Bilgi

Bir hücrede belirli bir genin aktivitesi yapay olarak arttırılabilir mi?

Bir hücrede belirli bir genin aktivitesi yapay olarak arttırılabilir mi?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Hücrenin kendisinden birçok gen düzenleme mekanizması varken, canlı bir hücrede gen aktivitesini kalıcı olarak arttırmanın (kodladığı proteinin daha yüksek miktarlarda üretilmesi için) biyoteknoloji yöntemleriyle (yani dış etkenler yok)? Bu konuyla ilgili herhangi bir çalışma veya deney var mı?


Bakterilerde olduğu kadar kültürlenmiş memeli/insan hücrelerinde daha yüksek (veya daha düşük) gen ekspresyonunu indüklemek için mevcut teknolojiler mevcuttur. Tekniğin bilinen durumu, CRISPR-Cas sistemindeki (genellikle Cas9) bir transkripsiyon aktivasyon alanını bir Cas genine kaynaştırdığınız ve ilgili hedef genler için bir kılavuz RNA sağladığınız CRISPR aracılı gen aktivasyonu/baskısıdır. Bu Cas geni "nükleaz-ölü" yapılır, böylece DNA'yı yalnızca hedefleyebilir, kesemez veya bozamaz (her ikisini de yapan doğal CRISPR-Cas sistemlerinin aksine) ve transkripsiyon aktivasyon alanını ilgilendiğiniz geninize getirmeye hizmet eder, bu da o genin transkripsiyonunda bir artışa yol açar.

Kültürlenmiş hücre hatlarında böyle bir sistemin daha önceki bir örneği için bu makaleye göz atın. Alan o zamandan beri epey ilerledi ve insanlar fare hatlarındaki genleri başarıyla aktive ettiler.


Belirli bir proteinin büyük miktarlarının peşindeyseniz, "rekombinant protein üretimi"ni arayın. Bu çok büyük bir alandır.


Transkriptaz ile bir dizi yürütülür. Sinyal miktarını veya bir miktar protein üretimini ikiye katlamak için dizi oluşumunu ikiye katlamayı deneyin.


Yapılabilir. Transkripsiyonu bastırmak veya etkinleştirmek için değiştirilmiş bir CRISPR-Cas9 mekanizmasını nasıl kullanabileceğinizi açıklayan bu makaleyi buldum.


Transgen İfadesini Optimize Etmek İçin Vektörlerin Tasarımı

B Gen İnaktivasyonu

Gen nakavt, bir geni etkisiz hale getirmek için güçlü ve geri dönüşü olmayan bir yöntemdir. Cre-LoxP sistemi bir olasılıktır (bkz. Bölüm 17.V.A ). Nakavt, geleneksel homolog rekombinasyon kullanılarak veya tasarlanmış endonükleazlarla gerçekleştirilebilir (bkz. Bölüm 17.IV). Ayrıca, tasarlanmış endonükleazlar veya RGEN sistemi kullanılarak seçilen bölgede DNA'nın çift kırılmasından sonra NHEJ kullanılarak bir gen nakavt elde edilebilir (bkz. Bölüm 17.IV). Bu yaklaşımın avantajları, yüksek verimi ve tek hücreli embriyolarda inaktivasyonun sağlanabilmesidir.


Oral skuamöz hücreli karsinomun moleküler patogenezi: tedavi için çıkarımlar

Oral skuamöz hücreli karsinom (OSCC) gelişimi, tütün, alkol, kronik inflamasyon ve viral enfeksiyon gibi çevresel etkiler kadar hastanın genetik yatkınlığından da etkilenen çoklu genetik değişikliklerin birikmesini gerektiren çok aşamalı bir süreçtir. Tümorijenik genetik değişiklikler iki ana tipten oluşur: inaktive edildiğinde tümör gelişimini destekleyen tümör baskılayıcı genler ve aktive edildiğinde tümör gelişimini destekleyen onkogenler. Tümör baskılayıcı genler, mutasyon, heterozigotluk kaybı veya delesyon gibi genetik olaylar veya DNA metilasyonu veya kromatin yeniden şekillenmesi gibi epigenetik modifikasyonlar yoluyla etkisiz hale getirilebilir. Onkogenler, gen amplifikasyonu, artan transkripsiyon veya artan transformasyon aktivitesine yol açan mutasyonlar nedeniyle yapıdaki değişiklikler nedeniyle aşırı ekspresyon yoluyla aktive edilebilir. Bu derleme, oral karsinogenezin moleküler mekanizmalarına ve OSCC'de değiştirilmiş molekülleri spesifik olarak hedeflemek için biyolojik tedavinin kullanımına odaklanmaktadır. OSCC'nin gelişimine katkıda bulunan moleküler değişiklikleri anlamamızda kaydedilen hızlı ilerleme, tümörlerin erken teşhisinde gelişmelere ve hastanın tümörünün spesifik özelliklerine göre kişiselleştirilmiş biyolojik tedavilerin iyileştirilmesine yol açmaktadır.


Bitkilerde sürekli kök hücre aktivitesinin arkasında yeni bir mekanizma

Şekil 1: Vasküler genetik ekspresyon ağının diyagramları (Mor= Ksilem hücreleri, Yeşil= Floem Hücreleri, Mavi= Vasküler kök hücreler). A. Bitkinin ikincil büyümesi sırasında damar gelişimi. B. Vasküler hücre indüksiyon kültür sistemi 'VISUAL'. C. İnşa edilen vasküler gen ekspresyon ağı. Her nokta bir geni gösterir ve çizgiler aralarında güçlü karşılıklı ilişkiler gösterir. Kredi: Kobe Üniversitesi

Üniversiteler arası bir araştırma grubu, bitkilerde vasküler gelişim sürecinin arkasındaki gen ekspresyon ağını kurmayı başardı. Bunu, yaprak hücrelerinden vasküler kök hücreler üreten 'VISUAL' doku kültürü platformunu kullanarak biyoinformatik analizi yaparak başardılar. Bu ağda ayrıca vasküler kök hücreleri düzenleyen yeni bir BES/BZR transkripsiyon faktörü olan BEH3'ü keşfettiler. Ek olarak, vasküler kök hücre çoğalmasını ve farklılaşmasını stabilize etmek için BEH3'ün aynı BES/BZR ailesinden diğer transkripsiyon faktörleri ile rekabet ettiği yeni bir vasküler hücre bakım sistemini aydınlattılar.

Ortak araştırma grubu, bilimsel araştırmacı Furuya Tomoyuki ve Doçent Kondo Yuki ve ark. (Kobe Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü'nden), Kyushu Üniversitesi'nden Profesör Satake Akiko, Özel Olarak Atanan Profesör Tanokura Masaru ve Özel Olarak Atanan Doçent Doktor Miyakawa Takuya (Tokyo Üniversitesi Tarım ve Yaşam Bilimleri Enstitüsü'nden) ve Doç. Tokyo Üniversitesi Sürdürülebilir Tarımsal Ekosistem Hizmetleri Enstitüsü).

Araştırmacılar, bitkilerde sürekli kök hücre aktivitesinin ardındaki moleküler temeli anlamamıza katkıda bulunacak olan kök hücreler için daha fazla düzenleyici faktör belirlemeyi umuyorlar.

Bu araştırma sonuçları Amerikan bitki bilimleri dergisinde yayınlandı. Bitki Hücresi 1 Haziran 2021'de.

  • Araştırmacılar, kapsamlı gen ekspresyonu veri kümelerinden vasküler kök hücrelere özgü toplam 394 gen çıkardı. Bunlar arasında, BES/BZR transkripsiyon faktörleri ailesine ait yeni bir kök hücre düzenleyici faktör olan BEH3'ü keşfettiler.
  • Diğer BES/BZR transkripsiyon faktörlerinden farklı olarak BEH3'ün neredeyse hiç fonksiyonel alana sahip olmadığını ve bu diğer faktörlerin aktivitesini rekabetçi bir şekilde inhibe ettiğini keşfettiler.
  • Araştırma grubu, BES/BZR transkripsiyon faktörleri arasındaki bu rekabetçi ilişkinin, vasküler kök hücrelerin sürekli aktivitesini koruyan düzenleyici sistemi aydınlatarak, vasküler kök hücrelerin çoğalmasını ve farklılaşmasını stabilize ettiğini gösterdi.
Şekil 2: BEH3 ve diğer BES/BZR transkripsiyon faktörleri arasındaki rekabetçi ilişkiyi gösteren model diyagramı. BEH3 ve diğer BES/BZR transkripsiyon faktörleri (burada BES1 ile temsil edilmektedir) DNA motifi BRRE'ye bağlanmak için birbirleriyle rekabet ederek aşağı yönde gen ekspresyonunu düzenlerler. Kredi: Kobe Üniversitesi

Bitkiler, kök hücrelerini kendi kendilerini kopyalayarak ve bu kök hücreleri farklılaştırarak, bitkinin organları ve dokuları gibi parçalarını oluşturmak için özel işlevlere sahip olacak şekilde şekillenirler. Hayvanlardan farklı olarak bitkiler yaşamları boyunca kök hücre üreterek yenilenmeye ve büyümeye devam ederler. Örneğin, kriptomeri gibi ağaçların ömrü uzun olabilir (Japonya'nın Yakushima Adası'ndaki Jomon Sedir Ağacı en az 2000 yaşındadır) ve her yıl ikincil büyümeyi teşvik ederler ve bu da gövdelerinin etrafında başka bir ağaç halkası oluşmasına neden olur. Bu ikincil büyüme, vasküler kök hücrelerin çoğaldığı ve ksilem hücrelerine ve floem hücrelerine farklılaştığı ve gövdenin daha geniş büyümesini sağladığı kambiyum tabakası adı verilen bir meristem dokusu bölgesinde meydana gelir. Başka bir deyişle, bitkinin büyümeyi sürdürebilmesi için yaşamı boyunca sürekli olarak damarlı kök hücre üretmesi gerekir ve kök hücre çoğalması ile farklılaşması arasındaki dengeyi korumaları hayati önem taşır.

Son yıllarda, model bitki Arabidopsis thaliana kullanılarak, kök hücrelerin çoğalmasının ve farklılaşmasının genetik, yaşam bilimleri ve bilişim araştırmaları perspektiflerinden nasıl düzenlendiğine dair çalışmalar yapılmıştır. Bununla birlikte, bitkilerin uygun kök hücre dengesini düzenleme ve sürdürme mekanizması henüz anlaşılamamıştır.

Araştırma Metodolojisi ve Bulguları

Vasküler kök hücrelerin ksilem hücrelerine ve floem hücrelerine farklılaşma sürecini analiz etmek için (Şekil 1) Doç. VISUAL, onu vasküler kök hücreler üzerinde araştırmalar için uygun kılan birçok faydaya sahiptir, örneğin, belirli bir gen fonksiyonu çıkarılmış (yani mutantlar) bitkileri genetik olarak analiz etmek kolaydır ve ayrıca vasküler kök hücrenin zamansal ilerlemesini gözlemlemek mümkündür. Bu çalışmada, araştırmacılar çoklu mutantlar hakkında veri topladılar ve çeşitli zaman noktalarında gen ekspresyonunun büyük ölçekli analizlerini gerçekleştirdiler.Farklı genler arasındaki ilişkiyi değerlendirmek için ekspresyon modellerindeki benzerlikler üzerinde gen ortak ekspresyonu ağ analizi yaptılar. Bu analizden, ksilem hücreleri, floem hücreleri ve vasküler kök hücrelerdeki farklı gen gruplarını tanımlamayı başardılar (Şekil 1). yeniden 1). VISUAL kullanarak, bu araştırma grubu daha önce BES/BZR transkripsiyon faktörleri BES1 ve BZR1'in vasküler kök hücre farklılaşmasında önemli bir rol oynadığını ortaya çıkarmıştı. Bu kez, ağ analizi yoluyla vasküler kök hücre gen grubunda başka bir BES/BZR transkripsiyon faktörü olan BEH3'ü tanımladılar ve ayrıca vasküler kök hücre baskılama işlevini de incelediler.

Şekil 3: Bu araştırmaya dayalı bir vasküler kök hücre düzenleme modeli. BES/BZR transkripsiyon faktörü ailesi içindeki rekabet, vasküler kök hücre çoğalması ve farklılaşması arasındaki dengeyi sağlam bir şekilde düzenler ve sürekli kök hücre aktivitesinin korunmasına katkıda bulunur. Kredi: Kobe Üniversitesi

Daha sonra araştırmacılar, BEH3'ün işlevi kaldırılmış mutantlar kullanarak vasküler oluşumu araştırdı. Mutantların, vahşi tipe (mutant olmayan bitki) kıyasla vasküler boyutta büyük farklılıklar olduğunu bulmuşlar ve BEH3'ün vasküler kök hücreleri stabilize ettiği sonucuna varmışlardır. Araştırma grubu daha önce BES1'in (vasküler hücre farklılaşmasını destekleyen) işlevinin güçlendirilmesinin vasküler hücre sayısının azalmasına neden olduğunu bulmuş, ancak güçlendirdiklerinde BEH3'ün işlevinin zıt olduğunu ve vasküler kök hücre sayısının arttığını bulmuşlardır. Bunu daha fazla araştırdıktan sonra araştırma grubu, BEH3'ün diğer BES/BZR transkripsiyon faktörleriyle aynı DNA motifine bağlanabilmesine rağmen, BEH3'ün aşağı akış genlerinin ekspresyonunu düzenleme yeteneğinin önemli ölçüde daha zayıf olduğunu keşfetti. Bu sonuçlar, BEH3'ün diğer BES/BZR transkripsiyon faktörlerinin aktivitesini engellediğini gösterdi (Şekil 2) ve araştırmacılar bu ilişkiden, BEH3'ün vasküler kök hücrelerdeki fonksiyonunun, BES1 de dahil olmak üzere aynı ailedeki faktörlerinkine zıt olduğu sonucuna vardılar. BEH3 ve diğer BES/BZR transkripsiyon faktörleri arasındaki bu rekabetçi ilişkiyi doğrulamak ve simüle etmek için bir matematiksel model kullanıldı ve sonuçlar, vasküler kök hücrelerde BEH3'ün varlığının vasküler boyutun stabilize edilmesine katkıda bulunduğunu gösterdi (Şekil 3).

Bu araştırma grubunun vasküler kök hücre gen ekspresyon ağında vasküler gelişim ve fonksiyonların anlaşılmasına katkı sağlayacak birçok önemli gen adayı olduğu düşünülmektedir. Bu çalışma ile elde edilen değerli bilgilerin vasküler araştırmaları hızlandıracağı umulmaktadır. Ek olarak, BEH3 ile diğer BES/BZR transkripsiyon faktörleri ve bunların ilgili farklılıkları arasındaki ilişkileri daha da aydınlatmak, bitkilerin kök hücre çoğalması ve farklılaşması arasındaki dengeyi koruduğu mekanizma hakkındaki anlayışımızı derinleştirecektir.

Gelecekte, bu bilgi biyokütle üretim tekniklerine ve büyük ölçekli istikrarlı bitki büyümesi gerektiren diğer alanlara katkıda bulunabilir.


Osteoblast farklılaşması sırasında dokuya özgü gen ekspresyonunun düzenlenmesiyle hücre büyümesinin ilişkisi

Hücre proliferasyonunun kemik hücre farklılaşması ile ilişkili gelişimsel bir diziyi karakterize eden genlerin zamansal ekspresyonu ile ilişkisi, moleküler, biyokimyasal, histokimyasal ve ultrastrüktürel yaklaşımların kombinasyonu ile fetal kalvarial kaynaklı osteoblastların birincil diploid kültürlerinde incelenebilir. Gen ekspresyonundaki değişiklikler, 1) üç ana periyodu olan bir gelişimsel diziyi tanımlar: proliferasyon, hücre dışı matris olgunlaşması ve mineralizasyon ve 2) hücrelerin ilerleyebildiği ancak başka sinyaller olmadan geçemeyeceği iki kısıtlama noktası. İlk kısıtlama noktası, proliferasyonun aşağı regüle edildiği ve hücre dışı matris olgunlaşması ile ilişkili gen ekspresyonunun indüklendiği, ikincisi ise mineralizasyon meydana geldiği zamandır. Başlangıçta, hücre döngüsü ve hücre büyümesini düzenleyen genleri ifade eden aktif olarak çoğalan hücreler, bir fibronektin/tip I kollajen hücre dışı matrisi üretir. Proliferatif aktivitedeki düşüş ile matriks olgunlaşması ve mineralizasyon ile ilişkili genlerin müteakip indüksiyonu arasındaki karşılıklı ve fonksiyonel olarak birleştirilmiş bir ilişki, aşağıdakilerle desteklenir: 1) proliferatif dönemden hemen sonra alkalin fosfataz ekspresyonunun arttığı ve daha sonra mineralizasyonun başlangıcında osteokalsin ve osteopontin ekspresyonunun arttığı zamansal bir olaylar dizisi 2) proliferasyon inhibe edildiğinde osteoblast fenotip belirteçleri, alkalin fosfataz ve osteopontin spesifik bir alt kümesinin artan ekspresyonu ve 3) kollajen birikimi teşvik edildiğinde osteoblast belirteçlerinin artan ekspresyon seviyeleri, hücre dışı matrisin hem proliferasyonun durdurulmasına hem de osteoblast fenotipinin gelişimine katkıda bulunduğunu düşündürmektedir. Dönüştürülmüş osteoblastlarda ve osteosarkom hücrelerinde katı büyüme kontrolünün kaybına, proliferasyon ve kemik hücresi farklılaşması ile bağlantılı genlerin progresif ekspresyonu arasındaki sıkı bağlantılı ilişkinin deregülasyonu eşlik eder.— S tein, GS Lian, JB O wen, TA İlişkisi Osteoblast farklılaşması sırasında dokuya özgü gen ekspresyonunun düzenlenmesine hücre büyümesi. FASEB J. 4: 3111-3123 1990.


MALZEMELER VE YÖNTEMLER

Veri işleme ve analiz

Her ifade özeti için (HBI [GEO Erişim No. <"type":"entrez-geo","attrs":<"text":"GSE7307","term_id":"7307">> GSE7307], expO [GEO Erişim No. <"type":"entrez-geo","attrs":<"text":"GSE2109","term_id":"2109">> GSE2109] ve CCLE [www.broadinstitute.org/ccle] ), Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 dizileri, Bioconductor (www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/affy.html) ve Entrez Gene'den (www.ncbi) affy paketi kullanılarak sağlam çok dizili ortalama (RMA) ile normalleştirildi. .nlm.nih.gov/gene) Daha önce tanımlandığı gibi ID özel prob seti tanımları ( Dai et#x000a0al., 2005 ). Seçilen genlerin RMA değerleri daha sonra Cluster 3.0 (de Hoon) kullanılarak medyan merkezli ve hiyerarşik olarak (merkezlenmemiş korelasyon ve ortalama bağlantıya dayalı olarak) kümelenmiştir. et#x000a0al., 2004 ) ve Java TreeView ile görselleştirildi ( Saldanha, 2004 ). Temel bileşen analizi grafikleri, hiyerarşik kümelemeye (yayınlanmamış veriler) benzer sonuçlar verdi.

Hücre döngüsü çalışması için ( Grant et#x000a0al., 2013), işlenmiş Agilent Tüm İnsan Genom Oligonükleotid dizi oranları (örnek/referans) Ek Tablo S1'den indirildi. Seçilen genlerin profilleri, tabloda verildiği gibi arctan2 değerlerine göre sıralanmıştır.

TCGA meme invaziv karsinomu verileri için normal ve tümör çiftlerini eşleştirmek için işlenmiş Agilent ekspresyon verileri (seviye 3) (örnek ID'ler Tablo 1'de verilmiştir) TCGA veri portalından (https://tcga-data.nci.nih. hükümet). Her kanser örneği için günlük2 Seçilen genlerin oranları, eşleşen normal örneğe göre hesaplandı ve tarif edildiği gibi ısı haritası oluşturuldu.

TABLO 1:

TCGA tümör örnekleriTCGA normal örnekleri
TCGA-A7-A13E-01A-11R-A12P-07TCGA-A7-A13E-11A-61R-A12P-07
TCGA-A7-A13F-01A-11R-A12P-07TCGA-A7-A13F-11A-42R-A12P-07
TCGA-BH-A0AU-01A-11R-A12P-07TCGA-BH-A0AU-11A-11R-A12P-07
TCGA-BH-A0B5-01A-11R-A12P-07TCGA-BH-A0B5-11A-23R-A12P-07
TCGA-BH-A0BS-01A-11R-A12P-07TCGA-BH-A0BS-11A-11R-A12P-07
TCGA-BH-A0BZ-01A-31R-A12P-07TCGA-BH-A0BZ-11A-61R-A12P-07
TCGA-BH-A0C3-01A-21R-A12P-07TCGA-BH-A0C3-11A-23R-A12P-07
TCGA-BH-A0DD-01A-31R-A12P-07TCGA-BH-A0DD-11A-23R-A12P-07
TCGA-BH-A0DT-01A-21R-A12D-07TCGA-BH-A0DT-11A-12R-A12D-07
TCGA-BH-A0HA-01A-11R-A12P-07TCGA-BH-A0HA-11A-31R-A12P-07
TCGA-BH-A18J-01A-11R-A12D-07TCGA-BH-A18J-11A-31R-A12D-07
TCGA-BH-A18K-01A-11R-A12D-07TCGA-BH-A18K-11A-13R-A12D-07
TCGA-BH-A18L-01A-32R-A12D-07TCGA-BH-A18L-11A-42R-A12D-07
TCGA-BH-A18M-01A-11R-A12D-07TCGA-BH-A18M-11A-33R-A12D-07
TCGA-BH-A18N-01A-11R-A12D-07TCGA-BH-A18N-11A-43R-A12D-07
TCGA-BH-A18P-01A-11R-A12D-07TCGA-BH-A18P-11A-43R-A12D-07
TCGA-BH-A18Q-01A-12R-A12D-07TCGA-BH-A18Q-11A-34R-A12D-07
TCGA-BH-A18R-01A-11R-A12D-07TCGA-BH-A18R-11A-42R-A12D-07
TCGA-BH-A18S-01A-11R-A12D-07TCGA-BH-A18S-11A-43R-A12D-07
TCGA-BH-A18U-01A-21R-A12D-07TCGA-BH-A18U-11A-23R-A12D-07
TCGA-BH-A18V-01A-11R-A12D-07TCGA-BH-A18V-11A-52R-A12D-07
TCGA-BH-A1EO-01A-11R-A137-07TCGA-BH-A1EO-11A-31R-A137-07
TCGA-BH-A1EU-01A-11R-A137-07TCGA-BH-A1EU-11A-23R-A137-07
TCGA-E2-A153-01A-12R-A12D-07TCGA-E2-A153-11A-31R-A12D-07
TCGA-E2-A158-01A-11R-A12D-07TCGA-E2-A158-11A-22R-A12D-07
TCGA-E2-A15I-01A-21R-A137-07TCGA-E2-A15I-11A-32R-A137-07
TCGA-E2-A15M-01A-11R-A12D-07TCGA-E2-A15M-11A-22R-A12D-07
TCGA-E2-A1BC-01A-11R-A12P-07TCGA-E2-A1BC-11A-32R-A12P-07

expO tümör numunelerinin bir alt kümesi de HBI özetindeki normal muadilleriyle karşılaştırıldı. Yaygın HBI dokularının (böbrek, kolon, karaciğer, meme, akciğer, yumurtalık/rahim ve prostat) her biri için, o dokudaki her bir genin medyan ekspresyon seviyesi hesaplandı ve her expO tümör numunesi, set ile karşılaştırıldı. karşılık gelen normal medyanlar. Isı haritası açıklandığı gibi oluşturuldu.

Pearson korelasyonları, ifade (log2 oranları) veri setindeki her bir gene karşı. Korelasyon değerleri daha sonra Cluster3'te kümelendi ve tarif edildiği gibi Java TreeView'da görselleştirildi. Korelasyonlar, Fisher dönüşümü yoluyla ortalama ile özetlendi.


İçindekiler

DCas9 Düzenle

Cas9 Endonükleaz Ölü, ayrıca ölü Cas9 veya dCas9, endonükleaz aktivitesi, endonükleaz alanlarındaki nokta mutasyonları yoluyla kaldırılan Cas9'un mutant bir formudur. Mutasyona uğramamış formuna benzer şekilde, dCas9, Cas9'un bağlanmasına izin veren PAM dizileri ile gRNA'yı tamamlayan spesifik genleri veya nükleotitleri hedeflemek için gRNA'larla birlikte CRISPR sistemlerinde kullanılır. Cas9 normalde RuvC ve HNH alanları olarak adlandırılan 2 endonükleaz alanına sahiptir. Nokta mutasyonları D10A ve H840A, endonükleaz aktivitesi için 2 önemli kalıntıyı değiştirir ve sonuçta deaktivasyonu ile sonuçlanır. DCas9, endonükleaz aktivitesinden yoksun olmasına rağmen, bu tür bir bağlanma diğer alanlar tarafından yönetildiğinden, kılavuz RNA'sına ve hedeflenen DNA zincirine hala bağlanma yeteneğine sahiptir. gRNA, dCas9'u transkripsiyonel faktörlerin ve RNA polimerazın DNA'ya erişmesini önleyecek şekilde konumlandırırsa, hedeflenen genin transkripsiyonunu tamamen bloke etmese bile, tek başına bu genellikle zayıflatmak için yeterlidir. Bununla birlikte, dCas9'un, transkripsiyonel aktivatörleri eklemek için kullanılabilen, tipik olarak proteinin N ve C terminusu olmak üzere değiştirilebilir bölgelere sahip olması nedeniyle, DNA'yı bağlama yeteneği, aktivasyon için de kullanılabilir. [2]

Kılavuz RNA Düzenle

Küçük bir kılavuz RNA (sgRNA) veya gRNA, Cas9 veya dCas9'u hedeflerine yönlendirmek için kullanılan yaklaşık 20 nükleotid içeren bir RNA'dır. gRNA'lar, CRISPR sistemleri için iki önemli bölge içerir: iskele ve boşluk bölgeleri. Ara bölge, genellikle promotör bölgesinde, hedef genlerde bulunanlara tamamlayıcı olan nükleotitlere sahiptir. İskele bölgesi (d)Cas9 ile bir kompleksin oluşumundan sorumludur. Birlikte (d)Cas9'u bağlarlar ve onu ilgilenilen gen(ler)e yönlendirirler. Bir gRNA'nın aralayıcı bölgesi, herhangi bir potansiyel dizi için modifiye edilebildiğinden, boşluk bölgesini tamamlayıcı bir diziye sahip herhangi bir gen ve nükleotid, olası hedefler haline gelebileceğinden, CRISPR sistemlerine çok daha fazla esneklik sağlar. [2]

Transkripsiyonel aktivatörler Düzenle

Transkripsiyon Aktivatörleri dCas9'a veya sistem tarafından hedeflenen gen(ler)in transkripsiyonu için RNA Polimeraz'ın yanı sıra önemli kofaktörlerin alınmasına yardımcı olan sgRNA'lara bağlı protein alanları veya tam proteinlerdir. Kendisini kodlayan genden bir proteinin yapılabilmesi için RNA polimerazın, transkripsiyon adı verilen bir işlem sırasında genin DNA şablonundan RNA yapması gerekir. Transkripsiyonel aktivatörler, bir DNA bağlanma alanına ve transkripsiyonun aktivasyonu için bir alana sahiptir. Aktivasyon alanı, gen dizisine genel transkripsiyon faktörlerini veya RNA polimerazını alabilir. Aktivasyon alanları, durmuş RNA polimerazları tarafından transkripsiyonu kolaylaştırarak da işlev görebilir ve ökaryotlarda, gen ekspresyonunu arttırmak için DNA üzerindeki nükleozomları hareket ettirmek veya histonları değiştirmek için hareket edebilir. [3] Bu aktivatörler, dCas9'a veya sgRNA'ya bağlanma yoluyla sisteme dahil edilebilir. Bazı araştırmacılar, transkripsiyonel yukarı regülasyonun kapsamının, bir deneyde aktivatör bağlanması için birden fazla alan kullanılarak ve belirli bir deney veya numunede aynı anda farklı aktivatör varyasyonları ve kombinasyonları kullanılarak modüle edilebileceğini belirtmişlerdir. [4] [5] [6]

İfade sistemi Düzenle

gRNA'ların ve (d)Cas9 proteinlerinin ilgili hücrelere dahil edilmesi için bir ekspresyon sistemi gereklidir. Tipik olarak kullanılan seçenekler, adeno-ilişkili virüs (AAV) vektörü veya lentivirüs vektörü gibi plazmitleri ve viral vektörleri içerir, ancak bunlarla sınırlı değildir.

VP64-p65-Rta Düzenle

VP64-p65-Rta veya VPR, dCas9 aktivatörü, bir Vp64 transkripsiyonel aktivatörünün dCas9'un C terminaline birleştirildiği mevcut bir dCas9 aktivatörünün değiştirilmesiyle oluşturulmuştur. DCas9-VPR proteininde, p65 ve Rta transkripsiyon faktörleri, dCas9-Vp64'ün C terminaline eklenir. Bu nedenle, üç transkripsiyon faktörünün tümü aynı gene hedeflenir. Yalnızca Vp64'ün aksine üç transkripsiyon faktörünün kullanılması, hedeflenen genlerin ekspresyonunun artmasına neden olur. Farklı genler dCas9 tarafından hedeflendiğinde, hepsi dCas9-VPR ile dCas9-VP64 ile olduğundan önemli ölçüde daha fazla ifade gösterdi. dCas9-VPR'nin aynı hücreye birden fazla sgRNA koyarak aynı hücre içindeki birden fazla genin ekspresyonunu arttırmak için kullanılabileceği de gösterilmiştir. [7] dCas9-VPR, nörogenin 2 (bağ) ve nörojenik farklılaşma 1 (bağ) genlerini aktive etmek için kullanılmıştır, bu da uyarılmış pluripotent kök hücrelerin uyarılmış nöronlara farklılaşmasına neden olur. [7] dCas9 aktivatörlerini karşılaştıran bir çalışma, VPR, SAM ve Suntag aktivatörlerinin çeşitli meyve sineği, fare ve insan hücre tiplerinde gen ekspresyonunu artırmak için dCas9 ile en iyi şekilde çalıştığını buldu. [8]

Sinerjik aktivasyon aracısı Düzenle

DCas9-VP64 gen aktivasyon sisteminin sınırlamasının üstesinden gelmek için, dCas9-SAM sistemi, çoklu transkripsiyonel faktörleri içerecek şekilde geliştirildi. MS2, p65 ve HSF1 proteinlerini kullanan dCas9-SAM sistemi, ilgilenilen geni aktive etmek için sinerjistik olarak çalışan çeşitli transkripsiyonel faktörleri işe alır.

Farklı transkripsiyonel aktivatörleri bir araya getirmek için, dCas9-SAM sistemi, MS2 proteini için bağlanma bölgelerine sahip olan modifiye edilmiş bir tek kılavuz RNA (sgRNA) kullanır. Saç tokası aptamerleri, dimerize MS2 bakteriyofaj kaplama proteinleri için bağlanma yerleri haline gelmek üzere sgRNA'nın tetra halkasına ve 2. gövdesine bağlanır. Saç tokaları dCas9-sgRNA kompleksinin dışına maruz kaldığından, diğer transkripsiyonel faktörler, dCas9-sgRNA kompleksini bozmadan MS2 proteinine bağlanabilir. Bu nedenle, MS2 proteini, p65 ve HSF1 proteinlerini içerecek şekilde tasarlanmıştır. MS2-p65-HSF1 füzyon proteini, hedef genlerin promotörü üzerine daha fazla transkripsiyonel faktör almak için dCas9-VP64 ile etkileşime girer.

DCas-SAM sistemini kullanan Zhang ve ark. (2015), HIV konakçı hücrelerinden viral proteinleri aşırı eksprese etmek için gizli HIV genini başarıyla yeniden etkinleştirdi. [9] Viral proteinlerin toksisitesi nedeniyle HIV-1 latent hücrelerinin apoptozunu tetiklemek için büyük ölçüde viral proteinleri aşırı eksprese edebildiler. Başka bir dCas-SAM sistem deneyinde Konermann ve ark. (2015), dCas sistemi aracılığıyla aday genleri aktive ederek bir BRAF inhibitörüne direnç veren melanom hücrelerinde genler buldu. [6] Böylece, dCas9-SAM sistemi ayrıca gizli genleri aktive etmek, gen terapileri geliştirmek ve yeni genler keşfetmek için kullanılabilir.

SunTag Düzenle

SunTag aktivatör sistemi, SunTag ile bağlanacak şekilde modifiye edilen dCas9 proteinini kullanır. SunTag, antikorların birden fazla kopyasını alabilen tekrarlayan bir polipeptit dizisidir. SunTag dCas9 aktive edici kompleksi, antikorlar üzerine transkripsiyonel faktörleri ekleyerek, transkripsiyonel faktörlerin alımını güçlendirir. dCas9 proteinini hedef genine yönlendirmek için dCas9 SunTag sistemi sgRNA'yı kullanır.

Tanenbaum ve diğerleri (2014), dCas9 SunTag sistemini oluşturdukları için kredilendirildi. Antikorlar için, transkripsiyonel faktör VP64'e bağlı GCN4 antikorlarını kullandılar. Antikorları hücrelerin çekirdeklerine taşımak için NLS etiketini bağladılar. Antikorların nükleer lokalizasyonunu doğrulamak için görselleştirme amacıyla sfGFP kullanıldı. Bu nedenle, GCN4-sfGFP-NLS-VP64 proteini, dCas SunTag sistemi ile etkileşime girecek şekilde geliştirilmiştir. Antikorlar, K562 hücre dizilerinde SunTag polipeptidlerine ve aktive edilmiş hedef CXCR4 genine başarılı bir şekilde bağlandı. [10] dCas9-VP64 aktivasyon kompleksi ile karşılaştırıldığında, K562 hücre hatlarında CXCR4 gen ekspresyonunu 5-25 kat daha fazla artırmayı başardılar. Sadece daha büyük bir CXCR4 protein aşırı ekspresyonu değil, aynı zamanda CXCR4 proteinleri de transwell migrasyon tahlilinde daha fazla seyahat etmek için aktifti. Böylece, dCas9-SunTag sistemi, virüs genleri gibi gizli olarak mevcut olan genleri aktive etmek için kullanılabilir.

DCas9 aktivasyon sistemi, aynı hücrede istenen bir genin veya birden fazla genin eksprese edilmesini sağlar. Genlerin ekspresyonunu aktive etmeyi içeren geniş bir genom ekranı kullanarak belirli bir sürece dahil olan genleri incelemek mümkündür. Hangi sgRNA'ların bir fenotip verdiğini incelemek, hangi genlerin belirli bir yola dahil olduğunu gösterir. DCas9 aktivasyon sistemi, tam olarak hangi hücrelerin aktive edildiğini ve aktivasyonun ne zaman gerçekleştiğini kontrol etmek için kullanılabilir. Işık veya kimyasalların varlığında bir dCas9-aktivatör füzyon proteinini açan dCas9 yapıları yapılmıştır. Hücreler ayrıca, bir hücre tipinin oluşumu veya korunması için önemli olan belirli genlerin ekspresyonunu artırarak bir hücre tipinden diğerine yeniden programlanabilir veya farklılaştırılabilir. [11]

Gen ifadesi üzerinde daha fazla kontrol

Bir araştırma grubu, dCas9'un belirli bir etki alanına, C1B1'e kaynaştırıldığı bir sistem kullandı. Hücre üzerinde mavi ışık parladığında, Cry2 alanı C1B1'e bağlanır. Cry2 alanı, bir transkripsiyonel aktivatöre kaynaştırılır, bu nedenle mavi ışık, aktivatörü dCas9'un bağlı olduğu noktaya hedefler. Işık kullanımı, hedeflenen genin ne zaman aktive edileceği üzerinde büyük ölçüde kontrol sağlar. Işığın hücreden uzaklaştırılması, hedef gende yalnızca dCas9'un kalmasına neden olur, bu nedenle ekspresyon artmaz. Bu şekilde sistem tersine çevrilebilir. [12] Benzer bir sistem kimyasal kontrol kullanılarak geliştirilmiştir. Bu sistemde, dCas9, FKBP alanını içeren bir MS2 füzyon proteini alır. Kimyasal RAP varlığında, bir kromatin değiştirici komplekse kaynaşmış bir FRB alanı, FKBP'ye bağlanır. Hücrelere RAP eklendiğinde, gene spesifik bir kromatin değiştirici kompleksi hedeflenebilir. Bu, bilim adamlarının belirli kromatin modifikasyonlarının bir genin ekspresyonunu nasıl etkilediğini incelemesine olanak tanır. [13] dCAs9-VPR sistemi, onu kodlama bölgesinin yukarısındaki bir genin promotörüne hedefleyerek bir aktivatör olarak kullanılır. Bir çalışmada, genin farklı kısımlarını hedeflemek için çeşitli sgRNA'lar kullanılmış ve dCas9-VPR aktivatörünün, bağlandığı yere bağlı olarak bir aktivatör veya bir baskılayıcı olarak hareket edebileceğini tespit etmiştir. Bir hücrede, promotörü hedefleyen sgRNA'lar, dCas9-VPR'nin ekspresyonu artırmasına izin verebilirken, genin kodlama bölgesini hedefleyen sgRNA'lar, dCas9-VPR'nin ekspresyonun azalmasına neden olur. [14]

Genom çapında aktivasyon Düzenle

sgRNA'ların çok yönlülüğü, dCas9 aktivatörlerinin bir organizmanın genomu içindeki herhangi bir genin ekspresyonunu arttırmasına izin verir. Bu, bir protein kodlayan genin veya kopyalanmış bir RNA'nın ifadesini arttırmak için kullanılabilir. Bir makale, genom çapında aktivasyonun, belirli bir ilaca aracılı dirençte hangi proteinlerin rol oynadığını belirlemek için kullanılabileceğini göstermiştir. [6] Başka bir makale, uzun, kodlamayan RNA'ların genom çapında aktivasyonunu kullandı ve belirli uzun kodlamayan RNA'ların ekspresyonunun arttırılmasının, ilaç vemurafenib'e direnç kazandırdığını gözlemledi. [15] Her iki durumda da, hangi sgRNA'ları içerdiklerini belirlemek için ilaçta hayatta kalan hücreler üzerinde çalışılabilir. Bu, araştırmacıların, hayatta kalan her hücrede hangi genin aktive edildiğini belirlemesine olanak tanır ve bu, o ilaca direnç için hangi genlerin önemli olduğunu gösterir.

Organizmalarda kullanım Düzenle

VP64, p65 ve HSF1 (ısı şok faktörü 1) ile bir dCas9 füzyonu, araştırmacıların Arabidopsis thaliana'daki genleri hedeflemesine ve genin kendisi bitkinin genomuna eklendiğindeki ile benzer bir seviyeye transkripsiyonu artırmasına izin verdi. Test edilen iki genden biri için, dCas9 aktivatörü yaprakların sayısını ve boyutunu değiştirir ve bitkilerin kuraklıkla daha iyi başa çıkabilmesini sağlar. Yazarlar, dCas9 aktivatörünün bitkilerde aşırı ekspresyon için bir transgen eklendiğinde gözlenenlere benzer fenotipler oluşturabileceği sonucuna varıyorlar. [16] Araştırmacılar, dCas9 aktivasyon sistemini, Cre rekombinaz sistemi kullanılarak belirli hücre hatlarında dCas9'un açılabileceği belirli bir fare türündeki birden fazla gene hedeflemek için birden fazla kılavuz RNA kullandılar. Bilim adamları, karaciğerin rejenerasyonu ve karsinomlarında yer alan süreçleri incelemek için birkaç genin hedeflenmesini ve artan ekspresyonunu kullandılar. [17]


Bitki Transgenezi için Genetik Mühendisliği

Teslim Ol Khatodia, S.M. Paul Khurana, Omics Teknolojileri ve Biyo-Mühendislik bölümünde, 2018

Soyut

İnsan değeri taşıyan tıbbi ve endüstriyel bileşikler üretmek için rekombinant proteinler için bir üretim sistemi yapmak üzere bitkilerin genetik mühendisliğine Bitki Moleküler Çiftçiliği denir. Bitkileri rekombinant protein üretimi için biyoreaktör olarak kullanmanın, düşük kurulum maliyeti ve genellikle güvenli olarak kabul edilen bitki ve ürünlerin ölçeklenebilirliği dahil olmak üzere birçok avantajı vardır. Bitki yapımı ilaçlar (PMP'ler) halihazırda Gaucher hastalığı gibi bazı hastalıklar için ticari olarak üretiliyor ve birçok bitki yapımı aşı klinik denemeler altında. Farmasötiklerin iki ana sınıfı, bitkilerin genetik mühendisliği kullanılarak geliştirilmektedir: Bitki antikorları ve Yenilebilir aşılar. This chapter highlights the procedure of using plants as bioreactor for recombinant protein production through plants, increasing recombinant protein accumulation, commercial status of PMPs and chloroplast genome engineering.


Tartışma

A cell-based reporter system was established for demonstrating hammerhead and glmS ribozyme activity via the assessment of reporter protein production. The established E. koli cells contained two foreign genes encoding EGFP-hDHFR reporter protein and RNaseJ1 ribonuclease enzyme. Initially, expression of the proteins was tested in single plasmid transformant or co-transformant cells. Highly variable growth and reporter production were observed in these transformants (Fig. 2b and Table S3) that reduced power to detect ribozyme activity. Plasmids impose a metabolic burden on transformed E. koli owing to the expression of plasmid encoded genes and replication of plasmid DNA [29]. The overproduction of RNaseJ1 inhibits growth of the pRJ1 plasmid transformant (Fig. S1). RNaseJ1 functions as a 5′-3′ exonuclease enzyme which plays a pivotal role in B. subtilis RNA metabolism. Although RNaseJ1 is not present in E. koli, it has some functional overlap with E. koli RNaseE [30]. The overexpression of RNaseJ1 in E. koli transformants carrying pRJ1 plasmid thus might have an impact on general RNA metabolism, affecting cell homeostasis and growth.

The degree of the metabolic load in plasmid transformants is also dependent on plasmid copy number and size [29]. Poor growth of co-transformants over-expressing RNaseJ1 (Fig. 2b) could also be exacerbated by the extra burden of carrying two plasmid types lacking segregation control. The reporter gene-expressing plasmids contain a pUC origin of replication, whereas the RNaseJ1-expressing plasmid contains a p15A origin of replication (Fig. 1). Plasmid copy numbers of these two replication systems are comparable [31]. However, the transformant population is heterogeneous owing to the unequal distribution of cellular components in cell division [32, 33], which is manifest as a bimodal distribution of plasmid copy number [31]. To mitigate metabolic burden, the heterologous genes were stably integrated via homologous recombination into the E. koli kromozom. Previous studies have demonstrated that genome integration of foreign genes is superior to plasmid-based expression, in which the heterologous protein is expressed more stably and with less impact on growth [34,35,36]. In concordance with previous studies showing the benefit of gene integration, the growth of iRJ1 with integrated RNaseJ1 gene transformed with different reporter plasmids was more consistent compared with plasmid co-transformants, with only minor retardation in the induced condition (Fig. 4b). However, induction of RNaseJ1 expression in iRJ1 transformants had a small and unspecific effect on plasmid-expressed reporter signal such that it was not possible to demonstrate ribozyme activity (Fig. 4c). We do not know why ribozyme activity could not be demonstrated with plasmid-based reporters, but the combined metabolic burden of carrying reporter plasmids and expressing heterologous proteins may create a cellular condition in which RNaseJ1 is less active and/or mRNA is globally more stable.

In contrast to iRJ1 plasmid transformants, specific effects of upstream active ribozyme sequences on reporter activity were demonstrated in double integrants. However, the mean level of reporter protein for the +ara condition was less than two-fold different from the corresponding −ara condition (Fig. 5b). This suggests that the degradation of ribozyme-cleaved reporter RNA by RNaseJ1 has a modest effect on the level of reporter protein under the assay conditions used. Although degradation of ribozyme-cleaved RNA by RNaseJ1 is rapid in E. koli [23], the reporter protein used in our assays may be stable owing to the EGFP moiety that has a half-life of more than 24 h in E. koli [37]. The reporter protein signal could thus persist even after RNaseJ1-mediated mRNA degradation. Reporter protein stability can be reduced by fusing with a degron, or degradation tag for in vivo proteolysis. For example, C-terminal fusion of the ssrA peptide degron can direct fusion proteins for degradation by the endogenous ClpXP and ClpAP proteases, leading to rapid protein degradation in E. koli [38]. The reporter protein with a shorter half-life will be beneficial for widening the dynamic range of the reporter assay. In addition, the ribozyme activity can be monitored in real time along with bacterial growth. As an alternative to protein reporters, turn-on fluorescent RNA reporters could be used [39]. RNA reporters expressed on the same RNA molecule as the ribozyme could give a better time-resolved signal of ribozyme activity, although extensive empirical testing may be required to establish a general ribozyme reporter system. Turn-on fluorescent RNA reporters are generally less bright and thus more difficult to quantify than fluorescent proteins [39], although their performance can be improved by flanking scaffolds, which act by stabilizing the in vivo folding of the RNA reporter [40]. However, scaffolded RNA reporters are more resistant to ribonucleases [40], which may interfere with the detection of ribozyme activity as RNaseJ1-mediated loss of reporter after ribozyme cleavage.

Using the double-integrant reporter system, we demonstrated the activities of the constitutively active (RzI) and cofactor-dependent (glmS) ribozyme. The latter was surprising as no exogenous cofactor was added in the assay, suggesting that the intracellular level of the glmS cofactor, GlcN6P, is sufficiently high for in vivo ribozyme activity. The level of GlcN6P in E. koli varies from 0.062 to 9 mM, depending on the available carbon source [41]. This concentration range is sufficient to activate the glmS ribozyme in vitro [13]. In other cell types such as Saccharomyces cerevisiae yeast [42] and Plasmodium falciparum malaria parasite [43], the glmS ribozyme is inactive unless the intracellular GlcN6P level is increased by treatment with exogenous sugar that can be converted to GlcN6P. NS glmS ribozyme cleaves more slowly in vitro than the hammerhead ribozyme at physiological concentrations (≈ 1 mM) of magnesium (glmS rate constant (Kobs) < 1 min − 1 , [13, 44] hammerhead Kobs > 1.2 min − 1 [7]), which could partly explain why the reduction of reporter in the induced condition is less for iglmS_iRJ1 than iRzI_iRJ1 (Fig. 5b). It would be interesting to test other classes of ribozymes for further comparison in our reporter system, including the rapidly cleaving twister ribozyme (twister Kobs ≈ 1000 min − 1 , [10]).


4. TARTIŞMA

Planarians are extremely resilient to the perturbation of cell homeostasis processes, including traumatic events such as extensive tissue damage. Their sturdiness resides in the adaptive response of a plastic body where homeostatic processes are continuously adjusted by cross-talk between stem cells and differentiated body parts, which have been suggested to represent a global stem cell niche. 31 For these reasons, unbalancing regenerative and homeostatic performances of planarians is challenging. Accordingly, artificially altered gravity did not permanently perturb planarian regeneration even in extreme conditions. Indeed, animals were able to complete a functional regeneration, although we observed a reduced regenerative capability in head fragments following exposure to simulated hypergravity. Higher susceptibility of head fragments – with respect to tail fragments – to factors perturbing stem cell activity has been commonly demonstrated for these organisms. 58 This phenomenon is probably due to the lower number of stem cells spread in this part of the body, so that minimal variations in the number of neoblasts induce a more readily observable phenotype. In general terms, a reduction in the regeneration ability might owe to reduced cell proliferation and/or an increased cell death. These two biological phenomena are indeed finely regulated during planarian regeneration, both showing two waves of activity, that is, one early after cut and the other later. While apoptosis and proliferation share this biphasic pattern, their distribution in the body is opposite. For apoptosis, the early peak occurs near the wound surface, and the second one is dispersed throughout the body 59 the exact contrary occurs for proliferation, being mitotic cells accumulated under the growing blastema only in the second proliferation burst. 60 A maximal impact upon blastema growth is therefore expected in case of an increase in the first peak of apoptosis and of a decrease in the second peak of proliferation. Slight changes in the number of apoptotic or mitotic cells spread far from the regeneration site are unlikely to directly perturb blastema growth.

In all altered gravity conditions tested in this study, we monitored a reduction of the proliferative activity in the second peak, which is consistent with a reduced blastema growth. On the contrary, we monitored an increase in apoptotic cells under the wound surface in early regeneration only in artificial hypergravity conditions. In the RPM, the number of apoptotic cells localized below the wound is slightly reduced. This difference might be at the basis for the different effect upon blastema growth observed in microgravity versus hypergravity simulations. Indeed, in this latter case the combination of two adverse effects, that is a reduced proliferation at the blastema site and an increased apoptosis under the wound surface, might concur to the slight reduction of the blastema growth rate. We currently do not know which cells underwent apoptosis, but, as at the same time (6 h) at which we observed an increase in apoptosis, we also monitored a number of mitosis comparable to controls so, it is possible to hypothesize that this process preferentially affects post-mitotic cells. Accordingly, it has been demonstrated that the two regenerative apoptotic waves predominantly, if not exclusively, occurred in differentiated cells. 59 We can thus imagine that a first early consequence of hypergravity is the induction of cell-death processes: this is also in line with what we observed in intact animals, where an increment in TUNEL-positive cells was monitored after 24 h of 10 g exposure. Altered gravity is also known to influence cell determination and differentiation in different types of cells ( 22, 61-64 ), and it also has an effect on cell differentiation in planarians, a process that can be easily followed by studying differentiation towards the epidermal lineage, for which early and late molecular markers are available. 50 Obtained data show again an opposite effect of hypergravity and microgravity experiments. Indeed, a significant increase of NB-21.11.e-positive cells (marker for enhanced differentiation) was detectable after simulated hypergravity exposure, while its significant reduction was produced by artificial microgravity exposure indicating a possible demonstration of the gravity continuum paradigm. 65

Pre-treatment with CONPs rescued the negative impact of simulated altered gravity on the blastema growth, cell proliferation, apoptosis, and cell differentiation. We can assume that protective effect is due to internalized nanoparticles, as we extensively washed planarian before exposition to altered gravity conditions. Owing to concomitance on CONP crystalline surface of both Ce 4+ and Ce 3+ states, 40 CONPs show self-regenerating antioxidant properties and ROS-scavenger functions, resulting into anti-inflammatory activity. 66 Hence, CONPs have had several biomedical applications, and showed a protective role in disorders characterized by ROS overproduction. 67-69 Since several literature sources report on overproduction of ROS induced by altered gravity, 70-73 we hypothesize that oxidative unbalance might be the principal cellular stress at which planarian cells are exposed following altered gravity, despite additional concurrent causes cannot be ruled out. Thus, we speculate that upon hypergravity exposure cells experience an increase in ROS production, to which some respond activating a cell-death program. In turn, increases in cell death may influence the cellular homeostasis of the animal, inducing premature cell differentiation and perturbing activation of neoblasts and their subsequent accumulation to form a blastema. Further experiments will be necessary to validate our hypothesis.


Hands-on Activity Bacteria Transformation

Birimler, belirli bir içerik veya konu alanı için kılavuz görevi görür. Ünitelerin altında dersler (mor) ve uygulamalı etkinlikler (mavi) bulunur.

Tüm derslerin ve etkinliklerin bir ünite altında yer almayacağını ve bunun yerine "bağımsız" müfredat olarak bulunabileceğini unutmayın.

TE Bülteni

Özet

The Enterococcus faecalis bacterium lives in the human gut.

Mühendislik Bağlantısı

Bacteria are the most common organisms modified by genetic engineers due to the simple structures of bacteria cells compared to those of eukaryotic cells. Engineers are able to add genes to bacteria using recombinant plasmids, which enable the bacteria to produce the desired beneficial proteins. Students use a paper model to simulate this real-life process used by bio-technicians.

Öğrenme hedefleri

Bu aktiviteden sonra öğrenciler şunları yapabilmelidir:

  • Model and describe the process used by engineers to modify the genome of bacteria.
  • Explain why bacteria are genetically modified more often than other organisms.
  • Discuss possible applications for genetically modified bacteria.

Eğitim Standartları

Her biri TeachMühendislik ders veya etkinlik, bir veya daha fazla K-12 bilim, teknoloji, mühendislik veya matematik (STEM) eğitim standardı ile ilişkilidir.

100.000'den fazla K-12 STEM standardının tamamı kapsanmaktadır TeachMühendislik tarafından toplanır, muhafaza edilir ve paketlenir. Başarı Standartları Ağı (ASN), bir proje D2L (www.achievementstandards.org).

ASN'de standartlar hiyerarşik olarak yapılandırılmıştır: ilk önce kaynağa göre Örneğin., duruma göre kaynak içinde türe göre Örneğin., bilim veya matematik içinde türe göre alt türe göre, sonra nota göre, vesaire.

NGSS: Yeni Nesil Bilim Standartları - Bilim

HS-LS1-1. Construct an explanation based on evidence for how the structure of DNA determines the structure of proteins which carry out the essential functions of life through systems of specialized cells. (9 - 12. Sınıflar)

Bu hizalamaya katılıyor musunuz? Geri bildiriminiz için teşekkürler!

Hizalama anlaşması: Geri bildiriminiz için teşekkürler!

Hizalama anlaşması: Geri bildiriminiz için teşekkürler!

All cells contain genetic information in the form of DNA molecules. Genes are regions in the DNA that contain the instructions that code for the formation of proteins, which carry out most of the work of cells.

Hizalama anlaşması: Geri bildiriminiz için teşekkürler!

Hizalama anlaşması: Geri bildiriminiz için teşekkürler!

Uluslararası Teknoloji ve Mühendislik Eğitimcileri Derneği - Teknoloji
  • Tıbbi teknolojiler, önleme ve rehabilitasyon, aşılar ve farmasötikler, tıbbi ve cerrahi prosedürler, genetik mühendisliği ve sağlığın korunduğu ve sürdürüldüğü sistemleri içerir. (9 - 12) Daha Fazla Detay

Bu hizalamaya katılıyor musunuz? Geri bildiriminiz için teşekkürler!

Bu hizalamaya katılıyor musunuz? Geri bildiriminiz için teşekkürler!

Devlet Standartları
Texas - Science
  • describe how techniques such as DNA fingerprinting, genetic modifications, and chromosomal analysis are used to study the genomes of organisms. (Grades 9 - 11) More Details

Bu hizalamaya katılıyor musunuz? Geri bildiriminiz için teşekkürler!

Malzeme Listesi

  • makas
  • tape, 3 small pieces , one per group these represent plasmid DNA and mammal DNA containing the insulin gene helpful to print page 1 on different colored paper than page 2 , one per group , one per student
  • stapler (can be shared among groups)

Çalışma Sayfaları ve Ekler

Bunun Gibi Daha Fazla Müfredat

Students learn how engineers apply their understanding of DNA to manipulate specific genes to produce desired traits, and how engineers have used this practice to address current problems facing humanity. Students fill out a flow chart to list the methods to modify genes to create GMOs and example a.

As a class, students work through an example showing how DNA provides the "recipe" for making human body proteins. They see how the pattern of nucleotide bases (adenine, thymine, guanine, cytosine) forms the double helix ladder shape of DNA, and serves as the code for the steps required to make gene.

Students learn about mutations to both DNA and chromosomes, and uncontrolled changes to the genetic code. They are introduced to small-scale mutations (substitutions, deletions and insertions) and large-scale mutations (deletion duplications, inversions, insertions, translocations and nondisjunction.

Students reinforce their knowledge that DNA is the genetic material for all living things by modeling it using toothpicks and gumdrops that represent the four biochemicals (adenine, thiamine, guanine, and cytosine) that pair with each other in a specific pattern, making a double helix. Student teams.

Ön Talep Bilgisi

A basic understanding of protein synthesis and DNA's role in the cell/body is helpful so students can follow how changes in DNA result in major changes in the characteristics of organisms.

Giriş/Motivasyon

How big are bacteria? (Answer: most are only a few micrometers. Micrometers are one millionth of a meter. 1 cm = 10,000 micrometers 1 mm = 1,000 micrometers) Bacteria are so small that most are less than one-tenth of the diameter of a human hair.

How many different species of bacteria exist? (Answer: Estimates vary from 10 million to 1 billion species.) So far, we have only discovered less than 10,000 different species, but some scientists estimate that as many as 1 billion different species of bacteria may exist on Earth! How prolific are bacteria? Bacteria are so plentiful that a 20-ounce bottle of water may contain up to 600 million bacteria!

Bacteria are everywhere, and most of the time they are harmless. In fact, many are beneficial to people because they are useful and necessary to a healthy human body and environment. What are some examples of these "good" bacteria? (Possible answers: E.coli within the intestines of mammals, bacteria within the soil, bacteria used to make foods such as yogurt.) Without bacteria, we would not be able to digest food or produce some of our favorite foods such as yogurt and cheese. The bacteria we might generally call "bad" for us include those responsible for causing illnesses like food poisoning.

Do you think genetic engineers could use and modify bacteria for any purpose? (Answer: Yes) Bacteria are the most commonly modified organisms. Let's look at how we can modify these bacteria and why we would want to modify them.

Prosedür

Bacteria can be adapted to produce a number of useful materials. Because of the simple structures of bacterial cells, they are the most commonly modified organisms. Many times, and in this activity, a gene is simply added to the bacteria, causing the bacteria to be able to produce a useful protein, such as insulin. Other changes to bacteria can reconfigure the cellular respiration product to create desirable byproducts such as diesel or plastic molecules instead of the usual byproduct, such as carbon dioxide.

The common method used for genetically modifying bacteria is to use recombinant plasmids. Plasmids are circular pieces of DNA when placed near bacteria, the plasmid is absorbed and incorporated into the bacterial cell. Once inside the bacteria, the plasmid is treated the same as the bacteria's original DNA. This means that the bacteria will use this new DNA from the plasmid to create proteins, and the plasmid will be replicated when the cell divides.

The process of creating genetically modified bacteria used in this activity is one of the simplest methods. First, a desired gene must be selected from some (any) organism, that is, the gene that codes for the creation of insulin protein, and removed from the DNA of that organism. Genes are removed using restriction enzymes. These enzymes search for specific nucleotide sequences in the DNA, called recognition sites, where they "cut" the DNA by breaking certain bonds. When the bonds are broken in a staggered manner it creates "sticky ends." If the enzyme breaks the bond to create a straight cut, the ends are called "blunt ends." The next step is to use the same restriction enzyme to cut open the plasmid.

The isolated gene is now placed where the plasmid was cut, and they are bonded together using another enzyme called ligase. Now a recombinant plasmid has been produced. The final step is to get the plasmid into a bacteria cell. Sometimes simply placing the bacteria in the correct environment is enough to artificially induce the bacteria to intake the recombinant DNA, otherwise some special method may be required if the plasmid is too large to cross the bacteria's cell membrane. Figure 1.shows a diagram of the entire process. Figure 1. The process to build a recombinant plasmid to modify bacteria.

  • Gather materials and make copies of the Modeling Bacteria Transformation Worksheet, one per group, and Assessment Questions, one per person.
  • Make copies of the DNA Sequences for Cut-Outs, one per group it is helpful if the plasmid DNAs (page 1) are printed on different colored paper from the mammal DNAs (page 2) to help distinguish them during the activity. Then cut the DNA sequences into strips.
  • If time is short, tape the cut-out plasmid DNA into circles with the DNA sequence facing outward. Otherwise, have students do this in step 2.

  1. Divide the class into groups of two students each. Hand out to each group a worksheet and its two strips of DNA sequences, pointing out which will be used to create the plasmid, and which is the mammal DNA containing the insulin gene.
  2. Direct groups to tape together the ends of the plasmid DNA to form a circular piece of DNA (see Figure 2) so that the printed sequence is visible on the outside of the plasmid. This is the initial plasmid that will be modified with the insulin gene. Figure 2. Illustration of the circular DNA created in step 2.


Videoyu izle: Nk 1 Protein och DNA 1 (Haziran 2022).