik olarak translasyondan önce mRNA'yı parçalayarak çalışır ve %100 tamamlayıcılığa sahiptir, bu nedenle çok sıkı hedef özgüllüğü. [7]

Eksojen siRNA'nın transfeksiyonu ile gen yıkımı genellikle yetersizdir çünkü etki özellikle hızlı bölünen hücrelerde sadece geçicidir. Bu, siRNA için bir ifade vektörü yaratılarak üstesinden gelinebilir. siRNA dizisi, iki iplik arasında kısa bir döngü oluşturmak için değiştirilir. Ortaya çıkan transkript, Dicer tarafından her zamanki gibi işlevsel bir siRNA'ya işlenebilen kısa bir firkete RNA'sıdır (shRNA). [8] Tipik transkripsiyon kasetleri, küçük nükleer RNA'ların (snRNA'lar) transkripsiyonunu yönlendirmek için bir RNA polimeraz III promotörü (örn., U6 veya H1) kullanır (U6, gen eklemede yer alır H1, insan RNase P'nin RNase bileşenidir). Ortaya çıkan siRNA transkriptinin daha sonra Dicer tarafından işlendiği teorize edilir.

Gen yıkım verimliliği, hücre sıkma kullanılarak da geliştirilebilir. [9]

RNAi'deki siRNA'ların aktivitesi, büyük ölçüde RNA kaynaklı susturma kompleksine (RISC) bağlanma yeteneğine bağlıdır. Dubleks siRNA'nın RISC'ye bağlanmasını, sens zincirinin endonükleazlarla çözülmesi ve bölünmesi takip eder. Kalan anti-sens iplik-RISC kompleksi daha sonra transkripsiyonel susturmayı başlatmak için hedef mRNA'lara bağlanabilir. [10]

dsRNA'nın, "küçük RNA kaynaklı gen aktivasyonu" veya RNAa olarak adlandırılan bir mekanizma olan gen ekspresyonunu da aktive edebildiği bulunmuştur. Gen promotörlerini hedefleyen dsRNA'ların, ilişkili genlerin güçlü transkripsiyonel aktivasyonunu indüklediği gösterilmiştir. RNAa, "küçük aktive edici RNA'lar" (saRNA'lar) olarak adlandırılan sentetik dsRNA'lar kullanılarak insan hücrelerinde gösterildi. Şu anda RNAa'nın diğer organizmalarda korunup korunmadığı bilinmemektedir. [11]

siRNA ile indüklenen transkripsiyonel gen susturma, RNA ile indüklenen susturma kompleksinin (RISC) montajı ile başlar. Kompleks, hedef genleri kodlayan mRNA moleküllerini parçalayarak belirli gen ekspresyonunu susturur. İşlemi başlatmak için, iki siRNA dizisinden biri olan kılavuz dizi (anti-sens dizisi) RISC'ye yüklenirken diğer dizi, yolcu dizisi (duyu dizisi) bozulur. Kılavuz ipliğin RISC'ye yüklenmesinden belirli Dicer enzimleri sorumlu olabilir. [12] Ardından, siRNA, RISC'yi mRNA molekülleri üzerindeki mükemmel tamamlayıcı diziyi tarar ve ona yönlendirir. [13] mRNA moleküllerinin bölünmesinin, RISC'nin Argonaute proteinlerinin Piwi alanı tarafından katalize edildiği düşünülmektedir. mRNA molekülü daha sonra, 5' ucundan sayılarak siRNA kalıntıları 10 ve 11 ile eşleştirilmiş hedef nükleotitler arasındaki fosfodiester bağı kesilerek kesin olarak kesilir. [14] Bu bölünme, hücresel eksonükleazlar tarafından daha da parçalanan mRNA fragmanları ile sonuçlanır. 5' fragmanı 3' ucundan eksozom ile indirgenirken 3' fragmanı 5' ucundan 5' -3' eksoribonükleaz 1(XRN1) ile bozulur. [15] Bölünmeden sonra hedef mRNA zincirinin RISC'den ayrılması, daha fazla mRNA'nın susturulmasına izin verir. Bu ayrışma sürecinin, ATP hidrolizi tarafından yönlendirilen dış faktörler tarafından desteklenmesi muhtemeldir. [14]

Bazen hedef mRNA molekülünün bölünmesi gerçekleşmez. Bazı durumlarda, fosfodiester omurgasının endonükleolitik bölünmesi, siRNA ve hedef mRNA'nın bölünme bölgesi yakınındaki uyumsuzlukları tarafından baskılanabilir. Diğer zamanlarda, RISC'nin Argonaute proteinleri, hedef mRNA ve siRNA mükemmel bir şekilde eşlendiğinde bile endonükleaz aktivitesinden yoksundur. [14] Bu gibi durumlarda, gen ekspresyonu bunun yerine miRNA kaynaklı bir mekanizma tarafından susturulacaktır. [13]

Piwi etkileşimli RNA'lar, transpozonların susturulmasından sorumludur ve siRNA'lar değildir. [16]

RNAi bir dizi başka yolla kesiştiği için, ara sıra bir siRNA'nın deneysel olarak eklenmesiyle spesifik olmayan etkilerin tetiklenmesi şaşırtıcı değildir. [17] [18] Bir memeli hücresi, bir siRNA gibi çift sarmallı bir RNA ile karşılaştığında, onu viral bir yan ürün olarak karıştırabilir ve bir bağışıklık tepkisi oluşturabilir. Ayrıca, yapısal olarak ilişkili mikroRNA'lar, gen ekspresyonunu büyük ölçüde bir hedef mRNA ile tamamlanmamış tamamlayıcılık baz çifti etkileşimleri yoluyla modüle ettiğinden, bir siRNA'nın eklenmesi, istenmeyen hedef dışı bırakmaya neden olabilir. siRNA'nın kimyasal modifikasyonları termodinamik özellikleri değiştirebilir ve bu da tek nükleotid özgüllüğünün kaybıyla sonuçlanır. [19]

Doğal bağışıklık Düzenle

Çok fazla siRNA'nın dahil edilmesi, doğuştan gelen bağışıklık tepkilerinin aktivasyonu nedeniyle spesifik olmayan olaylara neden olabilir. [20] Bugüne kadarki çoğu kanıt, retinoik asitle indüklenebilir gen I (RIG-I) de dahil olabilse de, bunun muhtemelen dsRNA sensörü PKR'nin aktivasyonundan kaynaklandığını düşündürmektedir. [21] Toll benzeri reseptör 7 (TLR7) yoluyla sitokinlerin uyarılması da tarif edilmiştir. siRNA'nın kimyasal modifikasyonu, gen fonksiyonu ve terapötik uygulamalar için doğuştan gelen bağışıklık tepkisinin aktivasyonunu azaltmak için kullanılır. Spesifik olmayan etkileri azaltmanın umut verici bir yöntemi, siRNA'yı bir mikroRNA'ya dönüştürmektir. [22] MikroRNA'lar doğal olarak oluşur ve bu endojen yoldan yararlanarak, elde edilen siRNA'ların nispeten düşük konsantrasyonlarında benzer gen yıkımını elde etmek mümkün olmalıdır. Bu, spesifik olmayan etkileri en aza indirmelidir.

Hedefleme Dışı Düzenleme

Hedef dışı bırakma, bir gen yıkım aracı olarak siRNA'ların kullanımına yönelik başka bir zorluktur. [18] Burada, eksik tamamlayıcılığa sahip genler, siRNA tarafından yanlışlıkla aşağı regüle edilir (aslında, siRNA bir miRNA gibi davranır), bu da veri yorumlamada ve potansiyel toksisitede sorunlara yol açar. Ancak bu, uygun kontrol deneyleri tasarlanarak kısmen ele alınabilir ve hedef dışı siRNA'lar üretmek için şu anda siRNA tasarım algoritmaları geliştirilmektedir. Genom çapında ekspresyon analizi, örneğin mikroarray teknolojisi ile daha sonra bunu doğrulamak ve algoritmaları daha da iyileştirmek için kullanılabilir. Dr. Khvorova'nın laboratuvarından çıkan 2006 tarihli bir makale, hedef dışı genlerdeki 3'UTR bölgeleriyle eşleşen siRNA'da 2. pozisyondan itibaren 6- veya 7-baz çifti uzunluğundaki uzantıları içerir. [23]

Adaptif bağışıklık tepkileri Düzenle

Düz RNA'lar zayıf immünojenler olabilir, ancak RNA-protein komplekslerine karşı antikorlar kolayca oluşturulabilir. Birçok otoimmün hastalık bu tip antikorları görür. Henüz proteinlere bağlı siRNA'ya karşı antikor raporları bulunmamaktadır. siRNA teslimi için bazı yöntemler, polietilen glikol (PEG) ile oligonükleotide birleşir ve atılımı azaltır ve dolaşımdaki yarı ömrü iyileştirir. Ancak son zamanlarda faktör IX'a karşı PEGillenmiş RNA aptamerinin büyük bir Faz III denemesi, RNA'nın PEG kısmına karşı şiddetli bir anafilaktik reaksiyon nedeniyle Regado Biosciences tarafından durdurulmak zorunda kaldı. Bu reaksiyon, bazı durumlarda ölüme yol açtı ve PEGillenmiş oligonükleotitler söz konusu olduğunda siRNA teslimi hakkında önemli endişeler doğurdu. [24]

RNAi makinelerinin doygunluğu

siRNA'ların hücrelere transfeksiyonu tipik olarak birçok genin ekspresyonunu düşürür, ancak genlerin yukarı regülasyonu da gözlenir. Gen ekspresyonunun yukarı regülasyonu, kısmen endojen miRNA'ların öngörülen gen hedefleri ile açıklanabilir. 150'den fazla siRNA transfeksiyon deneyinin hesaplamalı analizleri, eksojen siRNA'ların endojen RNAi mekanizmasını doyurabildiği ve endojen miRNA tarafından düzenlenen genlerin baskılanmasıyla sonuçlandığı bir modeli destekler. [25] Böylece, siRNA'lar istenmeyen hedef dışı etkiler, yani.siRNA ve hedef arasındaki kısmi bir dizi eşleşmesi yoluyla mRNA'ların istenmeyen aşağı regülasyonu, RNAi mekanizmasının doygunluğu, miRNA tarafından düzenlenen genlerin derepresyonunu içeren ve veri yorumlama ve potansiyel toksisitede benzer sorunlara neden olan başka bir spesifik olmayan etkidir. [26]

siRNA'lar, geliştirilmiş aktivite, artan serum stabilitesi, daha az hedef dışı ve azalmış immünolojik aktivasyon gibi terapötik özelliklerini geliştirmek için kimyasal olarak modifiye edilmiştir. Genellikle siRNA, kandaki bozulmayı önlemek için bir nanolipid partikülü içinde kapsüllenmiştir. Tüm bu tür kimyasal modifikasyonların ayrıntılı bir veri tabanı, bilimsel literatürde manuel olarak siRNAmod olarak küratörlüğünü yapmaktadır. [27] siRNA'nın kimyasal modifikasyonu, istemeden tek nükleotid özgüllüğünün kaybına da neden olabilir. [28]

Özünde, ilgili herhangi bir geni yıkma yeteneği göz önüne alındığında, siRNA'lar aracılığıyla RNAi, hem temel [29] hem de uygulamalı biyolojide büyük ilgi yarattı.

siRNA ve RNAi bazlı terapötikler için en büyük zorluklardan biri hücre içi dağıtımdır. [30] siRNA ayrıca zayıf stabiliteye ve farmakokinetik davranışa sahiptir. [31] siRNA'nın nanopartiküller yoluyla teslimi umut vericidir. [30] in vivo siRNA oligoları, plazma ve doku endonükleazları ve eksonükleazları [32] tarafından bozunmaya karşı hassastır ve insan gözü gibi lokalize dağıtım bölgelerinde sadece hafif etkinlik göstermiştir. [33] Saf DNA'nın hedef organizmalara iletilmesi zordur çünkü büyük boyutu ve yapısı zarlar arasında kolayca yayılmasını engeller. [30] siRNA oligoları, 21-23 oligolarının küçük boyutları nedeniyle bu sorunu ortadan kaldırır. [34] Bu, nanovektörler adı verilen nano ölçekli dağıtım araçları aracılığıyla teslimata izin verir. [33]

siRNA iletimi için iyi bir nanovektör, siRNA'yı bozulmadan korumalı, hedef organdaki siRNA'yı zenginleştirmeli ve siRNA'nın hücresel alımını kolaylaştırmalıdır. [32] SiRNA nanovektörlerinin üç ana grubu şunlardır: lipid bazlı, lipid olmayan organik bazlı ve inorganik. [32] Lipid bazlı nanovektörler, siRNA'yı katı tümörlere ulaştırmak için mükemmeldir, [32] ancak diğer kanserler, siklodekstrin bazlı nanopartiküller gibi farklı lipid bazlı olmayan organik nanovektörler gerektirebilir. [32] [35]

Lipid bazlı nanopartiküller yoluyla iletilen siRNA'ların merkezi sinir sistemi (CNS) bozuklukları için terapötik potansiyele sahip olduğu gösterilmiştir. [36] Merkezi sinir bozuklukları nadir değildir, ancak kan beyin bariyeri (BBB) ​​sıklıkla potansiyel terapötiklerin beyne erişimini engeller. [36] BBB yüzeyindeki akış proteinlerini hedefleyen ve susturan siRNA'ların, BBB geçirgenliğinde bir artış yarattığı gösterilmiştir. [36] Lipid bazlı nanopartiküller yoluyla iletilen siRNA, BBB'yi tamamen geçebilir. [36]

siRNA iletiminde büyük bir zorluk, hedef dışı kalma sorunudur. [30] [33] Genler her iki yönde de okunduğundan, amaçlanan antisens siRNA zinciri okunsa ve hedef mRNA'yı devre dışı bıraksa bile, sens siRNA zincirinin başka bir fonksiyonda yer alan başka bir proteini hedefleyebilme olasılığı vardır. [37]

İlk iki terapötik RNAi çalışmasının (yaşa bağlı maküler dejenerasyon, diğer adıyla AMD için belirtilen) Faz I sonuçları, 2005'in sonunda siRNA'ların iyi tolere edildiğini ve uygun farmakokinetik özelliklere sahip olduğunu bildirdi. [38]

Bir faz 1 klinik denemede, karaciğere metastaz yapmış ileri kanserli 41 hastaya, lipid nanopartikülleri aracılığıyla verilen RNAi uygulandı. RNAi, kanser hücrelerinin büyümesinde anahtar proteinleri kodlayan iki geni, vasküler endotelyal büyüme faktörünü (VEGF) ve kinesin iğsi proteinini (KSP) hedef aldı. Sonuçlar, kanserin altı ay sonra stabilize olması veya bazı hastalarda metastazın gerilemesi ile klinik faydalar gösterdi. Hastalardan alınan biyopsi örneklerinin farmakodinamik analizi, örneklerde RNAi yapılarının varlığını ortaya çıkararak moleküllerin amaçlanan hedefe ulaştığını kanıtladı. [39] [40]

Kavram kanıtı denemeleri, Ebola hedefli siRNA'ların insanlarda maruziyet sonrası profilaksi olarak etkili olabileceğini ve insan olmayan primatların %100'ünün en ölümcül suş olan Zaire Ebolavirüs'ün ölümcül dozundan sağ çıktığını göstermiştir. [41]

siRNA'nın hücre içi olarak iletilmesi bir zorluk olmaya devam ediyor. Verimlilik ve toksisite açısından farklılık gösteren siRNA için üç ana dağıtım tekniği vardır.

Transfeksiyon Düzenle

Bu teknikte siRNA ilk olarak hedef gene karşı tasarlanmalıdır. siRNA, gene karşı yapılandırıldıktan sonra, bir transfeksiyon protokolü aracılığıyla etkin bir şekilde iletilmelidir. Teslimat genellikle katyonik lipozomlar, polimer nanopartiküller ve lipit konjugasyonu ile yapılır. [42] Bu yöntem avantajlıdır çünkü çoğu hücre tipine siRNA iletebilir, yüksek verimliliğe ve tekrarlanabilirliğe sahiptir ve ticari olarak sunulur. siRNA'nın transfeksiyonu için en yaygın ticari reaktifler Lipofectamine ve Neon Transfection'dır. Ancak tüm hücre tipleri ile uyumlu değildir ve in vivo etkinliği düşüktür. [43] [44]

Elektroporasyon Düzenle

Elektrik darbeleri ayrıca hücre içi siRNA'yı hücrelere iletmek için kullanılır. Hücre zarı, bir elektrik alanına duyarlı hale getiren fosfolipidlerden yapılmıştır. Hızlı ama güçlü elektrik darbeleri başlatıldığında, lipid molekülleri ısınma nedeniyle termal faz geçişlerine maruz kalırken kendilerini yeniden yönlendirir. Bu, lipit çift katmanlı hücre zarında hidrofilik gözenekler ve lokal pertürbasyonların oluşmasıyla sonuçlanır, ayrıca geçici bir yarı geçirgenlik kaybına neden olur. Bu, iyonlar ve metabolitler gibi birçok hücre içi içeriğin yanı sıra ilaçların, moleküler probların ve nükleik asitlerin aynı anda alınmasına izin verir. Transfekte edilmesi zor hücreler için elektroporasyon avantajlıdır, ancak bu teknikte hücre ölümü daha olasıdır. [45]

Bu yöntem, VEGF'yi hedefleyen siRNA'yı çıplak farelerde ksenograflı tümörlere vermek için kullanılmıştır, bu da tümör büyümesinin önemli bir şekilde bastırılmasıyla sonuçlanmıştır. [46]

Viral aracılı dağıtım Düzenle

Transfekte edilmiş tasarlanmış siRNA'nın gen susturma etkileri genellikle geçicidir, ancak bu zorluğun üstesinden bir RNAi yaklaşımı ile gelinebilir. Bu siRNA'nın DNA şablonlarından iletilmesi, retrovirüs, adeno-ilişkili virüs, adenovirüs ve lentivirüse dayalı birkaç rekombinant viral vektör aracılığıyla yapılabilir. [47] Sonuncusu, siRNA'yı hedef hücrelere kararlı bir şekilde ileten en etkili virüstür, çünkü bölünmeyen hücreleri iletebildiği gibi doğrudan çekirdeği de hedefleyebilir. [48] ​​Bu spesifik viral vektörler, hücrelere transfeksiyon için uygun olmayan siRNA'yı etkin bir şekilde kolaylaştırmak için sentezlenmiştir. Diğer bir yön, bazı durumlarda sentetik viral vektörlerin, siRNA'yı, siRNA'nın stabil ekspresyonuna ve uzun vadeli gen yıkımına izin veren hücre genomuna entegre edebilmesidir. Bu teknik avantajlıdır çünkü in vivo ve transfekte edilmesi zor hücreler için etkilidir. Bununla birlikte, bazı hücre tiplerinde mutajenik ve immünojenik etkilere yol açan antiviral tepkileri tetikleyebilmesi nedeniyle sorunlar ortaya çıkmaktadır.

Bu yöntemin Huntington hastalığının tedavisi için merkezi sinir sisteminin gen susturulmasında potansiyel kullanımı vardır. [49]

1993 yılında RNAi mekanizmasının keşfedilmesinden on yıl sonra, ilaç sektörü siRNA tedavisinin araştırma ve geliştirilmesine yoğun bir şekilde yatırım yaptı. Bu tedavinin küçük moleküller ve antikorlara göre birçok avantajı vardır. Üç ayda bir veya altı ayda bir uygulanabilir. Diğer bir avantaj, bir proteinin spesifik konformasyonunu tanıması gereken küçük molekül ve monoklonal antikorların aksine, siRNA'nın mRNA ile Watson-Crick baz eşleşmesi ile işlev görmesidir. Bu nedenle, yüksek afinite ve özgüllük ile tedavi edilmesi gereken herhangi bir hedef molekül, eğer doğru nükleotid dizisi mevcutsa seçilebilir. [31] Araştırmacıların üstesinden gelmesi gereken en büyük zorluklardan biri, terapilerin vücuda gireceği bir dağıtım sisteminin belirlenmesi ve kurulmasıydı. Ve bağışıklık sistemi sıklıkla RNAi terapilerini, bir bağışıklık tepkisini tetikleyebilen enfeksiyöz ajanların kalıntıları olarak algılar. [3] Hayvan modelleri, insanlarda görülen bağışıklık tepkisinin derecesini doğru bir şekilde temsil etmiyordu ve tedavide yatırımcıların RNAi'den vazgeçtiği vaadine rağmen. [3]

Ancak, insanlar için RNAi tedavisinin geliştirilmesine devam eden birkaç şirket vardı. Alnylam Pharmaceuticals, Sirna Therapeutics ve Dicerna Pharmaceuticals, pazara RNAi terapileri getirmek için çalışan şirketlerden birkaçıdır. Kan dolaşımında uygulanan siRNA tedavilerinin neredeyse tamamının karaciğerde biriktiği öğrenildi. Bu nedenle erken ilaç hedeflerinin çoğu karaciğeri etkileyen hastalıklardı. Tekrarlanan geliştirme çalışmaları, bağışıklık tepkisini azaltmak için RNA molekülünün kimyasal bileşiminin iyileştirilmesine de ışık tuttu ve ardından çok az yan etkiye neden oldu. [50] Aşağıda, onaylanmış terapiler veya sıradaki terapilerden bazıları listelenmiştir.

Alnylam İlaç Düzenle

2018 yılında Alnylam ilaç, FDA tarafından onaylanmış bir siRNA tedavisine sahip olan ilk şirket oldu. Onpattro (patisiran), yetişkinlerde kalıtsal transtiretin aracılı (hATTR) amiloidozun polinöropatisinin tedavisi için onaylandı. hATTR, nadir görülen, giderek güçten düşüren bir durumdur. Dünya çapında 50.000 kişiyi etkiliyor. İlacın doğrudan karaciğere iletilmesi için siRNA, bir lipid nanoparçacığıyla kaplanmıştır. siRNA molekülü, anormal TTR proteinlerinin RNA üretimine müdahale ederek amiloid proteinlerinin üretimini durdurur. Bu, bu proteinlerin vücudun farklı organlarında birikmesini önler ve hastaların bu hastalığı yönetmesine yardımcı olur. [51] [52]

hATTR için diğer tedavi seçenekleri, hastalık hala erken aşamadaysa potansiyel olarak yardımcı olabilecek bir ortotopik karaciğer naklidir (OLT). Ancak OLT, hastalığın ilerlemesini sadece yavaşlatabilir ve tedavi edemez. Geçici rahatlama sağlayan küçük moleküllü ilaçlar da vardır. Onpattro piyasaya sürülmeden önce, hATTR için tedavi seçenekleri sınırlıydı. Onpattro'nun onayından sonra FDA, Alnylam'a, ciddi bir durumu tedavi etmesi amaçlanan ve mevcut herhangi bir tedaviye göre önemli bir gelişme olan ilaçlara verilen Çığır Açan Terapi Tanımı verdi. Ayrıca, 200.000'den az insanı etkileyen koşulları güvenli bir şekilde tedavi etmeyi amaçlayan tedavilere verilen Yetim İlaç Tanımlamaları ile ödüllendirildi. [53]

2019'da FDA, akut hepatik porfiriyi (AHP) tedavi etmek için kullanılan ikinci RNAi tedavisi olan Givlaari'yi (givosiran) onayladı. Hastalığa, hem üretimi sırasında oluşan toksik porfobilinojen (PBG) moleküllerinin birikmesi neden olur. Bu moleküller farklı organlarda birikir ve bu da AHP semptomlarına veya ataklarına yol açabilir.

Givlaari, hem üretiminin erken bir aşamasında yer alan bir karaciğer enzimi olan aminolevulinik asit sentaz 1'in (ALAS1) ekspresyonunu azaltan bir siRNA ilacıdır. ALAS1'in aşağı regülasyonu, AHP semptomlarına neden olan nörotoksik ara maddelerin seviyelerini düşürür. [31]

Yıllarca süren araştırmalar, karaciğeri etkileyenlerin ötesinde siRNA tedavilerinin daha iyi anlaşılmasına yol açmıştır. Alnylam Pharmaceuticals şu anda Huntington hastalığı ve Alzheimer hastalığı gibi amiloidoz ve CNS bozukluklarını tedavi edebilen tedavilerde yer almaktadır. [3] Ayrıca yakın zamanda CNS, göz ve karaciğer hastalıkları için tedaviler geliştirmek için Regeneron Pharmaceuticals ile ortaklık kurdular.

2020 itibariyle, ONPATTRO ve GIVLAARI, ticari uygulama için mevcuttur ve iki siRNA, lumasiran (ALN-GO1) ve inclisiran, FDA'ya yeni ilaç başvurusu için sunulmuştur. Birkaç siRNA, faz 3 klinik çalışmalardan geçiyor ve daha fazla aday erken gelişim aşamasında. [31] 2020'de Alnylam ve Vir farmasötik bir ortaklık duyurdu ve ciddi COVID-19 vakalarını tedavi edecek bir RNAi tedavisi üzerinde çalışmaya başladı. [54]

Bir siRNA terapileri boru hattı geliştirmede başarılı olan diğer şirketler, Eli Lily ile ortak olan Dicerna Pharmaceuticals ve Johnson ve Johnson ile ortak olan Arrowhead Pharmaceuticals'dır. Amgen ve AstraZeneca gibi diğer bazı büyük ilaç şirketleri de biyolojik ilaçların bu alanındaki potansiyel başarısını gördüklerinden siRNA terapilerine büyük yatırımlar yaptılar. [55]


Gen Susturucu RNA'nın Doğrudan Kalıtımını Gözlemlemek

Genetik kalıtımın temelleri iyi bilinmektedir: ebeveynlerin her biri, üreme sırasında DNA'larının yarısını yavrularına aktarır. Bu genetik tarifin, yeni bir organizmanın vücudunu inşa etmek ve işletmek için ihtiyaç duyduğu tüm bilgileri içerdiği düşünülmektedir.

Ancak son araştırmalar, bazı türlerde ebeveynlerin yaşam deneyimlerinin yavrularını değiştirebileceğini göstermiştir. Yetersiz beslenmek, toksinlere maruz kalmak veya hastalığa yakalanmak ebeveynin gen ekspresyon modellerinde değişikliklere neden olabilir ve bazı durumlarda bu değişiklikler bir sonraki nesle aktarılabilir. Ancak, genetik olmayan kalıtım olarak bilinen bu etkiye neden olan mekanizmalar bir sırdır.

Maryland Üniversitesi'nden yapılan yeni araştırma, şaşırtıcı bir olası açıklama sunuyor. Gelişimsel biyologlar, ilk kez, hücreler içindeki genleri susturabilen DNA'nın yakın bir kuzeni olan çift sarmallı RNA (dsRNA) moleküllerinin yuvarlak solucanda doğrudan ebeveynden yavruya geçtiğini gözlemlediler. Caenorhabditis elegans. Daha da önemlisi, dsRNA moleküllerinin ebeveynlerde yarattığı gen susturma etkisi onların yavrularında da devam etti.

Çalışma, 17 Ekim 2016'da çevrimiçi erken baskısında yayınlandı. Ulusal Bilimler Akademisi Bildiriler Kitabı, genetik olmayan kalıtım mekanizmalarının herkesin şüphelendiğinden daha basit olabileceğini öne sürüyor.

UMD Hücre Biyolojisi ve Moleküler Genetik Bölümü'nde yardımcı doçent ve çalışmanın kıdemli yazarı Antony Jose, “Bir dsRNA molekülünün bir nesilden diğerine geçtiğini ilk kez görüyoruz” dedi. "Varsayım, dsRNA'nın ebeveynin genetik materyalini değiştirdiği ve bu değiştirilmiş genetik materyalin bir sonraki nesle aktarıldığıydı. Ancak gözlemlerimiz, RNA'nın orta adamı devre dışı bıraktığını gösteriyor.”

Jose ve ekibi, yüksek lisans öğrencisi ve başyazar Julia Marré ve eski araştırma teknisyeni Edward Traver dahil, floresan etiketle işaretlenmiş dsRNA'yı kan dolaşımı sistemine tanıttı. C. elegans solucanlar. Daha sonra bu floresan RNA moleküllerinin ebeveynin dolaşım sisteminden fiziksel olarak döllenmeyi bekleyen bir yumurta hücresine geçişini izlediler.

Şaşırtıcı bir şekilde, bazı dsRNA molekülleri ebeveyndeki genleri susturamadı çünkü dsRNA dizisi ebeveynin genlerinden hiçbiriyle eşleşmedi. Ancak, yeni solucan diğer ebeveyninden eşleşen genin bir kopyasını aldığında, dsRNA molekülleri yavrulardaki genleri susturdu. Bu, bazı durumlarda dsRNA tarafından gen susturulmasının tüm bir nesli atlayabileceğini düşündürmektedir.

"dsRNA'nın nesiller arası sınırları aştığını görebilmemiz şok edici. Sonuçlarımız, bir nesildeki çevrenin bir sonraki nesli nasıl etkileyebileceğine dair somut bir mekanizma sağlıyor” dedi. “Fakat bir ebeveynin, sahip olmadığı bir geni susturmak için bilgiyi iletebildiğini görmek iki kat şaşırtıcı.”

Jose ve meslektaşları, dsRNA'nın nesiller arası bilgi aktarımında bu kadar doğrudan bir rol oynamasını beklemiyorlardı. Jose, dsRNA'nın birçok virüsün yaşam döngüsüne etki ettiği için, canlı bir hücrenin doğal savunmasının dsRNA'nın bir sonraki nesli istila etmesini engelleyeceğini varsaymanın mantıklı olduğunu açıkladı.

"Çok şaşırtıcı. Bir sonraki neslin korunacağı düşünülebilir, ancak tüm bu dsRNA moleküllerinin bir sonraki nesle atıldığını görüyoruz, ”diye ekledi Jose. “Yumurta hücreleri, döllenmeye hazırlanırken besinleri emmek için aynı mekanizmayı kullanır. Gelecek nesil sadece beslenmekle kalmıyor, aynı zamanda bilgi de alıyor.”

Jose ve meslektaşları, dsRNA'nın genleri birden çok nesil boyunca susturduğu kesin mekanizmalar hakkında daha fazla şey öğrenmeyi umuyor.

“Benzer şeylerin insanlarda da olabileceğine dair ipuçları var. RNA'nın insan kan dolaşımında var olduğunu biliyoruz. Ancak RNA moleküllerinin nereden geldiğini, nereye gittiklerini veya tam olarak ne yaptıklarını bilmiyoruz” dedi. "Çalışmamız heyecan verici bir olasılığı ortaya koyuyor - bunlar ebeveynlerden çocuklarına mesajlar olabilir."


İn vitro kopyalanan dsRNA, yeni bir şişman kafalı minnow (Pimephales promelas) cilt hücre hattında viral hemorajik septisemi virüsü (VHSV)-IVb enfeksiyonunu sınırlar

Olta balıkçıları tarafından yırtıcı türleri yakalamak için kullanılan balık olan yem balıklarının yetiştirilmesi, Kuzey Amerika'da ekonomik ve ekolojik öneme sahiptir. Şişko minnow (Pimephales promelas) dahil olmak üzere yem balıkları, viral hemorajik septisemi virüsü (VHSV) gibi suda yaşayan virüslerin neden olduğu enfeksiyonlara karşı hassastır. VHSV enfeksiyonları toplu ölüm olaylarına neden olabilir ve bir vektör olarak yem balıkları yoluyla yeni su kütlelerine yayılma potansiyeline sahiptir. Bu çalışmada, fathead minnow'dan (FHMskin) türetilen yeni bir deri hücre dizisi anlatılmakta ve bunun doğuştan gelen antiviral bağışıklık tepkilerini ve olası tedavileri incelemek için bir araç olarak kullanımı tanıtılmaktadır. FHMskin, %10 fetal sığır serumunda ve 25-30 °C daha yüksek sıcaklıklarda optimum şekilde büyür. FHMskin, VHSV-IVb enfeksiyonuna karşı hassas ve izinlidir, 7.35 x 107 TCID'lik yüksek viral titreler üretir50/mL sadece 2 gün sonra. FHMskin hücreleri, 48 saat boyunca 50-500 ng/mL in vitro kopyalanmış dsRNA ile tedaviden sonra önemli dsRNA kaynaklı ölüm yaşamaz ve dsRNA tedavisine, üç doğuştan gelen bağışıklık geninin, viperin, ISG15 ve Mx1'in yüksek seviyelerini ifade ederek yanıt verir. 24 saat boyunca dsRNA ile ön tedavi, hücreleri VHSV'nin neden olduğu hücre ölümünden önemli ölçüde korudu, 500 ng/mL dsRNA, 0.1'lik bir enfeksiyon çokluğunda hücre ölümünü %70'ten %15'in altına düşürdü. Bu nedenle, yeni hücre dizisi FHMskin, kültürde yüksek VHSV-IVb lastikleri üretmek için ve dsRNA bazlı antiviral terapötiklerde gelecekteki uygulamalarla dsRNA ile indüklenen doğuştan gelen antiviral tepkileri incelemek için yeni bir yöntemi temsil eder.

Anahtar Kelimeler: Antiviral bağışıklık Şişko minnow İnterferon ile uyarılan genler Viral hemorajik septisemi virüsü dsRNA.


İçindekiler

RNA susturma, gen ekspresyonunun kontrol edilmesi ve düzenlenmesinde yer alan mekanik olarak ilişkili birkaç yolu tanımlar. [4] [5] [6] RNA susturma yolakları, homolog dizileri inaktive etme, endonükleaz aktivitesini teşvik etme, translasyon durdurma, ve/veya kromatik veya DNA modifikasyonu. [7] [8] [9] Fenomenin ilk çalışıldığı bağlamda, küçük RNA'nın bitkileri virüslere karşı savunmada önemli bir rol oynadığı bulundu.Örneğin, bu çalışmalar enzimlerin çift sarmallı RNA'yı saptadığını göstermiştir (dsRNA) normalde hücrelerde bulunmaz ve onu hastalığa neden olmayan küçük parçalar halinde sindirir. [10] [11] [12] [13] [2]

RNA susturma ve mekanizmasının bazı işlevleri anlaşılırken, çoğu anlaşılmamıştır. Örneğin, RNA susturmanın gelişimin düzenlenmesinde ve transpozisyon olaylarının kontrolünde önemli olduğu gösterilmiştir. [14] RNA susturmanın bitkilerde ve böceklerde antiviral korumada rol oynadığı gösterilmiştir. [15] Ayrıca mayada, RNA susturmanın heterokromatin yapısını koruduğu gösterilmiştir. [16] Bununla birlikte, gen ekspresyonunun düzenlenmesinde RNA susturmanın çeşitli ve nüanslı rolü, devam eden bir bilimsel araştırma olmaya devam etmektedir. Artan sayıda karakterize edilmiş küçük RNA dizileri için bir dizi farklı işlev önerilmiştir - örneğin, gelişimsel, nöronal hücre kaderinin düzenlenmesi, hücre ölümü, çoğalma, yağ depolama, hematopoietik hücre kaderi, insülin salgılanması. [17]

RNA susturma, translasyonu baskılayarak veya haberci RNA'yı parçalayarak işlev görür (mRNA), baz eşleştirmenin tamamlayıcılık miktarına bağlı olarak. RNA, genlerin proteinlere çevrilmesinde aracı rolüyle büyük ölçüde araştırılmıştır. [18] Bununla birlikte, daha aktif düzenleyici işlevler, ancak 1990'ların sonundan itibaren araştırmacılar tarafından ele alınmaya başlandı. [19] Tanımlanan ilk mekanizmanın anlaşılmasını sağlayan çığır açan çalışma, 1998'de Fire ve diğerleri, [1] tarafından yayınlandı ve çift sarmallı RNA'nın gen susturma için bir tetikleyici olarak hareket edebileceğini gösterdi. [19] O zamandan beri, çeşitli diğer RNA susturma sınıfları tanımlanmış ve karakterize edilmiştir. [4] Halihazırda, bu keşiflerin terapötik potansiyeli, örneğin hedeflenen gen tedavisi bağlamında araştırılmaktadır. [20] [21]

RNA susturma, gelişen bir mekanizma sınıfı olsa da, ortak bir tema, küçük RNA'lar ve gen ifadesi arasındaki temel ilişkidir. [8] Şu anda tanımlanmış olan ana RNA susturma yollarının, hem transkripsiyon sonrası gen susturma (PTGS) [22] hem de kromatine bağımlı gen susturma (CDGS) yollarını içerebilen etki mekanizmalarına sahip olduğu da gözlemlenmiştir. [4] CDGS, yeni ortaya çıkan transkriptler üzerinde küçük RNA komplekslerinin birleştirilmesini içerir ve transkripsiyonel gen susturma (TGS) ve ortak transkripsiyonel gen susturma (CTGS) olaylarını içeren kapsayıcı etki mekanizmaları olarak kabul edilir. [23] Bu en azından önemlidir, çünkü kanıtlar küçük RNA'ların kromatin yapısının ve TGS'nin modülasyonunda bir rol oynadığını göstermektedir. [24] [25]

Literatürde RNA interferansı üzerine erken odaklanmaya rağmen (RNAi) haberci RNA translasyonu düzeyinde meydana gelen bir çekirdek mekanizma olarak, diğerleri o zamandan beri DNA ve kromatin düzeyinde hareket eden daha geniş korunmuş RNA susturma yolları ailesinde tanımlanmıştır. [26] RNA susturma, bir dizi küçük RNA'nın susturma aktivitesine atıfta bulunur ve genellikle RNAi'den daha geniş bir kategori olarak kabul edilir. Terimler literatürde bazen birbirinin yerine kullanılsa da, RNAi genellikle RNA susturmanın bir dalı olarak kabul edilir. Bu ilgili kavramlar arasında bir ayrım yapmanın yararlı olduğu ölçüde, RNA susturma, gen ekspresyonunda yer alan küçük RNA ile ilgili kontrollerin daha geniş şemasına ve genomun mobil tekrarlayan DNA dizilerine, retroelementlere karşı korunmasına atıfta bulunduğu düşünülebilir. ve mutasyonları indükleyebilecekleri ölçüde transpozonlar. [27] RNA susturma için moleküler mekanizmalar başlangıçta bitkilerde çalışıldı [12], ancak o zamandan beri mantarlardan memelilere kadar çeşitli denekleri kapsayacak şekilde genişletildi ve bu yolların yüksek oranda korunduğuna dair güçlü kanıtlar sağladı. [28]

Şu anda en az üç birincil küçük RNA sınıfı tanımlanmıştır, yani: küçük enterferans yapan RNA (siRNA), mikroRNA (miRNA) ve piwi etkileşimli RNA (piRNA).

Küçük enterferans yapan RNA (siRNA) Düzenle

siRNA'lar çekirdekte ve sitoplazmada hareket eder ve CDGS'nin yanı sıra RNAi'de yer alır. [4] siRNA'lar, duyu ve duyu olmayan RNA'lar gibi çeşitli tek sarmallı RNA (ssRNA) öncülerinden türetilen uzun dsRNA öncülerinden gelir. siRNA'lar ayrıca ters çevrilmiş tekrar bölgelerinin transkripsiyonundan türetilen firkete RNA'larından gelir. siRNA'lar ayrıca enzimatik olarak kodlamayan RNA öncülerinden de ortaya çıkabilir. [29] RNAi çerçevesinde siRNA üzerine literatürün hacmi çok geniştir.

MikroRNA (miRNA) Düzenle

MiRNA'ların çoğu sitoplazmada hareket eder ve mRNA bozulmasına veya translasyon durmasına aracılık eder. [30] Bununla birlikte, bazı bitki miRNA'larının, DNA metilasyonunu teşvik etmek için doğrudan hareket ettiği gösterilmiştir. [31] miRNA'lar, RNaseIII enzimleri Drosha ve Dicer tarafından üretilen firkete öncülerinden gelir. [32] Hem miRNA hem de siRNA, ya RNA kaynaklı susturma kompleksini oluşturur (RISC) veya RNA kaynaklı transkripsiyonel susturma kompleksi olarak bilinen RISC'nin nükleer formu (RİTS). [33] RNAi çerçevesinde miRNA ile ilgili literatür çok geniştir.

Üç asal çevrilmemiş bölge ve mikroRNA

Haberci RNA'ların (mRNA'lar) üç ana çevrilmemiş bölgesi (3'UTR'ler) genellikle transkripsiyon sonrası RNA enterferansına neden olan düzenleyici diziler içerir. Bu tür 3'-UTR'ler genellikle hem mikroRNA'lar (miRNA'lar) hem de düzenleyici proteinler için bağlanma bölgeleri içerir. 3'-UTR içindeki spesifik bölgelere bağlanarak miRNA'lar, translasyonu inhibe ederek veya doğrudan transkriptin bozulmasına neden olarak çeşitli mRNA'ların gen ekspresyonunu azaltabilir. 3'-UTR ayrıca bir mRNA'nın ekspresyonunu engelleyen baskılayıcı proteinleri bağlayan susturucu bölgelere de sahip olabilir.

3'-UTR genellikle mikroRNA yanıt öğelerini (MRE'ler) içerir. MRE'ler, miRNA'ların bağlandığı dizilerdir. Bunlar 3'-UTR'ler içindeki yaygın motiflerdir. 3'-UTR'ler içindeki tüm düzenleyici motifler arasında (örneğin susturucu bölgeler dahil), MRE'ler motiflerin yaklaşık yarısını oluşturur.

2014 itibariyle, miRNA dizileri ve açıklamalarından oluşan bir arşiv olan miRBase web sitesi [34], 233 biyolojik türde 28.645 giriş listelemiştir. Bunlardan 1.881 miRNA, açıklamalı insan miRNA lokuslarındaydı. miRNA'ların ortalama olarak yaklaşık dört yüz hedef mRNA'ya sahip olduğu tahmin edildi (birkaç yüz genin ekspresyonunu etkiler). [35] Freidman ve ark. [35], insan mRNA 3'UTR'leri içindeki >45.000 miRNA hedef bölgesinin arka plan seviyelerinin üzerinde korunduğunu ve insan protein kodlayan genlerin >%60'ının miRNA'larla eşleşmeyi sürdürmek için seçici baskı altında olduğunu tahmin etmektedir.

Doğrudan deneyler, tek bir miRNA'nın yüzlerce benzersiz mRNA'nın stabilitesini azaltabileceğini göstermektedir. [36] Diğer deneyler, tek bir miRNA'nın yüzlerce proteinin üretimini baskılayabildiğini, ancak bu baskının genellikle nispeten hafif olduğunu (2 kattan daha az) göstermektedir. [37] [38]

Gen ekspresyonunun miRNA düzensizliğinin etkileri kanserde önemli görünmektedir. [39] Örneğin, mide-bağırsak kanserlerinde, epigenetik olarak değiştirilmiş ve DNA onarım enzimlerini aşağı regüle etmede etkili olarak dokuz miRNA tanımlanmıştır. [40]

MiRNA gen ekspresyonunun düzensizliğinin etkileri, şizofreni, bipolar bozukluk, majör depresyon, Parkinson hastalığı, Alzheimer hastalığı ve otizm spektrum bozuklukları gibi nöropsikiyatrik bozukluklarda da önemli görünmektedir. [41] [42] [43]

Piwi etkileşimli RNA (piRNA) Düzenle

piRNA'lar, tekrarlayan DNA ve transpozonlar dahil olmak üzere çok çeşitli kaynaklardan türetilen, hayvan hücrelerinde eksprese edilen küçük kodlamayan RNA moleküllerinin en büyük sınıfını temsil eder. [44] Bununla birlikte, piRNA'ların biyogenezi de en az anlaşılandır. [45] piRNA'ların hem transkripsiyon sonrası hem de kromatin seviyelerinde etkili olduğu görülmektedir. En azından boyut ve karmaşıklık açısından bir artış nedeniyle miRNA'dan farklıdırlar. İlişkili küçük enterferans yapan RNA'yı tekrarlayın (rasiRNA'lar) piRNA'nın bir alt türü olarak kabul edilir. [3]

RNA Susturma için en temel mekanik akış aşağıdaki gibidir: (Mekanizmanın daha ayrıntılı açıklaması için RNAi:Hücresel mekanizma makalesine bakın.)

1: Ters çevrilmiş tekrarlar firkete/panhandle yapılarına sahip RNA --> 2: dsRNA --> 3: miRNA'lar/siRNA'lar --> 4: RISC --> 5: Hedef mRNA'nın yok edilmesi

  1. İyi RNA susturma için en iyi öncünün, sırayla küçük firkete RNA ve kanatçık yapıları oluşturan ters çevrilmiş tekrarlara sahip tek sarmallı antisens RNA'ya sahip olmak olduğu keşfedilmiştir. [6] Saç tokası veya kanat sapı yapıları, RNA'nın bağımsız kalabilmesi ve diğer RNA iplikleriyle birleşmemesi için mevcuttur.
  2. Bu küçük firkete RNA'ları ve/veya kanatları daha sonra exportin-5 adı verilen nükleer dışa aktarma reseptörü aracılığıyla çekirdekten sitozole taşınır ve daha sonra DNA gibi çift sarmallı bir dizi olan bir çift sarmallı RNA olan bir dsRNA'ya dönüştürülür. nükleotidler. Mekanizma dsRNA'ları değil de sadece tek zincirleri kullansaydı, diğer "iyi" mRNA'lara hibridize olma şansı daha yüksek olurdu. Çift telli olarak, ihtiyaç duyulduğunda çağrıda tutulabilir.
  3. dsRNA daha sonra bir Dicer tarafından küçük (21-28 nt = nükleotid uzunluğunda) miRNA'lar (miRNA'lar) veya siRNA'lar (kısa enterferans yapan RNA'lar) iplikçiklerine bölünür. Bir Dicer, iplikle karıştırılmış bir protein kompleksi olan bir endoribonükleazRNazdır. (ler) RNA.
  4. Son olarak, çift sarmallı miRNA'lar/siRNA'lar tek sarmallara ayrılır, ikisinin antisens RNA sarmalı, katalitik bileşen Argonaute'yi içeren RISC (RNA kaynaklı susturma kompleksi) adı verilen başka bir endoribonükleaz enzim kompleksi ile birleşecek ve RISC'yi kırılması için yönlendirecektir. yok edilebilmesi için "mükemmel tamamlayıcı" hedef mRNA'yı veya viral genomik RNA'yı yükseltin. [2][6]
  5. Bu, kısa diziye özgü bir alana dayalı olarak, karşılık gelen bir mRNA'nın kesileceği anlamına gelir. Emin olmak için, başka birçok yerde de kesilecektir. (Mekanizma sadece uzun bir esneme ile çalışsaydı, tamamlayıcı uzun mRNA'sıyla eşleşmek için zamanının olmaması ihtimali daha yüksek olurdu.) Tekrarlanan ilişkili kısa enterferans RNA'larının (rasiRNA) bir sahip olduğu da gösterilmiştir. kromatin modifikasyonunu yönlendirmede rol oynar. [2]

Nature Reviews tarafından RNAi mekanizmasının animasyonlu bir açıklaması için aşağıdaki Dış Bağlantılar bölümüne bakın.

Virüslere veya transpozonlara karşı bağışıklık

RNA susturma, hücrelerimizin (ve tüm krallıklardan gelen hücrelerin) RNA virüsleri ve transpozonlarla (bunlar hem kendi hücrelerimizden hem de diğer araçlardan kaynaklanan) savaşmak için kullandığı mekanizmadır. [2] RNA virüsleri söz konusu olduğunda, bunlar yukarıda belirtilen mekanizma tarafından hemen yok edilir. Transpozonlar söz konusu olduğunda, bu biraz daha dolaylıdır. Transpozonlar genomun farklı bölümlerinde yer aldığından, farklı promotörlerden gelen farklı transkripsiyonlar, birbirleriyle hibridize olabilen tamamlayıcı mRNA'lar üretir. Bu gerçekleştiğinde, RNAi mekanizması harekete geçerek, transpozonların kendilerini hareket ettirmek için gerekli olacak proteinlerin mRNA'larını zayıflatır. [46]

Genlerin aşağı regülasyonu

Genlerin aşağı regülasyonu hakkında ayrıntılı bir açıklama için, bkz. RNAi:genlerin aşağı regülasyonu

Genlerin yukarı regülasyonu

Genlerin yukarı regülasyonu hakkında ayrıntılı bir açıklama için, bkz. RNAi:genlerin yukarı regülasyonu

RNA susturma da düzenlenir

RNA susturmanın aşağı akış hedef mRNA'ları düzenlemesiyle aynı şekilde, RNA susturmanın kendisi de düzenlenir. Örneğin susturma sinyalleri, RdRP'ler (RNA'ya bağımlı RNA polimerazlar) veya RDR'ler adı verilen bir grup enzim tarafından hücreler arasında yayılır. [2]

dsRNA aracılı diziye özgü mRNA bozulmasını içeren küçük RNA gen susturma mekanizmalarının artan anlayışı, fonksiyonel genomik, biyotıp ve deneysel biyoloji alanlarını doğrudan etkilemiştir. Aşağıdaki bölüm, RNA susturma etkilerini içeren çeşitli uygulamaları açıklamaktadır. Bunlar, biyoteknoloji, terapötikler ve laboratuvar araştırmalarındaki kullanımları içerir. Çok sayıda küçük RNA'yı ve hedeflerini tanımlamak ve karakterize etmek için biyoinformatik teknikler de uygulanmaktadır.

Biyoteknoloji Düzenle

Uzun dsRNA'ların veya siRNA'ların yapay olarak eklenmesi, hem kültürlenmiş hücrelerde hem de canlı organizmalarda gen ekspresyonunu etkisiz hale getirmek için bir araç olarak benimsenmiştir. [2] RNA susturma efektörleri olarak küçük RNA'ların yapısal ve işlevsel çözünürlüğünün deneysel biyoloji üzerinde doğrudan bir etkisi olmuştur. Örneğin, dsRNA, ilgili bir gene tamamlayıcı spesifik bir diziye sahip olacak şekilde sentezlenebilir. Bir hücreye veya biyolojik sisteme dahil edildikten sonra, eksojen genetik materyal olarak tanınır ve karşılık gelen RNA susturma yolunu aktive eder. Bu mekanizma, bir fenotipe göre genler için fonksiyon kaybını araştırmak için yararlı olan, hedefe göre gen ekspresyonundaki azalmaları etkilemek için kullanılabilir. Yani, ekspresyon düşüşlerinin fenotipik ve/veya fizyolojik etkilerini incelemek, bir gen ürününün rolünü ortaya çıkarabilir. Gözlenebilir etkiler nüanslı olabilir, öyle ki bazı yöntemler bir genin "knockdown" (ifadeyi azaltma) ve "nakavt" (ifadeyi ortadan kaldırma) arasında ayrım yapabilir. [47] RNA enterferans teknolojileri, son zamanlarda fonksiyonel genomikte en yaygın olarak kullanılan tekniklerden biri olarak not edilmiştir. [48] ​​Küçük RNA'lar kullanılarak geliştirilen ekranlar, hücre bölünmesi, apoptoz ve yağ regülasyonu gibi temel süreçlerde yer alan genleri tanımlamak için kullanılmıştır.

Biyotıp Düzenle

En azından 2000'li yılların ortalarından beri, biyomedikal ve terapötik uygulamalar için kısa enterferans yapan RNA'ların geliştirilmesine yönelik yoğun bir ilgi vardır. [49] Bu ilgiyi desteklemek, viral enfeksiyonlardan kansere ve nörodejeneratif bozukluklara kadar çeşitli hastalıklarla mücadele için küçük RNA'ların klinik potansiyelini ve güvenliğini başarılı bir şekilde gösteren artan sayıda deneydir. [50] 2004 yılında, siRNA için ilk Araştırmaya Dayalı Yeni İlaç başvuruları Amerika Birleşik Devletleri'nde Gıda ve İlaç İdaresi ile dosyalandı ve yaşa bağlı makula dejenerasyonu için bir tedavi olarak tasarlandı. [48] ​​RNA susturma in vitro ve in vivo olarak ya virüslerde ekspresyon ya da oligonükleotidlerin sentezi yoluyla tetikleyiciler (RNAi'yi indükleyen nükleik asitler) yaratılarak gerçekleştirilmiştir. [51] İyimser olarak birçok çalışma, küçük RNA temelli tedavilerin, geçmişte küçük molekül/farmakolojik ve aşı/biyolojik tedavilerin başarısız olduğu veya daha az etkili olduğu patojenlere ve hastalıklara karşı yeni ve güçlü silahlar sunabileceğini göstermektedir. [49] Bununla birlikte, güvenlik ve etkinliği sağlamak için küçük RNA efektör moleküllerinin tasarımı ve sunumunun dikkatlice düşünülmesi gerektiği konusunda da uyarılır.

Tedavide, klinik tıpta ve teşhiste RNA susturmanın rolü hızla gelişen bir alandır ve önümüzdeki birkaç yıl içinde bu teknolojiyi kullanan bazı bileşiklerin pazar onayına ulaşması beklenmektedir. RNA susturma işleminin giderek daha önemli bir rol oynadığı birçok klinik alanı vurgulamak için aşağıda bir rapor özetlenmiştir, bunların başlıcaları oküler ve retinal bozukluklar, kanser, böbrek bozuklukları, LDL düşürme ve antiviraldir. [51] Aşağıdaki tablo, şu anda klinik denemelerin çeşitli aşamalarında bulunan RNAi tabanlı tedavinin bir listesini göstermektedir. Bu denemelerin durumu, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin bir hizmeti olan ClinicalTrials.gov web sitesinde izlenebilir (NIH). [52] Klinik gelişime ulaşan ilk bileşikler arasında yer alan oküler ve retinal bozukluklar için geliştirilmekte olan tedaviler dikkate değerdir. AGN211745 (sirna027) (Allergan) ve bevasiranib (Cand5) (Opko), yaşa bağlı makula dejenerasyonunun tedavisi için klinik geliştirmelerden geçmiştir, ancak bileşikler piyasaya ulaşmadan önce denemeler sonlandırılmıştır. Oküler koşullar için geliştirilmekte olan diğer bileşikler arasında SYL040012 (Sylentis) ve QPI-007 (Quark) bulunur. SYL040012 (bamosinan), glokom için klinik geliştirme aşamasında olan bir ilaç adayıdır, sıklıkla artan göz içi basıncı ile ilişkili ilerleyici bir optik nördejenerasyon QPI-007, açı kapanması glokomu ve arteritik olmayan ön iskemik optik nöropati tedavisi için bir adaydır, her iki bileşik de şu anda Faz II klinik deneylerden geçiyor. Kanser ve nadir hastalıklar gibi durumlar için çeşitli bileşikler de geliştirilmektedir.

klinik alan İlaç gösterge Hedef
Oküler ve retina bozuklukları TD101 Pachyonychia konjenita Keratin 6A N171K mutantı
Oküler ve retina bozuklukları QPI-1007 Arteritik olmayan ön iskemik optik nöropati kaspaz 2
Oküler ve retina bozuklukları AGN211745 Yaşa bağlı makula dejenerasyonu, koroid neovaskülarizasyonu VEGFR1
Oküler ve retina bozuklukları PF-655 Diyabetik makula ödemi, yaşa bağlı makula dejenerasyonu RTP801
Oküler ve retina bozuklukları SYL040012 glokom β2 adrenerjik reseptör
Oküler ve retina bozuklukları Bevasiranib Diyabetik makula ödemi VEGF
Oküler ve retina bozuklukları Bevasiranib makula dejenerasyonu VEGF
Yengeç Burcu CEQ508 Ailesel adenomatöz polipoz β-katenin
Yengeç Burcu ALN-PLK1 karaciğer tümörü PLK1
Yengeç Burcu FANG Katı tümör Furin
Yengeç Burcu CALAA-01 Katı tümör RRM2
Yengeç Burcu SPC2996 kronik lenfositik lösemi BCL-2
Yengeç Burcu ALN-VSP02 Katı tümör VEGF, kinesin iğ proteini
Yengeç Burcu NCT00672542 metastatik melanom LMP2, LMP7 ve MECL1
Yengeç Burcu Atu027 Katı maligniteler PKN3
Böbrek bozuklukları QPI-1002/I5NP Akut böbrek hasarı p53
Böbrek bozuklukları QPI-1002/I5NP Greft disfonksiyonu böbrek nakli p53
Böbrek bozuklukları QPI-1002/I5NP Böbrek hasarı akut böbrek yetmezliği p53
LDL düşürme TKM-ApoB hiperkolesterolemi APOB
LDL düşürme PRO-040,201 hiperkolesterolemi APOB
Antiviral miravirsen Hepatit C virüsü miR-122
Antiviral pHIV7-shI-TAR-CCR5RZ HIV HIV Tat proteini, HIV TAR RNA, insan CCR5
Antiviral ALN-RSV01 RSV RSV nükleokapsidi
Antiviral ALN-RSV01 Akciğer nakli hastalarında RSV RSV nükleokapsidi

Ana zorluk Düzenle

Geleneksel olarak üretilen ilaçlarda olduğu gibi, RNAi bazlı ilaçların başarılı yan dallarının geliştirilmesindeki ana zorluk, RNAi tetikleyicilerinin vücutta ihtiyaç duyulan yere tam olarak iletilmesidir. Oküler makula dejenerasyonu panzehirinin diğer hastalıklarda panzehirden daha erken başarılı olmasının nedeni, göz küresinin neredeyse kapalı bir sistem olması ve serumun tam olması gereken yere bir iğne ile enjekte edilebilmesidir. Gelecekteki başarılı ilaçlar, muhtemelen nanobotların yardımıyla, ihtiyaç duyulan yere inebilenler olacak. Aşağıda, RNAi tetikleyicilerinin mevcut iletim yollarını gösteren bir tablonun [51] bir yorumu bulunmaktadır.

Laboratuvar Düzenle

Bilimsel topluluk, RNA susturmasını bir araştırma aracı olarak kullanmakta hızlı davrandı. mRNA'nın stratejik hedeflemesi, gen işlevi ve açılıp kapatılma yeteneği hakkında büyük miktarda bilgi sağlayabilir.İndüklenmiş RNA susturma, gen ekspresyonunu bastırmak için kontrollü bir yöntem olarak hizmet edebilir. Makine ökaryotların çoğunda korunduğundan, bu deneyler bir dizi model organizma için iyi ölçeklenir. [53] Pratikte, sentetik kısa saç tokası RNA'ları eksprese etmek, stabil bir yıkıma ulaşmak için kullanılabilir. [54] Bu tasarımcı kısa saç tokası RNA'larını ifade etmek için promotörler yapılabilirse, sonuç genellikle hem in vitro hem de in vivo bağlamlarda güçlü, kararlı ve kontrollü gen yıkımıdır. [55] Kısa firkete RNA vektör sistemleri, kapsam olarak cDNA aşırı ekspresyon sistemlerinin kullanımına kabaca benzer olarak görülebilir. [56] Genel olarak, sentetik ve doğal küçük RNA'ların hayvanlarda olduğu kadar hücrelerde de gen fonksiyonunu incelemek için önemli bir araç olduğu kanıtlanmıştır. [57]

Küçük RNA'ları ve hedeflerini belirlemeye yönelik biyoinformatik yaklaşımlar, bitkilerde, C. elegans, D. melanogaster, zebra balığı, fare, sıçan ve insanda gen ekspresyonunu etkilediği tahmin edilen binlerce değilse de birkaç yüz küçük RNA adayı döndürmüştür. [58] Bu yöntemler büyük ölçüde nakavt deneyleri için küçük RNA adaylarını belirlemeye yöneliktir ancak daha geniş uygulamalara sahip olabilir. Bir biyoinformatik yaklaşımı, tohum tamamlayıcı hedef bağlama bölgelerini filtreleyerek dizi koruma kriterlerini değerlendirdi. Bahsedilen çalışma, memeli genlerinin yaklaşık üçte birinin, bu durumda miRNA'lar tarafından düzenleneceğini öngördü. [59]

Etik ve Risk-Fayda Analizi Düzenle

RNA susturmanın dikkate alınması gereken bir yönü, olası hedef dışı etkileri, toksisitesi ve dağıtım yöntemleridir. RNA susturma geleneksel bir ilaç olacaksa, öncelikle biyotıbbın tipik etik sorunlarını geçmelidir. [60] Risk-fayda analizini kullanarak, araştırmacılar RNA susturmanın zarar vermeme, fayda sağlama ve özerklik gibi etik ideolojilere uygun olup olmadığını belirleyebilirler. [61]

İzin vermeyen kişilere bulaşabilecek enfeksiyon yetkin virüsler oluşturma riski vardır. [62] Bu tedavilerin gelecek nesilleri etkileme riski de vardır. Özerklik açısından bu iki senaryo etik dışı olabilir. Şu anda, güvenli olmayan dağıtım yöntemleri ve vektör virüslerinin istenmeyen yönleri, RNA susturulmasına karşı argümana katkıda bulunuyor. [61]

Hedef dışı etkiler açısından, siRNA doğuştan gelen interferon yanıtlarını indükleyebilir, doyma yoluyla endojen miRNA'ları inhibe edebilir ve diğer hedef olmayan mRNA'lara tamamlayıcı dizilere sahip olabilir. Bu hedefler dışında onkogenler ve antiapoptotik genler gibi hedef yukarı regülasyonları da olabilir. RNA susturma toksisitesi, çelişkili raporlar olduğu için hala gözden geçirilmektedir. [61] [62] [63]

RNA susturma hızla gelişiyor, bu nedenle etik konuların daha fazla tartışılması gerekiyor. Genel etik ilkeler bilgisi ile sürekli olarak risk-fayda analizi yapmalıyız. [61]


UMD Biyologları, Gen Susturucu RNA'nın Doğrudan Kalıtımını İlk Gözlemleyen

Genetik kalıtımın temelleri iyi bilinmektedir: ebeveynlerin her biri, üreme sırasında DNA'larının yarısını yavrularına aktarır. Bu genetik tarifin, yeni bir organizmanın vücudunu inşa etmek ve işletmek için ihtiyaç duyduğu tüm bilgileri içerdiği düşünülmektedir.

Ancak son araştırmalar, bazı türlerde ebeveynlerin yaşam deneyimlerinin yavrularını değiştirebileceğini göstermiştir. Yetersiz beslenmek, toksinlere maruz kalmak veya hastalığa yakalanmak ebeveynin gen ekspresyon modellerinde değişikliklere neden olabilir ve bazı durumlarda bu değişiklikler bir sonraki nesle aktarılabilir. Ancak, genetik olmayan kalıtım olarak bilinen bu etkiye neden olan mekanizmalar bir sırdır.

/> Maryland Üniversitesi'nden yapılan yeni araştırma, şaşırtıcı bir olası açıklama sunuyor. Gelişimsel biyologlar, ilk kez, hücreler içindeki genleri susturabilen DNA'nın yakın bir kuzeni olan çift sarmallı RNA (dsRNA) moleküllerinin yuvarlak solucanda doğrudan ebeveynden yavruya geçtiğini gözlemlediler. Caenorhabditis elegans. Daha da önemlisi, dsRNA moleküllerinin ebeveynlerde yarattığı gen susturma etkisi onların yavrularında da devam etti.

Çalışma, 17 Ekim 2016'da çevrimiçi erken baskısında yayınlandı. Ulusal Bilimler Akademisi Bildiriler Kitabı, genetik olmayan kalıtım mekanizmalarının herkesin şüphelendiğinden daha basit olabileceğini öne sürüyor.

UMD Hücre Biyolojisi ve Moleküler Genetik Bölümü'nde yardımcı doçent ve çalışmanın kıdemli yazarı Antony Jose, “Bir dsRNA molekülünün bir nesilden diğerine geçtiğini ilk kez görüyoruz” dedi. "Varsayım, dsRNA'nın ebeveynin genetik materyalini değiştirdiği ve bu değiştirilmiş genetik materyalin bir sonraki nesle aktarıldığıydı. Ancak gözlemlerimiz, RNA'nın orta adamı devre dışı bıraktığını gösteriyor.”

Jose ve ekibi, yüksek lisans öğrencisi ve başyazar Julia Marré ve eski araştırma teknisyeni Edward Traver dahil, floresan etiketle işaretlenmiş dsRNA'yı kan dolaşımı sistemine tanıttı. C. elegans solucanlar. Daha sonra bu floresan RNA moleküllerinin ebeveynin dolaşım sisteminden fiziksel olarak döllenmeyi bekleyen bir yumurta hücresine geçişini izlediler.

Şaşırtıcı bir şekilde, bazı dsRNA molekülleri ebeveyndeki genleri susturamadı çünkü dsRNA dizisi ebeveynin genlerinden hiçbiriyle eşleşmedi. Ancak, yeni solucan diğer ebeveyninden eşleşen genin bir kopyasını aldığında, dsRNA molekülleri yavrulardaki genleri susturdu. Bu, bazı durumlarda dsRNA tarafından gen susturulmasının tüm bir nesli atlayabileceğini düşündürmektedir.

"dsRNA'nın nesiller arası sınırları aştığını görebilmemiz şok edici. Sonuçlarımız, bir nesildeki çevrenin bir sonraki nesli nasıl etkileyebileceğine dair somut bir mekanizma sağlıyor” dedi. “Fakat bir ebeveynin, sahip olmadığı bir geni susturmak için bilgiyi iletebildiğini görmek iki kat şaşırtıcı.”

Jose ve meslektaşları, dsRNA'nın nesiller arası bilgi aktarımında bu kadar doğrudan bir rol oynamasını beklemiyorlardı. Jose, dsRNA'nın birçok virüsün yaşam döngüsüne etki ettiği için, canlı bir hücrenin doğal savunmasının dsRNA'nın bir sonraki nesli istila etmesini engelleyeceğini varsaymanın mantıklı olduğunu açıkladı.

"Çok şaşırtıcı. Bir sonraki neslin korunacağı düşünülebilir, ancak tüm bu dsRNA moleküllerinin bir sonraki nesle atıldığını görüyoruz, ”diye ekledi Jose. “Yumurta hücreleri, döllenmeye hazırlanırken besinleri emmek için aynı mekanizmayı kullanır. Gelecek nesil sadece beslenmekle kalmıyor, aynı zamanda bilgi de alıyor.”

Jose ve meslektaşları, dsRNA'nın genleri birden çok nesil boyunca susturduğu kesin mekanizmalar hakkında daha fazla şey öğrenmeyi umuyor.

“Benzer şeylerin insanlarda da olabileceğine dair ipuçları var. RNA'nın insan kan dolaşımında var olduğunu biliyoruz. Ancak RNA moleküllerinin nereden geldiğini, nereye gittiklerini veya tam olarak ne yaptıklarını bilmiyoruz” dedi. "Çalışmamız heyecan verici bir olasılığı ortaya koyuyor - bunlar ebeveynlerden çocuklarına mesajlar olabilir."

UMD'nin makaledeki ortak yazarları arasında Jose'ye ek olarak, yüksek lisans öğrencisi Julia Marré ve eski araştırma teknisyeni Edward Traver da vardı.

Araştırma makalesi, "Hücre dışı RNA, bir nesilden diğerine taşınır. Caenorhabditis elegans Julia Marré, Edward Traver ve Antony Jose, derginin 17 Ekim 2016 çevrimiçi erken baskısında yer alıyor. Ulusal Bilimler Akademisi Bildiriler Kitabı .

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir (Ödül No. R01GM111457). Bu makalenin içeriği mutlaka bu kuruluşun görüşlerini yansıtmaz.

Medya İlişkileri İletişim: Matthew Wright, 301-405-9267, [email protected]

Maryland Üniversitesi
Bilgisayar, Matematik ve Doğa Bilimleri Fakültesi
2300 Symons Salonu
Kolej Parkı, MD 20742
www.cmns.umd.edu
@UMDbilim

Bilgisayar, Matematik ve Doğa Bilimleri Fakültesi Hakkında
Maryland Üniversitesi'ndeki Bilgisayar, Matematik ve Doğa Bilimleri Koleji, her yıl lisans ve lisansüstü programlarında 7.000'den fazla geleceğin bilimsel liderini eğitiyor. Kolejdeki 10 bölüm ve bir düzineden fazla disiplinler arası araştırma merkezi, yıllık 150 milyon doları aşan sponsorlu araştırma fonu ile bilimsel keşifleri teşvik ediyor.


Özet

Protein transkripsiyon faktörlerine ek olarak, ökaryotlar küçük RNA gen ekspresyonunu düzenleyen moleküller & neredeyse her zaman onu bastırarak & mdash bu nedenle fenomene denir RNA susturma.

Küçük RNA moleküllerinin iki kaynağı vardır:

  • küçük enterferans yapan RNA'lar (siRNAs)
    • Bitki hücreleri, bunları istilacı virüslerin çift sarmallı RNA'sından (dsRNA) yapar.
    • Bilim adamları ve ilaç şirketleri, bunları belirli genlerin (RNA interferansı veya RNAi olarak adlandırılan) ifadesini kapatmak için ajanlar olarak yaparlar.
    • Bunlar, tüm bitki ve hayvanların genomlarında kodlanmıştır.
    • Her ikisi de Dicer tarafından üretilir.
    • Her ikisi de bir rNA-benuyarılmış silencing Ckarmaşık (RISC).
      • Küçük RNA'nın nükleotid dizisi, mRNA'nınkiyle tam olarak eşleşirse, mRNA kesilir ve yok edilir.
      • Yalnızca kısmi bir eşleşme varsa (genellikle 3' UTR'sinde), çeviri (yani protein sentezi) bastırılır. Bu aktivitelerin her ikisi de sitozolde gerçekleşir ve belki de P gövdeleri.
      • Bununla birlikte, bazı küçük RNA'lar için, RISC kompleksi çekirdeğe girer ve karşılık gelen genin/genlerin transkripsiyonunu kapatır.
        • çözülmemiş DNA dizisine (veya belki de oluşturulurken RNA transkriptine) bağlanma
        • ökromatinin heterokromatine dönüştürülmesi [Link]
        • gen(ler)in etrafındaki nükleozomlarda lizin-9 histon H3'ün metilasyonu [Bağlantı].

        Laboratuvar ve belki de terapötik araçlar olarak kullanılmalarının yanı sıra, küçük RNA'lar onları yapan organizmalar için açıkça gereklidir.


        Diğer TLR Yolu Kusurları

        Rebeca Pérez de Diego , Carlos Rodríguez-Gallego , Stiehm'in 27'sinde Bağışıklık Yetersizlikleri , 2014

        TLR3 Eksikliği

        TLR3, çoğu viral enfeksiyon sırasında üretilen bir ara ürün olan dsRNA'yı tanıyan bir tip I integral membran proteinidir. Muhtemelen nekrotik hücreler 113,114 veya ultraviyole hasarlı küçük nükleer U1 RNA (snU1),115 tarafından salınan hücre endojen RNA gibi viral olmayan diğer dsRNA'lar da TLR3'ü aktive edebilir. Buna karşılık, toplam insan hücresel RNA'sı TLR3'ü aktive edemez. 116 TLR3 eksprese eden başlıca hücreler, dendritik hücreler, CD8+ T hücreleri ve NK hücreleri dahil olmak üzere periferal lökositlerdir. Nöronlar, oligodendrositler, astrositler ve mikroglia hücreleri de dahil olmak üzere birçok başka hücre tipi de TLR3'ü ifade eder. TLR3 çoğu hücre tipinde hücre içidir ve hücre yüzeylerinde TLR3'ü açıkça ifade ettiği gösterilen tek hücreler insan akciğer fibroblastlarıdır. 11

        İnsanlarda, HSE'li üç hastada TLR3 eksikliği tanımlanmıştır. 20,24 TLR3 eksikliğinin ilk raporu, HSE'den muzdarip iki hastayı içeriyordu. Bu iki hasta akraba değildi ve akraba olmayan Fransız ebeveynlerden doğdu. 20 İlk hasta, 5 yaşında SEÇ'den muzdarip bir kız çocuğuydu. Hastalık sağ yüz klonik nöbetleri ile başladı, bunu sağ brakiofasiyal felç ve ikincil ateş (38.3°C) izledi. Hasta iyi bir iyileşme ile asiklovir (3 hafta boyunca günde 60 mg/kg IV) ile tedavi edildi. Bir yıl ve 7 ay sonra, yeni bir HSE bölümü geliştirdi. Asiklovir tedavisine devam edildi (3 hafta boyunca günde 60 mg/kg IV, ardından oral asiklovir). Klinik semptomlar geriledi ve çocuk iyileşti. İkinci hastaya ise 5 aylıkken HSE tanısı konuldu. Bu atak yüksek ateş (39,5°C) ve sağ hemiklonik nöbet ile başladı. İntravenöz asiklovir tedavisi altında klinik durum düzeldi (3 hafta boyunca günde 60 mg/kg IV). Üçüncü hasta, akraba olmayan Polonyalı ebeveynlerden doğan bir erkek çocuktu. 8 yaşında HSE çekti. Klinik belirtiler asiklovir tedavisi ile iyi kontrol edildi (3 hafta boyunca günde 60 mg/kg IV). Hasta HSE epizodundan önce ve sonra herpes labialis sundu. Hasta, HSE atağından bu yana majör nörolojik sekellerden muzdariptir. 24

        İnsan TLR3 (4q35) beş eksona sahiptir, bunlardan ekson 1 ve ekson 2 ve ekson 5'in parçaları kodlamasızdır. TLR3 bir lider dizi, bir LRR alanı, bir transmembran alanı ve bir TIR alanından oluşan 904 amino asitlik bir proteini kodlar. UNC-93B eksikliği ilk olarak üç hastada dışlandı. İki hasta ilgisizdi ve aynı heterozigot ikameye sahipler. TLR3 1660 nükleotid pozisyonunda (c.1660C>T), bağımsız mutasyon olaylarının bir sonucu olarak. Mutasyon, dsRNA'nın TLR3'e bağlanması için kritik bir bölge olan LRR alanında yer alan 554 (P554S) kalıntısında bir prolinin bir serin ile değiştirilmesine yol açar. P554S aleli, kesilmiş bir proteini kodlar ve fonksiyon kaybı olduğu ve otozomal dominant (AD) TLR3 eksikliği veren baskın bir negatif etkiye sahip olduğu gösterilmiştir. 20,24 Üçüncü hasta, P554S için bileşik heterozigot ve c.2236G>T ikamesiydi. c.2236G>T mutasyonu, 746 (E746X) kalıntısında bir sonlandırma kodonu ekler. E746X proteini TIR alanından yoksundur ve anormal glikosilasyon nedeniyle iki farklı moleküler kütlenin mutant proteinleri saptanabilir. 24 E746X'in bir fonksiyon kaybı aleli olduğu bulundu. Hasta bu nedenle iki işlev kaybı için bileşik heterozigottur. TLR3 alelleri vardır ve tam TLR3 eksikliğinin AR formuna sahiptir. AR hastasının E746X mutasyonu için heterozigot olan annesinden alınan fibroblastlar, poli (I:C)'ye normal yanıt verir ve bu da E746X'in baskın olmadığını düşündürür. 24 Bildirilen hastalardan altı akraba, P554S mutasyonu için heterozigottu. HSV-1 seropozitiftiler ancak HSE'den muzdarip değillerdi, bu da P554S TLR3 mutasyonunun eksik klinik penetrasyon ile HSE'ye AD yatkınlığı sağladığını düşündürür. 20,24

        TLR3 eksikliği olan dördüncü bir hasta, heterozigot TLR3 P554S mutasyonu, tespit etmeyi amaçlayan bir ankette tespit edildi TLR3 Almanya'dan biyopsi ile kanıtlanmış enteroviral miyokarditli 57 hastada varyantlar. Hasta 54 yaşında coxsackievirus B3 (CVB3) miyokarditinden muzdaripti. 22

        AD ve AR TLR3 eksikliği olan PBMC'ler, HSV-1 ve poli (I:C) dahil olmak üzere test edilen 11 virüse yanıt olarak normal IFN-a, IFN-p ve/veya IFN-λ üretimi sergiledi. 20,24 Poli (I:C) veya HSV-1 ile uyarılan AR TLR3 eksikliği olan hastadan alınan farklı monosit ve monosit türevli makrofaj alt gruplarında (MDM'ler) normal bir antiviral IFN veya IFN ile indüklenebilir gen üretimi de gözlendi. . 24 Poli (I:C)'ye yanıt, AD TLR3 eksikliği olan hastalardan alınan pDC'lerde ve miyeloid DC'lerde (mDC) de normaldi. 20 Bu veriler, bu lökositlerin HSV-1'e yanıt olarak antiviral IFN indüksiyonu için sağlam bir TLR3 yolu gerektirmediğini göstermektedir. Ayrıca TLR3 eksikliği olan hastalarda HSE seyri sırasında dissemine hastalık olmamasını ve başka viral hastalıkların olmamasını açıklayabilir. 20,24 Monosit türevli dendritik hücreler (MDDC'ler), NK hücreleri ve CD8 α/β T hücreleri gibi diğer hücre tipleri, antiviral IFN üretimi açısından poli (I:C) stimülasyonuna yanıt vermemiştir. 20 TLR3 mutasyonundan etkilenmesine rağmen, NK ve CD8 T hücrelerinin TLR3-heterozigot çocuklarda HSE patogenezine katkısı, NK ve T hücre eksiklikleri olan hastaların yanı sıra CD8- ve HLA-I eksikliği olan hastalar, HSE'ye özellikle yatkın değildir. 103,117 Poli (I:C), HSV-1 ve VSV ile stimülasyona yanıt olarak IFN-β ve -λ ve IL-6 üretimi AR ve AD TLR3 eksikliği olan fibroblastlarda bozulur, ancak yüksek AD TLR3 eksikliği olan hastalardan alınan fibroblastlarda poli (I:C) konsantrasyonları gözlenir. Bozulmuş TLR3 sinyali ayrıca HSV-1 veya VSV ile enfeksiyonu takiben hastalardan alınan fibroblastlarda yüksek düzeyde viral replikasyona ve hücre ölümüne yol açar. AR TLR3 eksikliği olan hastadan alınan fibroblastlar poli (A:U) ile stimüle edildiğinde benzer sonuçlar gözlendi ki bu görünüşte TLR3'ü poli (I:C)'den daha spesifik olarak uyarıyor. 24 Yabani tip veya P554S ile transfekte edilmiş bir HEK293 hücre çizgisi (insan embriyonik böbrek hücrelerinden türetilmiştir) TLR3 mutasyonun ayrıca CVB3 replikasyonunda önemli bir artışla sonuçlandığını gösterdi. 22 Genel olarak, TLR3'ten bağımsız dsRNA'ya yanıt veren yolların aktivasyonu, TLR3 yolunu içeren eksiklikleri olan hastalarda HSV-1 ve muhtemelen CVb3 dışındaki virüslerin kontrolüne katkıda bulunabilir. 109,110,118–120


        SiRNA deneyleri için önerilen kontroller ve kontroller

        Artan sayıda laboratuvar, bir proteinin hücreler içindeki işlevini değerlendirmek için sürecin bir parçası olarak siRNA yıkım tekniğini kullanıyor. Teknik genellikle proteinin hücrelerden uzaklaştırılmasının etkisini belirlemek için kullanılır:

        • Hücre ölür mü? Ölümcül bir nakavt mı?
        • Diğer proteinlerin ekspresyon seviyesini etkiler mi (özellikle sinyal yollarında)?
        • Hücre içindeki diğer proteinlerin yerini etkiler mi?
        • Hücre fenotipini, morfolojisini, fonksiyonunu nasıl etkiler?

        SiRNA'ya kısa giriş

        Küçük enterferans yapan RNA (siRNA'lar), hücrede çeşitli rollere sahip 20-25 nükleotid uzunluğunda çift sarmallı RNA molekülleridir. Bunlar, tamamlayıcı mRNA'ya hibritleşerek gen ekspresyonuna müdahale ettikleri RNA interferans (RNAi) yolunda yer alırlar. moleküller. Bu, belirli bir gen için mRNA bozulmasını ve gen ekspresyonunun baskılanmasını tetikler.

        siRNA'lar ilk olarak 1999'da David Baulcombe'un laboratuvarı tarafından keşfedildi. 2001'de, sentetik siRNA'ların Thomas Tuschl tarafından memeli hücrelerinde RNA interferansını (RNAi) indüklediği aşağıdaki makalede gösterildi:

        Elbashir S, Harborth J, Lendeckel W, Yalçın A, Weber K, Tuschl T (2001). "21-nükleotid RNA'ların dupleksleri, kültürlenmiş memeli hücrelerinde RNA enterferansına aracılık eder". Doğa 411 (6836): 494-498. PubMed 11373684.

        RNA'nın hedef dizilerini hibridize etmek ve onları parçalamak için tasarlanan "sentetik" siRNA oligoları, artık hücrelerde RNAi'yi indüklemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Hedeflenen mRNA'nın bozunması, karşılık gelen proteinin ekspresyonunu etkin bir şekilde "devre dışı bırakır". Hedef proteinin azaltılmış seviyelerinin etkileri daha sonra analiz edilebilir.

        O nasıl çalışır?

        1. Çift sarmallı RNA (dsRNA), kısa bir oligo siRNA veya bir siRNA'nın kopyalanabileceği bir DNA plazmidi kullanılarak hücreye verilir.
        2. Hücredeki Dicer proteini, dsRNA'yı 21 bp dsRNA'ya (siRNA) sindirir.
        3. siRNA'lar, RNA Kaynaklı Susturma Kompleksine (RISC) entegre edilir.
        4. Bu RISC kompleksi içinde, dsRNA'lar zincir ayrılmasına uğrar. Antisens iplik, hücredeki tamamlayıcı / hedef mRNA'ya hibritleşir.
        5. Aktive edilmiş RISC içindeki nükleazlar, hedeflenen mRNA'yı bozar.
        6. Parçalanmış mRNA, proteine ​​çevrilemez. Bu, proteinin ifade edilemeyeceği ve proteinin nakavt edilmesiyle sonuçlanacağı anlamına gelir.

        Optimum nakavt için siRNA dizisinin optimizasyonu

        Yıkmak istediğiniz proteinin mRNA dizisinden en uygun siRNA dizisini sağlamaya yardımcı olacak birçok çevrimiçi program mevcuttur.
        Bu bilgisayar programları, aşağıdakilere dayalı olarak proteinin tam uzunluktaki mRNA'sı boyunca 21 bp dizisini puanlar:

        1. AUG başlangıç ​​kodonunun 50-100 nükleotidi içinde veya sonlandırma kodonunun 50-100 nükleotidi içinde yer alan dizi (kopyalanan genin susturulmasını sağlamak için).
        2. siRNA dizisi AA ile başlar (antisens dizisinin 3'-ucunda dTdT kullanımına izin verir). Bu, sentez maliyetini düşürür ve siRNA dupleksini eksonükleaz aktivitesine karşı daha dirençli hale getirir.
        3. GC içeriği: İdeal olarak GC içeriği < %50'dir (çoğu yazılım varsayılanı %40 ila %50 arasındadır)
        4. Nükleotid tekrarlarının uzantıları.
          Üç veya daha fazla G veya C tekrarı içeren dizilerden kaçınır
          (Etkili hibridizasyonu önleyen molekül içi ikincil yapıları başlatır)
        5. Hızlı Arama ('hedeflemeyi' önlemek için).

        Bir hedef dizi seçildikten sonra, hedef dizinizin diğer gen dizileriyle homolog olmadığından emin olmak için bir BLAST araştırması başlatılır.
        Genel bir kural olarak, programın sağladığı en yüksek puana sahip üç siRNA dizisini seçin ve deneyin, bu size birinin işe yaraması için yüksek bir şans verecektir.
        Not – bu genellikle dergi yayınları için editörler tarafından beklenir.
        Kombinasyonları kullanın – üç SiRNA ile başlayın ve bire kadar ölçeklendirin
        Aynı anda ikiden fazla geni devirmek mümkündür, ancak önce ayrı ayrı optimize edilir.

        SiRNA deneyleri için önerilen kontroller ve kontroller

        Aşağıdaki bölüm, siRNA deneylerinize dahil etmenizi önerdiğimiz kontrol örnekleri hakkında bilgi sağlar. Ayrıca deneyi tasarlarken ve gerçekleştirirken yapılması gereken kontrollere ilişkin bilgileri de içerir.

        Hücre hattı – yüksek transfeksiyon verimliliğine sahip olduğu bilinen bir hücre hattını içerir.
        Örneğin. 292, HeLa, MRC5, U2OS (Birincil hücreleri kullanmamanızı tavsiye ederiz – kolayca transfekte olmazlar).

        siRNA içermeyen bir endojen pozitif kontrol örneği.
        İlgilenilen protein için bir pozitif kontrol ve siRNA nakavt için bir negatif kontrol olarak. siRNA dışındaki tüm reaktifler eklenmelidir, bu, transfeksiyon reaktiflerinden herhangi bir etkiyi kontrol eder.

        siRNA oligo veya plazmit miktarını optimize etmek için bir doz yanıt eğrisi kullanın.
        Optimum bir siRNA konsantrasyonu bulmak için. Nakavt oluşturmak için yeterli siRNA olmalıdır, ancak RISC kompleksini aşırı aktive etmeyen veya diğer reaktiflerden toksik etkilere neden olmayan bir konsantrasyonda olmalıdır.

        Etiketli siRNA - transfeksiyonu doğrulamak için örneğin GFP etiketi floresanını gözlemleyin.
        Hücrelere eklenen siRNA'nın küçük bir yüzdesi, transfeksiyonu doğrulamak için floresan olarak etiketlenebilir (örneğin GFP). Toplam siRNA'nın yalnızca küçük bir yüzdesi etiketlenmelidir, geri kalanı etiketlenmemelidir çünkü etiket RNA bağlanmasını önleyecektir.

        Hücrelerin canlılığını kontrol etmek için toksisite kontrolleri.
        Bazı reaktifler toksik olabileceğinden transfeksiyon toksisitesini hesaplayın ve izleyin. Bu, örneğin ölü hücreleri tespit etmek için çeşitli hücre lekeleri kullanılarak hücre canlılığının kontrol edilmesiyle yapılabilir, örn. tripan mavisi.

        İndüklenmiş / indüklenmemiş.
        siRNA, indüklenebilir bir promotöre sahip bir plazmitten eksprese ediliyorsa, hem indüklenmiş hem de indüklenmemiş transfekte edilmiş numuneler test edilmelidir.

        siRNA negatif kontrolü (saçma / karıştırılmış bir dizi ile siRNA kullanarak).
        siRNA, bir dizi başka yolla kesişir, bu nedenle spesifik olmayan etkiler tetiklenebilir.
        MikroRNA'lar, gen ekspresyonunu büyük ölçüde bir hedef mRNA ile tamamlanmamış hibridizasyon yoluyla modüle eder ve bir siRNA'nın eklenmesi, istenmeyen hedeflemeye neden olabilir.

        siRNA'nın (bilgisayar programları) sırasını kontrol edin – BLAST araması.
        siRNA'nın yalnızca ilgilendiğiniz proteinle ilgili mRNA'ya hibridize olmasını sağlamak için siRNA dizilerinde hızlı arama yapın.

        'Sahte' kontrol.
        Başka bir protein siRNA kullanın, ör. RISC sinyal yolunun aktivasyonunu kontrol etmek için GAPDH (hedef protein siRNA'sı olmadan) ve ayrıca bunun genel hücre fonksiyonunu etkilemediğini kontrol edin.

        mRNA'nın ve mevcut proteinin bozunma süresini kontrol edin.
        Protein ne kadar büyükse, hem proteinin hem de ilişkili mRNA'nın yarı ömrü o kadar uzun olur. siRNA yıkımının hücreler üzerinde etkili olması için gereken süreyi optimize etmeniz gerekebilir.

        Kurtarma deneyi kontrolü.
        Proteini yeniden tanıtmak için hücreleri rekombinant proteinle transfekte edin. Genellikle dergiler tarafından yayınlanmak üzere talep edilir.

        Sonuçların değerlendirilmesi – uygulama kontrol örnekleri (örn. pozitif ve negatif kontroller).
        Sonuçları değerlendirmek için kullandığınız uygulama için gerekli tüm kontrolleri eklediğinizden emin olun. Bu, endojen pozitif ve negatif kontrolleri içerecektir.

        Sonuçların değerlendirilmesi:

        RT-PCR
        mRNA'nın varlığını kontrol etmek için. Hedeflenen mRNA hala mevcut mu? Yoksa nakavt başarılı oldu mu?
        Çok hassastır ancak beklenen protein seviyelerine ilişkin doğru bir tahminde bulunmaz.

        Batı lekesi
        Proteinin varlığını veya yokluğunu gösterir. Ayrıca numunedeki birkaç proteini tespit etmek için antikorları kullanabilir ve bu nedenle hedef proteinin nakavtının diğer proteinler üzerindeki etkisini gözlemleyebilir.

        immünositokimya
        Nakavt proteinin varlığını veya yokluğunu gösterir.
        Avantaj – çift boyama, böylece diğer proteinlerin ekspresyonu ve hücresel yerleşimi üzerindeki etkiyi de kontrol edebilir.

        Sorun giderme özeti

        1. Sıralamayı nasıl seçtiniz? Birden fazla siRNA dizisi denediniz mi? Dizinin proteine ​​uygun olup olmadığını kontrol edin.
        2. Transfeksiyon verimliliğini kontrol ettiniz ve nakavtın etkili olması için süreyi optimize ettiniz mi?
        3. Floresan etiketleri ile transfeksiyonu ve RT-PCR ile nakavtı kontrol ettiniz mi?
        4. Doğru endojen pozitif ve negatif kontrolleri kullandınız mı? Şifreli siRNA veya standart negatif siRNA kontrolleri kullandınız mı?

        Kaynaklar

        • Ücretsiz çevrimiçi siRNA tasarımı ve flash öğretici. hedef seçimi için mRNA veya cDNA dizisinin elde edilebildiği biyomedikal ve genomik bilgilere erişim sağlar.
        • UCSC Genom Web Sitesinde Blat aracı.


        Videoyu izle: Yaşamın Kökeni: RNA NOVA Laboratuvarları. RNA: Harika Molekül (Haziran 2022).