Bilgi

23.2: Genomik Yaklaşımlar - DNA Mikroarray - Biyoloji

23.2: Genomik Yaklaşımlar - DNA Mikroarray - Biyoloji


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Geleneksel olarak, bir proteinin hücresel seviyelerinin kimyasal bir efektöre yanıt olarak değiştiği bilindiğinde, moleküler çalışmalar onun geninin transkripsiyonunun kontrolüne odaklandı. Bu çalışmalar genellikle gen ekspresyonunun kontrolünün, transkripsiyon faktörlerinin DNA ile etkileşimleri yoluyla bir geni açıp kapatarak, transkripsiyon düzeyinde olduğunu ortaya çıkardı. Bununla birlikte, protein seviyeleri, mRNA translasyonu veya bozunma hızını düzenleyerek transkripsiyon sonrası olarak da kontrol edilir. Transkripsiyonel ve posttranskripsiyonel düzenleme mekanizmaları üzerine yapılan çalışmalar, doğru proteinin doğru zamanda doğru miktarlarda nasıl yapıldığını anlamamız için ufuk açıcıdır.

Şüphelenmiş olabiliriz, ancak şimdi biliyoruz ki gen ekspresyonunun ve hücresel tepkilerin kontrolü, tek bir genin transkripsiyonunu veya tek bir proteinin translasyonunu artırmak veya azaltmaktan daha karmaşık olabilir. Tüm genom dizileri ve yeni teknikler, bir hücredeki hemen hemen tüm genlerin ekspresyonunun aynı anda çalışılmasını mümkün kılar. genomik. Genomik çalışmalar, bir organizmadaki gelişimsel ve fizyolojik değişiklikleri daha tam olarak açıklamak için anlaşılması gereken düzenlenmiş gen ağlarını ortaya çıkarır. Bir hücredeki aktif genlerden kopyalanan tüm RNA'ları "görebildiğiniz" zaman, bir hücrenin transkriptome. Genomiklere benzeterek, transkriptomik Etkileşimli RNA'ların "ağları" çalışmalarını tanımlar. Yine genomik ve transkriptomik analojiyle, hücrelerdeki veya dokulardaki aktif ve aktif olmayan proteinlerin, kullanımdan önce nasıl değiştirildiklerini (işlendiğini) ve nasıl etkileşime girdiklerini kapsamlı bir şekilde incelemeye denir. proteomik. Proteomik çalışmalara uygulanan teknolojiler arasında protein mikrodizileri, immünokimyasal teknikler ve benzersiz olarak protein analizine uygun olan diğerleri bulunur (daha fazla bilgi için Proteomik Teknikleri-Wikipedia'ya tıklayın). Protein Mikrodizileri protein-protein etkileşimlerinin yanı sıra farklı hücresel koşullar altında proteinlerin farklı durumlarını tanımlamak için giderek daha fazla kullanılmaktadır. Bu heyecan verici gelişmeler ve bunların temel ve klinik araştırmalar üzerindeki etkileri hakkında ncbi'den Protein Microarrays'de daha fazlasını okuyun.

Son olarak şunu bir düşünün: genomik bir kütüphaneye benzer bir proteomik kütüphane yaratmak göz korkutucu bir ihtimal gibi görünebilir. Ama çabalar sürüyor. Dokuya özel bir insan proteomunun örneklenmesine yol açan orijinal araştırma için İnsan Proteomunun haritalanmasında bir bıçak bölümüne bakın ve daha genel bilgi için Proteome Yaklaşma Stratejileri'ne tıklayın. DNA mikrodizilerinin bazı kullanımlarına bakalım. Bu teknoloji, bir cam slayt veya çip üzerinde DNA'yı (örneğin, bir genomik veya cDNA kitaplığından klonlanmış DNA, PCR ürünleri, oligonükleotitler…) "lekelemeyi" içerir. Mikrodizi analizi dilinde, slaytlar problardır. Bir çipi tespit etmek robotik bir işlemdir. DNA lekeleri mikroskobik olduğundan, hücreye özgü bir transkriptom (cDNA kitaplığı) tek bir çipe sığabilir. Küçük bir genom mikrodizisi de tek bir çipe sığabilirken, daha büyük genomların birkaç slayta ihtiyacı olabilir. DNA mikrodizilerinin birincil kullanımı, transkripsiyonel profil oluşturma. Bir genomik mikrodizi, belirli bir anda hücrelerde ifade edilen genlerin çoğunu (tümü değilse de) (yani, transkriptomunu) tanımlamak için mRNA'lardan yapılan flüoresan etiketli hedef cDNA'ların bir karışımını araştırabilir. cDNA mikrodizi probları, normal farklılaşma sırasında veya kimyasal sinyallere yanıt olarak hücrelerde veya dokularda gen ekspresyonundaki nicel farklılıkları da araştırabilir. Ayrıca genotipleme için de değerlidirler (yani bir organizmadaki genleri karakterize etmek). Mikrodiziler o kadar hassastır ki, tek bir nükleotit ile farklılık gösteren iki gen veya DNA bölgesini bile ayırt edebilirler. Daha fazla bilgi için Tek Nükleotid Polimorfizmleri veya SNP'ler üzerine tıklayın. Aşağıdaki mikrodizide, her renkli nokta (kırmızı, sarı, yeşil), mikrodizideki hedef dizilere hibritleşen farklı floresan etiketli bir moleküldür. Floresan mikroskobunda, noktalar UV ışığına tepki olarak farklı renklerde floresan yayar.

Kantitatif mikrodizi yöntemleri ile her bir probdan gelen sinyalin parlaklığı (yoğunluğu) ölçülebilir. Bu şekilde, hücredeki nispi cDNA (ve dolayısıyla farklı RNA'lar) miktarlarını karşılaştırabiliriz. transkriptome farklı dokulardan veya farklı doku tedavilerinden kaynaklanan Bir sonraki sayfada mikrodizilerin farklı uygulamalarının bir tablosu (Wikipedia'dan uyarlanmıştır) gösterilmektedir.

Teknolojinin Uygulanmasıözet
Gen İfadesi ProfillemeBir transkripsiyon (mRNA veya gen ekspresyonu) profilleme deneyinde, belirli tedavilerin, hastalıkların ve gelişim aşamalarının gen ekspresyonu üzerindeki etkilerini incelemek için binlerce genin ekspresyon seviyeleri aynı anda izlenir.
karşılaştırmalı genomik hibridizasyonBir organizmanın genomunun farklı bir türden bir hedef genom için prob olduğu, farklı hücrelerde veya yakından ilişkili organizmalarda genom içeriğinin değerlendirilmesi.
gen kimliğiGenetiği değiştirilmiş organizmalar (GDO'lar), hücre kültüründeki mikoplazmalar veya hastalık tespiti için patojenler için gıda ve yemdeki organizmaların kimliklerini kontrol etmek için küçük mikrodiziler. Bu algılama protokolleri genellikle PCR ve mikroarray teknolojisini birleştirir.
YONGA; kromatin immünopresipitasyonBelirli bir proteine ​​bağlanan DNA dizileri, proteinin immüno-çökeltilmesiyle izole edilebilir. Parçalar, genom boyunca protein bağlama bölgesi işgalinin belirlenmesine izin veren bir mikro diziye (bir döşeme dizisi gibi) hibritlenebilir.
baraj kimliğiChIP'ye benzer şekilde, ilgili bir protein tarafından bağlanan genomik bölgeler izole edilebilir ve bağlanma bölgesi doluluğunu belirlemek için bir mikrodiziyi araştırmak için kullanılabilir. ChIP'den farklı olarak, DamID antikorlara ihtiyaç duymaz, ancak bakteriyel DNA adenin metiltransferaz ile kaynaştırılmış ilgili proteinin çok küçük miktarlarını ifade ederek bu bölgeleri seçici olarak büyütmek için proteinin bağlanma bölgelerinin yakınında adenin metilasyonunu kullanır.
SNP algılamaPopülasyonlar içindeki veya arasındaki aleller arasında tek nükleotid polimorfizminin belirlenmesi. Bazı mikrodizi uygulamaları, Genotipleme, adli analiz, hastalığa yatkınlığın ölçülmesi, ilaç adaylarının belirlenmesi, değerlendirme dahil olmak üzere SNP tespitinden yararlanır. germ hattı bireylerde mutasyon veya somatik kanserlerdeki mutasyonlar, heterozigotluk kaybının değerlendirilmesi veya genetik bağlantı analizi.
Alternatif ekleme korumasıBir ekson bağlantı dizisi tasarımı, bir gen için öngörülen ekzonların beklenen veya potansiyel birleşme bölgelerine özgü probları kullanır. Tipik bir gen ekspresyon dizisine (gen başına 1-3 prob ile) ve bir genomik döşeme dizisine (gen başına yüzlerce veya binlerce prob ile) orta yoğunlukta veya kapsama alanındadır. Bir genin alternatif ek formlarının ekspresyonunu tahlil etmek için kullanılır. Ekson dizileri, bilinen veya tahmin edilen genler için her bir eksonu tespit etmek üzere tasarlanmış probları kullanan farklı bir tasarıma sahiptir ve farklı birleştirme izoformlarını tespit etmek için kullanılabilir.
döşeme dizisiGenom döşeme dizileri, bazen bütün bir insan kromozomu kadar büyük, ilgilenilen bir genomik bölgeyi yoğun bir şekilde temsil etmek üzere tasarlanmış örtüşen problardan oluşur. Amaç, daha önce bilinmeyen veya tahmin edilmemiş olabilecek transkriptlerin veya alternatif olarak eklenmiş formların ekspresyonunu ampirik olarak tespit etmektir.

Mikrodizilerin Gücü. https://youtu.be/88rzbpclscM

Dünya rekorlarını seviyorsanız, kendi genomumuzdan 10 kat daha büyük olan en büyük genoma sahip semendere bir göz atın: BÜYÜK Axolotl Genomu. Bütün bu DNA ile ne yapıyorlar? Ve mevcut teknolojilerimiz bunu çözebilir mi? Orijinal rapor için aşağıdaki bağlantıya tıklayın: buraya.


Mikrodiziler

Frederick D.Park, . Tannishtha Reya , Klinik Araştırmacılar için Temel Bilim Yöntemlerinde , 2017

Duyarlılık, Özgüllük ve Bilinen Dizilere Bağlılık

Mikrodiziler, RNA-Seq'den hem daha az duyarlı hem de daha az spesifiktir. Mikrodizi prob kapsamı aralığı tamamen önceki dizi bilgisine bağlıdır, oysa RNA-Seq, tüm transkriptomun kapsamlı bir görünümünü sağladığı için bu tür bilgilerle önyargılı veya sınırlı değildir. Ve böylece, yüksek yoğunluklu mikrodiziler boşluğu daraltıyor olsa da, mikrodiziler, RNA-Seq tarafından tespit edilebilen yeni transkriptleri veya izoformları hala kaçırabilir. Ek olarak, RNA-Seq tarafından bulunan SNP'ler, RNA transkriptlerinde ifade edildikleri için hem yeni hem de daha bilgilendirici olabilir, oysa mikrodiziler sadece genomik DNA'da bilinen SNP'leri tespit eder. Mikrodizilerin bir başka dezavantajı, yeni dizi verileri kullanılabilir hale geldikçe, daha önceki mikrodizi verilerinin geçersiz hale gelebilmesidir. Yeni diziyi kapsayan daha yeni bir mikro diziyle bir dizi numunenin yeniden çalıştırılması gerekirken, daha kapsamlı RNA-Seq verileri alakalı kalacaktır. RNA-Seq ayrıca konakçıyı parazit transkriptlerinden ayırt edebilir ve önceden dizi bilgisi olmaksızın herhangi bir organizmanın transkriptlerini inceleyebilir. Bu, özellikle tek bir suş içinde bile genomik dizilimde büyük varyasyonlara sahip olan bakteriler için faydalıdır.

Mikrodiziler aynı zamanda nükleik asit hibridizasyonuna dayandıkları için RNA-Seq'ten daha az duyarlı ve spesifiktir. Prob dizileri, bir hedef diziye iyi bir özgüllük için seçilse de, bir prob, tek bir hedefe tamamen özgü olmayabilir. Ayrıca, floresan boyalar hibridizasyonu farklı şekilde etkileyebilir. Bu temel fark göz önüne alındığında, mikrodizi verilerinin RNA-Seq verilerine karşı sırasıyla "analog" ve "dijital" olduğu söylenebilir. Mikrodiziler, yalnızca prob yoğunluklarını karşılaştırarak göreli ifade sağlayabilir. RNA-Seq gibi transkript ifadesinin mutlak miktarını sağlamazlar. Ek olarak, mikrodiziler, bolluğun her iki ucunda da doğrusal olmayan hibridizasyon kinetiği nedeniyle daha az potansiyel dinamik aralığa sahiptir - problar yüksek bolluk hedefleri tarafından doyurulabilir ve çok düşük bolluk hedefleri ile arka plan gürültüsünün üzerinde çok az sinyal verebilir. Artan dizileme derinliği ile RNA-Seq, düşük bolluklu transkriptler için çok daha iyi hassasiyet ve sinyal-gürültü oranı sunar.


DNA mikrodizisi ne için kullanılır?

İlk ortaya çıktıklarında, DNA mikrodizileri yalnızca bir araştırma aracı olarak kullanıldı. Bilim adamları bugün büyük ölçekli popülasyon çalışmaları yürütmeye devam ediyor - örneğin, belirli bir mutasyona sahip bireylerin gerçekte ne sıklıkla meme kanseri geliştirdiğini belirlemek veya belirli hastalıklarla en sık ilişkili olan gen dizilerindeki değişiklikleri belirlemek. Bu mümkün olmuştur, çünkü bilgisayar çiplerinde olduğu gibi, insan genomunun çok büyük bir bölümünü temsil eden mikrodizi çiplerine çok sayıda "özellik" yerleştirilebilir.

Mikrodiziler, hücrelerde ve dokularda belirli genlerin ne ölçüde açılıp kapandığını incelemek için de kullanılabilir. Bu durumda, örneklerden DNA'yı izole etmek yerine, RNA (DNA'nın bir kopyası olan) izole edilir ve ölçülür.

Günümüzde DNA mikrodizileri bazı hastalıkların klinik tanı testlerinde kullanılmaktadır. Bazen, belirli bireyler için hangi ilaçların en iyi şekilde reçete edilebileceğini belirlemek için de kullanılırlar, çünkü genler vücudumuzun bu ilaçlarla ilgili kimyayı nasıl idare ettiğini belirler. geçmişte artık bunun yerine DNA dizilimi kullanılıyor. Ancak mikrodizi testleri hala dizilemeden daha ucuz olma eğilimindedir, bu nedenle çok büyük çalışmalarda ve bazı klinik testler için kullanılabilirler.

İlk ortaya çıktıklarında, DNA mikrodizileri yalnızca bir araştırma aracı olarak kullanıldı. Bilim adamları bugün büyük ölçekli popülasyon çalışmaları yürütmeye devam ediyor - örneğin, belirli bir mutasyona sahip bireylerin gerçekte ne sıklıkla meme kanseri geliştirdiğini belirlemek veya belirli hastalıklarla en sık ilişkili olan gen dizilerindeki değişiklikleri belirlemek. Bu mümkün olmuştur, çünkü bilgisayar çiplerinde olduğu gibi, insan genomunun çok büyük bir bölümünü temsil eden mikrodizi çiplerine çok sayıda "özellik" yerleştirilebilir.

Mikrodiziler, hücrelerde ve dokularda belirli genlerin ne ölçüde açılıp kapatıldığını incelemek için de kullanılabilir. Bu durumda, örneklerden DNA'yı izole etmek yerine, RNA (DNA'nın bir kopyası olan) izole edilir ve ölçülür.

Günümüzde DNA mikrodizileri bazı hastalıkların klinik tanı testlerinde kullanılmaktadır. Bazen, belirli bireyler için hangi ilaçların en iyi reçete edilebileceğini belirlemek için de kullanılırlar, çünkü genler vücudumuzun bu ilaçlarla ilgili kimyayı nasıl idare ettiğini belirler. Yeni DNA dizileme teknolojilerinin ortaya çıkmasıyla birlikte, mikrodizilerin kullanıldığı bazı testler geçmişte artık bunun yerine DNA dizilimi kullanılıyor. Ancak mikrodizi testleri hala dizilemeden daha ucuz olma eğilimindedir, bu nedenle çok büyük çalışmalarda ve bazı klinik testler için kullanılabilirler.


Protein konumunun kromatin immünopresipitasyon ve mikrodizi tabanlı analizi

ChIP-Chip olarak da bilinen genom çapında lokasyon analizi, canlı hücrelerde meydana gelen protein-DNA etkileşimlerini tanımlamak için kromatin immünopresipitasyon ve DNA mikrodizi analizini birleştirir. Protein-DNA etkileşimleri, kimyasal çapraz bağlama ile in vivo olarak yakalanır. İstenen proteinin hücre lizizi, DNA fragmantasyonu ve immünoafinite saflaştırması, o proteinle bağlantılı DNA fragmanlarını birlikte saflaştıracaktır. Zenginleştirilmiş DNA popülasyonu daha sonra etiketlenir, farklı şekilde etiketlenmiş bir referans numune ile birleştirilir ve zenginleştirilmiş sinyalleri algılamak için DNA mikrodizilerine uygulanır. Daha sonra zenginleştirilmiş ve referans kanalları normalleştirmek, sinyalleri DNA mikrodizilerinde temsil edilen genom bölümlerine bağlamak, güven ölçümleri sağlamak ve protein-genom doluluk haritaları oluşturmak için çeşitli hesaplama ve biyoinformatik yaklaşımlar uygulanır. Burada, hücrelerin çapraz bağlanmasından etiketli malzemenin hibridizasyonuna kadar kullandığımız deneysel protokolleri ve bu protokollerin sonuçları etkileyen yönlerine ilişkin içgörüleri açıklıyoruz. Bu protokoller, yeterli sayıda hücre elde edildikten ve birçok farklı hücre ve doku tipinde sağlam, yüksek kaliteli ChIP-çip sonuçları üretmek için kullanıldığından tamamlanması yaklaşık 1 hafta gerektirir.

Rakamlar

Örnek bir zaman çizelgesi…

ChIP-Chip protokolü için örnek bir zaman çizelgesi. Bireysel adımlar beyaz olarak gösterilir…

Farklı derecelerde sonuçların…

Parça boyutunda değişen derecelerde sonikasyonun sonuçları. Toplam 2…

Giriş DNA'sının bir örneğini gösteren %2 agaroz jel, LMPCR amplifikasyonundan sonra DNA...

Hibritleştirilmiş dizi örnekleri ve…

Hibritleştirilmiş diziler ve dağılım grafiği örnekleri. ( a ) Bir parça…

Genomik bölgeleri tanımlamak için işlenen bir diziden veri örnekleri…


Genom içeriği ve gen dizilimi

- ama insan genomunda 20.000 gen var. maya 6.000 gendir. yani tek bir hücre organizmasında genlerde o kadar farklı değil.

- Genomumuzdaki dna'mızın çoğu protein kodlamaz = transpozisyon ve evrim yoluyla biriken önemsiz DNA

- bu daha küçük genomların bazıları daha verimli bir şekilde çoğalmalıdır, bizim için sorun değil. genomumuz bu ekstra DNA parçalarına sahip olmaya daha toleranslıdır, tam olarak net değil

- genom büyüklüğü her zaman organizma karmaşıklığı ile eşit değildir

- Çıktığınız 500 baza okuma denir. Tek bir DNA dizi reaksiyonunun çıktısı

Fed tarafından finanse edilen 1.
- 1. yöntem: Mikrobiyal hücrelerde DNA'nın klonlanmasına dayanan ve Sanger dideoksi dizileme tekniğini kullanan ilk insan genomunun diziliminde kullanıldı. Geleneksel WGS.

- 2. yöntem: hücresiz, yüksek verim.

-1, Genomik kütüphane oluştur: koleksiyonu
genomik DNA fragmanları (kısıtlamadan
enzim sindirimi) vektörlere klonlandı
(plazmitler, yapay kromozomlar)
toplu olarak tüm genomu temsil eden

burada bir genomik lib oluşturuyoruz (dna'yı alın, kesin ve bir vektöre klonlayın). vektör bir plazmit gibi olacak, dna kendi kendine otonom olarak çoğalabilir, ama aynı zamanda onu bir bakteriye yerleştirip çoğaltabilir. vektörlere klonlanmış DNA (sadece 6 veya 7 kb plazmitler) ve yapay kromozomlar daha uzun DNA parçalarını tutabilir). böylece bir organizmanın tüm dna dizisini temsil edecek bir kitaplık oluşturursunuz.

- bireysel klonları sıralayın

- ekleri alın ve uçlarını sıralayın. sadece bitiş sırasını belirleyin. çünkü amacınız örtüşmeyi belirlemekse, bunun için en önemli sonuç uçlardır. Hangilerinin örtüştüğünü belirledikten sonra. ve sonra geri dönün ve onları tamamen sıralayın. ama eğer sonları belirleyebilirsen. sonra onları tam olarak birleştirmek için desenler sipariş ettiniz.

- eşleştirilmiş son okumaları kullanın. birden fazla eklentiye sahip olabilirsiniz.
kırmızı ile gösterilen bu vektörün sırasını biliyorsunuz. bu yüzden bu vektörü vektörün sırasına göre tasarlamak kolaydır. böylece bu primerleri tasarlayabilirsiniz. sonra yeşil, mavi, açık yeşil turuncu renkte yeni bir dizi elde edebilirsiniz.

- euk için tekrarlar var, tandem tekrarı max seq okumadan daha uzun. Boşluğu kapatmanın bir yolu yok, bazen yanlış okumalarla aynı hizaya gelirler.

- soln, aynı klondaki genomik eklerin karşıt uçlarından dizi okuma çiftlerinden, eşleştirilmiş uç okumalardan faydalanmaktı.

- iki contig arasındaki boşluğu bulmaya çalışmak. Klonların mesafesi bilindiğinden, eksik boşluğun ne kadar sürdüğünü bilirsiniz.

sonuçta, parçanız arasındaki boşlukların nerede olduğunu anlayarak tek bir sıralı DNA parçası modeli oluşturmayı umuyor. bunu çok sayıda dna parçası için yapın ve çok fazla şey oluşturabilirsiniz. ama sadece bunu yaparak bir kromozom için tüm milyon bazını oluşturamazsınız. dna'nın bir kısmının kütüphanede temsil edilmemesi veya rxn dizilemesinin mükemmel bir şekilde çalıştığı yol boyunca bazı boşluklara sahip olacaksınız.

o zaman geri dönmenin yollarından biri sıralı contig almaktır. bunlar biraz daha uzun dizilerdir (contig). uçlara bakın. aralarında bir boşluk olduğunu söyle. bu uçlar örtüşmez. ya başka bir dna lib oluşturun ya da lib'e tekrar bakın. o bölgeyi kapsayacak bir DNA.
Eğer onu bulursan, kütüphanede bir miktar DNA parçası. boşluğu doldurabileceğini sıralayabilseydin
dna frag contig ve boşluklarının sıralı desenlenmesine iskele denir. İskeleler, bir sipariş olduğu kadar fiziksel bir şey değil, sizin oluşturduğunuz haritalardır.

örneğin, contig a kromozom 1 üzerindedir ve contig b de oradadır ve 2 kb'lik bir boşluk olduğunu biliyorsunuz = iskele.

- genomik kitaplıkları kullanarak dizi boşluklarını köprülemeye bir alternatif

- cdna'yı alın ve uçları sıralayın. sonra etiketler oluşturun. tam seq ile ilgilenmiyorsunuz. sadece hangi genlerin kopyalandığını bilmek istiyorum. uçlardan gelen bilgi, bunun x geni mi yoksa gal4 mi yoksa w/e mi olduğunu bilmek için yeterlidir.

- nt veya AA dizilerinin bir veri tabanında, bir "sorgu" dizisine benzer diziler aranır (örneğin, varsayılan gen)

- fikir şu ki, dna seq ve protein seq'den oluşturulmuş veritabanları var. DNA'nız varsa ve kavramsal bir çeviri yapıyorsanız (üçlü gruplar halinde (kodonlar) dizi parçalarını alın, çevrilmiş amino asidi düşünün ve amino asitleri bir araya getirin ve bilinen protein dizilerine sahip bir veritabanında arama yapın).

- Aslında protein kodlamasıysa, DNA uzantısı ile eşleşme olup olmadığını görebilirsiniz. Blast bir hizalama aracıdır, analizi yapmanıza yardımcı olur. Hesaplamalı araç, ilgili nt veya AA sırasını tanımlamanıza izin verir.

- nt'yi alıp diğer dna dizileriyle karşılaştırabilirsiniz. aa not nt üzerinde analiz yapmak için çok daha güçlü. amino asitlerle daha az seçenek, dolayısıyla daha fazla hizalama gücü. protein dizisini karşılaştırmak çok daha kolay.

- böylece veri tabanını alacaksın, bilinmeyen bir dizi gir. otomatik olarak çevirisini yapın ve i'ye karşı arama yapın, nt'yi alabilir ve diğer dna dizileriyle karşılaştırabilirsiniz. aa not nt üzerinde analiz yapmak için çok daha güçlü. amino asitlerle daha az seçenek, dolayısıyla daha fazla hizalama gücü. protein dizisini karşılaştırmak çok daha kolay. aldığınız eşleşmenin rastgele gerçekleşmesi beklentisiyle bir sayı geri verir.
- varsayılan gen, başka bir organizmadaki bilinen gene benzerdir = ortolog.
Diyelim ki hızlı arama yaptınız, güçlü bir eşleşme buldunuz. bulduğunuz dna dizisi prob korunur. dizinizdeki varsayılan gen, ortolog olarak adlandırılan başka bir organizmadaki bilinen diziye benzer. aynı organizmada benzer/aynı bir gen buldunuz (çoğaltma olayları) - buna ortolog değil paralog denir.

Bunun nedeni, bir ortolog bulursanız, dizilerin işlevi hakkında bir şey çıkarırsanız, kodlanmış proteinlerin benzer şekilde çalışması gerekir.
seq'in aynı organizmada protein çevirdiğini bulursanız, abt işlevinden hiçbir şey çıkaramazsınız - aynı işleve sahip olabilir, olmayabilir. bunlardan biri mutasyon biriktirir (işlevsel olarak faydalı). proteinin farklı işlevleri bu şekildedir. hücrenin tek bir işlev proteini vardır, ancak değişikliklerle kopyalanmış, belki aynı işleve sahip olabilir, ancak kodlanmış proteinin de farklı işlevi olacaktır.


Basit evrim senaryolarını modellemek için laboratuvar koşulları altında mikroorganizmaların veya popülasyonların uzun vadeli seçimi.

Gerçek durumu daha sonraki analizlere kadar bilinmeyen bir genomik varyantın tanımlanması.

Mikrodiziler bağlamında, DNA probu, solüsyona eklenen etiketli bir genomik DNA örneğini araştırmak için bir mikrodiziye eklenen DNA oligonükleotidi, PCR ürünü veya genomik klon anlamına gelir. Southern lekeleme bağlamında, DNA probu, bir zar üzerinde immobilize edilmiş genomik DNA örneğini araştırmak için solüsyona eklenen etiketli DNA oligonükleotidi anlamına gelir.

Milyonlarca probun paralel sentezine izin vererek, ışık kullanarak yeni oluşan oligonükleotitlerin korumasını seçici olarak kaldırmak için maskelerin kullanılması.

Dört DNA bazından birini mikrodizi üzerindeki bir sonda bölgesine yerleştirmek için yazıcı kartuş kafalarının kullanılması.

Floresan yerinde hibridizasyon

(BALIK). Floresan mikroskobu kullanarak belirli bir kromozomu veya geni tespit etmek için floresan olarak etiketlenmiş bir DNA probunun kullanıldığı bir teknik.

Her PCR döngüsü sırasında biriken bir floresan boya tarafından üretilen sinyalin izlenmesiyle bir PCR reaksiyonunun ürünlerinin ölçüldüğü bir prosedür.

Tm (erime sıcaklığı), bir oligonükleotidin, dupleks ipliklerin %50'sinin ayrıldığı sıcaklıktır.

Başka bir mutasyonun fenotipik etkisini baskılayan veya hafifleten mutasyonlar.

Bir genomdaki farklı DNA dizilerinin sayısı, başlangıçta ısıyla denatüre edilmiş DNA'nın yeniden birleşme hızıyla ölçülür.

Bilinen büyüklükte bir DNA parçasının her iki ucundaki dizinin belirlenmesi.

Bilinen bir referansla karşılaştırılarak kesin DNA dizisinin belirlenmesi.

Genellikle Gauss olan temel bir dağılımı varsayan istatistiksel testler. Gauss terimi, şekli varyans tarafından belirlenen, tanımlanmış bir ortalama değer etrafında simetrik olan sürekli bir olasılık dağılımını tanımlar.

(Yonga). Bir antikor vasıtasıyla ilgilenilen bir proteine ​​bağlanan DNA'nın fraksiyonlanması.

Numune ve kontrol arasındaki oranın ilgilenilen metrik olması için dahili bir referans içeren yöntemlerin kullanılması.


KARDİYOVASKÜLER HASTALIKLARDA MikroRNomikler

Kardiyak hipertrofi, hipertansiyon, iskemik kalp hastalığı, kapak hastalıkları ve endokrin bozuklukları gibi bir dizi kardiyovasküler hastalığa ortak bir patolojik yanıttır. Kardiyak hipertrofi genellikle insanlarda kalp yetmezliğine yol açar ve kardiyovasküler hastalıklarda mortalite ve morbiditenin önemli bir belirleyicisidir. miRNA'lar kalp hücrelerinin farklılaşması ve büyümesi için önemli düzenleyicilerdir ve bu nedenle miRNA'ların kalp hipertrofisi ve kalp yetmezliğinde önemli roller oynadığını varsaymak mantıklıdır.

Neredeyse aynı anda, üç bağımsız grup (mevcut yazar dahil), aortik bağlanma veya aktive kalsinörin ekspresyonu ile hipertrofik hale getirilen fare kalplerinin miRNA ekspresyon imzasında dramatik sonuçlar bildirdi (24, 101, 115) (Tablo 1). Her iki hayvan modelinde de miRNA'ların hipertrofik kalplerde anormal şekilde eksprese edildiğine dikkat edilmelidir ve bu sonuçlar, hipertrofili kardiyak miyositlerin in vitro çalışmaları ile doğrulanmıştır (24, 101, 111, 115). Ayrıca, hipertrofik kalplerde yukarı regüle edilen bazı miRNA'ların aşırı ekspresyonu kardiyak miyosit hipertrofisini indüklerken, hipertrofik kalplerde aşağı regüle edilen bazı miRNA'ların aşırı ekspresyonu kardiyak miyosit hipertrofisini önler. Öte yandan, hipertrofik hayvan ve insan kalplerinde upregüle edilen bir miRNA olan miR-21'in inhibisyonu, in vitro olarak hipertrofik kalpleri inhibe eder (24). miR-21'in rolü başka bir grup tarafından da doğrulandı (111). İn vivo, hipertrofik kalplerde yukarı regüle edilen bir miRNA olan miR-195'in aşırı ekspresyonu, kardiyak hipertrofiyi indüklemek için yeterlidir (115), bir gen mutasyonu veya "yem" yaklaşımı, miR-208 ve miR-133'ün rolünü doğrulamıştır. kardiyomiyosit hipertrofisi (20, 114). Birlikte ele alındığında, bu bulgular, birden fazla miRNA'nın kardiyak hipertrofide rol oynadığını ve anormal şekilde eksprese edilen bir miRNA'nın modüle edilmesinin hipertrofiyi modüle etmek için yeterli olduğunu göstermektedir. Bununla birlikte, kardiyak hipertrofi üzerindeki bireysel miRNA aracılı etkilerden sorumlu moleküler mekanizmalar belirsizdir.

Daha yakın zamanlarda miRNA'ların insan kardiyak hipertrofisi ve kalp yetmezliğindeki rolleri birkaç klinik çalışmada aydınlatılmıştır (76, 115, 126). İdiyopatik, son aşama, başarısız insan kalplerinde hipertrofi ile düzenlenen miRNA'ların Northern blot analizi, miR-24, miR-125b, miR-195, miR-199a ve miR-214'ün ekspresyonunun kontrol ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde arttığını gösterir. kalpler (115). Tespit edilen 87 miRNA'dan kırk üçü, iskemik kardiyomiyopati, dilate kardiyomiyopati veya aort stenozu (87) bulunan kalplerde anormal şekilde eksprese edilir ve bu, miRNA'ların gerçekten insan kardiyak hipertrofisi ve kalp yetmezliğinin patofizyolojisinde rol oynadığını gösterir.

Neointimal lezyon oluşumu, ateroskleroz, koroner kalp hastalıkları, postanjiyoplasti restenozu ve transplantasyon arteriyopatisi gibi çeşitli kardiyovasküler hastalıklarda bulunan yaygın bir patolojik lezyondur. Mikrodizi analizi ve iyi kurulmuş bir neointimal oluşum modeli kullanarak, neointimal lezyon oluşumu ile vasküler duvardaki miRNA ekspresyon profilini belirledik (24). Normal, yaralanmamış arterlerle karşılaştırıldığında, mikroarray analizi, anormal miRNA ekspresyonunun anjiyoplasti sonrası vasküler duvarların bir özelliği olduğunu göstermiştir. Sıçan karotid arterinde yüksek oranda eksprese edilen ve anjiyoplasti sonrası birden fazla kat yukarı regüle veya %50 aşağı regüle olan bu miRNA'lar ayrıca qRT-PCR ve/veya Northern blot analizi ile doğrulandı (24). Anormal şekilde aşırı eksprese edilmiş bir miRNA, miR-21'in antisens aracılı yıkım yoluyla modüle edilmesi, anjiyoplasti sonrası sıçan arterinde neointimal lezyon oluşumu üzerinde önemli ölçüde olumsuz bir etkiye sahiptir (Şekil 2). Bu sonuçlar miRNA'ların proliferatif vasküler hastalıkların gelişiminde önemli düzenleyiciler olduğunu göstermektedir (Tablo 1).

incir. 2.MiR-21'in aşağı regülasyonu, anjiyoplasti sonrası sıçan karotid arterinde neointimal lezyon oluşumunu azaltır. Anjiyoplastiden 14 gün sonra araç-, miR-21 antisens oligonükleotit (2'OMe-miR-21) ve kontrol oligonükleotit (2'OMe-EGFP) ile tedavi edilen gruplardan sıçan karotid arterlerinin temsili hematoksilen-eozin lekeli fotomikrografları. İzni ile çoğaltılmıştır Sir Res (56).

İskemik kalp hastalığı ortamındaki kardiyak aritmiler, ani ve öngörülemeyen yapıları ve potansiyel olarak ciddi sonuçları nedeniyle ciddi bir sağlık sorunu olmaya devam etmektedir. Miyokard enfarktüsünün sıçan modelinde ve koroner kalp hastalığı olan insan kalbinde, kasa özgü miRNA, miR-1, iskemik kalp dokusunda önemli ölçüde yukarı regüle edilmiştir (126). MiR-1'in aritmojenezdeki rolünü daha fazla belirlemek için, enfarktüslü miyokardda miR-1 ekspresyonunu arttırmak veya inhibe etmek için hem fonksiyon kazanımı hem de fonksiyon kaybı yaklaşımları uygulandı. Sonuçlar, olgun miR-1 enjeksiyonunun aritmojenezi şiddetlendirdiğini, buna karşın miR-1'in bir antisens inhibitörü tarafından ortadan kaldırılmasının aritmileri bastırdığını göstermektedir. Sonuçlar miR-1'in aritmojenik etkilerinin yanı sıra proaritmik etkileri olduğunu göstermektedir (126). GJA1 ve KCNJ2 iyon kanalları için genlerin susturulması, bu proteinlerin miR-1 aracılı aritmojenik etkide önemli oyuncular olduğunu doğruladı (126) (Tablo 1).

miR-133 ekspresyonu diyabetik tavşan kalbinde yukarı doğru düzenlenir (123). Eter-a-go-go ile ilgili gen (ERG), bir anahtar K + kanalını (IKr) kalp hücrelerinde, miR-133 (123) için bir hedef olduğu doğrulandı. Ekzojen miR-133'ün tavşan miyositlerine ve hücre hatlarına verilmesi, ERG'nin transkripsiyon sonrası baskısını üretir, böylece transkript seviyesini değiştirmeden ERG protein seviyelerini aşağı regüle eder ve ardından I'in önemli depresyonuna neden olur.Kr, miR-133 antisens inhibitörü tarafından iptal edilen bir etki (123). Böylece depresyon benKr ERG'nin miR-133 tarafından baskılanması yoluyla, miyosit repolarizasyonunun yavaşlamasına ve dolayısıyla QT uzamasına ve diyabetik kalplerde ilişkili aritmilere katkıda bulunabilir (Tablo 1).

Kalp hücrelerinde, KCNQ1, KCNE1 ile birleşir ve yavaş gecikmeli doğrultucu akımı I oluşturan bir kanal kompleksi oluşturur.KS. KCNQ1 ve KCNE1'in ekspresyonu bölgesel olarak heterojendir ve kalbin patolojik durumlarıyla birlikte değişir, ancak bu değişikliklerden sorumlu moleküler mekanizmalar belirsizdir. Son zamanlarda, bir çalışma, KCNQ1 ve KCNE1'i sırasıyla kasa özgü miRNA'ların, miR-133 ve miR-1'in hedefleri olarak tanımlamıştır (124). miR-1 ve miR-133'ün heterojen ifadesi, KCNQ1 ve KCNE1'in ifadesindeki iyi bilinen bölgesel farklılıklar ve her bölgedeki mRNA ve protein seviyeleri arasındaki eşitsizlik için bir açıklama sunar (124).

HCN2 ve HCN4, kalbin ritmik aktivitesini kontrol eden iki önemli kalp pili kanal proteinidir. Yakın tarihli bir çalışma, HCN2 mRNA'nın miR-1 ve miR-133'ün hedefi olduğunu ve HCN4 mRNA'nın miR-1'in hedefi olduğunu göstermiştir (122). MiRNA'ları gene özgü bir şekilde kullanma olasılığını araştırmak için, bu çalışmanın yazarları, gene özgü miRNA mimik ve miRNA maskeleme antisens yaklaşımları olan iki yeni terapötik yaklaşım geliştirdi. Sonuçları, HCN2 ve HCN4'ün 3′-UTR'lerini hedeflemek için tasarlanmış 22-nt RNA'lar olan gene özgü miRNA taklitlerinin, HCN2 ve HCN4'ün ekspresyonunu ve işlevini ortadan kaldırmada etkili olduğunu göstermektedir. Bu arada, HCN2 ve HCN4'ün 3′-UTR'lerindeki miR-1 ve miR-133 hedef bölgelerine dayanan mikroRNA maskeleme antisensi, HCN2 ve HCN4 ekspresyonunu ve işlevini belirgin şekilde artırır. Böylece miRNA'ların etki prensiplerine dayanan bu iki terapötik yaklaşım, kardiyak aritmiler için yeni gen tedavisi stratejileri sağlayabilir (122).


Mikrodizi Kilometre Taşları

Edwin Southern, yerinde sentezlenmiş, oligo-nükleotid mikrodiziler için Birleşik Krallık patent başvurularını dosyaladı

Stephen Fodor ve meslektaşları fotolitografik dizi üretim yöntemini yayınlıyor

NIH karşıtları tarafından yılmayan Patrick Brown, benekli diziler geliştiriyor

Affymax, Affymetrix'i doğurur

Mark Schena, gen ekspresyon analizi için mikrodizilerin ilk kullanımını yayınladı

Edwin Southern, Oxford Gene Technologies'i kurdu

İlk insan gen ekspresyonu mikroarray çalışması yayınlandı

Affymetrix, HIV için ilk GeneChip mikroarray kataloğunu Nisan ayında yayınladı

Stanford araştırmacıları, mayanın ilk tam genom mikroarray çalışmasını yayınladı

Brown's lab develops CLUSTER, a statistical tool for microarray data analysis red and green "thermal plots" start popping up everywhere

Todd Golub and colleagues use microarrays to classify cancers, sparking widespread interest in clinical applications

Affymetrix spins off Perlegen, to sequence multiple human genomes and identify genetic variation using arrays

The Microarray Gene Expression Data Society develops MIAME standard for the collection and reporting of microarray data

Joseph DeRisi uses a microarray to identify the SARS virus

Affymetrix, Applied Biosystems, and Agilent Technologies individually array human genome on a single chip

Roche releases Amplichip CYP450, the first FDA-approved microarray for diagnostic purposes


Ekland EH, Fidock DA: Advances in understanding the genetic basis of antimalarial drug resistance. Curr Opin Mikrobiyol. 2007, 10: 363-370. 10.1016/j.mib.2007.07.007.

Ringwald P: Susceptibility of Plasmodium falciparum to antimalarial drugs: Report on global monitoring: 1996-2004. 2005, Geneva, Switzerland: World Health Organization

Richie TL: High road, low road? Choices and challenges on the pathway to a malaria vaccine. Parasitology. 2006, 133: S113-S144. 10.1017/S0031182006001843.

Thera MA, Doumbo OK, Coulibaly D, Diallo DA, Kone AK, Guindo AB, Traore K, Dicko A, Sagara I, Sissoko MS, Baby M, Sissoko M, Diarra I, Niangaly A, Dolo A, Daou M, Diawara SI, Heppner DG, Stewart VA, Angov E, Bergmann-Leitner ES, Lanar DE, Dutta S, Soisson L, Diggs CL, Leach A, Owusu A, Dubois M-C, Cohen J, Nixon JN, et al: Safety and immunogenicity of an AMA-1 malaria vaccine in Malian adults: results of a phase 1 randomized controlled trial. PLoS BİR. 2008, 3: e1465-10.1371/journal.pone.0001465.

Weisman JL, Liou AP, Shelat AA, Cohen FE, Kiplin Guy R, DeRisi JL: Searching for new antimalarial therapeutics amongst known drugs. Chem Biol Drug Des. 2006, 67: 409-416. 10.1111/j.1747-0285.2006.00391.x.

Chong CR, Chen X, Shi L, Liu JO, Sullivan DJ: A clinical drug library screen identifies astemizole as an antimalarial agent. Nat Chem Biol. 2006, 2: 415-416. 10.1038/nchembio806.

Plouffe D, Brinker A, McNamara C, Henson K, Kato N, Kuhen K, Nagle A, Adrian F, Matzen JT, Anderson P, Nam T-g, Gray NS, Chatterjee A, Janes J, Yan SF, Trager R, Caldwell JS, Schultz PG, Zhou Y, Winzeler EA: Silico'da activity profiling reveals the mechanism of action of antimalarials discovered in a high-throughput screen. Proc Natl Acad Sci USA. 2008, 105: 9059-9064. 10.1073/pnas.0802982105.

Wellems TE, Panton LJ, Gluzman IY, do Rosario VE, Gwadz RW, Walker-Jonah A, Krogstad DJ: Chloroquine resistance not linked to mdr-like genes in a Plasmodium falciparum geçmek. Doğa. 1990, 345: 253-255. 10.1038/345253a0.

Fidock DA, Nomura T, Talley AK, Cooper RA, Dzekunov SM, Ferdig MT, Ursos LMB, bir Singh Sidhu A, Naudé B, Deitsch KW, Su X-z, Wootton JC, Roepe PD, Wellems TE: Mutations in the P. falciparum digestive vacuole transmembrane protein PfCRT and evidence for their role in chloroquine resistance. Mol Hücre. 2000, 6: 861-871. 10.1016/S1097-2765(05)00077-8.

Sidhu ABS, Verdier-Pinard D, Fidock DA: Chloroquine resistance in Plasmodium falciparum malaria parasites conferred by pfcrt mutasyonlar. Bilim. 2002, 298: 210-213. 10.1126/science.1074045.

Hunt P, Afonso A, Creasey A, Culleton R, Sidhu ABS, Logan J, Valderramos SG, McNae I, Cheesman S, Rosario Vd, Carter R, Fidock DA, Cravo P: Gene encoding a deubiquitinating enzyme is mutated in artesunate- and chloroquine-resistant rodent malaria parasites&sect. Mol Mikrobiyol. 2007, 65: 27-40. 10.1111/j.1365-2958.2007.05753.x.

Volkman SK, Sabeti PC, DeCaprio D, Neafsey DE, Schaffner SF, Milner DA, Daily JP, Sarr O, Ndiaye D, Ndir O, Mboup S, Duraisingh MT, Lukens A, Derr A, Stange-Thomann N, Waggoner S, Onofrio R, Ziaugra L, Mauceli E, Gnerre S, Jaffe DB, Zainoun J, Wiegand RC, Birren BW, Hartl DL, Galagan JE, Lander ES, Wirth DF: A genome-wide map of diversity in Plasmodium falciparum. Nat Genet. 2007, 39: 113-119. 10.1038/ng1930.

Jeffares DC, Pain A, Berry A, Cox AV, Stalker J, Ingle CE, Thomas A, Quail MA, Siebenthall K, Uhlemann A-C, Kyes S, Krishna S, Newbold C, Dermitzakis ET, Berriman M: Genome variation and evolution of the malaria parasite Plasmodium falciparum. Nat Genet. 2007, 39: 120-125. 10.1038/ng1931.

Mu J, Awadalla P, Duan J, McGee KM, Keebler J, Seydel K, McVean GAT, Su X-z: Genome-wide variation and identification of vaccine targets in the Plasmodium falciparum genetik şifre. Nat Genet. 2007, 39: 126-130. 10.1038/ng1924.

Wootton JC, Feng X, Ferdig MT, Cooper RA, Mu J, Baruch DI, Magill AJ, Su X-z: Genetic diversity and chloroquine selective sweeps in Plasmodium falciparum. Doğa. 2002, 418: 320-323. 10.1038/nature00813.

Price RN, Uhlemann A-C, Brockman A, McGready R, Ashley E, Phaipun L, Patel R, Laing K, Looareesuwan S, White NJ, Nosten F, Krishna S: Mefloquine resistance in Plasmodium falciparum and increased pfmdr1 gene copy number. Lancet. 2004, 364: 438-447. 10.1016/S0140-6736(04)16767-6.

Sidhu ABS, Uhlemann A-C, Valderramos SG, Valderramos J-C, Krishna S, Fidock DA: Decreasing pfmdr1 copy number in Plasmodium falciparum malaria heightens susceptibility to mefloquine, lumefantrine, halofantrine, quinine, and artemisinin. J Infect Dis. 2006, 194: 528-535. 10.1086/507115.

Jiang H, Joy D, Furuya T, Su Xz: Current understanding of the molecular basis of chloroquine-resistance in Plasmodium falciparum. J Postgrad Med. 2006, 52: 271-276.

Reed MB, Saliba KJ, Caruana SR, Kirk K, Cowman AF: Pgh1 modulates sensitivity and resistance to multiple antimalarials in Plasmodium falciparum. Doğa. 2000, 403: 906-909. 10.1038/35002615.

Gregson A, Plowe CV: Mechanisms of resistance of malaria parasites to antifolates. Pharmacol Rev. 2005, 57: 117-145. 10.1124/pr.57.1.4.

Sidhu ABS, Sun Q, Nkrumah LJ, Dunne MW, Sacchettini JC, Fidock DA: Laboratuvar ortamında efficacy, resistance selection, and structural modeling studies implicate the malarial parasite apicoplast as the target of azithromycin. J Biol Chem. 2007, 282: 2494-2504. 10.1074/jbc.M608615200.

Kidgell C, Volkman SK, Daily J, Borevitz JO, Plouffe D, Zhou Y, Johnson JR, Le Roch KG, Sarr O, Ndir O, Mboup S, Batalov S, Wirth DF, Winzeler EA: A systematic map of genetic variation in Plasmodium falciparum. PLoS Patog'u. 2006, 2: e57-10.1371/journal.ppat.0020057.

Nair S, Miller B, Barends M, Jaidee A, Patel J, Mayxay M, Newton P, Nosten Fo, Ferdig MT, Anderson TJC: Adaptive copy number evolution in malaria parasites. PLoS Genetics. 2008, 4: e1000243-10.1371/journal.pgen.1000243.

Gardner MJ, Hall N, Fung E, White O, Berriman M, Hyman RW, Carlton JM, Pain A, Nelson KE, Bowman S, Paulsen IT, James K, Eisen JA, Rutherford K, Salzberg SL, Craig A, Kyes S, Chan M-S, Nene V, Shallom SJ, Suh B, Peterson J, Angiuoli S, Pertea M, Allen J, Selengut J, Haft D, Mather MW, Vaidya AB, Martin DMA, et al: Genome sequence of the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Doğa. 2002, 419: 498-511. 10.1038/nature01097.

Gresham D, Ruderfer DM, Pratt SC, Schacherer J, Dunham MJ, Botstein D, Kruglyak L: Genome-wide detection of polymorphisms at nucleotide resolution with a single DNA microarray. Bilim. 2006, 311: 1932-1936. 10.1126/science.1123726.

Jiang H, Yi M, Mu J, Zhang L, Ivens A, Klimczak L, Huyen Y, Stephens R, Su X-z: Detection of genome-wide polymorphisms in the AT-rich Plasmodium falciparum genome using a high-density microarray. BMC Genomik. 2008, 9: 398-10.1186/1471-2164-9-398.

Bolstad BM, Irizarry RA, Astrand M, Speed TP: A comparison of normalization methods for high density oligonucleotide array data based on variance and bias. Biyoinformatik. 2003, 19: 185-193. 10.1093/bioinformatics/19.2.185.

Zhou Y, Abagyan R: Match-only integral distribution (MOID) algorithm for high-density oligonucleotide array analysis. BMC Biyoinformatik. 2002, 3: 3-10.1186/1471-2105-3-3.

Cowman AF, Galatis D, Thompson JK: Selection for mefloquine resistance in Plasmodium falciparum is linked to amplification of the pfmdr1 gene and cross-resistance to halofantrine and quinine. Proc Natl Acad Sci USA. 1994, 91: 1143-1147. 10.1073/pnas.91.3.1143.

Ferreira ID, Rosário VE, Cravo PV: Real-time quantitative PCR with SYBR Green I detection for estimating copy numbers of nine drug resistance candidate genes in Plasmodium falciparum. Malar J. 2006, 5: 1-10.1186/1475-2875-5-1.

Nair S, Nash D, Sudimack D, Jaidee A, Barends M, Uhlemann A-C, Krishna S, Nosten F, Anderson TJC: Recurrent gene amplification and soft selective sweeps during evolution of multidrug resistance in malaria parasites. Mol Biol Evol. 2007, 24: 562-573. 10.1093/molbev/msl185.

Carret CK, Horrocks P, Konfortov B, Winzeler E, Qureshi M, Newbold C, Ivens A: Microarray-based comparative genomic analyses of the human malaria parasite Plasmodium falciparum using Affymetrix arrays. Mol Biochem Parasitol. 2005, 144: 177-186. 10.1016/j.molbiopara.2005.08.010.

Nkrumah LJ, Muhle RA, Moura PA, Ghosh P, Hatfull GF, Jacobs WR, Fidock DA: Efficient site-specific integration in Plasmodium falciparum chromosomes mediated by mycobacteriophage Bxb1 integrase. Nat Yöntemleri. 2006, 3: 615-621. 10.1038/nmeth904.

Jomaa H, Wiesner J, Sanderbrand S, Altincicek B, Weidemeyer C, Hintz M, uuml , rbachova I, Eberl M, Zeidler J, Lichtenthaler HK, Soldati D, Beck E: Inhibitors of the nonmevalonate pathway of isoprenoid biosynthesis as antimalarial drugs. Bilim. 1999, 285: 1573-1576. 10.1126/science.285.5433.1573.

Rohmer M: The discovery of a mevalonate-independent pathway for isoprenoid biosynthesis in bacteria, algae and higher plants. Nat Prod Rep. 1999, 16: 565-574. 10.1039/a709175c.

Borrmann S, Adegnika A, Matsiegui P-B, Issifou S, Schindler A, Mawili-Mboumba D, Baranek T, Wiesner J, Jomaa H, Kremsner P: Fosmidomycin-clindamycin for Plasmodium falciparum infections in African children. J Infect Dis. 2004, 189: 901-908. 10.1086/381785.

Borrmann S, Issifou S, Esser G, Adegnika A, Ramharter M, Matsiegui P-B, Oyakhirome S, Mawili-Mboumba D, Missinou M, Kun JJ, Jomaa H, Kremsner P: Fosmidomycin-clindamycin for the treatment of Plasmodium falciparum sıtma. J Infect Dis. 2004, 190: 1534-1540. 10.1086/424603.

Borrmann S, Adegnika AA, Moussavou F, Oyakhirome S, Esser G, Matsiegui P-B, Ramharter M, Lundgren I, Kombila M, Issifou S, Hutchinson D, Wiesner J, Jomaa H, Kremsner PG: Short-course regimens of artesunate-fosmidomycin in treatment of uncomplicated Plasmodium falciparum sıtma. Antimicrob Agents Chemother. 2005, 49: 3749-3754. 10.1128/AAC.49.9.3749-3754.2005.

Cassera MB, Gozzo FC, D'Alexandri FL, Merino EF, del Portillo HA, Peres VJ, Almeida IC, Eberlin MN, Wunderlich G, Wiesner J, Jomaa H, Kimura EA, Katzin AM: The methylerythritol phosphate pathway is functionally active in all intraerythrocytic stages of Plasmodium falciparum. J Biol Chem. 2004, 279: 51749-51759. 10.1074/jbc.M408360200.

Cassera MB, Merino EF, Peres VJ, Kimura EA, Wunderlich G, Katzin AM: Effect of fosmidomycin on metabolic and transcript profiles of the methylerythritol phosphate pathway in Plasmodium falciparum. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2007, 102: 377-384. 10.1590/S0074-02762007000300019.

Ribacke U, Mok BW, Wirta V, Normark J, Lundeberg J, Kironde F, Egwang TG, Nilsson P, Wahlgren M: Genome wide gene amplifications and deletions in Plasmodium falciparum. Mol Biochem Parasitol. 2007, 155: 33-44. 10.1016/j.molbiopara.2007.05.005.

Iafrate AJ, Feuk L, Rivera MN, Listewnik ML, Donahoe PK, Qi Y, Scherer SW, Lee C: Detection of large-scale variation in the human genome. Nat Genet. 2004, 36: 949-951. 10.1038/ng1416.

Sebat J, Lakshmi B, Troge J, Alexander J, Young J, Lundin P, Maner S, Massa H, Walker M, Chi M, Navin N, Lucito R, Healy J, Hicks J, Ye K, Reiner A, Gilliam TC, Trask B, Patterson N, Zetterberg A, Wigler M: Large-scale copy number polymorphism in the human genome. Bilim. 2004, 305: 525-528. 10.1126/science.1098918.

Redon R, Ishikawa S, Fitch KR, Feuk L, Perry GH, Andrews TD, Fiegler H, Shapero MH, Carson AR, Chen W, Cho EK, Dallaire S, Freeman JL, Gonzalez JR, Gratacos M, Huang J, Kalaitzopoulos D, Komura D, MacDonald JR, Marshall CR, Mei R, Montgomery L, Nishimura K, Okamura K, Shen F, Somerville MJ, Tchinda J, Valsesia A, Woodwark C, Yang F, et al: Global variation in copy number in the human genome. Doğa. 2006, 444: 444-454. 10.1038/nature05329.

Sebat J: Major changes in our DNA lead to major changes in our thinking. Nat Genet. 2007, 39: S3-S5. 10.1038/ng2095.

Ganesan K, Ponmee N, Jiang L, Fowble JW, White J, Kamchonwongpaisan S, Yuthavong Y, Wilairat P, Rathod PK: A genetically hard-wired metabolic transcriptome in Plasmodium falciparum fails to mount protective responses to lethal antifolates. PLoS Patog'u. 2008, 4: e1000214-10.1371/journal.ppat.1000214.

Shendure J, Porreca GJ, Reppas NB, Lin X, McCutcheon JP, Rosenbaum AM, Wang MD, Zhang K, Mitra RD, Church GM: Accurate multiplex polony sequencing of an evolved bacterial genome. Bilim. 2005, 309: 1728-1732. 10.1126/science.1117389.

Bekal S, Craig J, Hudson M, Niblack T, Domier L, Lambert K: Genomic DNA sequence comparison between two inbred soybean cyst nematode biotypes facilitated by massively parallel 454 micro-bead sequencing. Mol Genet Genomics. 2008, 279: 535-543. 10.1007/s00438-008-0331-8.

Hillier LW, Marth GT, Quinlan AR, Dooling D, Fewell G, Barnett D, Fox P, Glasscock JI, Hickenbotham M, Huang W, Magrini VJ, Richt RJ, Sander SN, Stewart DA, Stromberg M, Tsung EF, Wylie T, Schedl T, Wilson RK, Mardis ER: Whole-genome sequencing and variant discovery in C. elegans. Nat Yöntemleri. 2008, 5: 183-188. 10.1038/nmeth.1179.

Trager W, Jenson JB: Cultivation of malarial parasites. Doğa. 1978, 273: 621-622. 10.1038/273621a0.

Winzeler EA, Richards DR, Conway AR, Goldstein AL, Kalman S, McCullough MJ, McCusker JH, Stevens DA, Wodicka L, Lockhart DJ, Davis RW: Direct allelic variation scanning of the yeast genome. Bilim. 1998, 281: 1194-1197. 10.1126/science.281.5380.1194.

Goodyer ID, Taraschi TF: Plasmodium falciparum: a simple, rapid method for detecting parasite clones in microtiter plates. Exp Parasitol. 1997, 86: 158-160. 10.1006/expr.1997.4156.

Desjardins RE, Pamplin CL, von Bredow J, Barry KG, Canfield CJ: Kinetics of a new antimalarial, mefloquine. Clin Pharmacol Ther. 1979, 26: 372-379.

Fidock DA, Wellems TE: Transformation with human dihydrofolate reductase renders malaria parasites insensitive to WR99210 but does not affect the intrinsic activity of proguanil. Proc Natl Acad Sci USA. 1997, 94: 10931-10936. 10.1073/pnas.94.20.10931.

PlasmoDB: The Plasmodium Genome Resource. [http://www.plasmodb.org]


Tartışma

Determination of procaryotic species and the degree of their relationship is a great challenge for microbiologists. In the last 50 years, many different molecular methods, including whole-genome DNA–DNA hybridization, SSU rRNA sequencing, multiple locus sequencing of protein encoding genes (for example, gyrB, recA) and average nucleotide identity, have been proposed for delineating bacterial species. Although the SSU rRNA gene-based method is a valuable, convenient and rapid tool for the determination of the phylogenetic relationships among different microorganisms, it provides poor resolution at the species and subspecies levels (Yamamoto and Harayama, 1998). Also, many procaryotic species have virtually identical SSU rRNA gene sequences but only have 25% DNA similarity (Stackebrandt and Goebel, 1994). Thus, the SSU rRNA analysis method is not a valid approach for determining species/strain relationships. Protein-coding genes could provide high resolution for species/strain determination, but the difficulty in using sets of protein coding genes for phylogenetic evaluation lies in selecting appropriate gene targets and designing amplification primers useful for large sets of microorganisms (Harayama and Kasai, 2006). In addition, phylogenetic analyses based on complete microbial genome sequences are possible, but the likelihood that all the sequenced genomes needed for comparison will be available is not feasible (Brutlag, 1998). Finally, whole-genome sequence analysis is a powerful approach for resolving the major problems of evolution, phylogeny and systematics of living organisms, but its use in general taxonomic studies is not currently practical (Tourova, 2000). Such analyses will require larger genomic data sets and more carefully designed sampling of natural populations (Konstantinidis and Tiedje, 2007). The average nucleotide identity of the shared genes between two strains was proposed to be a robust approach to determine genetic relatedness among different strains (Konstantinidis and Tiedje, 2004). The average nucleotide identity value of 94% corresponded to the traditional 70% DNA–DNA reassociation standard of the current species definition. Although the average nucleotide identity approach is simple, it still relies on the availability of whole-genome sequences and hence it will have a limited use. Nevertheless, whole-genome DNA–DNA hybridization is still considered to be the cornerstone for bacterial species determination and will have to be used to circumscribe procaryotic species (Rossello-Mora, 2006).

The development and application of microarray-based genomic technology for microbial detection and community analysis have received a great deal of attention. Because of its high-density and high-throughput capacity, it is expected that microarray-based genomic technologies will revolutionize the detection, identification and characterization of microorganisms. Therefore, in this study, we have developed the CGA-based hybridization approach for determining species relationships. Experimental comparisons of the CGA hybridization-based results with available traditional DNA–DNA hybridization data, SSU rRNA and gyrB gene sequences and genome fingerprinting methods indicate that the CGA-based hybridization could be a useful alternative to the traditional whole-genome DNA–DNA hybridization approaches for determining procaryotic species relationships.

Overall, DNA similarities from the CGA-based hybridizations were comparable to those from various conventional whole-genome DNA–DNA hybridization approaches. When the actual values for genome relatedness were compared between different methods, the results from the CGA-based hybridization were more consistent to those from the S1 method than the membrane filter method (Goris et al., 1998), as indicated by smaller average differences (<15%) between the similarity values derived from CGA-based hybridization and S1 methods for A. tolulyticus suşlar. DNA similarities from the CGA-based hybridizations for reference strain P. stutzeri ATCC 17587 also matched well with the ΔTm values of the P. stuzeri strains by hydroxyapatite and/or dot filter method with the reference strain P. stutzeri ATCC 17591 (identical to 17587). However, DNA similarities from CGA-based hybridizations with multiple Pseudomonas strains were significantly lower than those from membrane filter methods, although strong linear relationships were observed. One possible explanation might be related to differences in hybridization stringency. Higher similarity values are expected if the hybridization is carried out at relatively low stringent conditions. The hybridization conditions may need to be optimized for different target microbial groups by considering GC content and genome size. It is also important to point out that DNA similarities determined by the traditional hybridization methods vary significantly among different methods (Goris et al., 1998).

Although significant relationships between the CGA hybridization-based similarities and those from SSU rRNA genes, gyrB genes or genomic fingerprinting were observed, the degree of correlations is considerably different. The correlations of the CGA hybridization-derived similarities to gyrB sequences are stronger than those to SSU rRNA sequences and genomic fingerprinting. It appears that the taxonomic resolution of the CGA-based hybridization is similar to or slightly higher than gyrB sequence analysis. While SSU rRNA sequence analysis can provide reliable information about species relationships at higher taxonomic levels (for example, genus or above), whole-genome DNA–DNA hybridizations are useful in providing insight into phylogenetic relationships at the species/strain levels. For example, the SSU rRNA gene sequence similarities among the A. tolulyticus strains tested in this study are all over 98%–100% however, the DNA similarities determined by both the CGA-based method and S1 method varied across a wide range (15.2%–93.9% for the CGA method, 18%–99% for S1 method) (Song et al., 1999). Owing to differences in resolving phylogenetic relationships, integrating CGA-based hybridization with SSU rRNA and gyrB gene sequence analysis could provide a reliable, rapid approach for delineating procaryotic species relationships.

Genome fingerprinting analysis is suitable for the elucidation of strain-level relationships (Versalovic et al., 1994), and was shown to be highly correlated to DNA–DNA reassociation values for xanthomonads (Rademaker et al., 2000). In this study, strong correlations between CGA hybridization-based similarities and the similarities derived from fingerprinting approaches were observed among closely related strains of P. stutzeri ve A. tolulyticus, but not among distantly related species from Pseudomonas, Azoarkus veya Shewanella genera. The genomic fingerprinting similarity values above 60% correlated well with CGA hybridization values for the tested P. stutzeri ve A. tolulyticus suşlar. These results indicated that CGAs could provide meaningful insight into relationships between closely related strains. But the power of phylogeny to resolve relationships at the strain level will be lower using CGA-based hybridization than genome fingerprinting approaches. For instance, based on the CGA hybridization results, A. tolulyticus Td-3 was not separated from Td-19, and P. stutzeri DNSP21 (genetic group IV) could not be separated from P. stutzeri ATCC 11256 (genetic group I) (Figure 1), but they were well separated based on genome fingerprinting methods. Lower resolution was also observed for some Shewanella species (data not shown).

Compared to the traditional DNA–DNA reassociation approach, CGAs have several advantages for the determination of species relatedness, including high-throughput capacity, parallel analyses and quantitation. CGA hybridization differs from membrane filter-based hybridization approaches in that the non-porous surface has advantages of miniaturization, hybridization kinetics, sample volume, reagent absorption, signal detection approaches and reproducibility (Schena and Davis, 2000). The capability of accurate and precise miniaturization with robots on non-porous substrates with the use of fluorescence-based detection offers significant advantages. In addition, multiple pairwise comparisons can be done with smaller amounts of genomic DNA (that is, 1 μg). This is important for determining the relationships between procaryotic species that are difficult to cultivate. CGAs could provide a high-throughput means for rapid identification of microbial species/strains. Because of its high capacity, one can construct a CGA containing bacterial type strains plus appropriately related strains. By hybridizing genomic DNA from unknown strains with this type of microarray, one should be able to quickly and reliably identify unknown strains, provided a suitably related probe is on the array. Generally, SNRs for hybridizations with perfect match DNAs are significantly higher than those with mismatch DNAs from other strains of the same species (Wu et al., 2004). Thus, species identification can be achieved based on the differences in hybridization intensity. However, as a low level of cross-hybridization could occur among different strains, establishing appropriate SNR thresholds to differentiate self-hybridization, cross-hybridization and background hybridization among different strains should be useful. In addition, when using CGAs for species identification, lower stringent hybridization conditions (for example, 42 °C and 50% formamide) should be used first to ensure that good hybridization signals can be obtained for distantly related target species.

Microbial diversity is extremely high and the majority of microorganisms are as-yet uncultivable. This could be a limitation in using CGA-based hybridization to determine species relatedness of uncultured microorganisms. However, the CGA-based hybridization itself does not require culturing. With the recent advances in environmental genomics, high-molecular-weight DNA from uncultivated microorganisms could be accessed through bacterial artificial chromosomes or fosmid cloning. High-molecular-weight bacterial artificial chromosomes/fosmid clones could also be used to fabricate CGAs, thus allowing the determination of relationships of target strain/clones to the uncultivated components of a complex microbial community. Because the size of bacterial artificial chromosomes/fosmid clones is generally 50- to 200-fold less than that for an entire genome, it is expected that microarrays fabricated with high-molecular-weight bacterial artificial chromosomes/fosmid clones should have similar performance characteristics as CGAs.


Videoyu izle: Teach Our Children Microarray (Mayıs Ayı 2022).